CN102206279A - 检测恩诺沙星的scFv抗体、其编码基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测恩诺沙星的scFv抗体，其包括重链和轻链，重链和轻链之间由柔性连接肽(Gly4Ser)3连接。重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。本发明还提供编码上述scFv抗体的基因。本发明检测恩诺沙星的scFv抗体，主要采用竞争性Elisa方法定性或定量检测样品中恩诺沙星的残留量；对样品的前处理要求低，前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；初次建库后，该种scFv抗体的制备便很方便，简单。采用高特异性的抗恩诺沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性好、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

Description

检测恩诺沙星的scFv抗体、其编码基因及应用
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域，具体地说，涉及一种检测恩诺沙星的scFv重组抗体、其编码基因及应用。
背景技术
恩诺沙星(Enrofloxacin，ENRO)，化学名称为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸，属于氟奎诺酮类，具广谱抗菌活性，对支原体有特效，对大肠杆菌、克雷白杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、金葡菌、链球菌等都有杀菌效用。
恩诺沙星可作为动物用药品，在动物体内的半衰期长，有良好之组织分布性，属于广效性抑菌剂，对于革兰氏阳性菌、阴性菌及霉浆体具有抑菌作用。它作为一种常用兽药在畜牧业生产中得到广泛使用。但因其具有一定的毒性，在动物性食品中的残留对食品卫生和公共健康产生威胁。
检测恩诺沙星残留的方法主要有仪器分析法和免疫学方法。化学分析方法因需要昂贵的仪器设备、对样品前处理要求高，且需要配备专门操作人员等，不适合现场监控检测。免疫学方法，目前主要是Elisa(酶联免疫吸附)方法，但该方法的核心试剂-单克隆抗体，因其制备和筛选过程繁琐，并对操作技术要求很高，故其广泛运用受到了很大限制。
综上，本发明人提出了运用噬菌体展示技术制备抗恩诺沙星的scFv重组抗体，并以此建立检测恩诺沙星残留的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测恩诺沙星的scFv抗体及编码该抗体的基因序列及氨基酸序列。
本发明的另一目的是提供上述scFv抗体及其编码基因在检测恩诺沙星中的应用。
为了实现本发明目的，本发明人运用噬菌体展示技术，将小鼠抗体的重链、轻链可变区基因进行体外扩增，并借助了15肽的连接肽段将重链和轻链片段拼接成一条单链抗体scFv，接着将该scFv片段插入噬菌体展示载体pCANTAB5e中，构建成重组质粒，并转化进宿主菌中，经过3轮固相淘筛和鉴定，获得了抗恩诺沙星的scFv单链抗体。其包括重链和轻链，其中，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。
前述的scFv抗体，重链和轻链之间的连接肽段为(Gly4Ser)3。
本发明还提供编码上述scFv抗体的基因，其中，编码scFv抗体重链的基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供含有编码上述scFv抗体的基因的载体。
本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。
本发明进一步提供上述scFv抗体、编码该抗体的基因、含有所述基因的载体或含有该载体的宿主细胞在检测恩诺沙星中的应用。
本发明还提供上述scFv抗体的制备方法，其是将编码上述scFv抗体的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。其中，所述表达载体为pCANTAB5e。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明检测恩诺沙星的scFv抗体，主要采用竞争性Elisa方法定性或定量检测样品中恩诺沙星的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的恩诺沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。能简便、高效地运用本发明获得的能分泌表达抗恩诺沙星重组抗体的重组菌株制备特异性的抗恩诺沙星scFv重组抗体。
附图说明
图1A和图1B：scFv-pCANTAB5e重组质粒sfiI和NotI双酶切电泳图，M：DL2000核酸分子量Marker，1～20：scFv-pCANTAB5e酶切产物。
图2：为30个重组菌诱导表达产生可溶性抗体scFv-ELISA检测结果。
图3：重组菌诱导表达产物SDS-PAGE电泳图，1：阴性对照，2：重组菌诱导表达胞周间质，3：重组菌诱导表达上清液，4：重组菌诱导表达全细胞提取物。
图4：恩诺沙星诱导表达上清可溶性重组抗体IC50实验结果曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的试剂盒材料均为市售商品。
实施例1免疫原及检测原的偶联制备
1、材料
牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、恩诺沙星(ENRO)标准品、透析膜、透析膜处理液、磁力搅拌仪、紫外分光光度仪。
2、方法
采用混合酸酐法，将恩诺沙星与蛋白大分子(BSA、OVA)进行偶联，制备免疫原和包被原。
2.1免疫原及包被原合成及纯化
A.中间产物制备
a.取20mg药物置于烧杯中，加入2ml DMF，若溶解不充分，可在超声波中助溶；
b.充分溶解后，加入25mg EDC和20mg NHS，磁力搅拌反应；
c.将以上烧杯用锡箔纸包裹好，室温磁力搅拌反应24小时，此液为A液。
B.合成及初步纯化
