CN110563806A - 靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列及应用，属于抗菌药物抗原检测领域。本发明借助于分子对接及虚拟筛选技术，在恩诺沙星单链抗体晶体结构的基础上，通过分子对接技术，搜寻虚拟多肽库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体。其多肽序列为DYYGNNYLDYYGL和FMYAFLGE。通过ELISA结合试验结果表明，恩诺沙星单链抗体能够与相应靶标抗原有良好的结合能力，借助本发明设计而成的多肽，可用于对恩诺沙星抗原进行定量和定性的快速检测。

Description

靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列及应用
技术领域
本发明涉及一种靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列及应用，属于抗菌药物抗原检测领域。
背景技术
利用噬菌体展示技术筛选氟喹诺酮类抗菌药物的特异性单链抗体，不依赖细胞融合和动物免疫就可以得到抗体，表达纯化后ELISA鉴定抑制效果，试验周期短。通过与Internet上的NCBI DNA数据库相联，用SWISS-MODEL软件对scFv基因序列进行同源建模，分析其结构。
基于分子对接的虚拟筛选技术是一种新兴的研究多肽与蛋白质之间相互作用的技术手段。这一技术主要是运用计算机快速运算实现多肽与相应靶标蛋白在空间构象上的对接，将虚拟多肽数据库中的分子逐一与靶标蛋白晶体结构的特定活性位点进行对接，通过计算机快速运算并不断调整多肽与靶标蛋白结合的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角和靶标蛋白的氨基酸残基侧链和骨架，寻找多肽分子与靶标蛋白在空间结构上的最佳构象，并预测两者之间的结合模式与亲和力，通过评分值挑选出接近天然构象的与靶标蛋白亲和力最佳的多肽配体的一种理论模拟分子间相互作用的方法。
恩诺沙星是一类化学合成的第三代喹诺酮类抗菌药，是小分子化合物，属于半抗原，将其与蛋白质载体进行偶联后，再制备成完全抗原，即指小分子物质必须和载体蛋白偶联之后方能刺激机体产生特异性的抗体，并包被于固相载体上用于ELISA检测。该药物具有抗菌谱广、抗菌力强、作用迅速、吸收完全、毒作用小和不易产生耐药等特点；随着恩诺沙星的广泛应用，在动物源性食品中的残留将对人类身体健康产生非常大的危害，已引起广泛关注,有必要进一步对其加强监测。
发明内容
本发明借助于分子对接及虚拟筛选技术，在恩诺沙星单链抗体晶体结构的基础上，通过分子对接技术，搜寻虚拟多肽库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体。通过ELISA结合试验结果表明，恩诺沙星单链抗体能够与相应靶标抗原有良好的结合能力，由此证明，借助本发明设计而成的多肽，可用于对恩诺沙星抗原进行定量和定性的快速检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列为SEQ ID NO.1：DYYGNNYLDYYGL和SEQ ID NO.2：FMYAFLGE。
所述的靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列，包括以所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的相应调整或修饰；修饰材料包括但不限制于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
所述的靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列在恩诺沙星抗原的鉴定中的应用。
所述的序列在恩诺沙星抗原的快速检测中的应用。
所述快速检测包括但不局限于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。
所述的序列在对恩诺沙星抗原进行定量和定性检测中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明借助于分子对接及虚拟筛选技术，在恩诺沙星单链抗体结构的基础上，通过分子对接技术，搜寻虚拟多肽库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体，最终得到特异性结合恩诺沙星抗原的多肽序列，其多肽序列为DYYGNNYLDYYGL(SEQ ID NO.1)和FMYAFLGE(SEQ ID NO.2)。经与恩诺沙星抗原进行亲和力鉴定，亲和力较好。
2、由于纯化技术的局限性，针对恩诺沙星的抗体获得很难，本发明设计得到的序列很好地避免了这一难题，实现快速的人工合成，检测成本低廉。
3、本发明设计而成的序列特异性较好。
4、本发明通过计算机辅助实施分子对接，可为实现恩诺沙星单链抗体结构功能解析提供较好的理论指导。
5、本发明通过对筛选序列进行标记，可实现对恩诺沙星抗原进行定性和定量的快速检测；具有操作简单、省时省力和费用低等优点。
附图说明
图1为重链(VH)、轻链(VL)基因的扩增琼脂糖凝胶电泳结果；
图中M指Marker，VH指重链基因片段，大小约340bp，VL1、VL2、VL3、VL4指轻链基因片段，大小约320bp。
图2为恩诺沙星ENR在大肠杆菌中的表达结果；
蛋白表达进行超声破碎后沉淀中表达量较高，上清表达量少。上清进行纯化后，洗脱液中的目的蛋白量较少，超微量紫外分光光度计检测蛋白浓度为1.84mg/ml。洗脱液1为100mM咪唑洗脱下的蛋白，洗脱液2为200mM咪唑洗脱下的蛋白。
图3为ENR-scFv同源建模的最佳模板(上图)和建模结果(下图)。
具体实施方式
实施例1：运用pCANTAB5e系统展示重组抗体建库及淘筛
一、脾细胞总RNA提取
1、颈椎脱臼法处死小鼠(未免疫的BALB/c小鼠)，将小鼠浸泡在75％(V/V)的酒精中10分钟，取出后将其置于白板上仰卧暴露腹部，放入超净工作台内，用灭菌剪刀开腹，用镊子取出脾脏。将脾脏放入盛有10mL灭菌的0.02M PBS缓冲液的平皿中，剥去周围脂肪组织，洗涤外表面，再放入盛有10mL灭菌的0.02M PBS缓冲液的平皿中漂洗1次，彻底洗去脾脏表面游离的脂肪细胞。
2、将脾脏置于灭菌后的尼龙网上，剪碎，用10mL灭菌的0.15M PBS缓冲液冲洗，边冲边用剪刀研磨。根据组织剩余量再加10mL灭菌的0.15M PBS缓冲液，使脾细胞全部通过网孔流入小烧杯中。
