CN107988244B

CN107988244B - 褐飞虱生存相关的ATPSb基因、编码蛋白及其应用

Info

Publication number: CN107988244B
Application number: CN201711110596.0A
Authority: CN
Inventors: 郝培应; 俞晓平; 冯娅琳; 马正; 申屠旭萍; 张蓬军; 许益鹏; 刘光富; 王正亮; 杨倩倩
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2017-11-12
Filing date: 2017-11-12
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2037-11-12
Also published as: CN107988244A

Abstract

本发明公开了一种褐飞虱生存相关的ATPSb基因、编码蛋白及其应用ATPSb基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码ATP合酶b亚基，该基因在维持褐飞虱正常的生存中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。ATPSb基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述的ATPSb基因或蛋白的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。本发明对该基因成功实施了RNA干扰，结果表明害虫的存活率下降，生存受到明显抑制，有望在实现抑制害虫的同时，充分发挥生态防治的功能。

Description

褐飞虱生存相关的ATPSb基因、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种褐飞虱生存相关的基因、编码蛋白及其应用。

背景技术

褐飞虱（Nilaparvata lugens Stål）是一种单食性水稻害虫，具有远距离迁飞特性和极强繁殖能力。褐飞虱主要通过取食水稻韧皮部汁液为害水稻，造成水稻生长延缓、分蘖延迟、空瘪粒增加，严重时全株死亡。此外，褐飞虱还可以传播多种水稻病毒。目前，对褐飞虱的应急防治主要以化学防治为主，但化学防治容易导致害虫的抗药性上升、水稻上有害物质残留、害虫再猖獗及环境污染等问题。在防治褐飞虱的农药中，曾经发挥过较好效果的有效农药，如氟虫腈、吡虫啉、噻嗪酮等，均已淘汰出局或限制使用，而近年出现的取代农药品种数量不多，很多地方在开展防治时，在农药的选择上感到束手无策。目前已鉴定的解毒酶和代谢酶等相关基因，尚不能很好地解释害虫抗药性产生的机制，对褐飞虱灾害还缺乏持续有效治理的手段。究其原因，此类化学农药多以大规模高强度杀灭害虫为目标，但是，由于褐飞虱种群遗传多样性非常复杂等现实原因，其中往往有部分个体能够存活下来，高选择压力的作用结果，最终会导致适应性更强的种群形成。另一方面，化学农药在杀死害虫的同时，也会危及包括天敌在内的非靶标生物，不可避免的会给农田生态系统造成负面影响，导致生态防治功能得不到应有的发挥。因此，筛选与发现新的褐飞虱防治靶标，调整目前的褐飞虱防治策略具有重要的现实意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种褐飞虱生存相关的ATPSb基因、编码蛋白及其应用。本发明根据ATPSb基因编码的蛋白质相对保守但核酸序列与其他生物同源性较低的特点，对靶标基因进行RNA干扰，实现了在核酸水平对褐飞虱的抑制，显著地降低了褐飞虱的存活率，并避免了在蛋白质水平采用的喷施农药等可能给非靶标生物造成的杀伤。

本发明的技术方案如下：

一种褐飞虱生存相关的ATPSb基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该基因编码ATP合酶b亚基，该基因在维持褐飞虱正常的生存中发挥重要功能，其功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。

一种所述的褐飞虱生存相关的ATPSb基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该基因功能受到抑制会导致褐飞虱存活率下降。

一种所述的褐飞虱生存相关的ATPSb基因的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。

一种针对所述的褐飞虱生存相关的ATPSb基因的RNA干扰技术在控制褐飞虱方面的应用，所述的RNA干扰技术导致褐飞虱的存活率下降。

一种如所述的褐飞虱生存相关的ATPSb基因编码的蛋白的应用，用于农药研发和生物防治褐飞虱。

本发明的有益效果：（1）褐飞虱存活率下降，可以减轻害虫取食对水稻作物的直接危害。（2）本发明利用靶标基因的核苷酸序列与天敌核苷酸序列同源性较低的特点，可以在核酸水平上进行RNA干扰，避免了由于蛋白质结构保守对天敌等非靶标生物的伤害，有望在实现抑制害虫的同时，充分发挥生态防治的功能。

