CN101983971A - 抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。本发明选取氟喹诺酮类药物中的六种药物，分别与载体蛋白牛血清白蛋白偶联合成免疫抗原，混和六种免疫抗原采用背部皮下注射免疫兔子，经过杂交瘤技术，最终得到抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体。本发明制备的抗体为兔单克隆抗体，兔单克隆的制备优于鼠单克隆抗体。兔子相比于小鼠可以识别更多免疫抗原的表位。其次，兔脾脏较大可以进行更多的融合实验，使高通量筛选融合细胞成为可能。本发明的抗氟喹诺酮类抗体对恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星等氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果，具有广谱性。可用于食品、饲料及环境样品中的氟喹诺酮类药物的残留检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。
背景技术
氟喹诺酮类(fluoroquinolones，FQNS或FQS)药物属第三代喹诺酮类抗菌药，发明于20世纪80年代，是在喹诺酮萘啶环的6位处引入了氟原子，7位上都连有哌嗪环，因而又统称氟喹诺酮类，是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物。
FQNS具有吸收好，半衰期长，抗菌谱广等优点，已成为兽医临床常用药品。但由于该类药物长期和广泛的应用，造成畜产品中药物大量残留，引起了一系列的负面影响，不仅直接危害人类健康，而且不利于养殖业的健康发展及畜禽产品出口。包括中国在内的很多国家都针对某一具体FQNS在动物性食品中的使用而制定了最高残留限量(MRL)，其残留问题已引起广泛的关注。
近年来随着氟喹诺酮类药物在临床上的大量广泛使用，其残留问题也越来越严重。在国内外用于FQNS药物残留检测的方法较多，有微生物法、免疫分析测定法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法、荧光分光光度法等。免疫分析测定法适用于大规模检测和筛选。ELISA方法灵敏度较高，特异性较强，测定方法简单快速，可同时筛选大量样品。目前常将ELISA法作为筛选法，高效液相色谱-质谱法作为确证方法配套使用。
兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔子相比于小鼠能识别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。本发明通过杂交瘤技术得到抗氟喹诺酮大类兔单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。
抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法的步骤如下：
1)将30mg环丙沙星、45mg N-羟基琥珀酰亚胺和150mg碳二亚胺盐酸溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中，避光搅拌反应24h，得到环丙沙星反应液；将牛血清白蛋白100mg，溶解于15mL磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将环丙沙星反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应3h，用磷酸盐缓冲液透析，得到环丙沙星免疫抗原，-20℃存放；氧氟沙星免疫抗原、恩诺沙星免疫抗原与环丙沙星免疫抗原合成方法相同；
2)将氟甲喹40mg溶解于1ml的二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应20分钟，得到氟甲喹溶液反应液；将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH 9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将氟甲喹溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到氟甲喹免疫抗原，-20℃保存；
3)将达氟沙星40mg溶解于3ml二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，暗处反应60分钟，得到达氟沙星溶液反应液；将60mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液，得到牛血清白蛋白溶液，将达氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到达氟沙星免疫抗原，-20℃保存；
4)将诺氟沙星40mg溶解于2ml二甲基甲酰胺和2ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应60分钟，得到诺氟沙星溶液反应液；将100mg牛血清白蛋白、167mg碳二亚胺盐酸、167mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于8ml去离子水中，再加入2ml乙二胺，4℃反应12h，得到牛血清白蛋白溶液；将诺氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到诺氟沙星免疫抗原，-20℃保存；
5)将上述合成的六种免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将六种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将六种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将六种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；
6)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为：在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；
7)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；
8)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产氟喹诺酮类兔单克隆抗体；
