CN104387460B - 一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的公开了一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供的新型杀虫蛋白对水稻褐飞虱有高毒力，为水稻抗稻褐飞虱提供了新的策略，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界范围内重要的粮食作物，然而水稻的病虫害严重影响了水稻的生产。随着转Cry1Ab及Cry1Ac等Bt蛋白水稻株系的推广种植预期可有效的防治鳞翅目和鞘翅目害虫的危害(Shu,Ye et al.2000,Breitler,Vassal et al.2004,Cohen,Chen etal.2008)。但是，也不可避免的促进了非靶标害虫昆虫如褐飞虱的种群数量和危害程度(Chen et al.2011)。因此，创制发展对稻褐飞虱等害虫有高毒力的新型杀虫基因迫在眉睫。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)是一种土壤杆菌，它在逆境条件下会形成芽孢并产生伴胞晶体，伴孢晶体由不同种Cry蛋白组成(亦被称为δ内毒素；δ-Endotoxins)，其对多鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫具有杀虫活性(Bravo,Likitvivatanavong et al.2011)。Cry蛋白的杀虫活性区通常由三个结构域组成，其中结构域I主要负责在昆虫中肠膜上形成孔洞，结构域II主要负责与昆虫中肠膜上受体结合，由此确定毒素特异性，结构域III的功能比较复杂，包括维持蛋白质的稳定性、协助结构域I在膜上穿孔及协助结构域II与膜上受体结合等等。通过对不同Cry蛋白的结构域II互换，会产生对某种害虫毒性增强的新的杀虫蛋白，因此通过结构域互换产生新的杀虫蛋白的方法被广泛的应用于Cry蛋白的改造(Saraswathy and Kumar 2004,Florez,Osorio etal.2012)。
Cry蛋白的对害虫的毒力非常高，且杀虫谱很窄，某一特定的Cry蛋白通常只对一种或几种昆虫起作用而对非靶标害虫及人畜完全无害。鉴于Cry蛋白的高效性和安全性，Cry基因也成为目前应用最广的用于抗虫转基因作物的杀虫基因(Romeis,Meissle etal.2006,Sanahuja,Banakar et al.2011)。然而，目前所发现的Cry蛋白主要是针对鳞翅目、鞘翅目和双翅目等害虫，对具有刺吸式口器的半翅目昆虫没有明显毒性(Chougule andBonning2012)。鉴于稻褐飞虱对水稻生产的重大危害，迫切的需要研发针对此类害虫的新型抗性基因。
发明内容
本发明的一个目的是提供抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白质，为HY151，其为用Cry54Aa1的结构域II替换掉Cry1Ac的结构域II得到的蛋白质，其包括Cry1Ac的结构域I、Cry54Aa1结构域II及Cry1Ac结构域III。
根据本发明，如在此定义的通过交换Cry1Ac及Cry54Aa1的结构域II，设计了相比于Cry1Ac及Cry54Aa1具有实质上改变的生化特性及杀虫活性的HY151蛋白。
本发明所创制HY151蛋白全长为614位氨基酸，其序列1到254位氨基酸来源于Cry1Ac，具有强的在昆虫中肠膜上形成空洞的能力；255到462位氨基酸来源于Cry54Aa1，具有与水稻褐飞虱中肠膜上受体特异结合的能力；463到614位氨基酸来源于Cry1Ac，具有稳定蛋白空间结构等功能。其序列经NCBI Blastp分析第36-254位氨基酸具有δ内毒素结构域I特征，其序列第259-452位氨基酸具有δ内毒素结构域II特征；其序列463-607位氨基酸具有δ内毒素结构域III特征。本发明所创制蛋白分子量为69037.1Da，等电点为4.85。本发明所创制HY151蛋白序列与NCBI数据库中已知序列比对，同源性最高为74％。
上述蛋白质为如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。
上述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的DNA分子；
2)其编码序列是序列表中序列3的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