附图说明

图1是褐飞虱ATPSb基因的mRNA表达水平。其中，1-2N: 1-2龄若虫；3-4N: 3-4龄若虫；5N: 5龄若虫；F1-9: 羽化1-9天的雌性褐飞虱；M：雄成虫F：雌成虫。

图2 是RNA干扰对褐飞虱ATPSb基因表达量的影响；

图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在显著差异（T检验，P<0.05）。CK：对照组；dsATPSb：dsATPSb饲喂的RNA干扰组。

图3 是ATPSb基因的RNA干扰对褐飞虱存活率的影响；

图中数据为3次重复的平均值±标准偏差，星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在显著差异（T检验，P<0.05），双星号表示在统计分析上处理组与对照组之间存在显著差异（T检验，P<0.01）。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1

1 材料与方法

1.1 供试褐飞虱

供试褐飞虱种群为感虫水稻品种TN1上饲养的Tn种群，由本实验室连续在TN1上饲养50代以上，饲养温度为26±2℃，相对湿度为80%±5%，光周期为12L:12D。

主要试剂

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser，DNA 2000Marker，Premix Taq™（TaKaRa Taq™ Version 2.0 plus dye），SYBR Premix Ex Taq 均购自大连 TaKaRa公司，SMARTer® RACE 5’/3’ Kit User Manual购自美国Clontech公司，MEGAscript® T7 High Yield Transcription Kit购自美国Ambion公司，测序以及引物合成有由上海桑尼生物科技有限公司完成。

褐飞虱ATP合酶b亚基基因ATPSb全长cDNA的克隆

收集TN1水稻上不同龄期的褐飞虱若虫和成虫混合材料，立即放入液氮中冻存。取样时若虫取30-50只，成虫取5只。使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA，具体步骤参照其说明书进行。使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000（Thermo）对RNA进行完整性及纯度检测。以1μg总RNA为模板，使用PrimeScript RT reagent KitWith gDNA Eraser试剂盒反转录合成cDNA，贮存于-20℃备用。

根据本实验室的转录组测序序列信息，获得褐飞虱ATP合酶b亚基的部分核心序列，并经NCBI网站序列比对鉴定。应用Primer Premier 5.0软件设计引物ATPSb-F和ATPSb-R（表1），对核心序列进行验证。以TN1上不同龄期的混合褐飞虱cDNA为模板，验证其核心序列。ATPSb全长cDNA的克隆参照Hao et al（2015）的方法，PCR扩增反应体系为50 μL，其中包括PCR Mix 25 μL，10 μmol/L正反引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min, 30个循环；72℃ 10 min；4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit回收目的片段，连接到载体pMD-18T上4℃过夜，转化到JM109感受态细胞中加1 mL LB液体培养基37℃摇床培养2 h，取200 μL菌液涂布在含有1% Amp的LB固体培养基37℃倒置培养9 h，随机挑取5个单菌落于含1% Amp的 LB 液体培养基1 mL的1.5 mL离心管中37℃摇床培养12 h，取1 μL菌液进行菌液PCR鉴定阳性克隆菌株并送到上海桑尼生物科技有限公司测序。测序结果用DNAMAN软件和原序列比对验证。

选取符合要求的RNA样品，用SMARTer® RACE 5’/3’ Kit User Manual 合成5'-RACE和3'-RACE的模板。分别设计外引物ATPSb-5O和ATPSb-3O（表1），以及内引物ATPSb-5I和ATPSb-3I（表1）。根据RACE试剂盒说明书，采用巢式PCR对目的基因的2端进行扩增，电泳，胶回收，连接，转化，测序，测序结果应用DNAMAN软件进行比对拼接获得ATPSb的全长cDNA。根据获得的全长cDNA序列，设计全长验证引物ATPSb-FL-F和ATPSb-FL-R（表1）对拼接的全长序列进行验证。

