CN114573675A - GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病毒的分子靶标的应用 - Google Patents

GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病毒的分子靶标的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病毒的分子靶标的应用。本发明提供了一种蛋白质，来源于灰飞虱(Laodelphax striatellus)，命名为LsGrpE蛋白，为序列表中序列1所示的蛋白质。编码LsGrpE蛋白的基因，命名为LsGrpE基因，也属于本发明的保护范围。本发明还保护LsGrpE蛋白或LsGrpE基因作为分子靶标的应用；所述分子靶标为抗灰飞虱和/或抗条纹病毒的分子靶标。LsGrpE可以用作抗灰飞虱的分子靶标用于灰飞虱的防治，并且可以间接阻止RSV的垂直传播过程。

Description

GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病毒 的分子靶标的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病毒的分子靶标的应用。
背景技术
灰飞虱(Laodelphax striatellus)是一种重要的农业害虫及多种植物病毒的传播媒介。这种昆虫主要以禾本科植物汁液为食，不同龄期的灰飞虱均可通过刺吸式口器从水稻的筛管处吸食汁液以维持生存。其高密度取食会造成植物营养物质的流失和取食伤口被病原微生物感染。其传播病毒则会引起植物病毒病害的爆发。植物病毒无法在单株水平进行治疗，病毒和媒介昆虫的互惠共生，常使农作物大面积发病，病害伴随虫害，造成更大的经济损失。
在灰飞虱引起的植物病害中，以传播水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病最具代表性，该病在2004年在我国江苏，浙江，安徽等地爆发，在江苏地区波及了79％水稻种植面积，并引起了5200km2面积的水稻绝收。研究表明：RSV完全依赖介体昆虫(主要是灰飞虱)在水稻植株之间传播，没有介体昆虫，RSV无法从带毒水稻传播至其它的水稻植株；此外，RSV实现了在灰飞虱种群内从母代到子代的垂直传播，从而可以在灰飞虱体内度过季节变化带来的恶劣生存环境，在稻田种植期通过天然带毒的子代昆虫迅速散播。因此，发展新的防虫抗病的方法，降低灰飞虱的种群数量并阻断RSV的传播，对于水稻种植有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病毒的分子靶标的应用。
本发明提供了一种蛋白质，来源于灰飞虱(Laodelphax striatellus)，命名为LsGrpE蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与灰飞虱发育相关的由其衍生的蛋白质；
(a3)来源于灰飞虱且与(a1)所限定的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且与灰飞虱发育相关的蛋白质。
这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
编码LsGrpE蛋白的基因，命名为LsGrpE基因，也属于本发明的保护范围。
LsGrpE基因为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(b2)来源于灰飞虱且与(b1)至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还保护LsGrpE蛋白或LsGrpE基因作为分子靶标的应用；所述分子靶标为抗灰飞虱和/或抗条纹病毒的分子靶标。
本发明还保护一种dsRNA，命名为dsRNALsGrpE，如序列表的序列3所示。
本发明还保护dsRNALsGrpE在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗植物条纹病毒制剂。
本发明还保护用于抑制LsGrpE蛋白的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗条纹病毒制剂。
本发明还保护用于抑制LsGrpE基因的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗条纹病毒制剂。
本发明还保护一种产品，包括如下(c1)或(c2)：
(c1)用于抑制LsGrpE蛋白的物质；
(c2)用于抑制LsGrpE基因表达的物质；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗条纹病毒制剂。
所述用于抑制LsGrpE基因表达的物质具体可为dsRNALsGrpE。
以上任一所述条纹病毒具体可为水稻条纹病毒。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
所述植物为禾本科植物。
所述植物为水稻属植物。
所述植物为水稻。
本发明的发明人发现，灰飞虱的LsGrpE蛋白定位于灰飞虱细胞的线粒体。发明人通过dsRNA介导的基因干扰技术降低LsGrpE的表达量后，昆虫行为迟缓，发育停滞并在即将进入成虫期之前大量死亡。并且，LsGrpE基因与水稻和人的GrpE基因同源性很低，因此可以避免靶向干扰灰飞虱的基因对昆虫的水稻寄主及以水稻为食的人类的影响。因此，LsGrpE可以用作抗灰飞虱的分子靶标用于灰飞虱的防治，并且可以间接阻止RSV的垂直传播过程。
