JP2000342262A

JP2000342262A - 耐病性遺伝子

Info

Publication number: JP2000342262A
Application number: JP11153146A
Authority: JP
Inventors: Kazutoshi Sawada; 和敏澤田; Michiaki Iwata; 道顕岩田
Original assignee: SHOKUBUTSU BOUGIYO SYST KENKYU; SHOKUBUTSU BOUGIYO SYST KENKYUSHO KK
Current assignee: SHOKUBUTSU BOUGIYO SYST KENKYU; SHOKUBUTSU BOUGIYO SYST KENKYUSHO KK
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2000-12-12

Abstract

(57)【要約】【課題】植物に獲得抵抗性を付与する遺伝子を単離す
ることを課題とする。【解決手段】イネいもち菌由来のcerebroside 型エリ
シターを用いて、植物に獲得抵抗性を付与するタンパク
質をコードする遺伝子をスクリーニングすることを特徴
とする当該遺伝子のスクリーニング方法、上記の方法に
より単離される植物に獲得抵抗性を付与するタンパク質
をコードする遺伝子、および配列番号：１、３、または
５に記載のタンパク質、または当該タンパク質中のアミ
ノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠
失、もしくは付加したアミノ酸配列を有し、イネに獲得
抵抗性を誘導するイネいもち菌由来cerebroside 型エリ
シターにより発現が誘導されるタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物に獲得抵抗性
を付与するタンパク質、当該タンパク質をコードするＤ
ＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、当該ベクターを保持
する形質転換細胞、当該形質転換細胞を含む形質転換植
物体に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は様々な病気に対する抵抗遺伝子を
もつ。しかし、ある一つの耐病性遺伝子はその遺伝子に
対する非病原性（avirulence）遺伝子をもつ特定の病原
菌の種類（レース）に対してのみ抵抗性を示し、これを
遺伝子対遺伝子説（Flor 1971Ann. Rev. Phytopathol.
9:275）と呼ぶ。最近では、トマトから「Pseudomonassy
ringae pv tomato」の非病原性遺伝子「avrPTO」に対す
る耐性遺伝子「PTO 」（Martin et al. 1993 Science 2
62:1432 ）と「Cladosporium fulvum 」の非病原性遺伝
子「Avr9」に対する抵抗性遺伝子「Cf-9」（Jones et a
l. 1994 Science 266:789 ）が単離されている。また、
シロイヌナズナでは「Pseudomonas syringae pv tomat
o」の非病原性遺伝子「avrRpt2 」に対する耐性遺伝子
「RPS1」（Bent et al. 1994 Science 265:1856 ）、
「Pseudomonas syringae pv tomato」の非病原性遺伝子
「avrRpm1 」および「avrB」に対する耐性遺伝子「RPM
1」（Grant et al. 1995 Science 269:843 ）などが単
離されている。また、非病原性遺伝子が不明であるがタ
バコでタバコモザイクウイルスに対する抵抗性遺伝子
「N」（Whitham et al. 1994 Cell 78:1101）が、イネ
で「Xanthomonas campestrispv oyzae 」に対する抵抗
性遺伝子「Xa21」（Song et al. 1995 Science 270:180
4 ）が、亜麻で「Melampsora lini 」に対する抵抗性遺
伝子「L6」（Lawrenceet al. 1995 Plant Cell 7:119
5）などが単離された。しかしながら、これらの抵抗性
遺伝子（真性抵抗性遺伝子）は非親和性遺伝子をもたな
い病原菌に対しては抵抗性は示さない。また、真性抵抗
性は病原菌の変異によって容易に崩壊してしまうことが
知られている。従って、これらの真性抵抗性遺伝子の利
用範囲は広くない。

【０００３】一方で植物では獲得抵抗性という動物の免
疫に例えられる現象が知られている（Chester 1933 Q R
ev. Biol. 8:275, Ryals et al. 1994 Plant Physiol.
104:1109）。これは植物が病原菌に感染した場合に、そ
れ以後その植物の感染していない組織が比較的長期間に
わたり、広い種類の病原菌に対して抵抗性を示す現象で
ある。

【０００４】しかしながら、獲得抵抗性のメカニズムに
ついてはほとんど解明されていないのが現状である。Wa
rdら（1991 Plant Cell 3:1085）は植物の獲得抵抗性を
誘導する薬剤であるサリチル酸や2, 6- ジクロロイソニ
コチン酸処理により発現が誘導される遺伝子として「PR
-1」、「PR-2」、「PR-4」、「PR-5」、「キチナー
ゼ」、「グルカナーゼ」、「PR-Q' 」、「SAR8.2」など
の遺伝子を報告しているが、これらは獲得抵抗性の引き
金になる遺伝子ではなく、単にウイルスなどに感染する
だけでも誘導される「Pathogenesis related protein
（感染特異的タンパク質）」の遺伝子（PR遺伝子）であ
った。また、実際「PR-1」や「PR-5」をタバコに過剰発
現させた場合にも、当該タバコはタバコモザイクウイル
スに対する耐性を示さなかった（Cutt et al. 1989 Vir
ol. 173:89, Linyhorest et al. 1989 Plant Cell 1:28
5 ）。また、ベンゾチアジアゾール処理によっても同様
な遺伝子の発現が誘導されることが報告されている（Fr
iedrich et al. 1996 Plant Journal 10:61 ）。さらに
プロベナゾール処理によって誘導される遺伝子がイネか
ら単離されたが、これもPR遺伝子であった（Midoh and
Iwata 1996 Plant Cell Physiol. 37:9 ）。即ち、植物
に獲得抵抗性を付与する遺伝子はいまだ単離されていな
いのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物獲得抵
抗性を付与する遺伝子を単離することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行なった結果、イネに獲得
抵抗性を誘導するイネいもち菌由来cerebroside 型エリ
シターを処理した植物に発現するｍＲＮＡをディファレ
ンシャルディスプレイ法(Liang and Pardee 1992 Scien
ce 2 57:967)によって比較し、エリシター処理をした植
物にのみ発現する遺伝子を単離することに成功した。本
発明者らは、さらに当該遺伝子につき解析をすすめた結
果、当該遺伝子の発現と植物の獲得抵抗性との間に顕著
な相関関係が認められることを見いだし、これにより発
明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、植物に獲得抵抗性を付与
するタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方
法および当該方法により単離される遺伝子に関し、具体
的には、（１）配列番号：１、３、または５に記載のタ
ンパク質、または当該タンパク質中のアミノ酸配列にお
いて1 もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは
付加したアミノ酸配列を有し、植物の獲得抵抗性を誘導
するエリシターにより発現が誘導されるタンパク質、
（２）配列番号：１、３、または５に記載のタンパク
質、または当該タンパク質中のアミノ酸配列において１
もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加し
たアミノ酸配列を有し、植物に獲得抵抗性を付与するタ
ンパク質、（３）配列番号：２、４、６、１０、１１、
または１２に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ
がコードするタンパク質であって、植物の獲得抵抗性を
誘導するエリシターにより発現が誘導されるタンパク
質、（４）配列番号：2 、4 、6 、１０、１１、または
１２に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコー
ドするタンパク質であって、植物に獲得抵抗性を付与す
るタンパク質、（５）上記（１）〜（４）のいずれかに
記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、（６）配列番
号：２、４、６、１０、１１、または１２に記載のＤＮ
ＡとハイブリダイズするＤＮＡであって、植物の獲得抵
抗性を誘導するエリシターにより発現が誘導されるタン
パク質をコードするＤＮＡ、（７）配列番号：２、４、
６、１０、１１、または１２に記載のＤＮＡとハイブリ
ダイズするＤＮＡであって、植物に獲得抵抗性を付与す
るタンパク質をコードするＤＮＡ、（８）上記（５）〜
（７）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター、
（９）上記（５）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡを
誘導的に発現させるプロモーターを含む、上記（８）に
記載のベクター、（１０）上記（８）〜（９）のいずれ
かに記載のベクターを保持する形質転換細胞、（１１）
植物細胞である上記（１０）に記載の形質転換細胞、
（１２）イネ細胞である上記（１０）に記載の形質転換
細胞、（１３）上記（１１）に記載の形質転換細胞を含
む形質転換植物体、（１４）上記（１２）に記載の形質
転換細胞を含むイネ形質転換植物体、に関する。

【０００８】なお、本発明において、「獲得抵抗性」と
は植物がある病原菌に感染した場合に、感染した植物が
それ以降広い種類の病原菌に対し抵抗性を示す現象（例
えば、病原菌の感染によって過敏感反応による壊死斑の
形成が起こり、その周辺組織もしくは全身的に病原菌の
再接種に対し抵抗的となる現象）、またはエリシター処
理によって全身的に病原菌の接種に対し抵抗的となる現
象を指す。

【０００９】

【発明の実施の形態】次に、本発明についてさらに詳細
に説明する。本発明は、植物に獲得抵抗性を付与するタ
ンパク質に関する。本発明の植物に獲得抵抗性を付与す
るタンパク質は、イネいもち病由来のcerebroside 型エ
リシターにより発現が誘導されるタンパク質であり、当
該cerebroside 型エリシターを用いて当該タンパク質を
コードする遺伝子をスクリーニングすることができる。
例えば、本発明のタンパク質に含まれる配列番号：１、
３、５に記載のタンパク質は、植物の獲得抵抗性を誘導
するエリシターにより発現が誘導され、また、当該タン
パク質をコードする遺伝子の発現と植物の獲得抵抗性と
の間には相関関係が認められる。従って、配列番号：
１、３、５に記載のタンパク質は、植物に獲得抵抗性を
付与するタンパク質であると考えられる。イネに獲得抵
抗性を誘導するイネいもち菌由来cerebroside 型エリシ
ターを処理した場合と処理しない場合に発現の違いがみ
られるmRNAをディファレンシャルディスプレイ法により
比較し、差異のあった遺伝子を単離した。単離した遺伝
子の発現といもち病抵抗性との関連を検討した結果、当
該遺伝子の発現といもち病抵抗性には相関関係があるこ
とを見いだした。さらに当該遺伝子をイネに導入した形
質転換植物体イネを作出した。

【００１０】本発明のタンパク質には、天然のタンパク
質の他、遺伝子組換え技術を利用して調製したタンパク
質も含まれる。天然のタンパク質は、常法、例えば、下
記の方法により調製された組換えタンパク質をウサギな
どの小動物に免役して得た抗体を適当な吸着体（ＣＮＢ
ｒ活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合
させてカラムを作製し、得られたカラムを利用してイネ
の葉のタンパク質抽出液を精製することにより調製する
ことが可能である。一方、組換えタンパク質は、常法、
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例え
ば、配列番号：２、４、６に記載のＤＮＡ）を適当な発
現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な細胞に導入
し、当該形質転換細胞から精製することにより調製する
ことが可能である。組換えタンパク質を生産するために
用いられる細胞としては、例えば、植物細胞、大腸菌、
酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。また、細
胞内で組換えタンパク質を発現させるためのベクターと
しては、例えば、植物、酵母細胞用にはプラスミド「pB
I121」や「pBI101」(Clontech 社製) 、大腸菌用にはプ
ラスミド「pET Expression system 」(Stratagene 社
製) 、哺乳類細胞用にはプラスミド「pMAM」(Clontech
社製) 、昆虫細胞用にはプラスミド「pBacPAK8.9」(Clo
ntech 社製) などが挙げられる。