a.取50mg BSA(或OVA)溶于6ml PBS(0.01M，pH7.4)中，充分溶解，此液为B液；
b.在磁力搅拌下，将A液逐滴滴入B液中；
c.用锡箔纸将烧杯包裹，室温搅拌反应过夜；
d.待以上反应完成，将过夜反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，用PBS透析3天。透析中，前3次，每隔2小时换液，之后每8-12小时换液；
e.透析结束后，将透析袋内的溶液以4000rpm离心30min，取上清，-20℃冻存；
f.取透析液在紫外分光光度仪下，检测偶联效果及偶联物浓度测定表明ENRO-BSA、ENRO-OVA偶联物制备成功。
实施例2小鼠免疫
1、材料
Balb/c小鼠(雄性、6周龄)、弗氏完全佐剂(sigma公司)、弗氏不完全佐剂(sigma公司)、96孔酶标板、免疫原ENRO-BSA、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20 PBST)、终止液、鼠源抗恩诺沙星单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1小鼠免疫
a.取100μg免疫原ENRO-BSA加入等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂；
b.首免：取8只6周龄Balb/c小鼠，采用背部多点注射免疫，0.2ml/只，同时设置生理盐水对照组；
c.二免与三免：免疫方法：取100μg免疫原与等量弗氏不完全佐剂制成乳化剂，背部多点免疫小鼠；每次免疫间隔15天。
d.三免15天后，处死小鼠，摘取脾脏，-70℃冻存。眶下窦取血，离心取血清。
2.2ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价
a.将包被原ENRO-OVA用包被缓冲液，按照0.5mg/l、0.4mg/l、0.3mg/l、0.2mg/l、0.1mg/l浓度梯度，200μl/孔，包被酶标板，4℃包被过夜；
b.洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
c.封闭：向每孔加满封闭液，于37℃封闭1.5小时；
d.洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
e.加血清抗体：将小鼠血清抗体，用PBS按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200进行梯度稀释后，加入封闭好的酶标孔中，200μl/孔，37℃孵育反应2小时；
f.洗涤：弃血清抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
g.加酶标二抗：HRP标记山羊抗鼠IgG抗体用PBS做1∶10000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
h.洗涤：弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
i.显色：加入200μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色45min左右；
j.终止：用200μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。
3、结果
通过间接ELISA检测，包被原最佳浓度0.2mg/ml。恩诺沙星免疫组的5只小鼠(1、2、6、7、8号)血清抗体效价达到1∶12800以上，可满足进一步实验的需要。
实施例3免疫小鼠脾细胞RNA的提取及通过RT-PCR获得cDNA
1、材料
免疫小鼠脾脏、细胞筛、DEPC处理的灭菌PBS、DEPC处理去离子水、总RNA提取试剂盒RNA iso Plus(Takara公司)、反转录试剂盒(Takara公司)。
2、方法
2.1脾细胞总RNA的提取
采用总RNA提取试剂盒RNA iso Plus，参照说明书进行。
待RNA完全溶解后，在紫外分光光度计上测定获得RNA的质与量。将RNA冻存于-70℃。
2.2反转录合成cDNA
从-70℃低温冰箱中取出获得的小鼠脾脏RNA，在低温环境下进行操作。采用商品化总RNA提取试剂盒(Takara)，参照说明书进行。
扩增获得cDNA第一链，-70℃保存。
3、结果
根据免疫小鼠血清抗体效价，选取了效价高的小鼠脾脏，通过提取RNA并进行反转录，共制得恩诺沙星免疫组小鼠(共5只：1、2、6、7、8号)脾细胞cDNA文库，cDNA浓度均达到500ng/μl。
实施例4scFv单链抗体库的构建
1、材料
免疫小鼠cDNA、重组噬菌体抗体扩增系统(Recombinant PhageAntibody System)(27-9400-01)包括重链引物对、轻链引物混合物和linker引物混合物、RS引物混合物(Pharmacia公司)、long amp TaqDNA聚合酶(NEB公司)、琼脂糖凝胶、DNA ladder(DL2000、1kb)(TaKara公司)、凝胶回收试剂盒(TaKara公司)、质粒提取试剂盒(TaKara公司)、T4 DNA连接试剂盒(NEB公司)、限制性内切酶(sfiI、NotI)(NEB公司)、pMD18-T simple载体系统(TaKara公司)、DH5α工程菌、TG1宿主菌、pCANTAB5e噬菌体载体、0.1N CaCl2、酵母提取物、Tryptone、氨苄青霉素、卡那霉素。
2、方法
2.1VH和VL基因PCR扩增
A.从超低温冰箱取出cDNA，在低温环境下构建VH基因PCR扩增反应体系：
Figure BDA0000052225250000061
将以上反应体系除longamp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增：
95℃5min热启动，加入Longamp Taq后：94℃1min，55℃2min，65℃2min；35个循环后，65℃10min，4℃保温。
PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混匀，加入到1％琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(340bp)的目的条带。