HY151蛋白编码基因的核酸序列全长为1845bp。本发明所创制HY151基因序列与NCBI数据库中已知序列比对，仅有41％的部分与已提交序列有同源性，这一部分来源于Cry1Ac基因。与蛋白质序列相对应的，HY151基因序列第1-762位核苷酸来自于Cry1Ac基因，第763-1386位核苷酸来自于Cry54Aa1基因，第1387-1845位核苷酸来自于Cry1Ac基因。本序列所用密码子为水稻优势密码子。本序列亦去除了影响mRNA稳定的一些基序，包括可能的mRNA剪切位点、可能的mRNA加PolyA位点、重复的PolyA及PolyT序列以及一些正向或反向的重复序列。用此序列产生的转基因水稻株系可以高量的表达本基因所编码蛋白，并提供高水平的防治害虫的能力。
序列3为序列1的优化前序列。本优化方案适用于但不限于在水稻中高水平表达HY151蛋白。首先本序列所用密码子为水稻最优势密码子。序列优化时同时考虑到5’非编码区及3’非编码区对基因所转录之mRNA整体二级结构的影响，以确保mRNA具有更稳定，更利于高效翻译其所编码的蛋白的能力。本序列亦去除了影响mRNA稳定的一些基序，包括可能的mRNA剪切位点、可能的mRNA加PolyA位点、重复的PolyA及PolyT序列以及一些正向或反向的重复序列。另外，为了有效的翻译起始，可能需要修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列，Lütcke(Lütcke,Chow et al.1987)提出针对植物的一种合适的共有序列为：AACAAUGGC，Joshi(Joshi,Zhou et al.1997)等提出适合单子叶植物的序列C(A/C)(A/G)CAAUGGCG，Furukawa(Furukawa,Maekawa et al.2006)等发现了一个高效的适用于水稻的序列GCCGCCATGG。另外，为了有效的提高翻译效率同时引入了Ω序列(Sleat,Gallic etal.1987,Gallie,Sleat et al.1988)。应用本优化方案所得到的序列所产生的转基因水稻株系可以高水平的表达本基因所编码蛋白，并提供高水平的防治害虫的能力。
下述1)-4)中的任一种生物材料也是本发明保护的范围：1)含有上述核酸分子的表达盒；2)含有上述核酸分子的重组载体；3)含有上述核酸分子的重组菌；4)含有上述核酸分子的转基因细胞系。
上述含有上述核酸分子的重组载体在本发明的实施例中为将序列表中序列1所示的核苷酸插入原核表达载体pET41a的BamHI和XhoI酶切位点间得到的载体。
上述蛋白质或上述核酸分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在作为Cry类杀虫剂中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述杀虫的对象为水稻褐飞虱。
本发明提供新颖的工程化杀虫蛋白HY151，这一蛋白比Cry1Ac及Cry54Aa1有实质上的改变，包括靶标害虫品种及杀虫活力，这一蛋白的靶标害虫是且不仅限于稻褐飞虱(BPH；Brown plant hopper；Nilapavata lugens)。
本发明近一步涉及编码此HY151蛋白的核苷酸序列，并且涉及含有这些HY151蛋白的组合物以及配制品，它们能够抑制害虫的生存、生长以及繁殖的能力或者能够限制昆虫相关的对作物植物的损害或损失。本发明进一步描述了制造此HY151蛋白的一种方法以及使用这一蛋白的方法，进一步提出在转基因植物中赋予对稻褐飞虱等害虫的抗性应用。
上述蛋白质或上述核酸分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在防治水稻褐飞虱和/或制备防治水稻褐飞虱产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明所选用改造方法为交换两个不同杀虫蛋白的某一序列区段，使其同时具有两个杀虫蛋白的特征和优点。本发明所选用的两个杀虫蛋白其中Cry1Ac具有对鳞翅目昆虫强的杀虫毒性，Cry54Aa1具有对半翅目稻褐飞虱有较微弱的毒性。本发明所用两个杀虫蛋白的编码基因序列都经过序列优化以增强在水稻等植物体中高水平表达。本发明所采用的策略为：用Cry54Aa1能与褐飞虱中肠受体结合的结构域II替换对稻褐飞虱没有毒性的Cry1Ac的结构域II，利用Cry1Ac强的、能在昆虫中肠膜表面形成孔洞的能力，创制形成对稻褐飞虱毒性显著增强的新型杀虫蛋白HY151。结构域II的替换所采用的方法为重叠PCR(Overlap PCR)法。
定义
“杀虫蛋白”是指能够控制昆虫的的生存、生长以及繁殖的蛋白，并且主要是通过杀死昆虫的方式实现是生物活性。
“δ-内毒素”是指由苏云金芽孢杆菌在产生的，具有对不同昆虫具有毒性的蛋白质。
“靶标害虫”是指对某一特定杀虫蛋白敏感的昆虫称为此杀虫蛋白的靶标害虫，与此对应的对此蛋白不敏感的害虫称为非靶标害虫。
“结构域”：是蛋白质中的一类结构单元，是构成蛋白质三级结构的基本单元。它由不同的α螺旋、β折叠或者其它蛋白质二级结构组成，具有相对独立的空间结构和功能。
