CN111019950A - 褐飞虱NlAtg1基因、编码蛋白及其应用 - Google Patents

褐飞虱NlAtg1基因、编码蛋白及其应用 Download PDF

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杨倩倩
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/60—Isolated nucleic acids

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Abstract

本发明公开了一种褐飞虱NlAtg1基因、编码蛋白及其应用。NlAtg1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，该基因功能受到抑制会影响褐飞虱线粒体结构和功能，导致褐飞虱存活率下降。NlAtg1基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的NlAtg1基因或蛋白的应用，可以用于褐飞虱防治中新型RNA杀虫剂开发或以NlAtg1蛋白为把标的农药研发。本发明对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的存活率下降，由于RNA干扰片段可以针对物种做特异设计，有望在实现抑制害虫的同时，减少对非靶标生物的杀伤，是一种环境友好型杀虫剂。

Description

褐飞虱NlAtg1基因、编码蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种褐飞虱NlAtg1基因、编码蛋白及其应用。
背景技术
褐飞虱（Nilaparvata lugens Stål）是一种重要的水稻害虫。目前，对褐飞虱的应急防治主要以化学防治为主。化学农药在杀死害虫的同时，也会危及包括天敌在内的非靶标生物，不可避免的会给农田生态系统造成负面影响，导致生态防治功能得不到应有的发挥。因此，筛选与发现新的褐飞虱防治靶标具有重要的现实意义。细胞自噬是一个高度调控的自我降解过程，通过清除多余蛋白、细胞器和入侵病原体等，维持细胞的生理稳态与生存。自噬由一系列的ATG（autophagy related gene）核心基因和至少四组重要的ATG蛋白复合物调控，ATG1激酶复合物是其中一类诱导自噬体形成的复合物，包括ATG1/ULK1、ATG13、ATG17/FIP200、ATG29和ATG31等。ATG1基因的干扰会影响细胞自噬在别的物种有研究，但是多为细胞水平的研究。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种褐飞虱NlAtg1基因、编码蛋白及其应用。本发明根据NlAtg1基因编码的蛋白质相对保守但核酸序列与其他生物同源性较低的特点，对靶标基因进行RNA干扰，实现了在核酸水平对褐飞虱的抑制，显著地降低了褐飞虱的存活率，并避免了在蛋白质水平采用的喷施农药等可能给非靶标生物造成的杀伤。
本发明的技术方案如下：
一种褐飞虱NlAtg1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，该基因编码ATG1蛋白，是褐飞虱正常生存所必需，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。
一种所述的褐飞虱NlAtg1基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该基因功能受到抑制会影响褐飞虱线粒体结构和功能，导致褐飞虱存活率下降。
一种所述的褐飞虱NlAtg1基因的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。
一种针对所述的褐飞虱NlAtg1基因的RNA干扰技术在控制褐飞虱方面的应用，所述的RNA干扰技术导致褐飞虱的存活率下降。
一种如所述的褐飞虱NlAtg1基因编码的蛋白的应用，用于褐飞虱防治中RNA杀虫剂开发或以NlAtg1蛋白为把标的新型农药研发。
本发明的有益效果：
ATG1基因是褐飞虱基因，序列不同于别的物种；ATG1基因的干扰除了细胞水平的影响，还有在个体水平的影响，即影响褐飞虱个体存活率。影响褐飞虱个体存活率，有助于褐飞虱防治。自噬在害虫防治上的应用，尚未见相关报道。具体的包括：
（1）褐飞虱存活率下降，可以减轻害虫取食对水稻作物的直接危害；
（2）本发明利用靶标基因的核苷酸序列与天敌核苷酸序列同源性较低的特点，可以在核酸水平上进行RNA干扰，避免了由于蛋白质结构保守对天敌等非靶标生物的伤害，有望在实现抑制害虫的同时，充分发挥生态防治的功能。
附图说明
图1是褐飞虱NlAtg1基因的mRNA表达水平。A，不同发育阶段: 1st-2nd: 1-2龄若虫；3rd/4th/5th: 3/4/5龄若虫；F雌性褐飞虱；M雌性褐飞虱。B，不同组织部位: H: head; T:thorax; M: midgut; O: ovary; F: fat body。
图2 是RNA干扰对褐飞虱NlAtg1基因表达量和存活率的影响；
图中A数据为3次重复的平均值±标准偏差，星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在极显著差异（T检验，P<0.01）。dsGFP：对照组；dsNlAtg1：dsNlAtg1饲喂的RNA干扰组；
