CN104926940B

CN104926940B - 一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104926940B
Application number: CN201510326036.3A
Authority: CN
Inventors: 刘贤金; 仲建锋; 徐重新; 张霄; 刘媛; 张存政; 何鑫; 武爱华
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2035-06-15
Also published as: CN104926940A

Abstract

本发明公开一种人源杀虫蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；该人源杀虫蛋白是由抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7定向突变形成饱和突变库后应用噬菌体展示技术筛选获得；其与昆虫BBMV的亲和力显著高于突变前的抗体C7，可有效的替代Cry1B毒素用于生物防治虫害，且其与C7同属于人源抗体，作为生物农药时，对人体危害小。

Description

一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别是一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是一种昆虫病原菌，其主要杀虫活性物质为细胞内毒素伴胞晶体蛋白，对多种农业害虫具有特异性毒杀作用（Bravo andSoberon，2008）；Cry1B是Bt毒素的一种，其对鳞翅目昆虫的靶标受体主要包括中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）上的胺肽酶（aminopeptidase N，APN）和钙粘蛋白（cadherin）((Bravo et al., 2004; Pigott and Ellar, 2007)，APN属于锌结合金属蛋白酶家族蛋白，它的碳端结合部位富含N-乙酰氨半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc），这些区域就是同Cry1B类毒素的结合位点（ Knight et al., 1994；Knight etal., 2004）。抗Cry1B毒素独特型单链抗体（ Anti-idiotype antibody scFvs,Anti-IdscFvs) ，可以模拟Cry1B毒素的结构与功能，因此推测其受体也是昆虫BBMV上的APN。

Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险(Bravo and Soberon, 2008；Pigott et al, 2008)，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发，Cry1B毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry1B毒素并与其竞争受体蛋白，已成为目前国内外科研的重点，公开号为CN103773775A的中国专利公开了一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7（以下简称C7），其能模拟Bt毒素并用作生物农药防治虫害，取得了积极的效果，但是该抗体与昆虫BBMV结合能力不高，杀虫效果不甚理想。

实际上，基因工程抗体常常存在亲和力低的问题，实践中通常采用易错PCR技术以提高抗体亲和力，但是随机突变的氨基酸大部分并不能落在影响亲和力的关键氨基酸残基上，这种突变存在一定的盲目性，成功率较低（Kobayash et al.，2010）。基于计算机分子模拟为基础的定点突变是则是更为理性的突变方法，其在已知蛋白三维结构及功能等方面信息的基础上，可以预测分子间结合区域并确定关键氨基酸残基（Qiao et al.，2013），关键氨基酸的有利突变可以提高抗体的亲和力，在体外通过定点突变等基因工程手段可以构建限定性突变抗体库，进而筛选到高亲和力的抗体（Sheedy et al.,2008）。

随着对抗体结构与功能关系的认知不断加深，借助计算机模拟技术进行抗体改造可以在限定范围内有目的地引入突变，对不利于抗体-抗原结合的氨基酸位点进行设计与定向改造，Wong 等（1995）在已知抗原-抗体复合物三维结构的基础上，对抗苯偶氮基胂酸酯（anti-p-azophenylarsonate）Fab 重链108 位上的Phe定点突变为Trp之后,相对野生抗体而言，突变体亲和力就提高了10 倍；Farady等（2009）采用同源建模、分子对接等方法将II型跨膜丝氨酸蛋白酶（matriptase，又名epithin）的抗体E2重链CDR3区98位氨基酸由Thr到Arg突变产生了大量的自由能变化，接下来的实验证实突变将亲和力提高了14倍，达到了240 pM；Zhang等（2013）在构建了抗成纤维细胞活化蛋白单链抗体E3突变库的前提下，对CDR区进行了有目的地定点突变，其中效果最好的突变为将单链抗体E3的重链33位氨基酸Asp变为Gly，107位Tyr变为His,此E3 Mut2比野生型E3亲和力提高了4倍，这些定点突变的氨基酸几乎都分布在抗原抗体结合区域内，对抗体CDR区一些结构产生微小的变化，使得抗体和抗原结合区域的互补性更趋完善（Cauerhff et al.,2004）。为进一步对抗体分子结合区域改造指明了方向，目前结合定点突变来筛选抗Cry1B毒素独特型单链抗体的方法尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用，该人源杀虫蛋白是通过对C7定向突变后筛选获得，与稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalisGuenee)中肠BBMV具有较高的亲和力，本发明是这样实现的：