【００１１】ベクターへのＤＮＡの挿入は、常法、例え
ば、Molecular Cloning (Maniatiset al. Cold Spring
harbor Laboratry Press)に記載の方法により行なうこ
とができる。また、宿主細胞へのベクターの導入は、常
法により宿主細胞に応じてエレクトロポーレーション
法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン
法、ポリカチオン法などの方法で行なうことが可能であ
る。

【００１２】得られた形質転換細胞からの本発明の組換
えタンパク質の精製は、タンパク質の性質に応じ、塩析
や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着体に
よるカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、ＳＤＳ電気
泳動、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行なうこ
とが可能である。また、本発明の組換えタンパク質をグ
ルタチオンS-トランスフェラーゼなどの標識との融合タ
ンパク質として発現させた場合には、当該標識に対する
アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製する
ことが可能である。

【００１３】また、当業者であれば、常法により、配列
番号：１、３、５に記載のタンパク質中のアミノ酸を適
宜置換などして配列番号：１、３、５に記載のタンパク
質の機能的同等物を取得することが可能である。従っ
て、配列番号：１、３、５に記載のタンパク質のアミノ
酸配列中のアミノ酸において１もしくは数個のアミノ酸
が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有し、植
物に獲得抵抗性を付与するタンパク質（または植物の獲
得抵抗性を誘導するエリシターにより発現が誘導される
タンパク質）も本発明のタンパク質に含まれる。例え
ば、アミノ酸の変異や置換であれば「Transformer Site
-directed Mutagenisis Kit 」や「ExSite PCR- Based
Site-directed Mutagenesis Kit 」(Clontech 社製) を
用いて行なうことが可能であり、また、アミノ酸の欠失
であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」(Clont
ech 社製) などを用いて行なうことが可能である。

【００１４】また、当業者にとっては、周知技術である
ハイブリダイゼーション技術（Southern 1975 J. Mol.
Biol. 98:503, Maniatis et al. Molecular Cloning Co
ldSpring harbor Laboratry Press ）を用いて、配列番
号：２、４、６、１０、１１、１２に記載のＤＮＡ配列
（またはその一部）をもとに、これと相同性を示すＤＮ
Ａを単離して、当該ＤＮＡから本発明のタンパク質の機
能的同等物を得ることも常套手段である。従って、配列
番号：２、４、６、７、８、９に記載のＤＮＡ配列から
なるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタ
ンパク質であって、植物に獲得抵抗性を付与するタンパ
ク質（または植物の獲得抵抗性を誘導するエリシターに
より発現が誘導されるタンパク質）も本発明のタンパク
質に含まれる。ハイブリダイズ技術により得られたタン
パク質は、本発明のタンパク質とアミノ酸配列において
４５％以上の相同性を有することが好ましく、６０％以
上の相同性を有することがさらに好ましく、７５％以上
の相同性を有することがさらに好ましい。

【００１５】なお、植物に獲得抵抗性を付与するエリシ
ターによる遺伝子の発現誘導は、それぞれのエリシター
に適した処理方法で処理した植物（対照として無処理の
植物）からＲＮＡを抽出して、各種遺伝子をプローブと
したノーザンハイブリダイゼーション法（Alwine et a
l. 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350 、Mania
tis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor La
boratory Press ）で検出することが可能である。ま
た、植物の獲得抵抗性の検定は、用いる植物と病原の組
み合わせに応じて常法により行なうことが可能である。
例えば、イネいもち病の場合は、特定のイネ品種にその
品種に罹病性のイネいもち病菌のレースを接種した場合
の過敏感反応の有無や病斑形成の程度を無処理の獲得抵
抗性を示さない植物と比較することによって検定するこ
とが可能である。また、タバコのタバコモザイクウイル
ス（ＴＭＮ）病の場合には、抵抗性遺伝子Ｎをもたない
タバコの品種にＴＭＶを接種した場合の過敏感反応の有
無やウイルスの増殖の程度を無処理の獲得抵抗性を示さ
ない植物と比較することによって検定することが可能で
ある。

【００１６】また、本発明は、上記本発明のタンパク質
をコードするＤＮＡに関する。

【００１７】本発明のＤＮＡは本発明のタンパク質をコ
ードしうるものであれば特に制限はなく、ｃＤＮＡの
他、ゲノミックＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡなども本
発明のＤＮＡに含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、文
献（Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol. 5:69 (198
5)）記載の方法にしたがって調製したゲノムＤＮＡを鋳
型として、配列番号：２、４、６、１０、１１、１２に
記載の塩基配列を基に作製したプライマーを用いてＰＣ
Ｒ（Saiki et al. Science 239:487(1988)）を行なうこ
とにより調製することが可能である。また、ｃＤＮＡで
あれば、常法（Maniatis et al. Molecular Cloning Co
ldSpring harbor Laboratry Press ）により植物からｍ
ＲＮＡを調製し、逆転写反応を行ない、上記と同様のプ
ライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより調製するこ
とが可能である。また、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡは、常
法によりゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば、
配列番号：２に記載の塩基配列を基に合成したプローブ
を用いてスクリーニングすることが可能である。なお、
得られたＤＮＡの塩基配列は、例えば、「シークエンサ
ーModel 373 」（ＡＢＩ社製）を用いて決定することが
可能である。

【００１８】また、本発明は、本発明のＤＮＡが挿入さ
れたベクターに関する。

【００１９】本発明のベクターとしては、組換えタンパ
ク質の生産に用いる上記ベクターの他に、形質転換植物
体作製のための植物細胞内で本発明のタンパク質を発現
させるためのベクターも含まれる。このようなベクター
としては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転
写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含
むターミネーター配列を含んでいれば特に制限はなく、
例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI10
1」、「pIG121Hm」などが挙げられる。

【００２０】なお、当該ベクターは、本発明のタンパク
質を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモータ
ーを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモータ
ーとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの
３５Ｓプロモーター（Odellet al. 1985 Nature 313:81
0）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al. 1991
Plant Cell 3:1155 ）、トウモロコシのユビキチンプ
ロモーター（Cornejoet al. 1993 Plant Mol. Biol. 2
3:567 ）などが挙げられる。また、誘導的に発現させる
ためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌、細菌、
ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線照
射、特定の化合物の散布などの外因によって発現するこ
とが知られているプロモーターなどが挙げられる。例え
ば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によって発現
するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al.
1996 Plant Mol. Biol. 30:387）やタバコのＰＲタンパ
ク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plan
t Cell 2:95 ）、低温によって誘導されるイネの「lip1
9 」遺伝子のプロモーター（Augan et al. 1993 Mol.Ge
n Genet. 240:1 ）、高温によって誘導されるイネの「h
sp80 」遺伝子と「hsp72 」遺伝子のプロモーター（Van
Breusegem et al. 1994 Planta 193:57 ）、乾燥によ
って誘導されるシロイヌナズナの「rab16 」遺伝子のプ
ロモーター（Nundy et al. 1990 Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87:1406）、紫外線照射によって誘導されるパセ
リのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-
Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、嫌気的条件で誘
導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:6624 ）などが挙げられる。また、
イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタン
パク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の
化合物によって、「rab16 」は植物ホルモンのアブシジ
ン酸の散布によっても誘導される。

【００２１】また、本発明は、本発明のベクターが導入
された形質転換細胞に関する。

【００２２】本発明のベクターが導入される細胞には、
組換えタンパクの生産に用いる上記の細胞の他に、形質
転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞
としては特に制限はないが、植物体への再分化の系が確
立されている、例えば、イネ、トウモロコシ、シャガイ
モ、タバコなどの細胞が好ましい。なお、本発明の植物
細胞には培養細胞の他、植物体の細胞も含まれる。プロ
トプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。

【００２３】植物細胞へのベクターの導入は、例えば、
アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood et al.
1993 Transgenic Res. 2:218, Hiei et al, 1994 Plant
J.6:271 ）、エレクトロポーレーション法（Tada et a
l. 1990 Theor. Appl. Genet 80:475）、ポリエチレン
グリコール法（Lazzeri et al. 1991 Theor. Appl. Gen
et 81:437 ）、パーティクルガン法（Sanford et al. 1
987 J. Part. Sci. tech. 5:27）、ポリカチオン法（Oh
tsuki ）などの方法を用いることが可能である。

【００２４】形質転換された植物細胞は、再分化させる
ことにより植物体を再生させることが可能である。再分
化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イ
ネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett.
2:74(1995) ）の方法が挙げられ、トウモロコシであれ
ばShillitoら（Bio/Technology 7:581(1989)）の方法や
Gorden-Kamm ら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げら
れ、ジャガイモであればVisserら（Theor. Appl. Genet
78:594(1989) ）の方法が挙げられ、タバコであればNa
gataとTakebe（Planta 99:12(1971)）の方法が挙げられ
る。

【００２５】これにより得られた形質転換植物体は、各
種病原菌に対する抵抗性を有するために生産性の向上と
収量の安定化、農薬使用量の低減化とそれによる生産コ
ストと労働時間の低減化や環境に対する負荷の削減に効
果があると期待される。また、耐病性であるために有機
栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い
収量が確保できることが期待できる。

【００２６】以下、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるもの
ではない。

【００２７】

【実施例】実施例１植物材料の栽培といもち病抵抗性の検定人工気象室において、１８℃、１２ｈｒ昼／１２ｈｒ夜
の条件にて１ヶ月栽培したイネ（Oriza sativa L. cv.
Akitacomachi）を用い、第３または第４葉が形成された
時期に少量の展着剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸バッフ
ァーに５０〜１００ｐｐｍになるよう溶解したcerebros
ide 型エリシターを散布するイネとcerebroside 型エリ
シターを含まないＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸バッファ
ーのみを散布するイネを用意した。散布後、２，４，
８，１２，２４，４８時間後にそれぞれのポットから第
４、５葉をそれぞれ採取し、液体窒素で凍結してＲＮＡ
調製用サンプルとした。

【００２８】また、一部のイネはエリシター処理後７日
目にファイトアレキシン量を測定し、植物体中でのエリ
シター応答の有無を確認した。その結果、４、５葉とも
にバッファーのみを処理したイネに比べ、cerebroside
型エリシター処理イネにおいて有意にファイトアレキシ
ンが誘導されていることを確認した（図１）。