所述的将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为：分别取2×108个脾淋巴细胞和1×108个240E细胞混匀，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混匀成糊状，37℃水浴预温，缓缓加入经37℃预温的50％聚乙二醇溶液，再加入经37℃预温的1640培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用。补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉淀悬浮于HAT培养液中；
所述氟喹诺酮药物结构通式为：
抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体用于制备检测氟喹诺酮类药物残留的ELISA检测试剂盒、用于制备检测氟喹诺酮类药物多残留的胶体金检测试剂盒和用于检测食品、饲料及环境样品中的氟喹诺酮类药物的残留；
所述的氟喹诺酮类药物为恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星及达氟沙星。
本发明制备的氟喹诺酮类单克隆抗体为兔单克隆抗体，兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。兔子相比于小鼠会识别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。本发明制备的抗体为抗氟喹诺酮大类的抗体，其较常规特异于单种药物的抗体，具有更高的广谱性，可以用于多药物的残留检测。
附图说明
附图是氟喹诺酮类药物抑制标准曲线。
具体的实施方式
抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法的步骤如下：
1)将30mg环丙沙星、45mg N-羟基琥珀酰亚胺和150mg碳二亚胺盐酸溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中，避光搅拌反应24h，得到环丙沙星反应液；将牛血清白蛋白100mg，溶解于15mL磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将环丙沙星反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应3h，用磷酸盐缓冲液透析，得到环丙沙星免疫抗原，-20℃存放；氧氟沙星免疫抗原、恩诺沙星免疫抗原与环丙沙星免疫抗原合成方法相同；
2)将氟甲喹40mg溶解于1ml的二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应20分钟，得到氟甲喹溶液反应液；将80mg牛血清白蛋白溶解于8ml pH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将氟甲喹溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到氟甲喹免疫抗原，-20℃保存；
3)将达氟沙星40mg溶解于3ml二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，暗处反应60分钟，得到达氟沙星溶液反应液；将60mg牛血清白蛋白溶解于8ml pH9.6碳酸缓冲液，得到牛血清白蛋白溶液，将达氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到达氟沙星免疫抗原，-20℃保存；
4)将诺氟沙星40mg溶解于2ml二甲基甲酰胺和2ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应60分钟，得到诺氟沙星溶液反应液；将100mg牛血清白蛋白、167mg碳二亚胺盐酸、167mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于8ml去离子水中，再加入2ml乙二胺，4℃反应12h，得到牛血清白蛋白溶液；将诺氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到诺氟沙星免疫抗原，-20℃保存；
5)将上述合成的六种免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将六种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将六种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将六种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；
6)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为：在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；
7)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；
8)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产氟喹诺酮类兔单克隆抗体；
所述的将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为：分别取2×108个脾淋巴细胞和1×108个240E细胞混匀，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混匀成糊状，37℃水浴预温，缓缓加入经37℃预温的50％聚乙二醇溶液，再加入经37℃预温的1640培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用。补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉淀悬浮于HAT培养液中；
所述氟喹诺酮药物结构通式为：
抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体用于制备检测氟喹诺酮类药物残留的ELISA检测试剂盒、用于制备检测氟喹诺酮类药物多残留的胶体金检测试剂盒和用于检测食品、饲料及环境样品中的氟喹诺酮类药物的残留；
所述的氟喹诺酮类药物为恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星及达氟沙星。
实施例1免疫抗原及包被抗原的合成
免疫抗原合成选择以下六种氟喹诺酮药物分别与载体蛋白牛血清白蛋白进行偶联：氧氟沙星、达氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹。六种药物结构如下：