一种人源杀虫蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明所述人源杀虫蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（a）对抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7和稻纵卷叶螟中肠BBMV上的APN分别同源建模：抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7的VH选取人类生殖细胞抗体 3-23/B3作为同源建模的模板，VL模板选取人类抗体Vκ域作为同源建模的模板；CmAPN选择人 APN Cd13 作为同源建模的模板；

（b）利用ZDOCK程序对抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7和稻纵卷叶螟中肠BBMV上的APN的同源建模进行分子对接，将获得的对接复合物提交至Mitchell Lab的热点预测服务器KFC2，定义抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7为配体，确定配体的热点；

（c）根据步骤b确定的热点，以抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7序列的重链3区A123、Y124以及轻链2区S204、S207进行饱和突变，具体为：

首先以SEQ ID No.1和SEQ ID No.3为引物，以C7菌液为模板进行PCR扩增，将扩增产物置于冰上，加入Dpn I酶混匀，于37℃酶切过夜，次日获得产物A；

然后以产物A和SEQ ID No.2为引物，以C7菌液为模板进行PCR扩增,将扩增产物置于冰上，加入Dpn I酶混匀，于37℃酶切过夜，次日获得产物B；

再以SEQ ID No.4和SEQ ID No.2为引物，产物B为模板进行PCR扩增，获得产物C;

最后以SEQ ID No.1和产物C为引物，产物B为模板进行PCR 扩增，将扩增产物置于冰上，加入Dpn I酶混匀，于37℃酶切过夜，次日获得产物D；

（d）用NcoI酶和NotI酶对纯化后的产物D以及噬菌体载体pIT2分别进行双酶切，回收酶切产物并以T4 DNA连接酶连接，16℃温度下过夜；次日将连接产物转入TG1电转化感受态细胞中，然后将转化菌均匀涂布于TYE-AG平板中，37℃培养过夜；第二天，向TYE-AG平板中加入1 mL TY-甘油培养基，混匀后，获得饱和突变抗体库；

所述TY-甘油培养基为含有终浓度为15%甘油的2×TY液体培养基；

（e）以昆虫中肠刷状缘膜囊泡蛋白为靶抗原，利用噬菌体展示技术，经三轮“吸附-洗脱- 扩增”的淘筛过程，筛选出所述人源杀虫蛋白。

进一步，本发明所述人源杀虫蛋白的制备方法，步骤c所述PCR扩增是指：

PCR扩增体系为：2× PCR Premix 25μl、10 μM的引物各1μl、模板5μl、ddH₂O补足至50μl；

PCR扩增条件：94℃ 5 min;94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 1min，共 30 个循环;72℃ 延伸10 min;4℃保持。

一种本发明所述人源杀虫蛋白在农业害虫防治中的应用。

一种含有本发明所述人源杀虫蛋白的杀虫剂。

本发明通过预测抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7和稻纵卷叶螟中肠BBMV上的APN（CmAPN）相互作用的热点来确定配体 C7的改造位点，进行定点突变，从而定向构建C7的饱和突变抗体库，并通过对抗体库进一步筛选，获得与稻纵卷叶螟中肠BBMV具有较高亲和力的人源杀虫蛋白Y124G，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）本发明所定点突变改造C7的方法与传统抗体改造方法（易错PCR等）相比，避免了盲目性，成功率较高，而且基于计算机分子模拟为基础的定点突变，在已知蛋白三维结构及功能等方面信息的基础上，预测分子间结合区域并确定关键氨基酸残基，关键氨基酸残基更加准确的反应了抗体蛋白作用界面的特征，从而使得分子模拟计算更加准确，大大提高了预测准确度。

（2）由C7定点突变构建的饱和突变抗体库，其中的抗体骨架区(恒定区)未变，与C7同属于人源抗体，因此Y124G应用于农业虫害防治时，对人体危害小。

（3）Y124G与昆虫BBMV的亲和力显著高于突变前的抗体C7，可更有效的替代Cry1B毒素用于生物防治。

附图说明

图1 是C7的氨基酸序列结构示意图。

图2 是 C7的重、轻链三维结构示意图；其中，A为VH的三维结构示意图（选取人类生殖细胞抗体 3-23/B3为模板），B为VL的三维结构示意图（选取人类抗体Vκ域为模板）。

图3 是C7和CmAPN三维结构模型示意图；其中，A为C7三维结构图；B为CmAPN三维结构图。

图4是模型的Ranmachandan plot图；其中A为C7模型的 Ranmachandan plot 图，B为CmAPN模型的Ranmachandan plot 图。