【００２９】さらに一部のイネにおいて、１０ｐｐｍの
エリシターおよび対照薬剤のラブサイド水和剤１０ｐｐ
ｍを処理後３日目に顕微鏡１０×１０視野中５０〜１０
０胞子のいもち菌を含む蒸留水３ｍｌを接種した場合、
ラブサイド水和剤１０ｐｐｍで防除価は４２％であった
のに対し、cerebroside 型エリシター１０ｐｐｍでは９
０％の防除価を示した（表１）。図１および表１から、
遺伝子スクリーニングに供試したイネはcerebroside 型
エリシターにより確実に防御応答が誘導されているもの
とした。

【００３０】（表１）試料濃度（ppm ）防除価（% ） cerebroside 型エリシター 10 90 ラブサイド水和剤 10 42

【００３１】実施例２ＲＮＡの調製とディファレンシャルディスプレイ採集した葉のサンプル各約０．５ｇからグアニジンチオ
シアネート／塩化セシウム法（Maniatis et al. 1982）
により全ＲＮＡを単離した。さらにディファレンシャル
ディスプレイ法に用いる２時間目のサンプルはOligotex
-dT30 super （タカラ社製）を用い、メーカープロトコ
ールに従ってトータルＲＮＡからポリ（Ａ）⁺ −ＲＮＡ
を調製した。

【００３２】ディファレンシャルディスプレイ法はSoko
lov and Prockop(1994) によるＲＡＰ法（RNA arbitrar
ily primed polymerase chain reaction method ）を採
用し、ＲＡＰ−ＰＣＲｋｉｔ（STRATAGENE社製）を用
いた。即ち、cerebroside 型エリシター処理後２時間目
のＲＮＡサンプルを用いてメーカープロトコールに従っ
て逆転写反応、キットに含まれる１５通りの任意プライ
マーの組み合わせによる２２５通りのポリメラーゼチェ
インリアクション（ＰＣＲ）増幅、電気泳動による増幅
断片の分離と検出を行なった。また、対照としてcerebr
oside 型エリシターを含まないＴｗｅｅｎ２０を含むリ
ン酸バッファー処理のＲＮＡサンプルを用いた。即ち、
逆転写反応はRNA サンプル（１００ｎｇ）を７０℃で１
０分間加熱後、氷上で冷却する。これを50mM Tris-HCl
pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MaCl₂,1.25 mM各 dNTP, RNas
e Inhibitor 40 ユニット, 25μM ランダムプライマー,
および moloney murine leukemia virus reverse trans
criptase 20 ユニットを含む反応溶液２０μｌ中で３７
℃，１時間反応させ、９０℃, ５分間で酵素を失活し１
０分間の氷冷後、ｃＤＮＡを回収し２００μｌの滅菌水
に溶解したものを逆転写反応液とした。

【００３３】ＰＣＲ反応は任意のデザインをもつプライ
マーを用いて行なった。即ち、逆転写反応液２μｌを10
mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 50μ
M 各dNTPs, 1 μM プライマー (18- mer)および Taq po
lymerase （タカラ社製） 1ユニットを含む反応液４８
μｌに加え、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは９４℃，１分
間加熱後、９４℃，１分間を１サイクル、３６℃，５分
間、７２℃，５分間を１サイクル、９２℃，１分間、３
５℃，１分間、７２℃，２分間を４０サイクルをそれぞ
れ行ない、その後７２℃で１０分間伸張反応を行なっ
た。なお、この反応には「Perkin-Elmer DNA Thermal C
ycler 480 」を用いた。電気泳動によるフラグメントの
分離は２．０％低融点アガロースゲル（NUSIEVE GTG; F
MC社製）を用いた。

【００３４】ディファレンシャルディスプレイの結果、
２種のサンプル間で増幅に差の認められた４３個の断片
はSUPREC-01 （タカラ社製）を用い、−８０℃，２０分
間凍結後、メーカープロトコールに従い特異的ＰＣＲ産
物を回収した。

【００３５】回収した断片はＲＡＰ法に用いたプライマ
ーと同じプライマーにより再増幅した。この断片をアガ
ロースゲル電気泳動で確認後、SUPREC-01 （タカラ社
製）を用い回収後、TOPO TA CLONING KIT （Invitrogen
社製）によりメーカープロトコールに従いPCR2.1TOPOベ
クターにクローニングした。。

【００３６】実施例３増幅断片をプローブとしたノーザンブロット解析回収断片がエリシター処理によって特異的に発現する遺
伝子に由来するか確認するために、この断片をそれぞれ
プローブとしてノーザンブロット解析を行なった。１０
０ｐｐｍのcerebroside 型エリシターを処理または未処
理後２，４，８，１２，２４，４８時間目のイネトータ
ルＲＮＡ各２０μｇを１％アガロース・ホルムアミドゲ
ルで電気泳動し、HybondN+メンブラン（アマシャム社
製）に転写した。ハイブリダイゼーションと洗浄は、下
記の通り実施した。即ち、ハイブリダイゼーションは5x
SSC 、１％ブロッキングリージェント（ベーリンガーマ
ンハイム社製）、７％ＳＤＳ、０．０２ｍｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡ中で４２℃、３時間インキュベート後、新し
いハイブリダイゼーション液中に煮沸急冷したプローブ
を５０ｎｇ／ｍｌの濃度になるよう加え、４２℃で一晩
インキュベートした。洗浄は0.1xSSC 、0.1%SDS 液中で
２０分×２回、５５℃で行なった。各回収断片はDIG Nu
cleic acid Detection Kit（ベーリンガーマンハイム社
製）を用いてラベルした。シグナルの検出はGS-250 Mol
ecular Imager （バイオラッド社製）を用い、１〜３日
間感光させた。この結果、Ｂ１プライマーとＡ２プライ
マーを用いて増幅された約７００ｂｐの断片（Ｂ１ｘＡ
２−７００）をプローブとした場合にcerebroside 型エ
リシターで誘導されるシグナルが検出された（図２）。
また、Ｂ１プライマーとＣ４プライマーを用いて増幅さ
れた約６５０ｂｐの断片（Ｂ１ｘＣ４−６５０）をプロ
ーブとした場合にもcerebroside 型エリシターで誘導さ
れるシグナルが検出された（図３）。また、Ｂ２プライ
マーとＡ５プライマーを用いて増幅された約７００ｂｐ
の断片（Ｂ２ｘＡ５−７００）をプローブとした場合に
もcerebroside 型エリシターで誘導されるシグナルが検
出された（図４）。また、Ｂ２プライマーとＢ１プライ
マーを用いて増幅された約６５０ｂｐの断片（Ｂ２ｘＢ
１−６５０）をプローブとした場合にもcerebroside 型
エリシターで誘導されるシグナルが検出された（図
５）。また、Ｃ４プライマーとＡ５プライマーを用いて
増幅された約８００ｂｐの断片（Ｃ４ｘＡ５−８００）
をプローブとした場合にもcerebroside 型エリシターで
誘導されるシグナルが検出された（図６）。また、Ｃ４
プライマーとＡ５プライマーを用いて増幅された約７５
０ｂｐの断片（Ｃ４ｘＡ５−７５０）をプローブとした
場合にもcerebroside型エリシターで誘導されるシグナ
ルが検出された（図７）。クローンNo. B1xA2-700 、B1
xC4-650 、B2xA5-700 、B2xB1-650 、C4xA5-800 、C4xA
5-750 は「TA Cloning Kit」（Invitrogen社製）を用い
てプラスミドにクローニングし、「シークエンサーMode
l373A 」（ABI 社製）で塩基配列を決定した。決定した
塩基配列をB1xA2-700 は配列番号：７、C4xA5-750 は配
列番号：８、B2xA5-700 は配列番号：９、B1xC4-650 は
配列番号：１０、B2xB1-650 は配列番号１１、C4xA5-80
0は配列番号：１２に示す。

【００３７】実施例４ＲＴ−ＰＣＲ解析による回収断片の発現確認回収断片がcerebroside 型エリシターによって特異的に
発現する遺伝子に由来するかを確認するために、各断片
からプライマーをデザインし検出感度の高いＲＴ−ＰＣ
Ｒ解析を行なった。ＲＴ−ＰＣＲはmRNA Selective PCR
Kit（タカラ社製）を用いた。1x mRNA Selective PCR
Buffer I, 5mM MgCl₂, 1mM dNTP/analog mixture, 0.8
U/μl RNase Inhibitor, 0.1U/μl AMV RTase XL, 0.1U
/ μl AMV-Optimized Taq, 1μg Total RNA, RNase Fre
e dH₂O, センス、アンチセンスプライマーから成る反応
溶液を作製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは５０℃，２
５分間加熱しｃＤＮＡ合成後、８５℃，１分間、５０〜
５５℃，１分間、７２℃，１分間を２５サイクル行な
い、その後７２℃で１０分間伸張反応を行なった。ま
た、ＲＮＡはエリシター処理後、２，１２，２４，４８
時間目に採取したイネ第５葉より調製したものを用い
た。ＲＮＡ濃度は分光光度計で測定後、ハウスキーピン
グ遺伝子であるアクチン遺伝子（Reece et al. 1990 ）
を用いた増幅により均一であることを確認した。その結
果、クローンNo. B1xA2-700 は配列番号：７からデザイ
ンしたプライマー：「CAGTTCTTGCCATGGTGATC」（配列番
号：１３）、「ACCATGTTGCTTGTCAGAGC」（配列番号：１
４）を用いたＰＣＲから（図８）、B1xC4-650 は配列番
号：８からデザインしたプライマー：「ATAGTACGACAAGC
GAGTGC」（配列番号：１５）、「AAGATTCACTCTAGAGGCC
G」（配列番号：１６）を用いたＰＣＲから（図９）、B
2xA5-700 は配列番号：９からデザインしたプライマ
ー：「TGCTTCATGACCCACTTAGCTGGAGA」（配列番号：１
７）、「ACAGTGAGAAAGATGTGGAGCAT 」（配列番号：１
８）を用いたＰＣＲから（図１０）、B2xB1-650 は配列
番号：１０からデザインしたプライマー：「GACTTTCTTT
CTCTGCTGCG」（配列番号：１９）、「GCTGTTCAACGAGGAC
AT」（配列番号：２０）を用いたＰＣＲから（図１
１）、 C4xA5-800は配列番号：１１からデザインしたプ
ライマー：「CACTTGGGAACCTTTGGAAG」（配列番号：２
１）、「CATCTTAGAATCGACCACGC」（配列番号：２２）
（図１２）を用いたＰＣＲから、C4xA5-750 （図１３）
は配列番号：１２からデザインしたプライマー：「GGAA
ATGCTTGGAACGGCAACCACA 」（配列番号：２３）、「AACA
GCTCGGAGTACCGCAAGTCGC 」（配列番号：２４）を用いた
ＰＣＲから、それぞれcerebroside 型エリシターによっ
て特異的に誘導されることが判明した。また、対照とし
て、「GGTGATGGTGTCAGCCACACTGT 」（配列番号：２
５）、「GCTGCTAGGAGCAAGGCAGTGAT 」（配列番号：２
６）をプライマーに用いアクチン遺伝子を増幅した結果
を図１４に示す。