图中B数据为3次重复的平均值±标准偏差，星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在显著差异（T检验，P<0.05），双星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在显著差异（T检验，P<0.01）。
图3 是褐飞虱NlAtg1基因RNA干扰对线粒体大小和糖原的影响；
图为中肠上皮细胞的TEM图，（A，B，C）用dsGFP处理，（D，E，F）为dsNlAtg1处理第4天。红色箭头表示自噬空泡或小室，蓝色箭头表示线粒体，黄色箭头表示糖原；（C）表示（B）中红色虚线框的放大部分，（F）表示（E）中红色虚线框的放大部分；比例尺：（A，D），5μm；（B，E）2μm；（C，F）500 nm。
图4 是褐飞虱NlAtg1基因RNA干扰对线粒体宽度和切面面积的影响；
所有数值均表示为三个独立复制品的平均值±标准差（p<0.05，**p<0.01）（每个重复大约测定100个线粒体）。
图5 是褐飞虱NlAtg1基因RNA干扰和饥饿处理对细胞自噬和线粒体的影响；
A为B的局部放大；D为C的局部放大；F为E的局部放大。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。
实施例1
1 材料与方法
1.1 供试褐飞虱
供试褐飞虱种群为感虫水稻品种TN1上饲养的Tn种群，由本实验室连续在TN1上饲养60代以上，饲养温度为26±2℃，相对湿度为80%±5%，光周期为12L:12D。
主要试剂
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，TaKaRa MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser，DNA 2000Marker，Premix Taq™（TaKaRa Taq™ Version 2.0 plus dye），SYBR Premix Ex Taq 均购自大连 TaKaRa公司，SMARTer® RACE 5’/3’ Kit User Manual购自美国Clontech公司，MEGAscript® T7 High Yield Transcription Kit购自美国Ambion公司，测序以及引物合成有由上海桑尼生物科技有限公司完成。
褐飞虱NlAtg1基因全长cDNA的克隆
收集TN1水稻上不同龄期的褐飞虱若虫和成虫混合材料，立即放入液氮中冻存。取样时若虫取30-50只，成虫取5只。使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA，具体步骤参照其说明书进行。使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000（Thermo）对RNA进行完整性及纯度检测。以1μg总RNA为模板，使用PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser试剂盒反转录合成cDNA，贮存于-20℃备用。
根据本实验室的转录组测序序列信息，获得褐飞虱NlAtg1基因的部分核心序列，并经NCBI网站序列比对鉴定。应用Primer Premier 5.0软件设计引物NlAtg1-F和NlAtg1-R（表1），对核心序列进行验证。以TN1上不同龄期的混合褐飞虱cDNA为模板，验证其核心序列。NlAtg1全长cDNA的克隆参照Hao et al（2015）的方法，PCR扩增反应体系为50 μL，其中包括PCR Mix 25 μL，10 μmol/L正反引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min, 30个循环；72℃ 10 min；4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit回收目的片段，连接到载体pMD-18T上4℃过夜，转化到JM109感受态细胞中加1 mL LB液体培养基37℃摇床培养2 h，取200 μL菌液涂布在含有1% Amp的LB固体培养基37℃倒置培养9 h，随机挑取5个单菌落于含1% Amp的 LB 液体培养基1 mL的1.5 mL离心管中37℃摇床培养12 h，取1 μL菌液进行菌液PCR鉴定阳性克隆菌株并送到上海桑尼生物科技有限公司测序。测序结果用DNAMAN软件和原序列比对验证。
选取符合要求的RNA样品，用SMARTer® RACE 5’/3’ Kit User Manual 合成5'-RACE和3'-RACE的模板。分别设计外引物NlAtg1-5O和NlAtg1-3O（表1），以及内引物NlAtg1-5I和NlAtg1-3I（表1）。根据RACE试剂盒说明书，采用巢式PCR对目的基因的2端进行扩增，电泳，胶回收，连接，转化，测序，测序结果应用DNAMAN软件进行比对拼接获得NlAtg1的全长cDNA。根据获得的全长cDNA序列，设计全长验证引物NlAtg1-FL-F和NlAtg1-FL-R（表1）对拼接的全长序列进行验证。
Figure 721229DEST_PATH_IMAGE001
1.4 褐飞虱NlAtg1基因的序列分析