图5 是Profiles-3D可靠性验证结果示意图；其中，A为 C7模型的可靠性验证结果示意图，B为CmAPN模型的可靠性验证结果示意图。

图6 是PyMOL软件输出的C7-CmAPN对接复合物空间结构示意图。

图7 是热点预测服务器KFC2预测的C7与CmAPN接触界面的热点示意图。

图8 是单克隆ELISA筛选突变型克隆；其中C7为野生型对照，CK-为阴性对照D5。

图9 是杀虫蛋白Y124G与稻纵卷叶螟中肠BBMV作用结构示意图；其中C7为野生型对照，CK-为阴性对照D5，CK+为阳性对照。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，下列实施例仅用于说明而非是对本发明权利要求范围的限制；下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。

实施例所涉及的实验材料：

C7菌液是由201410037175.X专利说明书实施例1步骤（2）中获得的与C7对应的单菌落，加入 2×TY-AG液体培养基培养至平台期，菌液OD₄₅₀值为1.2；

D5菌液由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室提供，为含有非“β ”类型的Ant1i-I1d ScFvs ，细菌处于生长平台期，菌液OD₄₅₀值为1.2；

噬菌体载体pIT2是提取C7质粒后，由Nco I 、Not I双酶切所得；

Nco I 、Not I酶、T4 DNA连接酶、Dpn I 酶、胰蛋白酶、辅助噬菌体M13K07均购于NEB公司；

PCR试剂购于东盛公司；

质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；

大肠杆菌TG1菌株购于英国Source BioScience公司；

TG1电转化感受态细胞：按照J.莎姆布鲁克所著《分子克隆实验指南》（第三版）（黄培堂译，2005）所述方法制备；

HRP-Anti-M13标签抗体购于GE 公司；

CrylB毒素购于上海佑隆生物科技有限公司；

6孔板(Costar 3516)以及96孔板(Costar 3599)购于美国Corning公司；

实施例涉及的培养基：

TYE培养基：在900 ml双蒸水中加入15.0 g琼脂糖，8 g NaCl，10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，用双蒸水定容到1 L，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用；

TYE-AG平板：在TYE培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素和质量比为1 %葡萄糖；

2×TY 液体培养基：在900 mL双蒸水中加入16 g胰蛋白胨，10 g酵母提取物和5 gNaCl，搅拌混匀，用双蒸水定容到1 L，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用；

TY-甘油培养基：2×TY液体培养基中加入终浓度为的15%甘油；

2×TY-AKG培养基：在2×TY的培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml卡那霉素和质量比为1 %葡萄糖；

2×TY-AG培养基：在2×TY的培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素和质量比为1 %葡萄糖；

2×TY-AK培养基：在2×TY的培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml卡那霉素；

PBS：称取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，分别加入到蒸馏水中，充分溶解后，定容到1 L；

PBST：在PBS中加入体积比为0.05%的吐温-20；

3 % MPBS：PBS中加入质量比为3%的脱脂奶粉；

PEG/NaCl：称取20 g PEG 8 000，14.61 g NaCl，加80 ml去离子水，定容到100ml，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。

实施例涉及的引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4均由上海生工公司合成；

抗独特型单链抗体Y124G测序由上海Introgene公司完成；

稻纵卷叶螟生物测定由扬州绿源生物化工有限公司完成。

实施例1 抗CrylB毒素独特型单链抗体C7、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis Guenee)APN(CmAPN)同源建模和分子对接

（1）同源建模

抗CrylB毒素独特型单链抗体C7（以下简称C7）的氨基酸序列已由公开号为CN103773775A的中国专利公开，其氨基酸结构如图1所示：C7序列由291个氨基酸组成，重、轻链分别包含3个CDR可变区，分别为CDR-H1：48-57，CDR-H2：72-86，CDR-H3:121-127，CDR-L1:178,-188，CDR-L2：204-210，CDR-L3：243-251（H：重链，L：轻链），重、轻链之间由15个氨基酸残基(GGGS)3的linker来连接，在序列末端带有6个H的组成的His标签；

CmAPN氨基酸序列由NCBI 蛋白质数据库获得，该基因登录号为：ADZ05466.1；

C7的同源建模方法为：利用NCBI的BLAST从PDB（Protein Data Bank, BrookhavenNational Laboratory)数据库分别搜索重、轻链的同源序列，并进行比对，根据一致性和相似性确定同源建模的模板，在分别构建、获取VH和VL的同源模型后，通过最小二乘法进行蛋白质主链结构重叠以最终构建C7三维结构；

CmAPN的同源建模方法为：直接在PDB数据库找到一致性较高的模板，同时采用CHARMm力场运用最陡下降法和共轭梯度法对模型的整体构象进行能量优化，消除不合理的张力；