【００３８】決定した回収断片の塩基配列はＤＮＡシー
ケンス入力解析システム；ＤＮＡSIS-Mac version 2.0
（日立ソフト）を用い、配列データの保存および解析を
行なった。また、ホモロジー検索ソフト（http://www.d
dbj.nig.ac.jp/）による解析から、クローンNo. B1xA2-
700 はヒトやマウスの解毒作用のあるseleniumu 結合タ
ンパク遺伝子（Mohinder et al. 1990、Pumford et al.
1992 ）やacetoaminophen結合タンパク遺伝子（Bartol
one et al. 1992 、Lanfear et al. 1993 ）と、クロー
ンNo. B1xC4-650 は推定したアミノ酸配列86残基による
ホモロジー検索の結果、Arabidopsis thalianaで単離さ
れているRNA polymerase II second largest subunitを
コードするcDNA（Larkin and Guilfoyle 1993 ）と、ク
ローンNo. B2xB1-650 は種々の植物で報告のあるβ-1,3
-endoglucanaseや-1,3-endoglucosidaseと、クローンN
o. C4xA5-800 は種々の植物で報告されている傷害や病
原菌の感染時に発現するglycinerich タンパクと高い相
同性を示すことが判明した。また、クローンNo. B2xA5-
700 およびクローンNo. C4xA5-750 は類似遺伝子の存在
はなく、全くの新規遺伝子であることが判明した。以
上、６種増幅断片の部分塩基配列によるホモロジー検索
の結果一覧を表２に示す。表２は、イネいもち菌由来の
cerebroside 型エリシターによるスクリーニングで単離
された6 種cDNAのホモロジー検索の結果を示す表であ
る。

【００３９】（表２） cDNA 断片長（bp）相同性のある遺伝子相同性（％） B1xA2-700 706 acetoaminophen binding protein 57 B1XC4-650 747 RNApolymerase II second largest chain 94 B2xA5-700 761 新規遺伝子 - B2xB1-650 724 β-1,3-glucanase 48 C4xA5-800 889 glycine rich protein 47 C4xA5-750 715 新規遺伝子 -

【００４０】実施例５完全長cDNAの単離と塩基配列の決定クローンNo. B1xA2-700 、C4xA5-750 、B2xA5-700 の全
長cDNAを得るために、「Marathon cＤＮＡAmplificatio
n Kit 」（Clontech社製）を用いてクローンNo.B1xA2-7
00、C4xA5-750 、B2xA5-700 の５′側とB2xA5-700 の
３′側の塩基配列を増幅した。本方法はmRNAからcDNAを
合成し、両端にアダプター配列を付加した後に、内部の
既知配列とアダプター配列をプライマーとしたＰＣＲに
よって既知配列の両端の未知のcDNA配列を増幅するもの
である。５′側を増幅するためのアダプタープライマー
としては、いずれの場合も「Marathon cＤＮＡAdaptor
(CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC)」（配列番号：２７）
を用い、B1xA2-700 の既知プライマーは「GCCAGCAGCATT
TCCCTCCTTATCCW」（配列番号：２８）、B2xA5-700 の既
知プライマーは「GCTCCAGCTAAGTGGGTCATGAAGCA」（配列
番号：２９）、C4xA5-750 の既知プライマーは「AGGACG
AGAGCGCGGGAGCTCTATT 」（配列番号：３０）を用いた。
また、B2xA5-700 の３分側増幅にはアダプタープライマ
ーとしては、「Marathon cDNAAdaptor(CCATCCTAATACGAC
TCACTATAGGGC) 」（配列番号：２７）を用い、既知プラ
イマーは「ATTGGCCTCCTCAACTTGAGTCTTG 」（配列番号：
３１）を用いた。鋳型にはcerebroside 型エリシター処
理８時間後のあきたこまちのRNA を用いた。すべての反
応条件はキットのマニュアルに記載の方法で行なった。
増幅された５′側断片と３′側断片をそれぞれ「TOPO T
A CLONING KIT 」（Invitrogen社製）を用いてPCRII TO
POベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。配
列番号：２に両配列を結合したB1xA2-700 遺伝子のcDNA
全塩基配列を示す。配列番号：４に両配列を結合したC4
xA5-750 遺伝子のcDNA全塩基配列を示す。配列番号：６
に両配列を結合したB2xA5-700 遺伝子のcDNA全塩基配列
を示す。

【００４１】さらに各クローンにおいて、５′側断片と
３′側断片の間で重複する領域にある制限酵素サイト
（B1x2-700はHaeII 、C4xA5-750 、B2xA5-700 はBamHI
）で切断し、「ＤＮＡLigation Kit」（タカラ社製）
を用いライゲーション反応によりcDNAのコーディング領
域の全長を一つの断片にクローニングした。なお、クロ
ーニングした遺伝子をそれぞれ「B1xA2-700 」遺伝子、
「C4xA5-750 」遺伝子、「B2xA5-700 」遺伝子と命名し
た。また、それぞれのプラスミドを「p(B1xA2-700)」、
「p(C4xA5-750)」、「p(B2xA5-700)」と命名した。

【００４２】実施例６いもち菌接種による回収断片の発現（ノーザンブロット
解析）回収断片がいもち菌接種によって特異的に発現する遺伝
子に由来するか確認するために、この断片をそれぞれプ
ローブとしてノーザンブロット解析を行なった。イネ品
種あきたこまちに親和性いもち菌（００７）および非親
和性いもち菌（Ｃ３）をそれぞれ50-100胞子/ 顕微鏡10
x10 視野の濃度でスプレー接種した。接種後、０，４，
８，１２，２４時間後にそれぞれのポットから第４、５
葉をそれぞれ採取し、液体窒素で凍結してＲＮＡ調製用
サンプルとした。採集した葉のサンプル約０．５ｇから
グアニジンチオシアネート／塩化セシウム法（Maniatis
et al. 1982）によりトータルＲＮＡを単離した。得ら
れたＲＮＡ２０μｇを１％アガロース・ホルムアミドゲ
ルで電気泳動し、HybondN+メンブラン（アマシャム社
製）に転写した。ハイブリダイゼーションと洗浄は、下
記の通り実施した。即ち、ハイブリダイゼーションは5x
SSC 、１％ブロッキングリージェント（ベーリンガーマ
ンハイム社製）、７％ＳＤＳ、０．０２ｍｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡ中で４２℃、３時間インキュベート後、新し
いハイブリダイゼーション液中に煮沸急冷したプローブ
を５０ｎｇ／ｍｌの濃度になるよう加え、４２℃で一晩
インキュベートした。洗浄は0.1xSSC 、0.1%SDS 液中で
２０分×２回、５５℃で行なった。各回収断片はDIG Nu
cleic acid Detection Kit（ベーリンガーマンハイム社
製）を用いてラベルした。シグナルの検出はGS-250 Mol
ecular Imager （バイオラッド社製）を用い、１〜３日
間感光させた。この結果、クローンNo. B1xA2-700（図
１５）、B1xC4-650 （図１６）、C4xA5-750 （図１７）
は非親和性いもち菌（Ｃ３）接種時に特異的に発現する
ことが判明した。また、クローンNo. B2xA5-700 （図１
８）、 C4xA5-800（図１９）は非親和性いもち菌（Ｃ
３）、親和性いもち菌のいずれにも応答し発現すること
が判明した。

【００４３】実施例７いもち菌接種による回収断片の発現（ＲＴ−ＰＣＲ解
析）回収断片がいもち菌接種によって特異的に発現する遺伝
子に由来するか確認するために、検出感度の高いRT-PCR
解析を行なった。反応に用いたプライマーは実施例４で
使用したプライマーと同様のものを用いた。RT-PCRはmR
NA Selective PCR Kit（タカラ社製）を用いた。1x mRN
A Selective PCR Buffer I, 5mM MgCl₂,1mM dNTP/analo
g mixture, 0.8U/μl RNase Inhibitor, 0.1U/μl AMV
RTaseXL, 0.1U/ μl AMV-Optimized Taq, 1μg Total R
NA, RNase Free dH₂O, センス、アンチセンスプライマ
ーから成る反応溶液を作製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣ
Ｒは５０℃，２５分間加熱しｃＤＮＡ合成後、８５℃，
１分間、５０〜５５℃，１分間、７２℃，１分間を２５
サイクル行ない、その後７２℃で１０分間伸張反応を行
なった。ＲＮＡはいもち菌接種後、０，４，８，１
２，２４時間目に採取したイネ第５葉から調製したもの
を用いた。ＲＮＡ濃度は分光光度計で測定後、ハウスキ
ーピング遺伝子であるアクチン遺伝子（Reece et al. 1
990 ）を用いた増幅により均一であることを確認した。
その結果、クローンNo. B1xA2-700 （図２０）、C4xA5-
750 （図２１）は非親和性いもち菌（Ｃ３）接種時に特
異的に誘導されることが確認された。クローンNo. B2xA
5-700 （図２２）、B2xB1-650（図２３）、C4xA5-800
（図２４）は非親和性いもち菌（Ｃ３）、親和性いもち
菌（００７）接種時の両方で誘導されることを確認し
た。また、対照として、アクチン遺伝子を増幅した結果
を図25に示す。

【００４４】実施例８単離遺伝子のイネへの誘導と解析「B1xA2-700 」遺伝子および「C4xA5-750 」遺伝子につ
いて植物体において恒常的に発現させるためのベクター
を構築した。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロ
モーターをもつイネ発現ベクターpIG121-Hm （Ohta et
al. 1990）を制限酵素XbaIで切断後、Bacterial alkali
ne phosphatase処理を行ない、５′末端を脱リン酸化し
た。これに５′側断片および３′側断片それぞれを含む
PCRII TOPOベクターを制限酵素XbaIと５′側断片と３′
側断片の間で重複する領域にある制限酵素サイト（B1xA
2-700 はHaeII, C4xA5-750はBamHI ）で切断した断片を
ＤＮＡLigation Kit（タカラ社製）でつなぎ、完全長cD
NAを含む発現ベクター「pIG121(B1xA2-700) 」、「pIG1
21(C4xA5-750) 」（図２６）を構築した。

【００４５】これらのプラスミドをアグロバクテリウム
法（Hiei. et al.(1994) Plant J.6:271 ）により、イ
ネ（コシヒカリ、あきたこまち）に導入して形質転換植
物体を得た。アグロバクテリウムは「EHA101」（Hood e
t al.(1986) J. Bacteriol.168:1291）を用いた。選択
薬剤としてはhygromycin（50μg/ml）およびkanamycin
（50μg/ml）を用いた。