1)将30mg环丙沙星、45mg N-羟基琥珀酰亚胺和150mg碳二亚胺盐酸溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中，避光搅拌反应24h，得到环丙沙星反应液；将牛血清白蛋白100mg，溶解于15mL磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将环丙沙星反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应3h，用磷酸盐缓冲液透析，得到环丙沙星免疫抗原，-20℃存放；氧氟沙星免疫抗原、恩诺沙星免疫抗原与环丙沙星免疫抗原合成方法相同；(同法合成氧氟沙星、恩诺沙星及环丙沙星包被抗原，包被抗原载体蛋白为卵清蛋白)；
2)将氟甲喹40mg溶解于1ml的二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应20分钟，得到氟甲喹溶液反应液；将80mg牛血清白蛋白溶解于8ml pH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将氟甲喹溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到氟甲喹免疫抗原，-20℃保存；(同法合成氟甲喹包被抗原，包被抗原载体蛋白为卵清蛋白)；
3)将达氟沙星40mg溶解于3ml二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，暗处反应60分钟，得到达氟沙星溶液反应液；将60mg牛血清白蛋白溶解于8ml pH 9.6碳酸缓冲液，得到牛血清白蛋白溶液，将达氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到达氟沙星免疫抗原，-20℃保存；(同法合成达氟沙星包被抗原，包被抗原载体蛋白为卵清蛋白)；
4)将诺氟沙星40mg溶解于2ml二甲基甲酰胺和2ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应60分钟，得到诺氟沙星溶液反应液；将100mg牛血清白蛋白、167mg碳二亚胺盐酸、167mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于8ml去离子水中，再加入2ml乙二胺，4℃反应12h，得到牛血清白蛋白溶液；将诺氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到诺氟沙星免疫抗原，-20℃保存；(同法合成诺氟沙星包被抗原，包被抗原载体蛋白为卵清蛋白)；
免疫抗原浓度及偶联率
实施例2氟喹诺酮类兔单克隆抗体产生
2.1兔子的免疫
将上述合成的六种免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将六种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将六种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将六种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；
2.2细胞融合
无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为：在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；
在细胞融合实验前一周左右，传代培养240E细胞(240E细胞株为一浆细胞瘤)，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合。融合剂为50％的聚乙二醇。融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照。
分别取2×108个脾淋巴细胞和1×108个240E细胞混匀，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混匀成糊状。37℃水浴预温，缓缓加入经37℃预温的50％聚乙二醇溶液。再加入经37℃预温的1640培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用。补加1640培养液后离心，弃上清，将细胞沉淀悬浮于HAT培养液中。
2.3融合细胞的培养与阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆
融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产氟喹诺酮类兔单克隆抗体；
实施例3筛选过程中间接ELISA与直接ELISA操作步骤
3.1间接ELISA法步骤如下：
1、包板：用包被缓冲液(CBS)将六种包被抗原稀释至0.5μg/mL混和包板，50μl/孔，4℃过夜包被或37℃包被2小时；
2、洗板：TBST洗一次，200μl/孔；
3、封闭：0.2％明胶/TBS，100μl/孔，37℃封闭1h；
4、洗板：TBST洗三次，200μl/孔；
5、加样：各细胞培养孔上清原液或稀释液，50μl/孔，30℃摇床反应1h；
6、洗板：TBST洗板三次，200μl/孔；
7、二抗：加入2500倍稀释的碱性磷酸酶标山羊抗兔，50μl/孔，置于30℃恒温摇床40min；
8、洗板：TBST洗板三次，200μl/孔；
9、显色：1×DEA底物缓冲液10mL需添加0.1mg/mL pNPP 100μl，50μl/孔，30℃静置15min；
10、终止：1M NaOH，50μl/孔；
11、读数：OD415。
3.2间接竞争ELISA法步骤如下：
1、包板：用包被缓冲液(CBS)将六种包被抗原稀释到0.5μg/mL，50μl/孔，4℃过夜包被或37℃包被2小时；
2、洗板：TBST洗一次，200μl/孔；
3、封闭：0.2％明胶/TBS，150μl/孔，37℃1h；
4、洗板：TBST洗三次，200μl/孔；
5、一抗：加入系列浓度的混和氟喹诺酮类的药物标准溶液和各细胞培养孔上清原液或稀释液各50μl，30℃恒温摇床反应1h；
6、洗板：TBST洗三次，200μl/孔；
7、二抗：加入2500倍稀释的碱性磷酸酶标山羊抗兔，50μl/孔，置于30℃恒温摇床40min；
8、洗板：TBST洗三次，200μl/孔；
9、显色：1×DEA底物缓冲液10mL需添加0.1mg/mL pNPP 100μl，50μl/孔，30℃静置15min；
10、终止：1M NaOH，50μl/孔；
11、读数：OD415。
实施例4氟喹诺酮类ELISA测定方法建立与鉴定
4.1氟喹诺酮类ELISA测定方法的原理