在分别获得C7和CmAPN的同源建模后，再利用Ramachandran plot图和Profiles-3D 程序对同源模建获得的C7和APN三维结构进行打分，评价三维结构与一级序列的兼容性及其可靠性，具体为：

C7的VH选取人类生殖细胞抗体 3-23/B3（PDB：3QOS）的晶体结构作为同源建模的模板（Malia,2011），它们的氨基酸序列一致性89%，其三维结构如图2(A)所示,C7的VL模板选取人类抗体Vκ域(PDB:2BX5) （James, 2007），它们的氨基酸序列一致性达到了98%，相似性94%，其三维结构如图2(B)所示;CmAPN选择与目的蛋白一致性＞30%且已经解析空间结构的同源蛋白质作为模板，使用人类 APN Cd13 (PDB:4FYQ) (Wong,2012)作为建模模板，一致性为31%，符合同源建模规则；最终C7和CmAPN三维结构模型示意图如图3所示，其中图3（A）为C7三维结构图；图3（B）为CmAPN三维结构图。

再通过Ramachandran法对C7和CmAPN结构模型主链构型的Φ-Ψ 二面角的分布进行检查,结果如图4是所示，其中图4（A）为C7模型的 Ranmachandan plot 图，可见C7模型的95% 残基落在最佳区域；图4（B）为CmAPN模型的Ranmachandan plot 图，可见CmAPN模型中97%残基落在最佳区域；说明同源建模结构的氨基酸二面角是合理的。

接着运用Profiles-3D 程序对获得的结构进行可靠性验证，结果如图5所示，其中，图5（A）为C7模型的可靠性验证结果示意图，可见C7的可靠性积得分130.73，高于理想最高值108.56；图5（B）为CmAPN模型的可靠性验证结果示意图，可见CmAPN可靠性得分为293.21，位于理论最低值182.38和理想最高值405.29区域内；根据Ramachandran法和用Profiles-3D 程序的评估结果，认为同源建模所得到的C7和CmAPN 的模型是合理可信的。

本步骤中所有的计算分析、同源建模所采用的Modeller程序都是由DiscoveryStudio 2.5（ DS 2.5, Accelrys Software Inc., San Diego, CA, USA）软件完成；蛋白三维结构输出使用PyMOL软件(The PyMOL Molecular Graphics System, DeLanoScientific, San Carlos, CA,USA)完成。

（2）分子对接及热点预测

定义CmAPN为受体，C7为配体，利用ZDOCK程序对所构建的C7模型和CmAPN模型的三维结构进行分子对接，将ZDOCK 输出文件中所有的Poses都用RDOCK程序进行优化，并应用Identify Binding Interfac模块分析两者的候选结合位点，具体为：

利用ZDOCK模块模拟的C7和CmAPN之间的相互作用，将对接后所产生的Poses 进行RDOCK优化，选取E_Rdock值最低的构象作为对接结果，PyMOL软件输出的 C7-CmAPN对接复合物空间结构示意图如图6所示，分析结合界面( Binding Interface) 的氨基酸残基，结果受体CmAPN中有26个氨基酸残基( I501-Q505，Q508， A518-N525，D528-Y530，D535，I596，D598-D604)，配体C7中有19个氨基酸残基( S52-A55， S121-F125，S184-Y186，N188，S203-G208)参与了二者的相互作用。

将C7-CmAPN对接复合物提交到Mitchell Lab的热点预测服务器KFC2 Hot SpotPrediction Server（网址为http://kfc.mitchell-lab.org/）（Darnell et al.，2007）,预测结果如图7所示，热点预测服务器KFC2预测到的配体C7的热点有：Y54、A123、Y124、Y186、Y203、S204、S207；按照Kabat规则，位于重链CDR3区的有：A123、Y124；轻链CDR2区的有：S204、S207。根据公开号为CN103773774A；CN103773775A；CN103773776A这3个中国专利的报道，对这些抗独特型单链抗体序列经过比对发现，它们主要的变化发生在重、轻链2区和3区，因此可以选择C7序列的重链3区A123、Y124以及轻链2区S204、S207这两个部分进行饱和突变，构建饱和突变抗体库。

本步骤中涉及的所有程序都是由DS 2.5软件完成，并用由PyMOL软件进行图像输出。

实施例2 构建定点突变的饱和突变抗体库

根据实施例1的分子对接预测结果，选择C7序列的重链3区A123、Y124以及轻链2区S204、S207作为突变的区域。

引入饱和突变位点所涉及的引物序列：

SEQ ID No.1(LMB3-F): CAGGAAACAGCTATGAC;