3、取下网袋，吹打均匀平皿内脾细胞悬液，将其转移到50mL离心管中。
4、4℃1000rpm离心10分钟，舍弃上清液。
5、沉淀细胞再用10mL灭菌的0.15M PBS缓冲液重悬离心洗涤一次。舍弃上清液，余离心管底部少量细胞悬液。
6、分离脾细胞后,以TRIzol法进行RNA提取，产物进行紫外分光光度计检测，浓度为39.33ng/μL，OD值260/280为1.787，OD值260/230为2.035。说明提取的RNA纯度较高。二、小鼠轻链(VL)、重链(VH)基因的扩增与鉴定
以所得总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，使用VL、VH引物扩增全套抗体基因。反应条件如下:94℃预变性5min，94℃45s，58℃1min，2℃45s，共进行30个循环，72℃延伸10min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段。结果见图1。所用引物见表1。
表1.引物序列及含义
注：表中VH for中下划线处为Sfi I酶切位点，VL back中下划线处为Not I酶切位点；VH back及VL for中下划线部分为(Gly4Ser)3序列；序列中简并碱基符号为W＝A/T；S＝G/C；M＝A/C；R＝A/G。
三、全长单链抗体(scFv)基因的组装
以编码柔性肽((Gly4Ser)3)的基因序列为接头，通过重叠延伸PCR技术将VL、VH基因组装成为含有酶切位点的全长scFv基因。PCR程序如下：先在常规PCR反应体系(50μL)中加入等摩尔VL、VH基因，94℃预变性5min，94℃45s，68℃1min，72℃45s，共进行10个循环，72℃延伸10min；以此产物为模板，以引物scFv for和scFv back进行二次PCR，94℃预变性5min，94℃45s，60℃1min，72℃45s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段。
四、噬菌体单链抗体表面展示文库的构建及鉴定
分别对scFv基因和pCANTAB5E噬菌粒载体进行SfiⅠ、NotⅠ双酶切并连接，转化E.coli TG1感受态细胞并涂板，37℃过夜培养后进行菌落计数，菌落计数为5.2×105(即为初级库库容量)。随机挑取单菌落进行PCR鉴定、BstNⅠ酶切鉴定,并提取噬菌粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定；将剩余转化菌液扩大培养，加入M13KO7辅助噬菌体37℃静置感染30min后，离心沉淀菌体细胞,用2×YT-AK培养基重悬，37℃震荡培养过夜,离心取上清液，加入PEG/NaCl冰浴1h，离心并重悬沉淀，经0.45μm滤膜过滤后所得即为初级噬菌体抗体库。五、噬菌体单链抗体库的亲和富集与免疫筛选
将所得初级噬菌体抗体库加入至ENR-BSA包被的96孔板中，37℃静置孵育1h，洗涤，100mmol/L三乙胺洗脱与抗原吸附的噬菌体,随后立即加入1mol/L Tris(pH8.5)进行中和，以此感染对数生长期E.coli TG1，经培养后收集菌体细胞，再次加入M13KO7辅助噬菌体进行感染，重复上述富集程序3～4次，挑取单菌落扩大培养，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
实施例2.序列与恩诺沙星的效价与抑制的ELISA鉴定
(一)ELISA鉴定恩诺沙星的效价
1、将恩诺沙星抗原以1μg/mL(蛋白量计)进行酶标板包被；PBS缓冲液进行酶标板包被，作为对照。其中，包被抗原均采用碳酸盐(CBS)缓冲液进行稀释，每孔50μL加入96孔酶标板中，置于4℃条件下过夜，用磷酸盐吐温PBST缓冲液洗涤5次后再用质量分数1％的牛血清白蛋白BSA液进行封闭。
2、将人工表达纯化的恩诺沙星单链抗体使用PBS缓冲液(pH 7.4)进行倍比稀释，以每孔50μL的体积加入到上述酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育30min。
3、用PBST缓冲液洗涤5次，并甩干酶标板孔中的液体；使用PBST缓冲液将偶联辣根过氧化物酶的亲和素稀释1000倍，以每孔50μL的体积加入甩干的酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育30min。
4、根据试验所需量，将TMB显色液以每孔100μL的体积加入到上述酶标板中，充分混匀30s之后，室温条件下显色10min。
5、将2M的硫酸液终止液以每孔50μL的体积加入上述酶标板中，充分混匀30s之后，在酶标仪器上，读取各孔在450nm处的吸光值，当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，判定结果为阳性。测定结果见下表2。
稀释倍数 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 阴性+PBS
抗体OD值 2.704 2.423 2.121 1.913 1.363 0.804 0.579 0.272 0.125 0.036 0.018 0.057
细胞上清OD值 1.759 1.514 1.071 0.987 0.868 0.779 0.604 0.484 0.173 0.084 0.062 0.061
结果表示：恩诺沙星单链抗体与抗原结合测得的OD值与细胞上清亲和力相当，说明恩诺沙星单链抗体的效价高，具有较好的亲和力。
(二)ELISA鉴定恩诺沙星的抑制
1、将恩诺沙星抗原以1μg/mL(蛋白量计)进行酶标板包被；PBS缓冲液进行酶标板包被，作为对照。其中，包被抗原均采用碳酸盐(CBS)缓冲液进行稀释，每孔50μL加入96孔酶标板中，置于4℃条件下过夜，用PBST缓冲液洗涤5次后再用质量分数1％的BSA液进行封闭。
2、将恩诺沙星药物的标准品使用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释成500ng/μL的浓度，以每孔50μL的体积加入到酶标板中，依次倍比稀释至31.25ng/μL，将人工表达纯化的恩诺沙星单链抗体使用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释成500ng/μL的浓度，以每孔50μL的体积加入到酶标板中与标准品混匀。设阳性对照孔不加标准品只加100μL恩诺沙星单链抗体。将酶标板置于37℃条件下，避光温育30min。