B.从超低温冰箱取出cDNA，在低温环境下构建VL基因PCR扩增反应体系反应体系如本节A所列，加入轻链引物混合物2μL，用双蒸水补足100μL反应体系。
将以上反应体系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，扩增参数如本节A所列。
PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混匀，加入到1％琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(325bp)的目的条带。
C.PCR扩增产物切胶纯化回收
使用胶纯化试剂盒(Takara公司)回收，参照说明书进行。
将纯化回收获得的VH和VL基因片段，在微量紫外分光光度计上测定片段的量。
2.2 SOE-PCR拼接VH-Linker-VL基因
采取“VH-Linker-VL”形式将VH基因、Linker及VL基因进行拼接。采用二步法SOR-PCR法进行。
取以上纯化获得的VH和VL基因片段，在低温环境下构建scFv基因拼接PCR扩增反应体系：
将以上反应体系加入到PCR管中，迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增：94℃1min，63℃4min，7个循环。
2.3引入sfiI、NotI酶切位点
A.以上反应结束，立即取出反应体系，迅速加入预先配制好的以下反应体系：
Figure BDA0000052225250000072
将以上反应体系迅速置入PCR仪中，并设置以下参数进行扩增：
94℃1min，55℃2min，65℃2min，30个循环后，65℃10min，4℃保温。
PCR扩增结束，取全部扩增产物与适当上样缓冲液混匀，加入到1％琼脂糖凝胶中，90V电泳40min，紫外下观察并记录扩增结果，并切取符合大小(750bp)的目的条带。
B.scFv拼接产物切胶纯化回收
使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)回收，参照说明书进行。
将纯化回收获得的scFv基因片段，在微量紫外分光光度计上测定片段的量。
C.scFv基因连接pCANTAB5e
使用商品化T4 DNA连接酶(Promega)，将经sfiI和NotI酶切处理的scFv片段与pCANTAB5e载体连接。操作方法参照说明书进行。
取适量pCANTAB5e载体和scFv基因片段，在低温环境下构建连接反应体系：
Figure BDA0000052225250000082
将连接体系置4℃连接过夜。
scFv片段(S+N)与pCANTAB5e(S+N)使用量，按照如下公式进行：
Figure BDA0000052225250000083
D.电转化TG1感受态细胞制备
a.取新鲜培养获得的宿主菌TG1(OD600＝0.72-0.76)，置于冰水混合物中骤冷；
b.将细菌培养物转移至预冷的离心管中，4℃，2000×g离心10min，收集菌体；
c.用预冷的双蒸水轻轻重悬菌体沉淀，先加入少量双蒸水重悬菌体，再加满双蒸水，4℃，2000×g，离心10min，弃上清；
d.用10％甘油重复以上c步骤两次，2400×g，离心10min，最后一次倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，分装离心管，100μL/管；
e.将离心管放入液氮中速冻，-70℃低温冰箱保存。
E.电转化
a.将电击杯(0.2cm间隙)置于冰上预冷，取出-70℃冻存的感受态细胞，于冰水混合物上融解；
b.取30μL感受态细胞，向其中加入2μL连接产物，轻轻混匀后，置于冰上90秒；
c.将混合液加入预冷电击杯的间隙中，擦干杯体，将电击杯置于电转化仪中；
d.设置电转参数：15kv/cm，5ms，电转；
e.取出电击杯，立即轻柔加入1ml预热的SOC培养基，轻轻混匀后，吸出转化液，37℃，150rpm，培养1.5小时。
2.4建库
A.取上步转化后培养的菌液100μL，用2×YT培养液做梯度倍比稀释，涂布SOB-AG平板，30℃培养过夜。计数平板上的单菌落数，推算库容。
剩余的转化后培养的菌液，加入80％终浓度灭菌甘油，-70℃冻存，此即为初级抗体库。
B.随机挑取SOB-AG平板上，长出的单克隆10个，提取质粒DNA，用sfiI和NotI双酶切，初步鉴定阳性克隆。质粒提取及酶切反应操作和以上步骤相同。
对酶切阳性的重组质粒DNA，进行序列测定和分析。
3、结果
以恩诺沙星免疫组小鼠(共8只)脾细胞cDNA文库为模板，通过初步扩增，获得了各免疫小鼠抗体重链、轻链可变区基因VH、VL片段，电泳显示条带大小为340bp和325bp，符合预期大小。
将VH、VL片段切胶纯化回收，与linker进行拼接，获得全长750bp的scFv电泳片段。
切胶纯化回收scFv片段，与pMD18-T simple载体做T-A克隆，插入载体构建scFv-pMD18-T重组质粒，转化DH5α感受态细胞。随机挑取10个单菌落，过夜培养后，提取重组菌质粒，用sfiI和NotI双酶切初步鉴定阳性克隆，电泳显示正确连接率达到100％。
将亚克隆板上所有菌落洗下，培养后，提取质粒DNA，sfiI和NotI双酶切获得scFv片段，与用同样双酶切处理的pCANTAB5e噬菌粒载体进行连接，转化后，涂布SOBAG平板。随机挑取20个单菌落，过夜培养后，提取质粒DNA，sfiI和NotI双酶切鉴定scFv与pCANTAB5e连接情况，结果有18个酶切阳性，分别切出约4.5kb大小的噬粒和约750bp的scFv插入片段，说明scFv片段成功插入pCANTAB5fe噬粒载体。计算库容均达到1.3×107。20个单菌落中有18个均能切出目的条带和载体片段(图1A和图1B)，重组率达到90％。
通过以上操作，共制备了恩诺沙星免疫组小鼠各5个初级抗体库，各抗体库库容如表1所示：
表1构建鼠源抗恩诺沙星单链抗体初级抗体库情况
  初级抗体库   重组率   库容
  ENRO-1   95％   2.5×105
  ENRO-2   85％   1.2×108
  ENRO-6   70％   2.1×107
  ENRO-7   85％   1.6×106
  ENRO-8   80％   1.3×106
实施例5淘筛
1、材料