SEQ ID No.2(pHENseq-R): CTATGCGGCCCCATTCA;

SEQ ID No.3(H-M): 5'CCCCAGTAGTCAAANNKNNKACCAGATTTCGC 3';

SEQ ID No.4(L-M): 5' CTCCTGATCTATNNKGCATCCNNKTTGCAAAGTGG 3';

其中，LMB3-F和pHENseq-R是扩增片段全长的上下游引物；H-M是引入重链3区A123、Y124的突变引物（其中下划线部分“NNKNNK”为饱和突变位点对应的密码子，下同）；L-M是引入轻链2区S204、S207的突变引物；将突变位点设计成 NNK（N为A、G、C 或T，K为G或T），可使每个位点完全包括20种氨基酸，有效的减少同义密码子的数量，并能有效的减少突变体库的筛选数量。

（1）重链3区A123、Y124突变

分别以SEQ ID No.1(LMB3-F)和SEQ ID No.3(H-M)为引物，C7菌液为模板扩增PCR；

PCR扩增体系为：2× PCR Premix 25μl、10 μM的LMB3-F引物和H-M引物各1μl、C7菌液5μl、ddH₂O补足至50μl；

PCR扩增条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 30 个循环;72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保持；

PCR反应结束后，将PCR产物置于冰上，加入适量Dpn I酶混匀，于37℃酶切过夜，以除去PCR产物中混有的未突变的模板质粒，次日获得产物A，检测得其浓度为60ng/ul；

本实施例利用“大引物PCR” 法突变，设计的引物中包含有预期的突变位点，这样PCR扩增出来的产物就应含有预期的突变位点，而待突变的质粒来源于大肠杆菌，在细菌中会被甲基化修饰，但是PCR产物不会被甲基化，因此用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使含有突变位点的PCR产物被选择性地保留下来，则认为获得的PCR产物就完成了定点突变。

（2）重链3区S204、S207突变

分别以步骤（1）获得的产物A和SEQ ID No.2(pHENseq-R)为引物，C7菌液为模板扩增PCR ；

PCR扩增体系为：2× PCR Premix 25μl、10 μM的产物A和pHENseq-R引物各1μl、C7菌液5μl、ddH₂O补足至50μl；

PCR扩增条件：94℃5 min，94℃45 s，56℃ 45 s，72℃ 1min，共 30 个循环，72℃延伸10 min，4℃保持；

PCR反应结束后，将PCR产物置于冰上，加入适量Dpn I酶混匀，于37℃酶切过夜，次日获得产物B，检测得其浓度为45ng/ul；

（3）轻链2区S204、S207突变

分别以SEQ ID No.4(L-M)和SEQ ID No.2(pHENseq-R)为引物，步骤（2）获得的产物B为模板扩增PCR ，

PCR扩增体系为：2× PCR Premix 25μl、10 μM的L-M引物和pHENseq-R引物各1μl、产物B 5μl、ddH₂O补足至50μl；

PCR扩增条件：94℃5 min，94℃45 s，56℃ 45 s，72℃ 1min，共 30 个循环，72℃延伸10 min，4℃保持；获得产物C，检测得其浓度为70ng/ul；

再次进行PCR扩增反应：分别以SEQ ID No.1(LMB3-F)和产物C为引物，步骤（2）获得的产物B为模板扩增PCR ，

PCR扩增体系为：2× PCR Premix 25μl、10 μM的产物C和pHENseq-R引物各1μl、产物B 5μl、ddH₂O补足至50μl；

PCR反应结束后，将PCR产物置于冰上，加入适量Dpn I酶混匀，于37℃酶切过夜，次日获得产物D。

（4）建立饱和突变抗体库

使用PCR产物纯化试剂盒对产物D进行纯化，纯化方法严格依据试剂盒说明书进行；用NcoI酶和NotI酶分别对获得的纯化产物和噬菌粒载体pIT2进行双酶切；分别回收酶切产物，用T4 DNA连接酶16 ^oC下连接过夜，次日获得连接产物；

取5 µl连接产物加入到100 ul感受态细胞TG1中，混匀，置于冰上放置10min；然后将混合物转移至已预冷的BTX电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部，HV,2.5 Kv,电击100 us；再将电击杯中的混合物转移到含有900 µl 2×TY液体培养基的离心管中，37°C，200rpm复苏1小时；然后将复苏产物均匀涂布于TYE-AG平板中，37°C过夜培养。