本发明中以达氟沙星与卵清蛋白的偶联物为包被抗原，并使包被抗原结合到酶标板固相载体表面，然后加入氟喹诺酮类药物标准溶液或待测的样本(含待测的稀释样本)及制备的氟喹诺酮类兔单克隆抗体，氟喹诺酮类药物标准溶液或待测样本与包被抗原竞争性结合氟喹诺酮类抗体，与包被抗原结合的抗体在加入酶标二抗后可以显现出颜色，与游离的氟喹诺酮类药物小分子结合的抗体在洗涤时被除去。最后加入底物显色，氟喹诺酮类药物标准溶液或样本中药物含量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，最后的发色反应减弱，抑制率就越高；反之，则发色反应增强，抑制率越低，因而先根据已知量氟喹诺酮类药物的标准溶液获得抑制率与标准含量之间的对数关系绘制标准曲线，再根据样本的抑制率来推出待测样本的浓度。
4.2包被抗原浓度和抗体工作浓度的确定
同时稀释抗体和包被抗原的浓度，用方阵滴定法。本发明的包被浓度为0.25μg/mL，抗体工作浓度0.1μg/mL。
4.3标准曲线和检测灵敏度
标准曲线的制备，其基本的操作步骤如下：
4.3.1包板
包被缓冲液将抗原稀释至包板浓度，100μL/孔，4℃冰箱中过夜包被或于37℃恒温箱中温育2h包被。
4.3.2封闭
取出包被好的酶标板，甩掉包被液，用PBST洗涤后，每孔加入2.0％脱脂奶，200μL/孔，于37℃恒温箱中温育1h。
4.3.3点板
1)配制氟喹诺酮药物的标准溶液
氟喹诺酮类药物小分子，用0.03mol/L NaOH溶液配制成浓度为1mg/mL储备液，置于冰箱中。用时系列稀释。
2)氟喹诺酮类抗体稀释液的配制
从冰箱中取出抗体，用PBS将抗体稀释至工作浓度。
3)点板
取出经封闭的板，PBST洗涤3次后，每孔加入系列浓度的氟喹诺酮类药物标准液50μL，再加入抗体稀释液50μL，对照孔中加入PBS 50μL和抗体稀释液50μL。放入37℃恒温箱中温育1h，弃去孔内液体，PBST溶液200μL/孔洗涤3次。
4.3.4酶标二抗加入
经1∶12000倍稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBS溶液，100μL/孔，37℃温育45min。用PBST溶液洗涤3次。
4.3.5显色
每孔加入TMB-过氧化脲溶液100μL，37℃恒温箱中温育15min，用50μL/孔2M H2SO4终止反应。在酶联仪上测定OD450的吸光值。根据抑制率与氟喹诺酮类药物浓度之间的对数关系绘制标准曲线。
ELISA方法的标准曲线用抑制率与药物浓度对数曲线表示。
抑制率计算公式如下：
其中，OD450sam表示竞争性孔的OD值，OD450min表示阴性孔的OD值，OD450max表示阳性孔的OD值。
由上述公式计算得到氟喹诺酮类混和药物各浓度的抑制率，绘制标准曲线。根据标准曲线计算，抑制率达50％时氟喹诺酮药物的含量为0.3200ng/mL，氟喹诺酮药物检测的线性范围0.1319ng/mL-0.7761ng/mL，最低检测限为0.0982ng/mL。
标准曲线见附图
4.4抗体的特异性
采用间接竞争ELISA法，将系列浓度的各种常用氟喹诺酮药物与抗体稀释液同时加入到包被有包被抗原的96孔酶标板中，以抑制率为纵坐标，各样品浓度对数为横坐标绘制标准曲线，分别计算各自的IC50值。再根据单抗对氟喹诺酮类的混和药物的IC50值与单抗对各单种药物的IC50值的比值得到交叉反应率(CR％)，实验结果见下表
氟喹诺酮类兔单克隆抗体交叉率测定
单抗对六种氟喹诺酮药物的交叉率比较好，即恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星。这六种药物的半数抑制率IC50值都小于10ng/ml，对诺氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星三种药物IC50值小于100ng/ml。从上述结果可以证明该抗体检测的广谱性比较好，可以作为氟喹诺酮大类的检测抗体。
Claims (7)
1.抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于它的步骤如下：
1)将30mg环丙沙星、45mgN-羟基琥珀酰亚胺和150mg碳二亚胺盐酸溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中，避光搅拌反应24h，得到环丙沙星反应液；将牛血清白蛋白100mg，溶解于15mL磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将环丙沙星反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应3h，用磷酸盐缓冲液透析，得到环丙沙星免疫抗原，-20℃存放；氧氟沙星免疫抗原、恩诺沙星免疫抗原与环丙沙星免疫抗原合成方法相同；
2)将氟甲喹40mg溶解于1ml的二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应20分钟，得到氟甲喹溶液反应液；将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将氟甲喹溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到氟甲喹免疫抗原，-20℃保存；
3)将达氟沙星40mg溶解于3ml二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，暗处反应60分钟，得到达氟沙星溶液反应液；将60mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH 9.6碳酸缓冲液，得到牛血清白蛋白溶液，将达氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到达氟沙星免疫抗原，-20℃保存；
4)将诺氟沙星40mg溶解于2ml二甲基甲酰胺和2ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应60分钟，得到诺氟沙星溶液反应液；将100mg牛血清白蛋白、167mg碳二亚胺盐酸、167mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于8ml去离子水中，再加入2ml乙二胺，4℃反应12h，得到牛血清白蛋白溶液；将诺氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到诺氟沙星免疫抗原，-20℃保存；
5)将上述合成的六种免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将六种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将六种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将六种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；
6)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为：在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；