酶标板、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(PBS缓冲液pH7.2和Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、免疫管、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20 PBST)、终止液、PEG8000/Nacl、TG1宿主菌、洗脱液(0.1N HCl、0.2N甘氨酸-Hcl pH2.5、0.1N TEA)、SOBAG平板(SOB平板含有氨苄青霉素和葡萄糖)、2×YT-AG、2×YT-KG、2×YT-G、2×YT-AK、M13K07、鼠源恩诺沙星单克隆抗体、山羊抗鼠IgG酶标抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1包被淘筛管
a.包被：选用含200μg/ml-包被原的Na2CO3缓冲液(0.05N，pH9.6)作为包被原的包被缓冲液，包被酶标板200μl/孔，包被条件分别为室温包被过夜。
用PBS洗管3次，拍干；(注：对洗管的定义为加入洗涤液，后将洗涤液倒出即可，以下适用此)
c.用封闭液(2％脱脂乳PBS，MPBS)封闭免疫管，37℃封闭2小时；
d.倾去封闭液，用PBS洗3次，拍干。
2.2淘筛前准备
a.取初级抗体库一支(1ml)，加入到250ml 2×YT-G培养基中，37℃，250rpm，1小时；
b.取培养液，测定细菌浓度，加入100μg/ml AMP和moi＝20∶1的M13K07噬菌体，37℃水浴轻摇30分钟，再摇床37℃上振荡250rpm，培养30分钟；
c.此时，从培养瓶中取出适量的培养液做梯度稀释，分别在2×YT-AG如2×YT-KG平板上铺板，以确定感染的有效性；
d.1000×g离心10分钟，小心取上清；
e.用2×体积(500ml)的2×YT-AK悬浮细菌沉淀，37℃，250rpm，培养过夜；
f.10000rpm离心20min，取上清至另一新管中，准备进行淘筛。
2.3PEG/NaCl沉析噬菌体
a.按1/5体积(约100ml)的量加入PEG/Nacl，4℃冰浴上进行噬菌体沉析，不超过1小时；
b.4000rpm离心20分钟，4℃，弃上清，尽量除尽管壁的残液；
c.用起始培养液1/50体积(约5ml)的PBS或2×YT悬浮噬菌体沉淀，再次10000rpm离心15分钟，取上清备用；
d.此时，取100μl制备获得的噬菌体上清，用2×YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl加入至新鲜培养的TG1宿主菌(OD600＝0.5)，37℃轻摇孵育20min，涂布SOBAG平板，30℃培养过夜，计算输入淘筛步骤的噬菌体量。此时的上清，应立即进行淘筛，因有些噬菌体抗体稳定性不是很好。
2.4淘筛
a.提前一天完成2.1中包被工作；
b.将包被好的淘筛小管用PBS洗3次，拍干；
c.向封闭好的免疫管加入处理过的噬菌体上清混合液，2ml/管，轻摇温育30min后，再静置温育1.5小时；
d.弃免疫管内噬菌体上清，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干；
e.洗脱条件优化：
分别采用如下4种洗脱条件：1.加入宿主菌TG1(OD600＝0.5)，2ml/管，37℃，150rpm振荡培养1小时；2.加入0.1N三乙胺(TEA)，2ml/管，37℃轻柔转动洗脱6min，后立即加入等体积Tris-Hcl pH7.4缓冲液中和洗脱液，后加入宿主菌TG1(OD600＝0.5)37℃，150rpm振荡培养1小时；3.加入0.2N甘氨酸-HCl pH2.5，2ml/管，37℃轻柔转动洗脱6min，后立即加入等体积Tris-HCl pH7.4缓冲液中和洗脱液，后加入宿主菌TG1(OD600＝0.5)37℃，150rpm振荡培养1小时；4.加入0.1N HCl，2ml/管，37℃轻柔转动洗脱6min，后立即加入等体积Tris-HCl pH7.4缓冲液中和洗脱液，后加入宿主菌TG1(OD600＝0.5)37℃，150rpm振荡培养1小时；此时，完成了第一轮淘筛，获得了一级抗体库；
f.取振荡培养的菌液，用2×YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOBAG平板，30℃培养过夜，计算输出淘筛步骤的噬菌体量；
g.向一级库中，加入终浓度为100μg/ml amp和2％葡萄糖，同时加入4×1010M13K07噬菌体，静置温育30min后，再250rpm振荡培养30min；1000×g离心10min，去上清，用100ml 2×YT-AK轻悬细胞，37℃，250rpm，培养过夜；
h.以下步骤从以上2.2e步骤，进行循环淘筛，开始下一轮淘筛；
i.最终经过3轮淘筛，取获得的菌液，用2×YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOBAG平板，30℃培养过夜。剩余菌液按照：800μl以上洗脱菌液+200μl(含80％灭菌甘油的2×YT，混匀后，-70℃冻存)，标记为三级抗体库。
3、结果
通过平行对比实验，最终确定了使用新鲜制备的宿主菌TG1(OD600＝0.5)作为洗脱液，淘筛输出的重组抗体数量明显高于其他3种洗脱方法。
初步选择了ENRO--2初级抗体库，将抗原包被免疫管进行固相淘筛，经过三轮淘筛富集，获得重组抗体三级库。通过淘筛，与抗原有特异性结合的重组抗体，得到了有效的选择和富集(表2)。
表2ENRO--2重组抗体库各轮淘筛富集情况
  重组噬菌体输入   重组噬菌体输出
  第一轮淘筛   4.6×108   2.8×104
  第二轮淘筛   6.2×108   3.2×105
  第三轮淘筛   4.1×109   5.2×105
实施例6Phage ELISA初步检测抗原阳性重组抗体
1、材料
96孔酶标板、包被原ENRO-OVA)、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20 PBST)、终止液、SOBAG平板、2×YT-AG、2×YT-AK、M13K07、HRP标记鼠源抗M13单克隆抗体(pharmacia公司)、鼠源抗恩诺沙星单克隆抗体、山羊抗鼠IgG酶标抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1从三级抗体库中单克隆表达重组抗体