次日，随机挑取30个单克隆菌落测序，挑完菌落之后向TYE-AG平板中加入1 mLTY-甘油培养基，用玻璃涂布器刮起平板上的菌体细胞，并彻底混匀，即获得饱和突变抗体库，分装后于-80 ℃保存备用。序列比对表明该抗体库具有丰富的多样性，经菌落计数法测定该抗体库的库容为2.0×10³。

实施例3 杀虫蛋白的筛选

（1）稻纵卷叶螟中肠BBMV制备

参照Wolfersberger的实验方法（Wolfersberger，1987），使用Mg-EGTA沉降法制备稻纵卷叶螟中肠BBMV，具体做法为：取稻纵卷叶螟4龄末期幼虫，提取中肠，在预冷的0.15 MNaCl中清洗，每500只中肠加入3 mL匀浆缓冲液；3次反复匀浆冰浴后，取适量加入24 mMMgCl₂后涡旋混匀，冰浴并离心后将上清液转入新的高速离心管中再离心；弃上清后倒置离心管待液体流尽后，将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，分装后于-80℃贮存备用；BBMV蛋白浓度通过Bradford法测定。

（2）利用BBMV对饱和突变抗体库富集和筛选

用逐渐降低包被浓度的固相筛选方法，取实施例2获得的饱和突变抗体库进行3轮筛选：第一轮筛选将浓度为100μg/mL的BBMV包被于6孔板底部，4ml/孔，于4℃过夜，次日用PBS洗板3次，每孔加入5ml3 % MPBS,37℃封闭2 h；以PBS洗板3次；然后每孔加入1ml实施例2获得的抗体库、4ml3 % MPBS，37 ℃缓慢振摇1 h，静置1 h,用PBST洗板10次，加入0.5ml浓度为10mg/ml 的胰蛋白酶( Trypsin)，洗脱吸附在孔中的噬菌体，洗脱液即为第1 轮筛选的噬菌体抗体，用于下一轮筛选。后续2轮筛选的BBMV包被浓度分别是50μg/mL和25μg/mL，所使用的抗体为前一轮筛选获得的噬菌体抗体，除用PBST洗板20次外，淘筛方法与第1 轮相同。如此经过3轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，使特异性噬菌体有效富集。每轮筛选后对次级库整体亲和力变化趋势进行分析，结果显示，相对产出率随着筛选轮数的增高而提高，第3轮较第1 轮提高了12 倍（表1），可见3轮筛选后特异性突变株得到了有效的富集。

表1 饱和突变抗体库的富集和筛选

筛选轮数	包被蛋白	包被浓度	投入量	产出量	产出/投入
						1	BBMV	100μg/mL	2.0×10⁶	6.0×10²	3.0×10^-4
2	BBMV	50μg/mL	1.8×10⁶	3.5×10³	1.9×10^-3
						3	BBMV	25μg/mL	2.1×10⁶	7.5×10³	3.6×10^-3

（3）单克隆ELISA鉴定分析

37 ℃，取第三轮筛选获得的噬菌体抗体10μl（同时以C7菌液设立野生型对照,D5菌液设立阴性对照）侵染1 ml处于生长对数期的大肠杆菌TG1，然后涂布于TYE-AG平板，37℃培养过夜；随机挑取长出的单菌落转接至96 孔板中，于250 r/min、37℃条件下振荡培养过夜；次日，从中取2μL菌液转移至新的96孔板中，37 ℃振荡培养2 h后，每孔加入25 μl 滴度为10⁹的辅助噬菌体M13K07，培养1 h；于1800 g 离心10 min，去掉上清液，每孔加入200μL 2×TY-AKG培养基重悬细胞，于250 r/min、30℃条件下振荡培养过夜；次日1800 g离心10 min，取上清液备用；（野生型对照为C7上清液，阴性对照为D5上清液）；

取30 ug/mL稻纵卷叶螟中肠BBMV包被96微孔板过夜，100 μl/孔，次日每孔加入200μl3 %MPBS溶液，37 ^oC静置孵育2 h进行封闭；每孔用250 μl PBST洗板，然后加入上清液，100 μl/孔？？，37 ^oC孵育2 h ；每孔用250 μl PBST洗板，加入1:5000稀释的HRP-Anti-M13标签抗体，37 ^oC孵育1 h；PBST洗板后加入四甲基联苯胺（ TMB）显色液，100 μl/孔？？，37 ^oC下反应10～20 min，最后加入浓度为2 M的H₂SO₄快速终止反应，并用Thermo全自动酶标仪，测定OD₄₅₀值。