1.4 褐飞虱ATP合酶b亚基的序列分析

根据DNAMAN 拼接获得的ATPSb全长cDNA 序列信息，利用开放阅读框分析软件(ORF finder https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 预测开放阅读框及蛋白质翻译情况，使用NCBI Blastx 进行氨基酸序列同源性比对，使用在线工具ExPASy ( http://web.expasy.org/protparam/) 对蛋白质的分子量、理论等电点等进行预测，采用SignalP4.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 对信号肽进行预测，采用在线工具InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search) 对蛋白质功能域进行预测。

褐飞虱ATPSb基因的表达规律分析

利用荧光定量PCR技术检测ATP合酶b亚基在TN1水稻上不同龄期的褐飞虱种群的相对表达量，包括1-2龄、3-4龄、5龄若虫和羽化1、3、5、7、9天的雌成虫以及雄虫。荧光定量PCR特异性引物为QATPSb-F和QATPSb-R（表1），以RPS11基因为内参（Yuan et al, 2014），检测褐飞虱ATPSb基因的相对表达量。荧光定量PCR参考马艳等（2013）的反应体系及方法，其中退火温度改为53℃。

饲喂法进行RNAi

根据cDNA全长序列设计用于合成dsRNA干扰片段的引物dsATPSb-F和dsATPSb-R（表1），并在特异性引物5' 端加保护碱基( GGATCC ) 及T7 启动子( TAATACGACTCACTATA )。为了不影响RNAi后的转录水平检测，干扰片段不包括荧光定量PCR检测的片段。按照MEGAscript® T7 High Yield Transcription Kit（Ambion）试剂盒说明书合成dsRNA。合成后的dsRNA采用LiCl沉淀法进行纯化：向dsRNA反应体系中加入30ul的ddH2O和30ul的LiCl Precipitation Solution，-20℃放置1h左右，11000rpm，4℃离心15min，去上清后加入用DEPC水配制的70%的乙醇1ml进行洗涤，离心后去除乙醇，加入20ulddH2O溶解，放置-20℃等待使用。

取饲养在TN1水稻品种上2龄褐飞虱若虫进行人工饲养，饲养条件参照Fu 等（2001）的营养液配方，饲喂装置为两端覆盖Parafilm膜（内含取食液）的双通玻璃管（2.5cm × 15 cm），待试虫饲喂取食液5天适应后，进行RNA干扰处理，纯化的dsRNA用取食液配制到终浓度为0.5 μg/μL。处理时，以取食液加入相应体积的dsRNA稀释液为对照组（CK），每饲喂装置接入20只经过上述预处理且发育基本一致的褐飞虱若虫，设置3个重复，每天更换取食液，清理和统计死亡的褐飞虱，计算存活率。

此外，设置平行的RNA干扰处理，每饲喂装置放入25只发育一致的褐飞虱若虫，且两管作为一个重复，每2天对各组分别进行取样，每组取6只若虫，并进行RNA的抽提及后续ATPSb基因表达量的荧光定量PCR检测。