“工程化杀虫蛋白HY151”：是指包括HY151蛋白编码序列的一种核酸，这种工程化HY151基因可以衍生于一种天然的Cry类基因或者一种合成的Cry类基因。
“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面(5’非编码区)和后面(3’非编码区)的调控序列。
“植物”是指处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
“转化”是指将源核酸引入至一种宿主细胞或生物中的一个过程。
“外源基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。
“基序”是指DNA，蛋白质等生物大分子中的保守序列，在反式作用因子的结构中，基序一般指构成任何一种特征序列的基本结构(既指此具功能的基本结构，也指编码此结构的蛋白质/DNA序列)，作为结构域中的亚单元，其功能是体现结构域的多种生物学作用。
“mRNA剪切”是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。
“密码子”是指信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基亦称三联体密码。同一个氨基酸可由不同的密码子编码称为“密码子的简并性”。
“密码子偏爱性”是指由于密码子的简并性，每个氨基酸至少对应1种密码子，最多有6种对应的密码子。不同物种、不同生物体的基因密码子使用存在着很大的差异。各种生物体似乎更偏爱使用某些同义三联密码子。其中在某一物种中使用频率高的密码子称为该物种的“优势密码子”。
“重叠PCR”：是指采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来形成一条杂合DNA链。
“保护碱基”是指限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
“半致死浓度”是指在动物急性毒性试验中，使受试动物半数死亡的毒物浓度，用LC50表示。
本发明的实验证明，本发明在前期工作的基础上，创造性的改造了Cry1Ac及Cry54Aa1杀虫蛋白，并得到了对褐飞虱等刺吸式口器昆虫具有强杀虫活性的新型杀虫蛋白HY151，从而为防治稻褐飞虱等水稻害虫提供了新的策略，具有广阔的应用前景；以Cry1Ac和Cry54Aa1基因为基础，通过交换Cry1Ac和Cry54Aa1的结构域II，开发对稻褐飞虱具有高毒力的新型杀虫蛋白，是一项具有重大理论和应用价值的研究。
附图说明
图1为Cry1Ac NCBI Blastp CDD分析结果
图2为Cry54Aa1NCBI Blastp CDD分析结果
图3为HY151NCBI Blastp CDD分析结果
图4为HY151重组示意图
图5为HY151编码序列获得过程overlap PCR结果
图6为pET41a-HY151质粒BamHI、XhoI双酶切鉴定结果
图7为pET41a-HY151的质粒图谱
图8为Cry54Aa1、HY151及Cry1Ac氨基酸序列比对结果
图9为pET41a-HY151原核表达结果
图10为pET41a-HY151纯化结果
图11为HY151编码序列优化后密码子使用情况与水稻密码子比较结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例构建过程中质粒提取、酶切、DNA的回收、纯化均按分子克隆中的方法进行(Sambrook and Russell 2001)。
实施例1、新型杀虫蛋白基因HY151的获得
一、Cry1Ac及Cry54Aa1蛋白及基因序列分析
将Cry1Ac及Cry54Aa1氨基酸序列应用NCBI网站Blastp功能分析其保守结构域Conserved domains，并对应的找出其编码核苷酸序列。得出Cry1Ac结构域I为第36-254位氨基酸，对应的核酸编码序列为第106-762位核苷酸；结构域II为第259-461位氨基酸，对应的核酸编码序列为第775-1383位核苷酸；结构域III为第464-608位氨基酸，对应的核酸编码序列为第1390-1824位核苷酸，其余序列为结构域间连接序列，如图1所示。Cry54Aa1结构域I为第72-316位氨基酸，对应的核酸编码序列为第214-948位核苷酸；结构域II为第321-514位氨基酸，对应的核酸编码序列为第961-1542位核苷酸；结构域III为第525-672位氨基酸，对应的核酸编码序列为第1573-2016位核苷酸，其余序列为结构域间连接序列，如图2所示。