本实施例共挑取300个单菌落测定OD₄₅₀值，结果发现与单菌落对应的上清液OD₄₅₀值高于阴性对照的有12个，其中3个最高的单菌落3A5、3G2和2F7对应的上清液OD₄₅₀检测结果如图8所示，图中，C7为野生型对照，CK-为阴性对照，该三个单菌落将用于下一步的测序分析。

序列比对结果表明3A5的重链3区124位发生了点突变，其基因序列如SEQ ID No.5所示，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，申请人将该段抗独特型单链抗体自命名为Y124G；3G2没有发生突变，跟C7序列完全一致；2F7序列的重链2区76位出现终止子；因此最终只选择3A5（Y124G）用作下一步的Biacore分析，与Y124G相对应的上清液为突变型上清液。

实施例4 杀虫蛋白Y124G与昆虫BBMV的结合实验

取实施例3中处于平台期的突变型上清液200 μL，（野生型对照、阴性对照分别取实施例3中获得的C7上清液和D5上清液）加入到20 mL 2×TY-AG 培养基中，于250 r/min、37℃条件下振荡培养至OD₆₀₀=0.4 (约2 h)后，加入2×10¹¹辅助噬菌体M13K07，200 r/min、37 ℃振荡培养1 h；于1 800 g 条件下离心10 min，去上清液，用20 mL 2×TY-AK培养基重悬沉淀，200 r/min、30 ℃振荡培养过夜；次日于1800 g条件下离心10 min，加入5 mL PEG/NaCl充分混匀后冰浴1 h；然后于3300 g 条件下离心30 min，弃上清，再用10 mL PBS 重新悬浮沉淀，最后再于116000 g 条件下离心10 min，取上清液，作为突变样品用于后续样品检测；野生型对照为处于平台期的C7上清液，其检测样品为野生型样品；阴性对照为处于平台期的D5上清液，其检测样品为阴性样品。

实验操作使用BIAcore X100 实验平台(GE Healthcare)，数据分析使用BiacoreX100 评价软件(GE Healthcare)，实验方法采用Richter等（2014）和Kalyoncu等（2014）的实验方法，反应过程中所用材料氨基偶联试剂盒、系统缓冲液HBS-EP (10 mmol/L HEPESpH 7.4，150 mmol/L NaCl，3 mmol/L EDTA，0.05% Tween 20)、上样缓冲液(10 mmol/LNaAc pH=4.0, 4.5, 5.0, 5.5)；再生缓冲液(10 mmol/L Glycine-HCl pH=1.5, 2.0,2.5, 3.0，5 mmol/L NaOH )和CM5传感芯片(sensor chip CM5)均为Biacore 标配产品。实验所用受体蛋白稻纵卷叶螟中肠BBMV使用PBS溶解到500 mg/L，反应时用NaAc稀释到50mg/L；待测样品Cry 1B（阳性对照CK⁺）和抗独特型单链抗体Y124G（突变型）、C7（野生型）、D5（阴性对照CK^-）使用HBS-EP缓冲液稀释到指定浓度,所有试剂均用去离子水配制，用0.22 μm滤膜过滤，使用前超声除气。

稻纵卷叶螟中肠BBMV作为受体蛋白，通过氨基偶联法固定到CM5传感芯片上。将CM5传感芯片FC1通道设为对照通道，FC2通道设为反应通道。活化FC2通道并且待基线平稳后，分别进样一定体积的不同pH值(4.0，4.5,5.0, 5.5)，包含BBMV(50 mg/L) 的NaAc(10mmol/L) 缓冲液，通过传感图谱判断吸附情况选取合适的pH值，封闭并确定固定BBMV至芯片上的蛋白量。然后使用不同pH值(1.5, 2.0, 2.5, 3.0)再生缓冲液确定芯片再生反应的最适pH值。所有样品均以10 μL/min的流速连续经过芯片表面，上样时间均为120 s，再生时间60 s。FC1通道为氨基偶联试剂盒活化-失活处理的对照通道，FC2通道是固定了BBMV的反应通道。最后的传感图显示FC2-FC1的响应值(以RU表示)。该RU值排除了受体和配体之间静电吸附导致的非特异性干扰信号，并扣除液体折射参数的变化和背景的非特异性作用。

SPR测定上样缓冲液选择pH=4.0的NaAc (10 mmol/L) 最终偶联量为1267 RU，再生选择pH 值2.5的Glycine-HCl(10 mmol/L)和5 mmol/L NaOH。Y124G、C7、D5、Cry1B作为待测分析物，逐个流过CM5芯片表面。样品同BBMV的结合能力如图9所示,阴性对照D5同BBMV基本没有结合，Cry1B毒素(20 μg/mL)的结合能力最强。突变型Y124G比野生型C7的结合能力强，提高了2.1倍。