数据统计与分析

采用WPS Excel软件进行数据整理，运用SPSS16.0独立样本T检验进行显著性差异分析。

结果与分析

2.1 褐飞虱ATP合酶b亚基的cDNA全长克隆及序列分析

ATP合酶b亚基的核心片段以褐飞虱cDNA为模板，PCR扩增后得到一条与预期长度433 bp相符的特异性条带。测序结果表明该片段序列与实际相符，Blast X比对发现，克隆的褐飞虱ATP合酶b亚基片段与桃蚜Myzus persicae的ATP合酶b亚基序列一致性为57%。应用RACE法扩增cDNA全长，获得620bp 5'端序列和556bp 3'序列。利用DNAMAN软件对褐飞虱ATP合酶b亚基核心序列、3’端及5’端进行拼接，得到1150 bp全长cDNA（SEQ ID NO：1），并将该基因命名为ATPSb（GenBank登录号: MF973493）。通过ORF Finder分析发现褐飞虱ATPSb基因cDNA全长序列包含一个完整的 843 bp的开放阅读框，编码280个氨基酸（SEQ ID NO：2）。软件分析表明，ATPSb编码的蛋白分子量为32.4 kDa，等电点为8.25，未发现内质网定位相关的信号肽，符合ATP合酶b亚基在细胞质翻译，定位线粒体的预期。

褐飞虱ATP合酶b亚基的表达规律分析

荧光定量PCR检测表明，ATP合酶b亚基在TN1水稻饲养的褐飞虱不同龄期均有不同程度表达。其中，在褐飞虱不同发育阶段以低龄若虫为高，随着龄期增大呈下降趋势，5龄若虫的表达量为1-2龄若虫的0.58倍；在雌成虫中，ATPSb的mRNA水平也随着羽化时间增加而下降，羽化1天的雌成虫约为羽化9天的6倍（图1，左）。在成虫中，雄成虫中的表达量明显高于雌成虫（图1，右）。

对褐飞虱ATP合酶b亚基表达水平的影响

荧光定量PCR检测结果显示，饲喂0.5 μg/mL dsATPSb的RNA干扰组，ATPSb基因的mRNA水平总体呈现连续性下降。与对照组相比，dsATPSb干扰组在处理6天时，ATPSb基因的mRNA水平约为对照组的50%，二者之间的差异显著（P<0.05）；饲喂8天时，mRNA的水平继续降低，减少至对照组的40%（P<0.05）。以上结果表明，靶向ATPSb基因的RNA干扰取得了显著效果（图2）。

2.4 ATPSb基因的RNA干扰对褐飞虱存活率的影响

在RNA干扰实验中，连续喂养dsATPSb的RNA干扰处理对褐飞虱存活率产生了显著的影响。从第6天开始，喂食dsATPSb的处理组与对照组就达到了显著的差异（P<0.05），第12天时，达到了极显著的差异（P<0.01）。到第18天时，处理组的存活率已接近于0，但对照组仍有80%的个体存活（图3）。由此可见，ATP合酶b亚基ATPSb基因的干扰对褐飞虱正常的生理活动产生了极大地影响，ATPSb对褐飞虱的生存具有重要的意义。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 褐飞虱生存相关的ATPSb基因、编码蛋白及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1150