a.取72孔培养板，加入2×YT-AG培养基400μl/孔；
b.用灭菌牙签，挑取上节中的SOBAG平板上长出的单个菌落，接种至上面各孔中，此板标记为Master Plate：
c.将Master Plate置于摇床，30℃，250rpm，振荡培养过夜；
d.次日，另取72孔培养板，取400μl含有2.5×1010pfu/ml M13K07的2×YT-AG至每孔，此板标记为P1 Plate；
e.从过夜培养的Master Plate上每孔取40μl培养液至P1 Plate；
f.将P1 Plate置于摇床，37℃，150rpm，振荡培养2小时；
g.1500×g离心20min，小心去上清；
h.向P1 Plate每孔加入400μl 2×YT-AK培养液，37℃，250rpm，振荡培养过夜；
i.1500×g离心20min，取上清待用。
2.2Phage ELISA
a.包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被96孔板，设立阳性对照和阴性对照；此时的阳性对照可以使用M13K07进行包被；
b.洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
c.封闭：加入2％脱脂乳PBS(MPBS)至满孔，37℃封闭1.5小时；
d.洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
e.加重组抗体：提前将重组抗体160μl+40μl MPBS混匀，室温孵育20min，加入封闭好的酶标孔中，37℃结合反应2小时；
f.洗涤：弃重组抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
g.加酶标二抗：将酶标抗M13抗体用PBS做1∶4000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
h.洗涤：弃酶标抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
i.显色：加入200μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色45min左右；
j.终止：用200μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。
3、结果
挑取各重组抗体三级库，在SOBAG平板上涂板的过夜培养单克隆若干个，表达融合性重组抗体，运用Phage ELISA检测抗原结合阳性重组抗体。随机挑取5个Phage ELISA检测阳性单克隆，提取质粒DNA，用sfiI和NotI双酶切后，进行测序。从挑取的6个阳性克隆的酶切片段，可以看出，阳性克隆中均已正确插入了目的条带，并且能在噬菌粒载体中正常表达和折叠，产生出有抗体功能的重组抗体，能够较好地识别相应抗原。对Phage ELISA检测阳性克隆的scFv基因序列测定，scFv基因序列如SEQ ID No.3(重链)和4(轻链)所示。
实施例7scFv ELISA检测可溶性抗原阳性重组抗体
1、材料
96孔酶标板、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20 PBST)、终止液、2×YT-AG、2×YT-AI、兔源抗E-tag抗体(Abcam公司)、HRP标记山羊抗兔IgG单克隆抗体(sigma公司)、鼠源抗恩诺沙星单克隆抗体、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1可溶性重组抗体表达
a.取72孔培养板，加入2×YT-AG培养基400μl/孔，标为S1 Plate；
b.从过夜培养的Master Plate上每孔取40μl饱和培养液至S1Plate；
c.将S1 Plate置于摇床，37℃，250rpm，振荡培养2小时；
d.1500×g离心20min，小心去上清；
e.向S1 Plate每孔加入400μl 2×YT-AI培养液，30℃，250rpm，振荡培养至少2小时；
f.1500×g离心20min，小心取上清待用。
2.2scFv ELISA
a.包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被96孔板，设立阳性对照和阴性对照；
b.洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
c.封闭：加入2％脱脂乳PBS(MPBS)至满孔，37℃封闭1.5小时；
d.洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
e.加以上制备好的可溶性重组抗体：提前将重组抗体160μl+40μl MPBS混匀，室温孵育20min。加入封闭好的酶标孔中，37℃结合反应2小时；
f.洗涤：弃重组抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
g.加E-tag抗体：将兔源抗E-tag抗体用PBS做1∶10000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
h.洗涤：弃E-tag抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
i.加HRP标记山羊抗兔IgG单克隆抗体：将HRP标记山羊抗兔IgG单克隆抗体用PBS做1∶8000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
j.洗涤：弃HRP标记山羊抗兔IgG单抗液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
k.显色：加入200μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色45min左右；
l.终止：用200μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。
2.3scFv ELISA阳性克隆的序列测定
随机挑取恩诺沙星的scFv ELISA阳性克隆菌株共6个，进行scFv基因的序列测定分析。