根据DNAMAN 拼接获得的NlAtg1全长cDNA 序列信息，利用开放阅读框分析软件( ORFfinder https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 预测开放阅读框及蛋白质翻译情况，使用NCBI Blastx 进行氨基酸序列同源性比对，使用在线工具ExPASy ( http://web.expasy.org/protparam/) 对蛋白质的分子量、理论等电点等进行预测，采用SignalP4.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 对信号肽进行预测，采用在线工具InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search) 对蛋白质功能域进行预测。
褐飞虱NlAtg1基因的表达规律分析
利用荧光定量PCR技术检测NlAtg1基因在TN1水稻上不同龄期的褐飞虱种群的相对表达量，包括若虫（1-2龄、3、4、5龄）、雌成虫、雄成虫。荧光定量PCR特异性引物为QNlAtg1-F和QNlAtg1-R（表1），以RPS11基因为内参，检测褐飞虱NlAtg1基因的相对表达量。荧光定量PCR参考马艳等（2013）的反应体系及方法，其中退火温度改为55℃。
饲喂法进行RNAi
根据cDNA全长序列设计用于合成dsRNA干扰片段的引物dsNlAtg1-F和dsNlAtg1-R（表1），并在特异性引物5' 端加保护碱基( GGATCC ) 及T7 启动子( TAATACGACTCACTATA )。为了不影响RNAi后的转录水平检测，干扰片段不包括荧光定量PCR检测的片段。按照MEGAscript® T7 High Yield Transcription Kit（Ambion）试剂盒说明书合成dsRNA。合成后的dsRNA采用LiCl沉淀法进行纯化：向dsRNA反应体系中加入30μl的ddH2O和30μl的LiCl Precipitation Solution，-20℃放置1h左右，11000rpm，4℃离心15min，去上清后加入用DEPC水配制的70%的乙醇1ml进行洗涤，离心后去除乙醇，加入20μl ddH2O溶解，放置-20℃等待使用。
取饲养在TN1水稻品种上2龄褐飞虱若虫进行人工饲养，饲养条件参照Fu 等（2001）的营养液配方，饲喂装置为两端覆盖Parafilm膜（内含取食液）的双通玻璃管（2.5cm × 15 cm），待试虫饲喂取食液5天适应后，进行RNA干扰处理，纯化的dsRNA用取食液配制到终浓度为0.5 μg/μL。处理时，以取食液加入相应体积的dsRNA稀释液为对照组（CK），每饲喂装置接入20只经过上述预处理且发育基本一致的褐飞虱若虫，设置3个重复，每天更换取食液，清理和统计死亡的褐飞虱，计算存活率。
此外，设置平行的RNA干扰处理，每饲喂装置放入25只发育一致的褐飞虱若虫，且两管作为一个重复，每2天对各组分别进行取样，每组取6只若虫，并进行RNA的抽提及后续NlAtg1基因表达量的荧光定量PCR检测。
数据统计与分析
采用WPS Excel软件进行数据整理，运用SPSS16.0独立样本T检验进行显著性差异分析。
结果与分析
2.1 褐飞虱NlAtg1基因的cDNA全长克隆及序列分析
RACE结果表明，NlAtg1基因全长cDNA为2502bp。使用ORF Finder预测，NlAtg1包含2040bp开放阅读框（GenBank登录号：MF062504），并编码一个679个氨基酸的蛋白质。NlATG1蛋白分子量为74.3kda，等电点为8.31，此肽中未发现信号肽。
褐飞虱NlAtg1基因的表达规律分析
利用荧光定量PCR检测NlAtg1基因在褐飞虱不同发育阶段的表达规律，结果发现，NlAtg1基因在褐飞虱不同发育阶段均有表达，1-5龄若虫相对较高，雌成虫和雄成虫均较低（图1A）；不同组织部位，以头部和脂肪体表达量较高，胸部最低（图1B）。
干扰对NlAtg1基因表达水平和褐飞虱存活率的影响
荧光定量PCR检测注射5 μg/μl的dsRNA 4d后的褐飞虱，结果显示，NlAtg1基因注射dsRNA后的表达水平均出现大幅下降，与dsGFP对照组相比，达到了极差异显著（P<0.01）（图2的A部分）。
RNA干扰结果发现，注射ds NlAtg1的致死作用显著，在RNA干扰的第 4天，注射ds NlAtg1的处理组的存活率与对照组达到了显著差异（P<0.05），从第8天开始就与对照组达到了极显著差异（P<0.01），第8天，处理组的存活率下降到48.3%，而对照组仍保持在78.3%的较高水平（图2的B部分）。
干扰对褐飞虱细胞自噬的影响
透射电镜结果显示，正常喂养的BPH中肠上皮细胞正在进行本地水平的自噬，有少数自噬空泡或自噬体，包括线粒体自噬（图3的A、B和C部分），而dsNlAtg1干扰后几乎没有空泡（图3的D、E和F部分）。此外，靶向NlAtg1的RNA干扰也影响糖原的代谢，导致中肠细胞内糖原的积累（图3的F部分）。dsNlAtg1干扰对褐飞虱线粒体的形态也产生了影响，靶向NlAtg1的干扰导致线粒体变窄，切面面积变小（图4）。
为了进一步证实dsNlAtg1干扰对自噬的影响，BPH先注射dsRNA，然后再进行饥饿处理。透射电镜观察表明，dsGFP处理的BPH饥饿中肠细胞（图5的C和D部分）明显诱导自噬，自噬空泡发生程度与饥饿中肠细胞类似（图5的A和B部分）。但是，dsNlAtg1处理组的自噬明显受到抑制，即使在饥饿状态下，中肠细胞也几乎没有空泡（图5的E和F部分）。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 褐飞虱NlAtg1基因、编码蛋白及其应用