根据以上信息设计引物，用Cry54Aa1的结构域II替换掉Cry1Ac的结构域II，结构域I与结构域II、结构域II与结构域III的连接部分也来自于Cry54Aa1，应用NCBI网站Blastp功能分析结果如图3所示，构建模式如图4所示，与Cry1Ac及Cry54Aa1的氨基酸序列比对结果见图8。具体引物序列如下：
表1 为用来制造编码HY151蛋白的序列的引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| Cry1AcL | 5’-TTTGTGGATCCATGGACAACAACCCA-3’ |
| Cry1AcR | 5’-GGGCACTCGAGTTCAGCCTCGAGTGT-3’ |
| Cry54L | 5’-TTTGTGGATCCATGTCGATGAAGTCGC-3’ |
| Cry54R | 5’-GGGCACTCGAGAACGTCTGGGGTAAAC-3’ |
| DS1Ⅰ5ⅡL | 5’-CGAACTATGACTCCAGAACCTATCTTATTTCCACCAAGAG-3’ |
| DS1Ⅰ5ⅡR | 5’-CTCTTGGTGGAAATAAGATAGGTTCTGGAGTCATAGTTCG-3’ |
| DS5Ⅱ1ⅢL | 5’-ATGTGCTCGCTGGCGGCTACAACATCATCGCATCCGATAG-3’ |
| DS5Ⅱ1ⅢR | 5’-CTATCGGATGCGATGATGTTGTAGCCGCCAGCGAGCACAT-3’ |
二、HY151基因PCR扩增
全部构建过程PCR扩增选用高保真Fast Pfu DNA Polymerase购自全式金生物技术公司，货号为：AP221。扩增体系采用50μl体系，具体如下：
表2 为扩增体系
PCR扩增程序为：
表3 为扩增程序
具体流程为：用引物cry1AcL和引物DS1Ⅰ5ⅡR以Cry1Ac基因为模板扩增得到产物P100(762bp)；用引物DS1Ⅰ5ⅡL和引物Cry54R以Cry54Aa1基因为模板扩增得到产物P055(1074bp)。接下来，用引物cry1AcL和引物Cry54R以P100和P055的混合物为模板扩增，得到产物P155(1836bp)。再然后，用引物cry1AcL和引物DS5Ⅱ1ⅢR以P155为模板扩增得到产物P150(1386bp)；用引物DS5Ⅱ1ⅢL和引物Cry1AcR以Cry1Ac基因为模板扩增得到产物P001(450bp)。
最后，用引物cry1AcL和引物Cry1AcR以P150和P001的混合物为模板扩增，得到1845bp的PCR产物，其核苷酸序列为序列表中序列3，为优化前HY151基因。
全部构建过程的PCR结果见图5。
三、HY151基因的优化
序列优化采用金斯瑞公司密码子优化软件OptimumGeneTM，采用水稻(Oryzasativa subsp.indica)最优势密码子，参考密码子表：
(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝311553&aa＝1&style＝GCG)，去除XmaI、KpnI、NotI和XhoI等酶切位点。序列优化时同时考虑到5’非编码区及3’非编码区对基因所转录之mRNA整体二级结构的影响，去除影响mRNA稳定的一些基序，包括可能的mRNA剪切位点、可能的mRNA加PolyA位点、重复的PolyA及PolyT序列以及一些正向或反向的重复序列。另外，加入了Kozak序列GCCGCCATGG(Furukawa,Maekawa etal.2006)及Ω序列(Gallie,Sleat et al.1987,Gallie,Sleat et al.1988)。优化后序列与优化前比较参数如下表4和表5。
表4.HY151序列优化前后碱基组成比较
表5.HY151序列优化前后GC含量及自由能比较
图11为HY151编码序列优化后密码子使用情况与水稻密码子比较结果。
按照上述方法，优化后的PCR产物核苷酸序列为序列表中序列1，将该PCR产物的基因命名为HY151，该基因编码的蛋白命名为HY151，其氨基酸序列为序列表中序列2。
四、杀虫蛋白HY151的原核表达及纯化
1、重组载体的构建
将上述三获得的优化后的PCR产物经1％琼脂糖凝胶6v/cm，20min分离后从琼脂糖中切出含目标条带并用SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒纯化回收。回收产物HY151基因用BamHI及XhoI双酶切(全部酶切)，并连接入同是BamHI及XhoI双酶切的原核表达载体pET41a(100ng/μl×45μl)。具体酶切体系为：
50μl酶切体系：
表6 为酶切体系
| Components | Volume |
| PCR回收产物 | 45μl |
| 10×buffer | 5μl |
| Enzyme | 1μl each |
37℃，1h。