3、结果
3.1scFv ELISA结果
通过间接ELISA，对挑取的30个重组菌进行诱导表达，测定可溶性重组抗体scFv的表达情况如图2所示。从图2中可以看出3、4、19、24号重组菌克隆诱导产生的可溶性重组抗体反应信号强，其中19号OD450值最高，且反应稳定性和一致性都很好。
3.2阳性菌株scFv序列分析
11个阳性菌株的序列测定分析结果表明，所有插入的scFv基因，其序列如SEQ ID No.3(重链)和SEQ ID No.4(轻链)所示，将核酸序列翻译成蛋白序列后，与Kabat Database进行分析比对，所得蛋白序列均含有符合鼠源抗体的框架区FR和编码区CDR的氨基酸区域，其重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
实施例8抗原阳性可溶性重组抗体的制备及鉴定
1、材料
96孔酶标板、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20 PBST)、终止液、2×YT-AG、2×YT-AI、SOBAG-N平板、1×TES缓冲液、1/5×TES缓冲液、HRP标记山羊源抗E-tag抗体(abcam公司)、鼠源抗恩诺沙星单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1对数生长期HB2151宿主菌制备
a.从minimal medium(基本培养基)平板上挑取单个HB2151菌，接种入5ml 2×YT培养基中；
b.37℃，250rpm，振荡培养过夜；
c.取500μl培养液接种50ml 2×YT培养基中，37℃，250rpm，振荡培养至OD值达到0.5，准备待用；
2.2可溶性重组抗体的小量生产
a.取400μl以上制备好的对数生长期HB2151菌入72孔培养板；
b.根据以上步骤七中scFv ELISA结果，取可溶性抗体强阳性菌株(N7-12、N7-21、E2-19)的第七步骤2.1中噬菌体液2μl加入至72孔培养板的相应孔中；
c.37℃，培养30min，间歇轻微轻柔摇动；
d.取培养液划线SOBAG-N平板，30℃，培养过夜；
e.挑取SOBAG-N平板上单个菌落3-5个，分别接种5ml2×YT-AG培养基中，30℃，250rpm，振荡培养过夜；
f.取过夜培养菌液，接种至50ml 2×YT-AG培养基中，30℃，250rpm，振荡培养1h；
g.1500×g室温离心20min，小心弃上清，用50ml 2×YT-AI培养基悬浮菌沉淀后，30℃，250rpm，振荡培养4h；
h.取培养液分为两份，1500×g室温离心20min，合并收集离心上清，此为表达上清液，-70℃冻存待用；
i.将其中一份菌沉淀用0.5ml冰预冷的1×TES缓冲液充分悬浮；
j.加入0.75ml 1/5×TES缓冲液，涡旋振荡，以引起温和的渗透力；
k.置于冰浴30min，移入1.5ml离心管，12000rpm，4℃离心15min；
l.取离心上清，此上清含有来自胞周间质的可溶性抗体，-70℃冻存待用；
m.将另一份菌沉淀，用0.5ml PBS悬浮，置沸水浴中煮5min；
n.将沸煮物至冰浴30min，12000rpm，4℃离心15min；
o.取离心上清，此上清含有来自全细胞提取物中的可溶性抗体，-70℃冻存待用。
2.3诱导表达物不同部分可溶性重组抗体的鉴定
a.包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被96孔板，200μl/孔，同时设立阳性对照和阴性对照；
b.洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
c.封闭：加入2％脱脂乳PBS(MPBS)至满孔，37℃封闭1.5小时；
d.洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
e.加以上制备好的各部分可溶性重组抗体，200μl/孔，37℃孵育反应2小时；
f.洗涤：弃重组抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
g.加E-tag抗体：将HRP-山羊源抗E-tag抗体用PBS做1∶5000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
h.洗涤：弃E-tag抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
i.显色：加入200μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色45min左右；
j.终止：用200μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。
3、结果
通过以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对C8-45菌株进行诱导表达，分别制备获得表达产物的上清、胞周间质和全细胞提取物，E-tag标签蛋白ELISA检测结果表明：三个部分的可溶性抗体对相应抗原均有识别能力，以胞周间质处的抗体识别和结合能力最强，上清次之，全细胞提取物最差。但是由于在诱导表达过程中，上清液量很大，所以就产生量来说，上清中的可溶性抗体量是最大的。
实施例9可溶性重组抗体SDS-PAGE电泳初步鉴定
根据实施例8的实验结果，选取上清中可溶性抗体作为研究对象，对获得的可溶性抗体的相关特性进行研究。
1、材料
HB2151宿主菌(Pharmacia公司)、96孔酶标板、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20 PBST)、终止液、2×YT-AG、2×YT-AI、SOBAG-N平板、1×TES缓冲液、1/5×TES缓冲液、HRP标记山羊源抗E-tag抗体(abcam公司)、鼠源抗恩诺沙星单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1对数生长期HB2151宿主菌制备
a.从minimal medium(基本培养基)平板上挑取单个HB2151宿主菌，接种入5ml 2×YT培养基中；
b.37℃，250rpm，振荡培养过夜；