【００４６】これら形質転換植物細胞のそれぞれにおい
て、「B1xA2-700 」遺伝子および「C4xA5-750 」遺伝子
の発現と獲得抵抗性が相関していることを確認するため
にＲＴ−ＰＣＲ解析を行なった。ＲＴ−ＰＣＲはmRNA S
elective PCR Kit（タカラ社製）を用いた。1x mRNA Se
lective PCR Buffer I, 5mM MgCl₂, 1mM dNTP/analog
mixture, 0.8U/μl RNase Inhibitor, 0.1U/μl AMV RT
ase XL, 0.1U/ μl AMV-Optimized Taq, 100ng Total R
NA, RNase Free dH₂O,センス、アンチセンスプライマー
から成る反応溶液を作製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ
は５０℃，２５分間加熱しｃＤＮＡ合成後、８５℃，１
分間、５３℃，１分間、７２℃，１分間を２５サイクル
行ない、その後７２℃で１０分間伸張反応を行なった。
ＲＮＡは形質転換後培養中のカルス状を用い、ISOGEN
（ニッポンジーン社製）によりメーカープロトコールに
従い調製した。プライマーは、「B1xA2-700 」遺伝子は
「CAGTTCTTGCCATGGTGATC」（配列番号：１３）と「ACCA
TGTTGCTTGTCAGAGC」（配列番号：１４）を「C4xA5-750
」遺伝子は「GGAAATGCTTGGAACGGCAACCACA 」（配列番
号：２３）と「AACAGCTCGGAGTACCGCAAGTCGC 」（配列番
号：２４）を用いた。解析の結果、それぞれの形質転換
植物細胞において当該遺伝子が過剰に発現していること
が判明した（図２７）。

【００４７】

【発明の効果】本発明により、植物に獲得抵抗性を付与
するタンパク質、当該タンパク質をコードするＤＮＡ、
当該ＤＮＡを含むベクター、当該ベクターを保持する植
物細胞、当該植物細胞を含む植物体が提供される。本発
明によれば、広い種類の病原菌に対する抵抗性を植物に
付与することも可能であり、例えば、生産性の向上と収
量の安定化、農薬使用量の低減化とそれによる生産コス
トと労働時間の低減化や環境に対する負荷の削減に効果
があると期待される。また、耐病性であるために有機栽
培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収
量が確保できると考えられる。

【００４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Plant Biological Defense System Laboratories <120> Disease resistance gene <130> SP-111201 <160> 31 <210> 1 <211> 457 <212> PRT <213> Oriza sativa <400> 1 Met Glu Lys Gly Pro Arg Glu Lys Leu Leu Tyr Val Thr Cys Val Tyr 1 5 10 15 Asn Gly Thr Gly Ile Asn Lys Pro Asp Tyr Leu Gly Thr Val Asp Val 20 25 30 Asp Pro Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Gln Val Ile His Arg Leu Pro Val 35 40 45 Thr His Val Gly Asp Glu Leu His His Ser Gly Trp Asn Ala Cys Ser 50 55 60 Ser Cys His Gly Asp Pro Ser Ala Ser Arg Arg Phe Leu Ile Leu Pro 65 70 75 80 Ser Leu Leu Ser Gly Arg Val Tyr Val Val Asp Thr Leu Lys Asp Pro 85 90 95 Arg Ala Pro Ala Leu His Lys Val Val Glu Ala Glu Asp Ile Ala Glu 100 105 110 Lys Thr Gly Leu Gly Phe Pro His Thr Ser His Cys Leu Ala Ser Gly 115 120 125 Glu Ile Met Ile Ser Cys Leu Gly Asp Lys Glu Gly Asn Ala Ala Gly 130 135 140 Asn Gly Phe Leu Leu Leu Asp Ser Glu Phe Asn Val Lys Gly Arg Trp 145 150 155 160 Glu Lys Pro Gly His Ser Pro Leu Phe Gly Tyr Asp Tyr Trp Tyr Gln 165 170 175 Pro Arg His Lys Thr Met Ile Ser Ser Ser Trp Gly Ala Pro Ala Ala 180 185 190 Phe Arg Thr Gly Phe Asp Leu Gln His Val Gln Asp Gly Leu Tyr Gly 195 200 205 Arg His Leu His Val Tyr Asp Trp Pro Gly Gly Glu Leu Lys Gln Thr 210 215 220 Leu Asp Leu Gly Ser Thr Gly Leu Leu Pro Leu Glu Val Arg Phe Leu 225 230 235 240 His Asp Pro Ser Lys Asp Thr Gly Tyr Val Gly Cys Ala Leu Thr Ser 245 250 255 Asn Met Val Arg Phe Phe Lys Thr Ala Asp Gly Ser Trp Ser His Glu 260 265 270 Val Ala Ile Ser Ile Lys Pro Leu Lys Val Arg Asn Trp Ile Leu Pro 275 280 285 Glu Met Pro Gly Leu Ile Thr Asp Phe Val Ile Ser Leu Asp Asp Arg 290 295 300 Tyr Leu Tyr Leu Val Asn Trp Leu His Gly Asp Ile Arg Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Ile Glu Asp Pro Ala Lys Pro Val Leu Ala Gly Gln Val Trp Ala Gly 325 330 335 Gly Leu Leu Gln Lys Gly Ser Glu Val Val Tyr Val Thr Glu Asp Asp 340 345 350 Lys Glu Glu Gln Tyr Ser Val Pro Gln Val Lys Gly His Arg Leu Arg 355 360 365 Gly Xaa Pro Gln Met Ile Gln Leu Ser Leu Asp Gly Lys Arg Ile Tyr 370 375 380 Val Thr Asn Ser Leu Phe Ser Arg Trp Asp Glu Gln Phe Tyr Gly Gln 385 390 395 400 Asp Leu Val Lys Lys Gly Ser His Met Leu Gln Ile Asp Val Asp Thr 405 410 415 Glu Lys Gly Gly Leu Ser Ile Asn Pro Asn Phe Phe Val Asp Phe Gly 420 425 430 Ala Glu Pro Glu Gly Pro Ser Leu Ala His Glu Met Arg Tyr Pro Gly 435 440 445 Gly Asp Cys Thr Ser Asp Ile Trp Ile 450 455

【００４９】 <210> 2 <211> 1737 <212> DNA <213> Oriza sativa <400> 2 gtagaaatga gtcatactat tgggatggag aaactgcaag atcgcttggc tgaagagtct 60 gagatgtgct gaggtgaagg cattaggggg tctccatgta ataggaactt ctttgcgcga 120 cggggccagg gtacgcgacg ccgctggagg ccatggagaa gggcccgagg gagaagctcc 180 tctacgtcac ctgcgtctac aacggtactg gaattaacaa gccggattac ctgggtacgg 240 tggacgtgga ccccaattcc cctacatact cccaagtgat ccacaggctc ccagtcaccc 300 atgtcggcga tgagctgcat cactctggat ggaacgcttg cagttcttgc catggtgatc 360 catcggctag ccgccgtttc ttgattctgc cttcgttgct gtctggccgt gtgtatgtcg 420 ttgacacgct gaaggaccca agggcgcctg ccttgcataa ggtggtcgag gctgaggaca 480 ttgctgagaa gacagggctt ggatttcctc atacatctca ttgcctggca tctggggaga 540 taatgatttc ttgccttggg gataaggagg gaaatgctgc tggcaatggc ttcctcctgc 600 tggattctga attcaatgtc aaaggacgtt gggaaaagcc aggtcacagc cccttgtttg 660 gctatgatta ttggtatcaa cctcgtcaca agacaatgat cagttcatca tggggagcac 720 ctgcagcttt caggactggt tttgatcttc agcatgtgca ggatggtctc tatggaagac 780 atctgcacgt gtatgactgg cctggtggtg agctcaagca gacactagat ttaggcagta 840 caggtcttct tccacttgag gtgaggtttt tacatgatcc atcaaaggat actgggtatg 900 tgggctgtgc tctgacaagc aacatggtca gatttttcaa gactgcagat ggatcatgga 960 gccatgaggt tgctatatct ataaaaccat tgaaagtgcg caactggatt ctgcctgaaa 1020 tgccaggact gataactgat tttgttatct ctctggatga tcgctatctc tacttggtca 1080 actggcttca tggtgatatc aggcagtaca acatcgagga ccctgcgaag cctgtgttgg 1140 ctggacaagt atgggcagga ggccttcttc aaaagggcag tgaggttgtg tatgtaactg 1200 aggatgacaa agaagagcag tacagtgtgc cccaggtcaa gggtcatcga cttagaggtg 1260 ggccacagat gattcagctg agcctggatg ggaagaggat atatgtgacc aactctcttt 1320 tcagccgatg ggacgagcag ttctatggcc aagatcttgt caagaagggc tcccacatgt 1380 tgcagatcga cgtcgacact gagaaaggag gactatcgat caaccctaac ttctttgtag 1440 attttggtgc tgagccagag ggtccctcct tggcccatga gatgagatat cctggtggag 1500 attgcacctc tgatatatgg atataaagat cttgaaggat ttgcatacac tcaggtgttg 1560 attcatcctg tgtattcact gtaactaaga ctgtatgctt gctgtggtct atatgtaatt 1620 tcgatggtaa caagtcccca taatacctag aacattcact ccatggctca tttggtaaca 1680 ttagcttaat aaagagatgt atccaatggt gcactttctg ctaaaaaaaa aaaaaaa 1737

【００５０】 <210> 3 <211> 354 <212> PRT <213> Oriza sativa <400> 3 Met Gly Val Gly Gly Glu Lys Phe Gln Leu Gly Thr Val Gly Ala Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ser Val Val Ser Ser Val Ser Ile Val Ile Cys Asn Lys Ala 20 25 30 Leu Met Ser Ser Leu Gly Phe Asn Phe Ala Thr Thr Leu Thr Ser Trp 35 40 45 His Leu Leu Val Thr Phe Cys Ser Leu His Val Ala Leu Trp Met Lys 50 55 60 Phe Phe Glu His Lys Pro Phe Asp Ser Arg Thr Val Met Gly Phe Gly 65 70 75 80 Val Leu Asn Gly Ile Ser Ile Gly Leu Leu Asn Leu Ser Leu Gly Phe 85 90 95 Asn Ser Val Gly Phe Tyr Gln Met Thr Lys Leu Ala Ile Ile Pro Cys 100 105 110 Thr Val Ile Leu Glu Thr Leu Phe Phe Arg Lys Lys Phe Ser Arg Ser 115 120 125 Ile Gln Leu Ser Leu Ser Val Leu Leu Phe Gly Val Gly Val Ala Thr 130 135 140 Val Thr Asp Leu Gln Leu Asn Ala Val Gly Ser Val Leu Ser Ser Leu 145 150 155 160 Ala Ile Ile Thr Thr Cys Ile Ala Gln Ile Met Thr Asn Thr Ile Gln 165 170 175 Lys Lys Phe Lys Val Ser Ser Thr Gln Leu Leu Tyr Gln Ser Cys Pro 180 185 190 Tyr Gln Ser Leu Thr Leu Phe Leu Ile Gly Pro Phe Leu Asp Gly Phe 195 200 205 Leu Thr Asn Gln Asn Val Phe Ala Phe Asp Tyr Thr Ser Gln Val Val 210 215 220 Phe Phe Ile Val Leu Ser Cys Leu Ile Ser Val Ser Val Asn Phe Ser 225 230 235 240 Thr Phe Leu Val Ile Gly Lys Thr Ser Pro Val Thr Tyr Gln Val Leu 245 250 255 Gly His Leu Lys Thr Cys Leu Val Leu Ile Phe Gly Tyr Val Leu Leu 260 265 270 His Asp Pro Leu Ser Trp Arg Asn Ile Leu Gly Ile Leu Ile Ala Val 275 280 285 Val Gly Met Val Leu Tyr Ser Tyr Phe Cys Thr Leu Glu Gly Gln Gln 290 295 300 Lys Asn Ala Glu Val Ser Pro Gln Gln Ala Lys Glu Gly Asp Ser Ala 305 310 315 320 Pro Leu Ile Ser Asp Ser Leu Ser Lys Val Glu Asn Gly Gly Gly Val 325 330 335 Val Asp Asp Glu Pro Leu Lys Val Pro Met Trp Ser Ser Lys Tyr Ser 340 345 350 Arg Ala