附图说明
图1为实施例1中的western blot结果图。
图2为实施例2的步骤三中的存活率统计结果。
图3为实施例2的步骤四中的灰飞虱在水稻植株上的照片。
图4为实施例2的步骤四中的各个发育期灰飞虱的形态比较。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、LsGrpE蛋白及其编码基因的发现
一、LsGrpE蛋白及其编码基因的发现
本发明的发明人从灰飞虱中发现一个新蛋白，命名为LsGrpE蛋白，如序列表的序列1所示。序列1中，第1至45位氨基酸残基组成线粒体转运肽(mitochondriatransitpeptide，mTP)。
将编码LsGrpE蛋白的基因命名为LsGrpE基因。灰飞虱的cDNA中，LsGrpE基因的编码框如序列表的序列2所示。
二、LsGrpE蛋白是定位在线粒体的蛋白
取不携带RSV的灰飞虱幼虫的细胞，分别分离获得全虫蛋白、线粒体蛋白和胞质蛋白，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后以抗LsGrpE的多克隆抗体作为一抗进行westernblot检测。结果见图1。图1中，泳道1对应全虫蛋白，泳道2对应线粒体蛋白，泳道3对应胞质蛋白。
实施例2、LsGrpE基因表达水平下降促进灰飞虱死亡率
一、制备dsRNALsGrpE
1、取灰飞虱幼虫，提取总RNA，反转录得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用LsGrpE T7f和LsGrpE T7r组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
LsGrpE T7f：5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGATGCTTCTGTTCTTCCAACCA-3’；
LsGrpE T7r：5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAGGCCTGATGATAGTTGGGAT-3’。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，通过体外转录制备得到dsRNA，即为dsRNALsGrpE。dsRNALsGrpE如序列表的序列3所示。
二、制备dsRNAGFP
合成DNA分子，然后反转录，制备得到dsRNAGFP。dsRNAGFP如序列表的序列4所示。
三、对灰飞虱3龄幼虫进行显微注射并统计存活率
取灰飞虱3龄幼虫置于冰上，使虫暂时性晕厥，使用显微注射器(Drummond)在灰飞虱的胸部扎针。分成两组，每组100头。dsGFP组，每只注射36.8nL dsRNAGFP溶液(dsRNAGFP溶液中，dsRNAGFP浓度为1μg/μL)。dsLsGrpE组：每只注射36.8nL dsRNALsGrpE溶液(dsRNALsGrpE溶液中，dsRNALsGrpE浓度为1μg/μL)。完成注射后，灰飞虱置于水稻植株(水稻品种为五育粳3号)上培养。
从注射开始计时，连续21天统计存活率。存活率统计结果见图2。在注射dsRNA后8天内，昆虫的死亡量较少，dsLsGrpE组和dsGFP组的存活率没有明显差别。在注射dsRNA的8天以后，dsLsGrpE组灰飞虱的死亡数量显著高于dsGFP组，存活率显著低于dsGFP组。注射dsRNA的15天后，dsLsGrpE组存活率不足50％，dsGFP组的存活率为90％。
四、对灰飞虱3龄幼虫进行显微注射并观察灰飞虱的发育变化
取灰飞虱3龄幼虫置于冰上，使虫暂时性晕厥，使用显微注射器(Drummond)在灰飞虱的胸部扎针。分成两组，每组100头。dsGFP组，每只注射36.8nL dsRNAGFP溶液(dsRNAGFP溶液中，dsRNAGFP浓度为1μg/μL)。dsLsGrpE组：每只注射36.8nL dsRNALsGrpE溶液(dsRNALsGrpE溶液中，dsRNALsGrpE浓度为1μg/μL)。完成注射后，灰飞虱置于水稻植株(水稻品种为五育粳3号)上培养。
观察灰飞虱在水稻中的取食位置。注射dsRNA的7天后，灰飞虱在水稻植株上的照片见图3。相较于dsGFP组，dsLsGrpE组灰飞虱的活动能力减弱，主要趴在水稻底部，鲜有移动位置。
注射dsRNA的15天后，dsGFP组的幼虫发育成为成虫，dsLsGrpE组的幼虫未发育成为成虫、还处于幼虫状态，即dsLsGrpE组的灰飞虱幼虫发育迟缓。各个发育期灰飞虱的形态比较见图4。图4中，A为背部观察图，B为腹部观察图，对应同一虫体。图4中，自左至右的第1张图和第2张图，为野生型灰飞虱。图4中，自左至右第3张图为dsLsGrpE组的灰飞虱。图4中，自左至右第4张图和第5张图为dsGFP组的灰飞虱。注射dsRNA的15天后，dsLsGrpE组幼虫，前翅长度没有超过后翅，翅的前端没有超过第一腹节，形态特征都更接近于4龄的幼虫，但是翅膀的长度又比4龄幼虫要长，虫子的体型大小接近5龄幼虫，单较5龄虫更加细长。注射dsRNA的28天后，dsLsGrpE组的幼虫未发育成为成虫，全部死亡。注射dsRNA的28天后，dsGFP组的幼虫发育成为成虫，存活率为80％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> GrpE蛋白或其编码基因作为特异性抗灰飞虱及水稻条纹病毒的分子靶标的应用