酶切产物再次经过1％琼脂糖凝胶6v/cm，20min分离并用SV Gel andPCR Clean-Up System试剂盒纯化回收，回收产物按以下条件连接，其中连接酶购自NEB公司T4DNA Ligase(货号为M0202L)：
10μl连接体系：
表7 为连接体系
| Components | Volume |
| HY151(BamHI+XhoI) | 4.5μl |
| pET41a(BamHI+XhoI) | 4μl |
| 10×buffer | 1μl |
| Enzyme | 0.5μl |
16℃，1h。
连接产物全部转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞(CD501)，并涂布含50mg/μl kanamycin LB平板。1L LB平板配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，121°高压灭菌20min。
第二天挑单克隆于10ml含50mg/μl kanamycin不含琼脂的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌12h，用Plus SV Minipreps DNA Purification System提取质粒酶切鉴定，结果见图6，并送睿博兴科公司进行测序，该质粒为将序列表中序列1所示的HY151基因插入pET41a载体得到的重组载体，命名为pET41a-HY151，其物理图谱见图7。
1L LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，121°高压灭菌20min。
2、重组菌的构建及目的蛋白的表达和纯化
将上述重组载体pET41a-HY151转化大肠杆菌表达菌株Trans BL21(DE3)(货号：CD601)转化操作按照产品说明进行操作，得到重组菌BL21(DE3)/pET41a-HY151。
采用同样的方法将pET41a空载体转化大肠杆菌表达菌株Trans BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pET41a。
第二天挑选重组菌BL21(DE3)/pET41a-HY151单克隆于10ml含50mg/μl kanamycin不含琼脂的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌12h。然后按照1:100接入新鲜的含50mg/μlkanamycin的100ml LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌，2h左右检测OD600，当OD600＝0.6时取500ul未诱导样品作为阴性对照。加入终浓度为1mM IPTG，并每2h取500ul诱导样品，重组菌BL21(DE3)/pET41a的样品只取第6个小时的样品。诱导6个小时后将各样品12000rpm离心1min加50μl 1×PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，PH 7.4)涡旋混匀，加50μl 2×SDS-PAGE loading buffer(120mM Tris-HCl 6.8,20％Glycerol,4％SDS,3％β-mercaptoethanol,0.02％bromophenol blue)混匀，沸水浴5min，跑1.2％SDS-PAGE胶检测。
结果如图9所示，其中，M：分子量marker；41a-：BL21(DE3)/pET41a未诱导对照；41a+：BL21(DE3)/pET41a诱导对照；151-：BL21(DE3)/pET41a-HY151未诱导对照；151+：BL21(DE3)/pET41a-HY151诱导结果，可以看出，BL21(DE3)/pET41a-HY151诱导条带与理论分子量为101kDa相符，说明蛋白HY151在大肠杆菌中得到诱导表达。
纯化过程为：挑选单克隆于10ml含50mg/μl kanamycin不含琼脂的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌12h。然后按照1:100接入新鲜的含50mg/μl kanamycin的200ml LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌，2h左右检测OD600，当OD600＝0.6时加入终浓度为1mMIPTG，16℃，200rpm诱导过夜。收集过夜诱导表达菌体，10,000g离心10分钟收集菌体。弃上清，用20ml 1×Ni-NTA结合缓冲液(50mM NaH2PO4,pH 8.0,300mM Nacl,10mM咪唑)重悬。并将重悬液置于大小合适的容器中，200W，10s，10s，超声至澄清。裂解物14,000g离心20min去除细胞碎片。离心后上清经0.45μm滤膜过滤(NML Syringe Filters-17598)，与Ni-NTAHis·Bind树脂混合，旋转混合器200rpm，4℃结合1h。用4ml 1×Ni-NTA漂洗缓冲液(50mMNaH2PO4,pH8.0,300mM Nacl,20mM咪唑)漂洗2次，用1ml 1×Ni-NTA洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4,pH8.0,300mM Nacl,2500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。