c.取500μl培养液接种50ml 2×YT培养基中，37℃，250rpm，振荡培养至OD值达到0.5，准备待用；
2.2可溶性重组抗体的生产
a.取400μl以上制备好的对数生长期HB2151菌入72孔培养板；
b.根据以上实施例7中scFv ELISA结果，取可溶性抗体强阳性菌株(C8-45)的第七步骤2.1中噬菌体液2μl加入至72孔培养板的相应孔中；
c.37℃，培养30min，间歇轻微轻柔摇动；
d.取培养液划线SOBAG-N平板，30℃，培养过夜；
e.挑取SOBAG-N平板上单个菌落3-5个，分别接种5ml2×YT-AG培养基中，30℃，250rpm，振荡培养过夜；
f.取过夜培养菌液，接种至50ml 2×YT-AG培养基中，30℃，250rpm，振荡培养1h；
g.1500×g室温离心20min，小心弃上清，用50ml 2×YT-AI培养基悬浮菌沉淀后，30℃，250rpm，振荡培养4h；
h.取培养液分为两份，1500×g室温离心20min，合并收集离心上清，此为表达上清液，-70℃冻存待用；
i.将其中一份菌沉淀用0.5ml冰预冷的1×TES缓冲液充分悬浮；
j.加入0.75ml 1/5×TES缓冲液，涡旋振荡，以引起温和的渗透力；
k.置于冰浴30min，移入1.5ml离心管，12000rpm，4℃离心15min；
l.取离心上清，此上清含有来自胞周间质的可溶性抗体，-70℃冻存待用；
m.将另一份菌沉淀，用0.5ml PBS悬浮，置沸水浴中煮5min；
n.将沸煮物至冰浴30min，12000rpm，4℃离心15min；
o.取离心上清，此上清含有来自全细胞提取物中的可溶性抗体，-70℃冻存待用。
3、结果
SDS-PAGE电泳结果如图3所示，可以看出在重组菌诱导表达产物的胞周间质和上清液中均有符合预期大小的蛋白产物表达，胞周间质中的重组抗体比上清中浓度稍高，大小约31kD。
实施例10可溶性重组抗体的IC50测定、交叉反应实验
根据实施例9的实验结果，选取上清中可溶性抗体作为研究对象，对获得的可溶性抗体的相关特性进行研究。IC50测定采用CI-ELISA进行，抗原抗体亲和参数实验采用竞争性ELISA进行。
1、材料
96孔酶标板、恩诺沙星阳性株(C8-45)诱导表达可溶性重组抗体(上清)、恩诺沙星标准品、2×YT-AG、2×YT-AI、SOBAG-N平板、1×TES缓冲液、1/5×TES缓冲液、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20 PBST)、终止液、HRP标记山羊源抗E-tag抗体(abcam公司)、鼠源抗恩诺沙星单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1可溶性重组抗体大量制备
操作方法如实施例9中2.2所列，将制备体系扩大20倍。
2.2上清中可溶性重组抗体IC50测定--CI-ELISA法
a.包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被96孔板，200μl/孔，同时设立阳性对照和阴性对照；
b.洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
c.封闭：加入2％脱脂乳PBS(MPBS)至满孔，37℃封闭2小时；
d.在封闭酶标板的同时，将浓度从10-3ng/m-105ng/ml 10倍梯度稀释的恩诺沙星标准品，分别和以上制备的C8-45可溶性抗体上清的梯度稀释(原液、1∶3、1∶6、1∶9、1∶12)液，按照100μl∶100μl等量混匀，37℃孵育反应1小时；
e.洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
f.将重组抗体-药物混匀孵育物共200μl加入到酶标板孔中，37℃孵育反应2小时；
g.洗涤：弃重组抗体-药物液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
h.加E-tag抗体：将HRP-山羊源抗E-tag抗体用PBS做1∶5000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
i.洗涤：弃E-tag抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
l.显色：加入200μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色30min左右；
m.终止：用100μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。
2.3上清中可溶性重组抗体交叉反应测定测定--CI-ELISA法
a.包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被96孔板，200μl/孔，同时设立阳性对照和阴性对照；
b.洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
c.封闭：加入2％脱脂乳PBS(MPBS)至满孔，37℃封闭2小时；
d.在封闭酶标板的同时，将10种浓度为1ng/ml的氟喹诺酮类药物标准品，分别和以上制备的C8-45可溶性抗体上清液(原液)，按照100μl：100μl等量混匀，37℃孵育反应1小时；
e.洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
f.将重组抗体-药物混匀孵育物共200μl加入到酶标板孔中，37℃孵育反应2小时；
g.洗涤：弃重组抗体-药物液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
h.加E-tag抗体：将HRP-山羊源抗E-tag抗体用PBS做1∶5000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
i.洗涤：弃E-tag抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
j.显色：加入200μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色30min左右；
k.终止：用100μl/孔终止液，终止显色，测定450nm OD值。