<130> GNCYX202758
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 234
<212> PRT
<213> Laodelphax striatellus
<400> 1
Met Gly Pro Ile Ser Met Cys Leu Arg Leu Gly Arg Leu Ala Val Asp
1 5 10 15
Asn Ser Ser His Tyr Gly Val Tyr Ser Ala Ile Ala Thr Asn Leu Arg
20 25 30
His Ala Ser Val Leu Pro Thr Arg Ile Gly Val Arg His Asn Thr Thr
35 40 45
Ala Ser Glu Glu Ala Lys Asn Thr Glu Asn Glu Asn Leu Ser Glu Thr
50 55 60
Glu Lys Glu Leu Lys Ser Lys Leu Asp Asn Ile Thr Glu Glu Phe Glu
65 70 75 80
Lys Phe Lys Val Gln Ser Gln Gln Thr Leu Asp Met Trp Lys Arg Gly
85 90 95
Val Ala Asp Ala Glu Asn Ala Arg Lys Arg Thr Glu Lys Gln Leu Val
100 105 110
Asp Thr Arg Gln Phe Ala Ile Gln Lys Phe Ala Lys Asp Ile Leu Glu
115 120 125
Val Ala Asp Cys Leu Ser Arg Ala Ile Asp Ser Val Pro Lys Thr Glu
130 135 140
Ile Thr Asp Gln Asn Pro His Leu Lys Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Thr
145 150 155 160
Leu Thr Asp Ser Glu Leu His Arg Val Phe Arg Thr His Gly Leu Ala
165 170 175
Gln Ile Asn Pro Ile Gly Glu Leu Phe Asp Pro Asn Tyr His Gln Ala
180 185 190
Leu Phe Asp Lys Glu Asp Glu Glu Lys Lys Pro Gly Thr Val Ile Val
195 200 205
Val Gln Lys Val Gly Tyr Lys Leu Asn Glu Arg Val Ile Arg Pro Ala
210 215 220
Leu Val Gly Ile Ser Lys Ala Lys Ala Thr
225 230
<210> 2
<211> 705
<212> DNA
<213> Laodelphax striatellus
<400> 2
atggggccga tatcgatgtg tttgcgattg ggacgattgg ctgtagacaa tagctctcat 60
tatggggttt actcagctat tgctacaaat ctaaggcatg cttctgttct tccaaccaga 120
ataggcgtaa gacacaacac gacagcttct gaagaagcta agaataccga aaatgaaaat 180
ttgtcagaaa ccgagaaaga actcaaatcc aaattagata atatcactga agaatttgaa 240
aaattcaaag tccaatcgca gcaaactttg gatatgtgga agagaggtgt agcagatgct 300
gaaaacgctc ggaaaagaac cgaaaaacag ctggttgata caagacagtt cgctattcag 360
aaattcgcca aagatattct ggaagtggcc gactgtttgt ccagagcaat cgatagcgtt 420
ccgaaaacgg aaatcactga ccagaatcca catttgaaga atctctatga aggattaaca 480
ctaactgact cggagctcca cagagtattt aggactcatg gcttggcaca aatcaatcca 540
attggtgaac tgttcgatcc caactatcat caggccttat ttgataagga ggatgaggaa 600
aagaagccag gaactgttat tgttgtgcag aaagtaggat acaaactgaa tgaacgtgtc 660
atacgaccgg cattggtagg aatttcaaaa gcaaaagcta cctta 705
<210> 3
<211> 480
<212> RNA
<213> Laodelphax striatellus
<400> 3
augcuucugu ucuuccaacc agaauaggcg uaagacacaa cacgacagcu ucugaagaag 60