<141> 2019-11-18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2040
<212> DNA
<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens Stål)
<400> 1
atggagattg ttggggatta cgaatatagc acaagcaata taatcggaca tggagcattt 60
gctgttgttt tcaaaggaag actccgaaaa aatccaagga atgttgtcgc catcaaaagt 120
atcacaaaaa agaacttggc gaaatcacag aaccttctcg gtaaagagat aaaaattctt 180
aaggagttga cagagcttca ccatgagaat gtcgtggcgt tgttggattg caaagaatcc 240
gcaaacaatg tattcttggt tatggagtac tgcaatggag gtgacttagc tgattactta 300
ggagtcaaag gtactctgag cgaagacact atcaggctat tcctgacgca acttgctggt 360
gctatgaaag ccctgcatgc caagggtgta gtacacaggg acctgaaacc tcagaatatt 420
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gagaccccgc cacctgtcaa cacgtggaca gtgactccga ccaactcgcc actgcgcaag 1320
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gctcatatga cttttgtcct gccggaatta ccaccggaaa ctatattaga gagagagcac 1500
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gcgggtgcgg gtgggaggcc tcgtaacgag tgtctcgtcc tgcttgtcag agcactacag 1620
ctgctcagct cggggctgac gcttgccaag accaaactag atgccaaggt gctgcaaccg 1680
tctgcatcgg tgaagaacgt agtgacgcaa ctgaatgcac gtttccgcca gtgtttggga 1740
gactgcaagc agcttaactc acctgtgcta ctgcagaatg ccagcgcaac ggctgacaag 1800
atactctaca atcatgccat acatatgtgt caatcggcgg ctctggacga gttgtttggc 1860
aatccggccg aatgcttcca gcgctaccag acggcgcaga tcctactgca cagtctcagt 1920
cagcaagtca gccatcatca ggacagggca cttctcacca aatataaaga tgcagttgaa 1980
aaaagactga gcgttctgca acaacaaggc tacgtttacg tcaacaatac atcgacttag 2040
<210> 2
<211> 679
<212> PRT
<213> 褐飞虱(Nilaparvata lugens Stål)
<400> 2
Met Glu Ile Val Gly Asp Tyr Glu Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Ile Gly
1 5 10 15
His Gly Ala Phe Ala Val Val Phe Lys Gly Arg Leu Arg Lys Asn Pro
20 25 30
Arg Asn Val Val Ala Ile Lys Ser Ile Thr Lys Lys Asn Leu Ala Lys
35 40 45
Ser Gln Asn Leu Leu Gly Lys Glu Ile Lys Ile Leu Lys Glu Leu Thr
50 55 60
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Ala Asn Asn Val Phe Leu Val Met Glu Tyr Cys Asn Gly Gly Asp Leu
85 90 95
Ala Asp Tyr Leu Gly Val Lys Gly Thr Leu Ser Glu Asp Thr Ile Arg
100 105 110
Leu Phe Leu Thr Gln Leu Ala Gly Ala Met Lys Ala Leu His Ala Lys
115 120 125
Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Gln Asn Ile Leu Leu Ser His
130 135 140
Asn Gly Gln Arg Pro Ser Pro Pro Pro Gln His Ile Lys Leu Lys Ile