7)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；
8)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产氟喹诺酮类兔单克隆抗体；
2.根据权利要求1所述的一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为：分别取2×108个脾淋巴细胞和1×108个240E细胞混匀，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混匀成糊状，37℃水浴预温，缓缓加入经37℃预温的50％聚乙二醇溶液，再加入经37℃预温的1640培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用，补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉淀悬浮于HAT培养液中；
3.根据权利要求1所述的一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述氟喹诺酮药物结构通式为：
4.一种如权利要求1所述的抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于：用于制备检测氟喹诺酮类药物残留的ELISA检测试剂盒；
5.一种如权利要求1所述的抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于：用于制备检测氟喹诺酮类药物多残留的胶体金检测试剂盒；
6.一种如权利要求1如所述的氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于：用于检测食品、饲料及环境样品中的氟喹诺酮类药物的残留；
7.如权利要求4、5或6所述的一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于所述的氟喹诺酮类药物为恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星及达氟沙星。
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Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206279A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-10-05 | 商务部流通产业促进中心 | 检测恩诺沙星的scFv抗体、其编码基因及应用 |
| CN102212136A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-10-12 | 商务部流通产业促进中心 | 检测诺氟沙星的scFv抗体、其编码基因及应用 |
| CN102323415A (zh) * | 2011-06-13 | 2012-01-18 | 清华大学深圳研究生院 | 一种检测环丙沙星的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN102680677A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-19 | 嘉兴博泰生物科技发展有限公司 | 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 |
| CN102827076A (zh) * | 2012-08-25 | 2012-12-19 | 河北农业大学 | 一种氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用 |
| CN103091495A (zh) * | 2013-01-16 | 2013-05-08 | 河南知微生物工程有限公司 | 一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡及其制备方法 |
| CN103323595A (zh) * | 2012-03-22 | 2013-09-25 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡及其应用 |
| CN103439504A (zh) * | 2013-08-03 | 2013-12-11 | 河南省农业科学院 | 快速检测氟罗沙星的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103630657A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-03-12 | 洛阳莱普生信息科技有限公司 | 一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒及其测试方法 |
| CN104698176A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-06-10 | 天津农学院 | 吸附氯霉素的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用 |
| CN106434566A (zh) * | 2016-06-28 | 2017-02-22 | 苏州大学 | 抗氟喹诺酮类药物簇特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其产生的单抗和应用 |
| CN106565843A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-04-19 | 浙江大学 | 抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法及其用途 |
| CN106645728A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-05-10 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种食品中氟喹诺酮类药物的检测试剂盒 |
| CN108727502A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-11-02 | 华南农业大学 | 一种左旋氧氟沙星抗体的Fab片段制备方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1861632A (zh) * | 2006-03-14 | 2006-11-15 | 山东大学 | 诺氟沙星的偶联物及其制备方法与应用 |