【００５１】 <210> 4 <211> 1646 <212> DNA <213> Oriza sativa <400> 4 cggaggagga ggagatgggt gtcggcgggg agaagttcca gctggggacg gtgggggcgc 60 tgagcctctc cgtggtgtca tccgtctcca ttgtcatctg caacaaggcg ctcatgagct 120 ccctcggctt caactttgcc actaccttga cgagttggca tcttcttgtc acattttgct 180 ccctccatgt agcattatgg atgaagttct tcgagcacaa gcctttcgac tcgagaactg 240 tcatgggatt tggagtgctc aatggcatct ccattggcct cctcaacttg agtcttggtt 300 ttaattctgt tggattttac cagatgacaa agctggctat catcccatgc actgttattt 360 tggagactct tttcttcagg aagaagttca gccggagtat ccaactgtcc ctttcagtgc 420 tcctctttgg tgtcggtgtt gcaacagtga ctgatctgca actcaatgct gtgggatccg 480 tattgtcctc gctggcaatt attacaacct gcatcgcgca aattatgaca aacactatcc 540 agaagaagtt caaggtttct tcaacccaat tattatacca atcttgcccc tatcaatcac 600 tgaccctctt ccttattggt ccattccttg atggattttt gactaaccaa aatgtatttg 660 cattcgacta cacatcccaa gttgtgtttt tcattgtatt atcgtgcttg atatctgtct 720 cagtgaactt cagcactttc cttgtgatcg gaaagacttc tcctgtcact taccaagtcc 780 tgggccatct taaaacatgc ctagtactga tttttggtta tgttttgctt catgacccac 840 ttagctggag aaacatactc ggcatcctaa ttgcagtagt tggaatggtc ttatactcat 900 acttctgcac attggagggc cagcaaaaaa acgccgaagt ctccccacaa caggcgaaag 960 aaggcgattc ggctcctttg atctcagact ctctgagcaa agttgagaat ggaggtggag 1020 tggttgatga tgagcctctc aaggtaccga tgtggagctc aaagtactca agggcgtgaa 1080 aataccttcc ttttagaagg cggcattata caggattcaa tttggtaggc ggatagtagg 1140 gttggaagcc aacccagatt gtaatgaaca ttccagttac atttttgggt ttatttaaca 1200 ttactatcta gtatctacta gcagtaaaag ggttcttggg aggattttac cttcaagata 1260 gcagatctgc ccttgaaact tagacaacag atattgtatg attgtatctg gatatgctcc 1320 acatctttct cactgtaact tcctatggga acatagatcc acagatagac ttcattcttt 1380 tgtaccaaag atccagagaa ctagagatct gcaaggttca agtttgtgac tgtaagttta 1440 tgtttacttt ggacccagtg atggagcttt tgtatattta ggaccaagtg caaagagggg 1500 ttcttttcca acaagttttc aatgcaataa catggtacaa ttgttgtgtt caatcatgta 1560 atttcccatg ttcaaaacaa tatttttggc tgagtgaatc gaatgccgca tgaaccgatt 1620 gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1646

【００５２】 <210> 5 <211> 714 <212> PRT <213> Oriza sativa <400> 5 Met Thr Pro Thr Val Leu Met Glu Phe Gly Gln Gln Arg Gln Ile Lys 1 5 10 15 Arg Gly Tyr Asp Glu Met Ala Phe Arg Gly Met Ala Ser Ala Ala Pro 20 25 30 Arg Gly Tyr Ala Glu Thr Val Gly Glu Ser Glu Gly Ala Ala Gly Ser 35 40 45 Pro Val Arg Val Asp Ser Glu Asp Ser Ser Ala Pro Lys Arg Lys Cys 50 55 60 Ile Ser Leu Asn Ser Asp Gly Phe Asp Val Lys Arg Glu Ile Phe Val 65 70 75 80 Pro Ala Lys Met Ser Ser Ser Glu Arg Arg His Leu Arg Lys Arg Phe 85 90 95 Arg Thr Glu Leu Asp Ser Val Arg Asn Leu Leu Lys Lys Pro Glu Phe 100 105 110 Ala Val Pro Val Pro Val Asn Arg Ala Pro Ala Leu Ser Ser Ser Ala 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Lys Lys Gly Gln Arg Gly Asn His Val Val Arg Gly 130 135 140 Ala Lys Gly Arg Phe Leu Pro Thr Lys Pro Arg Pro Glu Ala Ser Thr 145 150 155 160 Val Leu Thr Glu Asp Ala Ile Phe Lys Gln Cys Asp Ala Ile Leu Lys 165 170 175 Lys Leu Met Thr Gln Lys Cys Ser Asn Ile Phe Asp Ser Pro Val Asp 180 185 190 Ala Val Lys Leu Asn Ile Pro Asp Tyr Phe Gln Ile Ile Lys Lys Pro 195 200 205 Met Asp Leu Gly Thr Ile Arg Asn Lys Leu Asp Ser Gly Ser Tyr Thr 210 215 220 Ser Pro Ser Glu Phe Ala Ala Asp Val Arg Leu Thr Phe Ser Asn Ala 225 230 235 240 Met Thr Tyr Asn Pro Arg Gly His Val Val His Asp Tyr Ala Ile Gln 245 250 255 Leu Asn Lys Met Phe Glu Ser Arg Trp Arg Thr Ile Glu Lys Lys Leu 260 265 270 Ala Ser Ile Ala Thr Glu Ala His Val Glu Val Asp Arg Ala Asp Ser 275 280 285 Lys Arg Arg Lys Thr Pro Pro Val Asp Cys Ser Glu Val Ser Thr Glu 290 295 300 Cys Val Arg Pro Thr Glu Ser Val Arg Pro Thr Glu Ser Val Lys Pro 305 310 315 320 Lys Met Thr Phe Glu Glu Lys Glu Ser Phe Gly Asn Cys Leu Ala Ser 325 330 335 Leu Ser Glu Asp Pro Glu Val Pro Ser His Ile Ile Asp Leu Leu Gln 340 345 350 Gln Cys Ile Asp Asn Asn Thr Asp Gln Leu Gly Asp Gly Glu Ile Glu 355 360 365 Ile Asp Ile His Ala Val Ser Asp Asp Leu Leu Phe Glu Leu Lys Lys 370 375 380 His Val Asp Lys Tyr Leu Gln Glu Arg Glu Gln Ser Gln Gln Ala Lys 385 390 395 400 Ser Glu Pro Ser Glu Asn Glu Ala Ala Asn Val Ser Gly Leu Ser His 405 410 415 Ser Ser Thr Asn Pro Cys Lys Gly Gly Asp Pro Val Glu Glu Asp Val 420 425 430 Asp Ile Cys Gly Asn Ala Ser Pro Ile Leu Ile Glu Lys Asp Ala His 435 440 445 Asn Asn Pro Asn Lys Cys Gly Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser 450 455 460 Gly Ser Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ser Gly Ser Asp Ser Glu Ser Glu 465 470 475 480 Gln Glu Lys Gly Gly Ser Pro Gly Lys Pro Lys Gly Ser Lys Arg Ser 485 490 495 Glu Gln Leu Val Glu Gln Glu Lys Ser Asp Val Ile Ser Pro Val Asp 500 505 510 Ala Ile Arg Pro Ala Asp Asp Val Glu Leu Arg Glu Gln Asp Asn Glu 515 520 525 Ser Lys Pro Ala Pro Glu Gly Glu Asn Ser Lys Pro Asp Arg Gln Val 530 535 540 Ser Pro Asp Lys Leu Leu Arg Thr Ala Phe Leu Arg Ser Arg Tyr Ala 545 550 555 560 Asp Val Ile Val Lys Ala Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Gly Asp Lys 565 570 575 Gln Glu Glu Leu Glu Lys Leu Gln Lys Glu Glu Lys Ala Arg Leu Leu 580 585 590 Ala Glu Gly Asn Ala Ala Met Glu Ala Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala 595 600 605 Glu Ala Lys Arg Lys Arg Asp Leu Glu Arg Glu Lys Ala Arg Gln Ala 610 615 620 Leu Gln Glu Met Glu Arg Thr Val Glu Ile Asn Asp Asn Leu His Leu 625 630 635 640 Lys Asp Leu Glu Met Leu Gly Thr Ala Thr Thr Glu His Ile Val Ser 645 650 655 Ser Val Asp Glu Thr Ser Pro Glu His Ser Gln Asp Gly Met Pro Ser 660 665 670 Phe Leu Pro Gly Ser Gly Asn Pro Leu Glu Gln Leu Gly Leu Phe Met 675 680 685 Lys Ala Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Pro Ser Cys Val Pro Ser 690 695 700 Thr Lys Asp Ala Glu Glu Gly Glu Ile Asn 705 710