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Ala Asp Phe Gly Phe Ala Arg Phe Leu Gln Asp Gly Val Met Ala Ala
165 170 175
Thr Leu Cys Gly Ser Pro Met Tyr Met Ala Pro Glu Val Ile Met Ser
180 185 190
Leu Gln Tyr Asp Ala Lys Ala Asp Leu Trp Ser Leu Gly Thr Ile Val
195 200 205
Phe Gln Cys Leu Thr Gly Arg Ala Pro Phe Gln Ala Gln Thr Pro Gln
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Pro Pro Gly Thr Ser Ala Asp Leu Gln Asp Leu Leu Asn Gly Leu Leu
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275 280 285
Ser Pro Gly Pro Gly Pro Glu Gln Pro Ala Lys Asn Cys Gln Leu Ala
290 295 300
Asn His Ser Phe Pro Val Cys Leu Ser Pro Asp Asp Ser Asp Asp Phe
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Cys Arg Asn Ser Glu Thr Asn Gln Glu Arg Asp Val Ser Ala Ser Pro
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405 410 415
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Ala His Met Thr Phe Val Leu Pro Glu Leu Pro Pro Glu Thr Ile Leu
485 490 495
Glu Arg Glu His Asn Glu Thr Leu Ala Lys Leu Asn Phe Val Leu Ala
500 505 510
Val Ser Glu Cys Val Met Glu Val Ala Gly Ala Gly Gly Arg Pro Arg
515 520 525
Asn Glu Cys Leu Val Leu Leu Val Arg Ala Leu Gln Leu Leu Ser Ser
530 535 540
Gly Leu Thr Leu Ala Lys Thr Lys Leu Asp Ala Lys Val Leu Gln Pro
545 550 555 560
Ser Ala Ser Val Lys Asn Val Val Thr Gln Leu Asn Ala Arg Phe Arg
565 570 575
Gln Cys Leu Gly Asp Cys Lys Gln Leu Asn Ser Pro Val Leu Leu Gln
580 585 590
Asn Ala Ser Ala Thr Ala Asp Lys Ile Leu Tyr Asn His Ala Ile His
595 600 605
Met Cys Gln Ser Ala Ala Leu Asp Glu Leu Phe Gly Asn Pro Ala Glu
610 615 620
Cys Phe Gln Arg Tyr Gln Thr Ala Gln Ile Leu Leu His Ser Leu Ser
625 630 635 640
Gln Gln Val Ser His His Gln Asp Arg Ala Leu Leu Thr Lys Tyr Lys
645 650 655
Asp Ala Val Glu Lys Arg Leu Ser Val Leu Gln Gln Gln Gly Tyr Val
660 665 670
Tyr Val Asn Asn Thr Ser Thr
675

Claims (5)

1.一种褐飞虱NlAtg1基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，该基因功能受到抑制会影响褐飞虱线粒体结构和功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。
2.一种如权利要求1所述的褐飞虱NlAtg1基因编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。
3.一种如权利要求1所述的褐飞虱NlAtg1基因的应用，其特征在于，用于褐飞虱防治中RNA杀虫剂开发或以NlAtg1蛋白为把标的新型农药研发。
4.一种针对如权利要求1所述的褐飞虱NlAtg1基因的RNA干扰技术在控制褐飞虱方面的应用，其特征在于，所述的RNA干扰技术导致褐飞虱的存活率下降。
5.一种如权利要求2所述的褐飞虱NlAtg1基因编码的蛋白的应用，其特征在于，用于农药研发和防治褐飞虱。
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