cuaagaauac cgaaaaugaa aauuugucag aaaccgagaa agaacucaaa uccaaauuag 120
auaauaucac ugaagaauuu gaaaaauuca aaguccaauc gcagcaaacu uuggauaugu 180
ggaagagagg uguagcagau gcugaaaacg cucggaaaag aaccgaaaaa cagcugguug 240
auacaagaca guucgcuauu cagaaauucg ccaaagauau ucuggaagug gccgacuguu 300
uguccagagc aaucgauagc guuccgaaaa cggaaaucac ugaccagaau ccacauuuga 360
agaaucucua ugaaggauua acacuaacug acucggagcu ccacagagua uuuaggacuc 420
auggcuuggc acaaaucaau ccaauuggug aacuguucga ucccaacuau caucaggccu 480
<210> 4
<211> 807
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ucuaaucaua aaaacccauc ucauaaauaa cgucaugcau uacauguuaa uuauuacaug 60
cuuaacguaa uucaacagaa auuauaugau aaucaucgca agaccggcaa caggauucaa 120
ucuuaagaaa cuuuauugcc aaauguuuga acgaucgggg aaauucgagc ucuuaagauc 180
uuccggacuu guacagcucg uccaugccga gagugauccc ggcggcgguc acgaacucca 240
gcaggaccau gugaucgcgc uucucguugg ggucuuugcu cagggcggac ugggugcuca 300
gguagugguu gucgggcagc agcacggggc cgucgccgau ggggguguuc ugcugguagu 360
ggucggcgag cugcacgcug ccguccucga uguuguggcg gaucuugaag uucaccuuga 420
ugccauucuu cugcuugucg gccaugauau agacguugug gcuguuguag uuguacucca 480
gcuugugccc caggauguug ccguccuccu ugaagucgau gcccuucagc ucgaugcggu 540
ucaccagggu gucgcccucg aacuucaccu cggcgcgggu cuuguaguug ccgucguccu 600
ugaagaagau ggugcgcucc uggacguagc cuucgggcau ggcggacuug aagaagucgu 660
gcugcuucau guggucgggg uagcggcuga agcacugcac gccguagguc agggugguca 720
cgaggguggg ccagggcacg ggcagcuugc cgguggugca gaugaacuuc agggucagcu 780
ugccguaggu ggcaucgccc ucgcccu 807

Claims (10)

1.一种蛋白质，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与灰飞虱发育相关的由其衍生的蛋白质；
(a3)来源于灰飞虱且与(a1)所限定的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且与灰飞虱发育相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(b2)来源于灰飞虱且与(b1)至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述基因作为分子靶标的应用；所述分子靶标为抗灰飞虱和/或抗条纹病毒的分子靶标。
5.一种dsRNA，如序列表的序列3所示。
6.权利要求5所述dsRNA在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗条纹病毒制剂。
7.用于抑制权利要求1所述蛋白质的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗条纹病毒制剂。
8.用于抑制权利要求2或3所述基因的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗条纹病毒制剂。
9.一种产品，包括如下(c1)或(c2)：
(c1)用于抑制权利要求1所述蛋白质的物质；
(c2)用于抑制2或3所述基因表达的物质；
所述产品的功能为如下(d1)或(d2)或(d3)：
(d1)作为灰飞虱杀虫剂；
(d2)作为施用于植物的抗灰飞虱制剂；
(d3)作为施用于植物的抗条纹病毒制剂。
10.如权利要求9所述的产品，其特征在于：所述用于抑制2或3所述基因表达的物质为权利要求5所述dsRNA。
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