【００５３】 <210> 6 <211> 2927 <212> DNA <213> Oriza sativa <400> 6 tggggttcga attcgaatta ggtctaggtg tgggattagg gtttttggag ggaacttttt 60 gaatacgttt tgtgtttctg ttgttctctt acatcaagct gtacgggaag ttcaaatttg 120 gcatttgatt ccgctaagtt caagtttccc ttccgcgtga ctgaatcttg ggtctcttat 180 ggttgtcaat ggtgaacaga tctggcgccc gggcacatga caccgacggt cctcatggag 240 tttgggcagc aaaggcagat taagcggggc tacgatgaaa tggcgttccg gggcatggcg 300 tcagcggcgc cacggggtta cgcggagacc gttggcgagt cggagggcgc ggcaggcagc 360 cccgttcgtg ttgactccga ggactcttcg gcccccaagc gcaagtgcat cagcctaaac 420 agcgacggct tcgatgtcaa gcgggagatt ttcgtcccag ccaagatgtc ctcctccgag 480 aggaggcatc tccggaagag gttccgcaca gagcttgatt cggtccggaa tctcctcaag 540 aagccggagt ttgctgtccc tgtccctgtc aatagagctc ccgcgctctc gtcctcggct 600 gcccctcgag gtaagaaggg acagcgtggt aaccatgtgg tccgtggtgc caaggggcgt 660 ttcttgccta caaagccccg acctgaggct tccacggtgt tgactgagga tgcgattttt 720 aagcaatgcg atgctattct gaaaaagctg atgactcaga aatgtagtaa catattcgac 780 tccccggttg atgctgttaa gctgaatatt ccagattatt ttcaaatcat caagaaaccg 840 atggatcttg gaactatcag gaataagctt gactctggtt cctacacgag tccatctgaa 900 tttgcagccg atgtacggct gaccttttca aatgcgatga cttacaatcc tcgtgggcat 960 gtagtgcatg attatgccat tcaactaaac aagatgtttg aatcaagatg gaggacaatt 1020 gaaaagaagc tggcttccat tgccacagag gcgcacgtcg aggttgacag ggctgactca 1080 aagaggagga agactccccc tgtggactgc agtgaggtgt caacagagtg tgtgaggcca 1140 acagagtctg ttagaccaac agagtctgta aagccaaaaa tgacattcga ggagaaagaa 1200 tcatttggga actgtttggc atctttgtct gaggatccgg aggtaccttc acacatcatt 1260 gatttgttgc agcaatgcat tgacaacaac acagatcagc ttggtgatgg agagatagag 1320 attgatatcc atgctgtcag tgatgaccta ctattcgagt tgaagaaaca tgttgacaag 1380 tatttgcaag agagagagca gagccagcag gcaaaatctg agccttctga gaatgaggct 1440 gctaatgtat ctggccttag ccactcctct acaaatccct gcaaaggtgg tgatccagtt 1500 gaggaggatg tagatatttg cgggaatgca tcccctatat tgatagaaaa agatgcacac 1560 aacaatccta acaagtgtgg tagcccaagt agttccagca gtgactctgg atcttcttcc 1620 agcgattctg agtcgggcag tgacagtgaa agcgaacaag aaaaaggtgg tagcccagga 1680 aagccgaagg gaagtaagag atctgaacaa ctggtggagc aagaaaagag tgatgttata 1740 agtccagtcg atgccatccg tcctgctgat gatgtggagc tccgtgagca ggataacgag 1800 tcaaagcctg ccccagaggg ggagaattca aaacccgaca ggcaagtctc cccagacaag 1860 ctcttaagaa cagccttcct taggagtcgt tatgctgatg tgattgttaa ggcacagggg 1920 attctcagcc agggtggaga caaacaggag gagctggaaa agctccagaa ggaagagaaa 1980 gcaaggctgt tggctgaagg aaatgcagct atggaagctc gaagagctga agctgaagct 2040 gaagccaagc gtaaacggga ccttgagagg gagaaagctc gccaggccct gcaggagatg 2100 gagagaacgg tggaaatcaa tgacaacctc catctaaagg atttggaaat gcttggaacg 2160 gcaaccacag aacatattgt gagttctgtt gatgagacta gtcctgagca ttcccaggat 2220 ggcatgccca gttttcttcc tggatcaggc aatccattgg aacagctggg actcttcatg 2280 aaagcagatg aggaggaaga ggaagaagat cctagctgtg tccccagcac taaagatgca 2340 gaggaaggag agatcaacta gtcccagtgc ttgtgggcta gttgctgaat tagctgtgca 2400 tatggtagac gctccttcct tctgcttcca aactagctcg aacaaggccc tcaattttga 2460 tgctgctgga tgtcgtaaat tatgcgcctg gagtatcgcg gtaacctgcc ctacaaatca 2520 tcatatgtgc ttggaggacg gcacagccat aatggccgcg acttgcggta ctccgagctg 2580 ttgtcgtgtg tatgtatgta gccatctttg aagtgccatg gccaggccgc aaggtgggta 2640 agcaatgaga ggaccaaatg gttctttgta catagtgaat tagtgatcca ggtgctaaag 2700 ctcccagcgg caaaaggtgt tgcccagcgg cttatagatt tttcgttcgt tcgttctcta 2760 gttttcggtt tgtccaattg cttcctgctg taaattctaa ttttgatgta gtggaggaag 2820 cgatagttgt ttgctgggca tactgggcaa agtaggaaaa agcttctgct tttcttgttt 2880 acagggaaaa aaaaagaaaa ttcaatgcgt caaaaaaaaa aaaaaaa 2927

【００５４】 <210> 7 <211> 706 <212> DNA <213> Oriza sativa <400> 7 aatctagagc tccagcagac actagattta ggcagtacag gtcttcttcc acttgaggtg 60 aggtttttac atgatccatc aaaggatact gggtatgtgg gctgtgctct gacaagcaac 120 atggtcagat ttttcaagac tgcagatgga tcatggagcc atgaggttgc tatatctata 180 aaaccattga aagtgcgcaa ctggattctg cctgaaatgc caggactgat aactgatttt 240 gttatctctc tggatgatcg ctatctctac ttggtcaact ggcttcatgg tgatatcagg 300 cagtacaaca tcgaggaccc tgcgaagcct gtgttggctg gacaagtatg ggcaggaggc 360 cttcttcaaa agggcagtga ggttgtgtat gtaactgagg atgacaaaga agagcagtac 420 agtgtgcccc aggtcaaggg tcatcgactt agaggtgggc cacagatgat tcagctgagc 480 ctggatggga agaggatata tgtgaccaac tctcttttca gccgatggga cgagcagttc 540 tatggccaag atcttgtcaa gaagggctcc cacatgttgc agatcgacgt cgacactgag 600 aaaggaggac tatcgatcaa ccctaacttc tttgtagatt ttggtgctga gccagagggt 660 ccctccttgg cccatgagat gagatatcct ggtggagatt gcacctctga tatatggata 720 taaagatctt gaaggatttg catacactca ggtgttgatt catcctgtgt attcactgta 780 actaagactg tatgcttgct gtggtctata tgtaatttcg atggtaacaa gtccccataa 840 tacctagaac attcactcca tggctcattt ggtaacatta gcttaataaa gagatgtatc 900 caatggtgca ctttctgcta aaaaaaaaaa aaaa 934

【００５５】 <210> 8 <211> 761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 aatctagagc tccctccaat gtgcagaagt atgagtataa gaccattcca actactgcaa 60 ttaggatgcc gagtatgttt ctccagctaa gtgggtcatg aagcaaaaca taaccaaaaa 120 tcagtactag gcatgtttta agatggccca ggacttggta agtgacagga gaagtctttc 180 cagtcacaag gaaagtgctg aagttcactg agacagatat caagcacgat aatacaatga 240 aaaacacaac ttgggatgtg tagtcgaatg caaatacatt ttggttagtc aaaaatccat 300 caaggaatgg accaataagg aagagggtca gtgattgata ggggcaagat tggtataata 360 attgggttga agaaaccttg aacttcttct ggatagtgtt tgtcataatt tgcgcgatgc 420 aggttgtaat aattgccagc gaggacaata cggatcccac agcattgagt tgcagatcag 480 tcactgttgc aacaccgaca ccaaagagga gcactgaaag ggacagttgg atactccggc 540 tgaacttctt cctgaagaaa agagtctcca aaataacagt gcatgggatg atagccagct 600 ttgtcatctg gtaaaatcca acagaattaa aaccaagact caagttgagg aggccaatgg 660 agatgccatt gagcactcca aatcccatga cagttctcga gtcgaaaggc ttgtgctcga 720 agaacttcat ccataatgct acatggaggg agctctagat t 761

【００５６】 <210> 9 <211> 715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 aatctagagc tccctccact acatcaaaat tagaatttac agcaggaagc aattggacaa 60 accgaaaact agagaacgaa cgaacgaaaa atctataagc cgctgggcaa caccttttgc 120 cgctgggagc tttagcacct ggatcactaa ttcactatgt acaaagaacc atttggtcct 180 ctcattgctt acccaccttg cggcctggcc atggcacttc aaagatggct acatacatac 240 acacgacaac agctcggagt accgcaagtc gcggccatta tggctgtgcc gtcctccaag 300 cacatatgat gatttgtagg gcaggttacc gcgatactcc aggcgcataa tttgcgacat 360 ccagcagcat caaaattgag ggccttgttc gagctagttt ggaagcagaa ggaaggagcg 420 tctaccatat gcacagctaa ttcagcaact agcccacaag cactgggact agttgatctc 480 tccttcctcc gcatctttag tgctggggac acagctagga tcttcttcct cttcctcctc 540 atctgctttc atgaagagtc ccagctgttc caatggattg cctgatccag gaagaaaact 600 gggcatgcca tcctgggaat gctcaggact agtctcatca acagaactca caatatgttc 660 tgtggttgcc gttcctagca tttccaaatc ctttagatgg agggagctct agatt 715

【００５７】 <210> 10 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ccacacgcgc acacgggata tatataactc gaggatgtgg cctactgact gctttctgcc 60 tcagggggtc agaccgctaa gcccaagtta gatttaagta ttgactatga acgaagacat 120 agtacgacaa gcgagtgccc catgtaatat ttggtctcaa cgtttcttct gatccttccc 180 agttttgtta tcctgagtga gcatcctggg agcgatggcc atcgccataa gctcctggaa 240 cagaagctta cacgcgtagg gtatatgcac ttggacaatg tcggttttgt tcttgcaccc 300 tctgcactca aaggaattct tcttgagatt agcaatagca ataagcccac acttctcgca 360 tacatggact ctgtacgcat cactctggtc aaataacctt tccttaagga aaaatgcagc 420 gccatgagca atcatacagt ccctctccat ctctccaaac cggagaccac catcgcgtga 480 gcgcccctcc gcaggttgtc tggtaagtat ctgcacagga ccacggcctc tagagtgaat 540 cttgtcatcc accatgtgct taagtctctg gtaataagta ggaccaagga aaatcatggc 600 agttaatttt cttccagtgt gaccgttgta catggtctcg aatccacgca tctgataacc 660 acatttatga agtgctttgc tgatgttatc cacagtaaca tcagtgaaag gagttgcatc 720 tccttctttt cccgtgtgcg cgtgtgg 747

【００５８】 <210> 11 <211> 724 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cttgtacgcg tgtgcgaccc aaacaccaac ctctcctacg acaacatgct gtacgcgcag 60 atcgacgccg tgtacgcggc catgaaggcc atggggcaca cggacatcgg cgtgaggatc 120 tccgagaccg ggtggccgtc caagggggac gaggacgagg ccggcgccac cgtggagaac 180 gccgcggcgt acaacggcaa cctgatgcag cggatcgcca tgaaccaggg gacaccgctc 240 aagcccaacg tgcccatcga cgtgttcgtg ttcgcgctgt tcaacgagga catgaaaccc 300 gggccgacct cggagcgtaa ctacggtctc ttctacccca acggctcgcc ggtttacgcc 360 atcaacaccg gcgccggtgg cgtgtcaggg cggacggggc cgttcgaccc gtactcggcg 420 cagatgttct cgtcggcgtc cagattggcg atgacgtctg ggatgggggt agttgtccta 480 ctcggcgcat tattcctctg agcttcctcc acacgtacca cgcagcagag aaagaaagtc 540 ccacgactga acgaatgatt gggggtggtt cgcttctgac taacgcatcc agcagtctct 600 gagttgtcat ttcattcaga gccggccgat tgcatgtgtt cgtcctgaca gcaaggagac 660 tgagaattta tactagttct gaatggacat cgagatcttt actatagtcg cacacgcgta 720 caag 724