3、用PBST缓冲液洗涤5次，并甩干酶标板孔中的液体；使用PBST缓冲液将偶联辣根过氧化物酶的亲和素稀释1000倍，以每孔50μL的体积加入甩干的酶标板中，混匀后，置于37℃条件下，避光温育30min。
4、根据试验所需量，将TMB显色液以每孔100μL的体积加入到上述酶标板中，充分混匀30s之后，室温条件下显色10min。
5、将2M的硫酸液终止液以每孔50μL的体积加入上述酶标板中，充分混匀30s之后，在酶标仪器上，读取各孔在450nm处的吸光值，判定结果。测定结果见下表3。
标准品浓度 500ng/μL 250ng/μL 125ng/μL 62.5ng/μL 31.25ng/μL 0
OD值 0.062 0.074 0.183 0.502 0.629 1.109
半抑制浓度IC50为62.5ng/μL，说明恩诺沙星单链抗体具有较好的特异性。
实施例3.恩诺沙星单链抗体应用于恩诺沙星药物残留的检测
国际上常用的恩诺沙星药残的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等。这些方法虽然灵敏、准确，但检测时间长、耗资大、对人员素质要求高，不适合对大批量样品测定，不适应快速、简便的市场监测要求。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，如能应用于恩诺沙星残留的检测中，将会大大降低检测的成本并缩短检测时间。已有实验用EDC法制备恩诺沙星的完全抗原,用制备的抗原免疫小鼠，经细胞融合、克隆后成功获得了稳定分泌抗恩诺沙星单抗的杂交瘤细胞株，具有较高的抗体效价，抗体亚型为IgG1，抗体亲和力高，可用于氟喹喏酮类药物残留的检测。
本发明不需要依赖细胞融合或经动物免疫就能得到亲和力高的抗体，检测成本低廉，更为便捷高效。
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列及应用
<130> 分子对接及虚拟筛选技术
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gcggcccagc cggccatggc csaggtycag ctkcagcagt ctgga 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcggcccagc cggccatggc cgakgtrcag cttcaggagt argga 45
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gcggcccagc cggccatggc cgargtgaag ctggtggart ctggr 45
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gcggcccagc cggccatggc csaggtccar ctgcagsary ctggr 45
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<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
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<400> 6
tccagaaccg ccaccgccgc taccgccgcc acctgmrgag acdgtgastg argtt 55
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
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agcggcggtg gcggttctgg aggcggcggt tctgayatgc agatgacmca gwc 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
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<400> 10
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<400> 11
cgcaattcct ttagttgttc ctttctatgc ggcccagccg gccatggcc 49
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ggttccagcg gatccggata cggcaccgga ctagtcgcgg ccgcgtcgac 50
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 13
Asp Tyr Tyr Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 14
Phe Met Tyr Ala Phe Leu Gly Glu
1 5

Claims (6)

1.靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列，其特征在于，所述的多肽序列为SEQID NO.1：DYYGNNYLDYYGL和SEQ ID NO.2：FMYAFLGE。
2.根据权利要求1所述的靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列，其特征在于，包括以所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的相应调整或修饰；修饰材料包括但不限制于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的靶向识别恩诺沙星单链抗体的核心氨基酸序列在恩诺沙星抗原的鉴定中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的多肽序列在恩诺沙星抗原的快速检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述快速检测包括但不局限于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。
6.根据权利要求1或2所述的核心氨基酸序列在对恩诺沙星抗原进行定量和定性检测中的应用。
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