3、结果
3.1上清中可溶性重组抗体IC50及交叉反应性测定
通过以上方法，获得了重组抗体的IC50值，以恩诺沙星浓度的对数为横坐标，OD450吸光度值B/B0为纵坐标，建立标准曲线(图4)。得出恩诺沙星诱导表达上清可溶性重组抗体的IC50值为8.87ng/ml。
选取与恩诺沙星结构相似的9种氟喹诺酮类药物，采用竞争性ELISA方法按照以上实验步骤进行交叉反应实验。结果表明9种药物中的5种(培氟沙星、奥索利酸、氧氟沙星、沙拉沙星、诺氟沙星)交叉反应小于0.01％，剩余4种药物的交叉反应性小于0.1％。表明该抗体具有较好的特异性。
实施例11实际样品的测定
1、材料
猪肉、猪肝脏、猪粪、乙腈、恩诺沙星阳性株(C8-45)诱导表达可溶性重组抗体(上清)、恩诺沙星标准品、PBS、NaoH、二氯甲烷、正己烷、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0.05N，pH9.6)、封闭液(2％脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0.1％Tween20PBST)、终止液、HRP标记山羊源抗E-tag抗体(abcam公司)、TMB显色液(sigma公司)。
2、方法
2.1加标样制备
a.分别取无药物残留的猪肉、猪肝脏和猪粪，用均质器充分均质，打成糜状；
b.取恩诺沙星药物标准品，分别配制10、50、100ng/ml标准液；
c.取1.0ml配制好的标准药物溶液加入到3g均质，充分混匀后，置4℃过夜处理待用；
d.取过夜处理的样本于50mL离心管中，加入乙腈-0.1MNaOH(9∶1，v/v)溶液9mL，充分上下混合10min；
e.3000×g 15℃离心10min；
f.取上清3mL，加入3mL 0.02M PBS(PH＝7.2)，再加入二氯甲烷8mL，充分混匀10min；
g.3000×g 15℃离心10min去上层，取下层有机相4mL至干燥容器中(清亮无杂质)，50℃氮气吹干/旋转蒸发至干，用1mL缓冲液复溶解干燥的残留物；
h.加入正己烷1mL混合2min，室温3000×g 15℃离心5min。轻吸掉上层正己烷和中间部分杂质，取下层100μL用于ELISA分析(稀释倍数为2倍)；
2.2间接ELISA测定回收率和日间、日内变异系数
a.包被：按照最佳包被条件，用相应包被原包被96孔板，200μl/孔，同时设立阳性对照和阴性对照；
b.洗涤：弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
c.封闭：加入含2％脱脂乳的PBS(MPBS)至满孔，37℃封闭2小时；
d.在封闭酶标板的同时，将以上制备的C8-45可溶性抗体上清液(原液)分别与制备好的样本中提取物和以下浓度梯度(2.5、5.0、10、20、40、80、100、120ng/ml)的恩诺沙星标准品，按照100μl∶100μl等量混匀，37℃孵育反应1小时；
e.洗涤：弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
f.将重组抗体-药物混匀孵育物共200μl加入到酶标板孔中，37℃孵育反应2小时；
g.洗涤：弃重组抗体-药物液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
h.加E-tag抗体：将HRP-山羊源抗E-tag抗体用PBS做1∶5000稀释，200μl/孔，37℃孵育反应1小时；
i.洗涤：弃E-tag抗体液，用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤3次，拍干酶标板；
l.显色：加入200μl/孔TMB显色液，37℃孵育显色30min左右；
m.终止：用100μl/孔终止液，终止显色，在450nm处读值。
n.日内变异系数测定，按照在一日内，以上条件分别间隔测定5次，平行测定。日间变异系数以上条件，在3日内分别进行平行测定。
3、结果
为了减少样本自身中的残留干扰，选择了空白猪肉、猪肝脏及猪粪作为添加回收试验的材料。使用间接ELISA方法，将待测的重组抗体和梯度浓度的恩诺沙星标准品建立标准曲线进行同步对照，以判定重组抗体对添加样品中恩诺沙星的检测能力。表3总结了添加回收试验的回收率、日内变异系数及日间变异系数，总体上看，获得重组抗体的回收率基本达到了检测要求，且测定方法比较稳定，已经能满足对实际样品的准确测定。
表3恩诺沙星重组抗体的平均回收率和变异系数
Figure BDA0000052225250000241
Figure BDA0000052225250000251
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000052225310000011
Figure IDA0000052225310000021

Claims (10)

1.一种检测恩诺沙星的scFv抗体，其包括重链和轻链，其特征在于，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，重链和轻链之间由连接肽段连接。
2.如权利要求1所述的scFv抗体，其特征在于，重链和轻链之间的连接肽段为(Gly4Ser)3。
3.编码权利要求1或2所述scFv抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码scFv抗体重链的基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
6.含有权利要求3-5任一项所述基因的载体。
7.含有6所述载体的宿主细胞。
8.权利要求1或2所述的scFv抗体、权利要求3-5任一项所述的基因、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在检测恩诺沙星中的应用。
9.权利要求1或2所述scFv抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求3-5任一项所述的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pCANTAB5e。
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