【００５９】 <210> 12 <211> 889 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 ccacacgcgc acacgggagg atgaggaact atatcagcta tgggatgtcg ttgcttgagg 60 aaaatgggca tgatgagatt gtcatcaaag ctatgggaag agccatcaat aagacagtca 120 tggttgttga attgatcaag agaaagatcg gtggtcttca tcagattaca tctactgaat 180 caattgacat cacggacact tgggaacctt tggaagaagg ccttctcccc ctagagacca 240 cctggcatgt atcaatgatc gccataacat tatccaagaa agcactggat acgttatctc 300 cagggtacca gccacctatc ccagctgaag aagtgagacc cgcttttgac tatgaacacg 360 aagaatcttt ccccactaat cgtggaagag gccgtggtgg tggcagaaga ggcaggggca 420 gagccatgag caatggtccc cccgcttatg actatggcga ggagtgggaa gaggaaggag 480 attattacaa ctacagaggc agagggagag gccgatttag aggacgagga cgtggaagag 540 gccgtggtgg ctactacgga ggtggtcgac gtggtggata tggctatgat tacggttatg 600 gcggcagggg ggactattat gaagatcagg gcgaatactt tgaagaacca gaggactacc 660 cccctccagg ccgtggacgt ggcaggggaa gaaggggcgg aggaccggga ccattccgtg 720 gttcgcgccc gtgggcgtgg tcgattctaa gatgaaatca ggaggaggtg cccttgaagc 780 ttgagaactc gtgtgcttaa attatctgat aatgctgttc tgtatggggg tttcgacatg 840 aatccgtatg ccccatcagt atgtttttac ttcccgtgtg cgcgtgtgg 889

【００６０】 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 cagttcttgc catggtgatc 20

【００６１】 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 accatgttgc ttgtcagagc 20

【００６２】 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 atagtacgac aagcgagtgc 20

【００６３】 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 aagattcact ctagaggccg 20

【００６４】 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 tgcttcatga cccacttagc tggaga 26

【００６５】 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 acagtgagaa agatgtggag cat 23

【００６６】 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 gactttcttt ctctgctgcg 20

【００６７】 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 gctgttcaac gaggacat 18

【００６８】 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 cacttgggaa cctttggaag 20

【００６９】 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 catcttagaa tcgaccacgc 20

【００７０】 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 ggaaatgctt ggaacggcaa ccaca 25

【００７１】 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 aacagctcgg agtaccgcaa gtcgc 25

【００７２】 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 ggtgatggtg tcagccacac tgt 23

【００７３】 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 26 gctgctagga gcaaggcagt gat 23

【００７４】 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 27 ccatcctaat acgactcact atagggc 27

【００７５】 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 28 gccagcagca tttccctcct tatccc 26

【００７６】 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 29 gctccagcta agtgggtcat gaagca 26

【００７７】 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 30 aggacgagag cgcgggagct ctatt 25

【００７８】 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 31 attggcctcc tcaacttgag tcttg 25

【図面の簡単な説明】

【図１】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理により誘導されたファイトアレキシン量の結果を示す
図である。

【図２】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「B1xA2-700 」の発現をノーザンブロッティン
グにより解析した結果を示すイメージアナライザーの像
である。

【図３】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「B1xC4-650 」の発現をノーザンブロッティン
グにより解析した結果を示すイメージアナライザーの像
である。

【図４】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「B2xA5-700 」の発現をノーザンブロッティン
グにより解析した結果を示すイメージアナライザーの像
である。

【図５】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「B2xB1-650 」の発現をノーザンブロッティン
グにより解析した結果を示すイメージアナライザーの像
である。

【図６】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「C4xA5-800 」の発現をノーザンブロッティン
グにより解析した結果を示すイメージアナライザーの像
である。

【図７】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「C4xA5-750 」の発現をノーザンブロッティン
グにより解析した結果を示すイメージアナライザーの像
である。

【図８】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「B1xA2-700 」の発現をRT-PCRにより解析した
結果を示す電気泳動の像である。

【図９】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター処
理による「B1xC4-650 」の発現をRT-PCRにより解析した
結果を示す電気泳動の像である。

【図１０】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター
処理による「B2xA5-700 」の発現をRT-PCRにより解析し
た結果を示す電気泳動の像である。

【図１１】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター
処理による「B2xB1-650 」の発現をRT-PCRにより解析し
た結果を示す電気泳動の像である。

【図１２】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター
処理による「C4xA5-800 」の発現をRT-PCRにより解析し
た結果を示す電気泳動の像である。

【図１３】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター
処理による「C4xA5-750 」の発現をRT-PCRにより解析し
た結果を示す電気泳動の像である。

【図１４】イネいもち菌由来cerebroside 型エリシター
処理によるアクチン遺伝子の発現をRT-PCRにより解析し
た結果を示す電気泳動の像である。

【図１５】イネいもち菌接種による「B1xA2-700 」の発
現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す
イメージアナライザーの像である。

【図１６】イネいもち菌接種による「B1xC4-650 」の発
現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す
イメージアナライザーの像である。

【図１７】イネいもち菌接種による「C4xA5-750 」の発
現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す
イメージアナライザーの像である。

【図１８】イネいもち菌接種による「B2xA5-700 」の発
現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す
イメージアナライザーの像である。

【図１９】イネいもち菌接種による「C4xA5-800 」の発
現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示す
イメージアナライザーの像である。

【図２０】イネいもち菌接種による「B1xA2-700 」の発
現をRT-PCRにより解析した結果を示す電気泳動の像であ
る。

【図２１】イネいもち菌接種による「C4xA5-750 」の発
現をRT-PCRにより解析した結果を示す電気泳動の像であ
る。

【図２２】イネいもち菌接種による「B2xA5-700 」の発
現をRT-PCRにより解析した結果を示す電気泳動の像であ
る。

【図２３】イネいもち菌接種による「B2xB1-650 」の発
現をRT-PCRにより解析した結果を示す電気泳動の像であ
る。

【図２４】イネいもち菌接種による「C4xA5-800 」の発
現をRT-PCRにより解析した結果を示す電気泳動の像であ
る。

【図２５】イネいもち菌接種によるアクチン遺伝子の発
現をRT-PCRにより解析した結果を示す電気泳動の像であ
る。

【図２６】「B1xA2-700 」および「C4xA5-750 」を恒常
的に発現させるためのプラスミドpIG121(B1xA2-700)
」、「pIG121(C4xA5-750) 」を示す図である。

【図２７】「pIG121(B1xA2-700) 」および「pIG121(C4x
A5-750) 」形質転換植物細胞において当該遺伝子の過剰
発現を確認した結果の電気泳動の像である。

【図２８】図２の発現パターンを示す。

【図２９】図３の発現パターンを示す。

【図３０】図４の発現パターンを示す。

【図３１】図５の発現パターンを示す。

【図３２】図６の発現パターンを示す。

【図３３】図７の発現パターンを示す。

【図３４】図８の発現パターンを示す。

【図３５】図９の発現パターンを示す。

【図３６】図１０の発現パターンを示す。

【図３７】図１１の発現パターンを示す。

【図３８】図１２の発現パターンを示す。

【図３９】図１３の発現パターンを示す。

【図４０】図１４の発現パターンを示す。

【図４１】図１５の発現パターンを示す。

【図４２】図１６の発現パターンを示す。

【図４３】図１７の発現パターンを示す。

【図４４】図１８の発現パターンを示す。

【図４５】図１９の発現パターンを示す。

【図４６】図２０の発現パターンを示す。

【図４７】図２１の発現パターンを示す。

【図４８】図２２の発現パターンを示す。

【図４９】図２３の発現パターンを示す。

【図５０】図２４の発現パターンを示す。

【図５１】図２５の発現パターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB03 4B024 AA07 AA08 BA79 BA80 CA04 CA09 CA12 CA20 DA01 EA04 GA11 GA27 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ02 QQ43 QQ53 QR32 QR40 QR56 QR62 QS25 QS34 QX01 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC20 BA02 BD50 CA24 CA53 4H045 AA10 CA31 EA05 EA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】イネいもち菌由来のcerebroside 型エリ
シターを用いて、植物に獲得抵抗性を付与するタンパク
質をコードする遺伝子をスクリーニングすることを特徴
とする当該遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２】請求項１記載の方法により単離される植
物に獲得抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝
子。
【請求項３】配列番号：１、３、または５に記載のタ
ンパク質、または当該タンパク質中のアミノ酸配列にお
いて１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは
付加したアミノ酸配列を有し、イネに獲得抵抗性を誘導
するイネいもち菌由来cerebroside 型エリシターにより
発現が誘導されるタンパク質。
【請求項４】配列番号：１、３、または５に記載のタ
ンパク質、または当該タンパク質中のアミノ酸配列にお
いて１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは
付加したアミノ酸配列を有し、植物に獲得抵抗性を付与
するタンパク質。
【請求項５】配列番号：２、４、６、１０、１１、ま
たは１２に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが
コードするタンパク質であって、イネに獲得抵抗性を誘
導するイネいもち菌由来cerebroside 型エリシターによ
り発現が誘導されるタンパク質。
【請求項６】配列番号：２、４、６、１０、１１、ま
たは１２に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡが
コードするタンパク質であって、植物に獲得抵抗性を付
与するタンパク質。
【請求項７】請求項３〜６のいずれか１項に記載のタ
ンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】配列番号：２、４、６、１０、１１、ま
たは１２に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡで
あって、イネに獲得抵抗性を誘導するイネいもち菌由来
cerebroside 型エリシターにより発現が誘導されるタン
パク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】配列番号：２、４、６、１０、１１、ま
たは１２に記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡで
あって、植物に獲得抵抗性を付与するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ。
【請求項１０】請求項７〜９のいずれか１項に記載の
ＤＮＡを含むベクター。
【請求項１１】請求項７〜９のいずれか１項に記載の
ＤＮＡを誘導的に発現させるプロモーターを含む、請求
項１０に記載のベクター。
【請求項１２】請求項１０〜１１のいずれか１項に記
載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項１３】植物細胞である請求項１２に記載の形
質転換細胞。
【請求項１４】イネ細胞である請求項１２に記載の形
質転換細胞。
【請求項１５】請求項１３に記載の形質転換細胞を含
む形質転換植物体。
【請求項１６】請求項１４に記載の形質転換細胞を含
むイネ形質転換植物体。