实施例5 生物测验

将新鲜水稻叶分别放入10mL实施例4制备的突变样品中，浸渍10 s后取出晾干；野生型对照为实施例4制备的野生型样品，阴性对照为实施例4制备的阴性样品，阳性对照为浓度为0.2g/L Cry1B毒素，空白对照为清水。

将处理后的水稻叶分别放入养虫小管，每管接入1头已饥饿4 h的稻纵卷叶螟3龄幼虫，然后置小管于温度为26±1 ^oC，相对湿度80±5 %，光照条件大于14 h的培养箱内饲养。24、48、72 h后分别观察、记录死亡虫数，并于每次观察后更换新的处理叶或对照叶继续饲养直到实验结束。取出幼虫检查时以小毛笔轻触虫体，无明显反应者为死亡。各处理使用20头3龄幼虫，每处理3次重复。试虫死亡率采用Abbott公式对死亡率进行校正，并以平均数±标准误表示（3 次重复试验）。

校正死亡率＝（处理死亡率－对照死亡率）／（1－对照死亡率）×100％

各处理时间相同时各个样品之间的比较采用单因素方差分析（One －way ANOVA）和Tukey 显著性检验，使用SPSS软件进行数据处理，处理结果如表2所示：

表2 抗独特型单链抗体对稻纵卷叶螟的杀虫效果比较

注：表中各列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

由表2可见，经过24 h的处理，杀虫蛋白Y124G跟野生型C7单杀虫效果无明显差异，但是48 h后，尤其是经过72 h的处理，Y124G将野生型C7的校正死亡率从42.22%提高到56.67%，杀虫活性显著提高，因此认为，杀虫蛋白Y124G为“β型”，且与CmAPN具有较高亲和力。

本发明所保护的技术方案并不仅限于上述实施例，本领域技术人员应当理解，根据本实施例记载的内容，不经过创造性劳动对其进行部分修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用

<140> 2015103260363

<141> 2015-06-15

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggaaacag ctatgac 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctatgcggcc ccattca 17

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccccagtagt caaannknnk accagatttc gc 32

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcctgatct atnnkgcatc cnnkttgcaa agtgg 35

<210> 5

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atagttagcg taacgatcta aagttttgtc gtctttccag acgttagtaa atgaattttc 60

tgtatgaggt tttgctaaac aactttcaac agtctatgcg gccccattca gatcctcttc 120

tgagatgagt ttttgttctg cggccccgtg atggtgatga tgatgtgcgg ccgcccgttt 180

gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt agaaggataa gcagcagcct gttgacagta 240

gtaagttgca aaatcttcag gttgcagact gctgatggtg agagtgaaat ctgtcccaga 300

tccactgcca ctgaaccttg atgggacccc actttgcaaa gaggatgcac tatagatcag 360

gagcttaggg gctttccctg gtttctgctg ataccaattt aaatagctgc taatgctctg 420

acttgcccgg caagtgatgg tgactctgtc tcctacagat gcagacaggg aggatggaga 480

ctgggtcatc tggatgtccg tcgacccgcc accgccgctg ccacctccgc ctgaaccgcc 540

tccaccgctc gagacggtga ccagggttcc ctgcccccag tagtcaaaac cagcaccaga 600

tttcgcacag taatatacgg ccgtgtcctc ggctctcagg ctgttcattt gcagatacag 660

cgtgttcttg gaattgtctc tggagatggt gaaccggccc ttcacggagt ctgcgtaacc 720

tgtagcacca ccattattag caatagttga gacccactcc agccccttcc ctggagcctg 780

gcggacccag ctcatggcat agctgctaaa ggtgaatcca gaggctgcac aggagagtct 840

cagggacccc ccaggctgta ccaagcctcc cccagactcc aacagctgca cctcggccat 900

ggccggctgg gccgcgagta ataacaatcc agcggctgcc gtaggcaata ggtatttcat 960

tatgactgtc tccttgaaat agaatttgca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 1020

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 1080

aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaact 1119

<210> 6

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ala Asn Asn Gly Gly Ala Thr

65 70 75 80

Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Gly Ala Gly Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ala Ala Ala Tyr Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Gly

260 265 270

Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala

275 280 285

Claims

1.一种人源杀虫蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

2.如权利要求1所述人源杀虫蛋白在农业害虫防治中的应用。

3.一种含权利要求1所述人源杀虫蛋白的杀虫剂。