将洗脱液用SDS-PAGE检测，结果如图10，可以看出，得到分子量大小为101kDa的目的蛋白HY151。
洗脱后的蛋白用1×PBS透析缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，10％v/v甘油，pH 10.0)，4℃透析12h，中间换两次缓冲液。
纯化后的蛋白经BCA法(康为世纪试剂盒CW0014)测定浓度。
实施例2、新型杀虫蛋白基因HY151抗虫生物活性测定
供试虫源：水稻褐飞虱(Nilapavata lugens)为中国水稻所，赖凤香老师实验室提供。
供试样品：
实施例1制备的抗稻褐飞虱蛋白HY151，为原核表达纯化可溶蛋白，浓度及产量表明在对应蛋白的保存管上，干冰寄送，-80℃保存；
Cry54Aa1蛋白：采用实施例1的原核表达的方法，制备Cry54Aa1蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列4；
54T蛋白：采用实施例1的原核表达的方法，制备54T蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列5；
Cry1Ac蛋白：采用实施例1的原核表达的方法，制备Cry1Ac蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列6；
实验地点：委托中国水稻所赖凤香老师实验室进行。
实验方法：实验于中国水稻所人工气候培养室进行，环境温度为：27±1℃。飞虱饲喂采用全人工饲料，饲育器为长15cm，直径2.5cm的无底的圆筒形玻璃器皿，饲料室由双层拉薄的Parafilm膜夹饲料液滴组成。
生测时将各待测样品进行50μg/μl、100μg/μl、200μg/μl及500μg/μl终浓度的梯度稀释混入人工饲料饲喂飞虱，并设定无蛋白添加的纯阴性对照(CK)。
实验具体方案为：每管接初孵(1龄)若虫25头后用纱布封口，平放，用黑布遮光保湿，只露出Parafilm膜封口端。每处理设4次重复，每2天查虫，记录活虫数。以第6天或第8天计算LC50，(因第6、8天虫龄为3-4龄，如果试虫还未死亡，为害苗已经很严重了)。具体结果见表8，半致死浓度LC50结果见表9。
表8 为杀虫蛋白HY151对水稻褐飞虱毒性测定第8天结果
表9 为杀虫蛋白HY151对水稻褐飞虱第8天半致死浓度
| 蛋白名称 | LC50 |
| Cry54Aa1 | 435.5 |
| HY151 | 7.5 |
| Cry1Ac | Not available |
可以看出，杀虫蛋白HY151比Cry1Ac和Cry54Aa1对水稻褐飞虱的杀虫率更高。
Claims (9)
1.一种蛋白质，为用Cry54Aa1的结构域II替换掉Cry1Ac的结构域II得到的蛋白质，其包括Cry1Ac的结构域I、Cry54Aa1结构域II及Cry1Ac结构域III；
所述蛋白质为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的DNA分子；
2)其编码序列是序列表中序列3的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。
5.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。
6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。
7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组菌在作为Cry类杀虫剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述杀虫的对象为水稻褐飞虱。
9.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组菌在防治水稻褐飞虱和/或制备防治水稻褐飞虱产品中的应用。
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