<212> DNA

<213> Nilaparvata lugens Stal

<400> 1

agagtacatg ggggcctgtg tcctgtgata ttgggtctgg atcgtgaagg gcaacaagaa 60

aatgttttcc agattagctt tcaattgcgc caaacaggtg cggccagccc tgataggtgc 120

agtgcgatgc agcggcaccg aagcggcaac gtcgcaatcg caacagctga tgagcaaggt 180

tgccgtgatg gcaccggcag ccagccgaca gctctcggcc accgccaccg gtgaccgccc 240

gccatgggag ggacccgagc gtgacctcgt caacttcccc cgccccgtca tgcccgagga 300

gcccggcaag gtccgctacc tcttcgtgcc tgaagagtgg ttcgagttct tttacaagaa 360

gactggtgtt actggtcctt acgtattggc tttcggtatt ttcaactatg taatgagcaa 420

agaagtgtgg ttaattgaac acgagtacta ctatgtttat gcgctggctg ccatcttcta 480

ttttggcgac aagaaatttg gaaagcaaat tggcgattat ttggacaaag agattgaagc 540

cgatacacat ttcttcgaaa aggataggct agacaagata gccaacttca acaagagcat 600

tgaggaggag aagacactgc agtggcagaa agaggccgac aagctgatca tcgaagccaa 660

acgcgagaac gtcgctctgc agcaggaggc cattttcaga gaacgtgcca tgttcgccta 720

ccaagaaatc aagaggcggt tggattacca gtcgcagaag cagctgatgg agcgacgcat 780

tgcgcagaag cacatggtcg aatggatcgt ggccaacgtg ctgaaggcca tcaccccgca 840

acaggaggcc gacacactca agaagtgcat cgtcgatctg caggccatgt cagccaaggc 900

ctaaaccctc ccccccctcc acttttagta aattatattc atcaacaaca ataagtcatc 960

ggtagaaatg tgtggtgaac tcaatcatgc aacctgtcaa cagtagaaga gatgcatgat 1020

gtgtggtgaa cttaccgcca tgaataaatg tcataaattc caattattgt tgaaagctaa 1080

tgtccttgcg aactgctaat aaattgttat agtttatatc gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140

aaaaaaaaaa 1150

<210> 2

<211> 280

<212> PRT

<213> Nilaparvata lugens Stal

<400> 2

Met Phe Ser Arg Leu Ala Phe Asn Cys Ala Lys Gln Val Arg Pro Ala

1 5 10 15

Leu Ile Gly Ala Val Arg Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ala Thr Ser Gln

20 25 30

Ser Gln Gln Leu Met Ser Lys Val Ala Val Met Ala Pro Ala Ala Ser

35 40 45

Arg Gln Leu Ser Ala Thr Ala Thr Gly Asp Arg Pro Pro Trp Glu Gly

50 55 60

Pro Glu Arg Asp Leu Val Asn Phe Pro Arg Pro Val Met Pro Glu Glu

65 70 75 80

Pro Gly Lys Val Arg Tyr Leu Phe Val Pro Glu Glu Trp Phe Glu Phe

85 90 95

Phe Tyr Lys Lys Thr Gly Val Thr Gly Pro Tyr Val Leu Ala Phe Gly

100 105 110

Ile Phe Asn Tyr Val Met Ser Lys Glu Val Trp Leu Ile Glu His Glu

115 120 125

Tyr Tyr Tyr Val Tyr Ala Leu Ala Ala Ile Phe Tyr Phe Gly Asp Lys

130 135 140

Lys Phe Gly Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Leu Asp Lys Glu Ile Glu Ala

145 150 155 160

Asp Thr His Phe Phe Glu Lys Asp Arg Leu Asp Lys Ile Ala Asn Phe

165 170 175

Asn Lys Ser Ile Glu Glu Glu Lys Thr Leu Gln Trp Gln Lys Glu Ala

180 185 190

Asp Lys Leu Ile Ile Glu Ala Lys Arg Glu Asn Val Ala Leu Gln Gln

195 200 205

Glu Ala Ile Phe Arg Glu Arg Ala Met Phe Ala Tyr Gln Glu Ile Lys

210 215 220

Arg Arg Leu Asp Tyr Gln Ser Gln Lys Gln Leu Met Glu Arg Arg Ile

225 230 235 240

Ala Gln Lys His Met Val Glu Trp Ile Val Ala Asn Val Leu Lys Ala

245 250 255

Ile Thr Pro Gln Gln Glu Ala Asp Thr Leu Lys Lys Cys Ile Val Asp

260 265 270

Leu Gln Ala Met Ser Ala Lys Ala

275 280

Claims

1.褐飞虱生存相关的ATPSb基因的应用，其特征在于，所述的应用为氨基酸序列如SEQID NO. 2 所示的ATPSb亚基在降低褐飞虱存活率的农药研发中的应用。

2.RNA干扰褐飞虱生存相关的ATPSb基因在控制褐飞虱方面的应用，其特征在于，所述的应用为使褐飞虱的存活率下降，所述的ATPSb基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。