| CN101455958A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-06-17 | 中国农业大学 | 自动物样品中提取喹诺酮类和磺胺类化合物的方法及其专用免疫亲和吸附剂 |
| CN101699292A (zh) * | 2009-10-29 | 2010-04-28 | 浙江大学 | 基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒 |
-
2010
- 2010-10-19 CN CN 201010514181 patent/CN101983971A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1861632A (zh) * | 2006-03-14 | 2006-11-15 | 山东大学 | 诺氟沙星的偶联物及其制备方法与应用 |
| CN101455958A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-06-17 | 中国农业大学 | 自动物样品中提取喹诺酮类和磺胺类化合物的方法及其专用免疫亲和吸附剂 |
| CN101699292A (zh) * | 2009-10-29 | 2010-04-28 | 浙江大学 | 基于兔单克隆抗体的环丙沙星残留分析酶联免疫吸附试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 20071015 潘孝成 氧氟沙星与二氟沙星的抗体制备及ELISA方法建立 全文 1-7 , * |
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206279A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-10-05 | 商务部流通产业促进中心 | 检测恩诺沙星的scFv抗体、其编码基因及应用 |
| CN102212136A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-10-12 | 商务部流通产业促进中心 | 检测诺氟沙星的scFv抗体、其编码基因及应用 |
| CN102212136B (zh) * | 2011-03-25 | 2013-01-16 | 商务部流通产业促进中心 | 检测诺氟沙星的scFv抗体、其编码基因及应用 |
| CN102206279B (zh) * | 2011-03-25 | 2013-08-28 | 商务部流通产业促进中心 | 检测恩诺沙星的scFv抗体、其编码基因及应用 |
| CN102323415A (zh) * | 2011-06-13 | 2012-01-18 | 清华大学深圳研究生院 | 一种检测环丙沙星的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN102323415B (zh) * | 2011-06-13 | 2014-03-19 | 清华大学深圳研究生院 | 一种检测环丙沙星的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103323595B (zh) * | 2012-03-22 | 2016-07-27 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡及其应用 |
| CN103323595A (zh) * | 2012-03-22 | 2013-09-25 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡及其应用 |
| CN102680677A (zh) * | 2012-05-08 | 2012-09-19 | 嘉兴博泰生物科技发展有限公司 | 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 |
| CN102680677B (zh) * | 2012-05-08 | 2015-04-01 | 嘉兴博泰生物科技发展有限公司 | 一种检测氧氟沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 |
| CN102827076B (zh) * | 2012-08-25 | 2013-10-30 | 河北农业大学 | 一种氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用 |
| CN102827076A (zh) * | 2012-08-25 | 2012-12-19 | 河北农业大学 | 一种氟喹诺酮类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用 |
| CN103091495A (zh) * | 2013-01-16 | 2013-05-08 | 河南知微生物工程有限公司 | 一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡及其制备方法 |
| CN103091495B (zh) * | 2013-01-16 | 2014-11-05 | 河南知微生物工程有限公司 | 一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡及其制备方法 |
| CN103439504A (zh) * | 2013-08-03 | 2013-12-11 | 河南省农业科学院 | 快速检测氟罗沙星的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103439504B (zh) * | 2013-08-03 | 2015-11-25 | 河南省农业科学院 | 快速检测氟罗沙星的免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103630657B (zh) * | 2013-11-07 | 2015-10-28 | 洛阳莱普生信息科技有限公司 | 一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒及其测试方法 |
| CN103630657A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-03-12 | 洛阳莱普生信息科技有限公司 | 一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒及其测试方法 |
| CN104698176A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-06-10 | 天津农学院 | 吸附氯霉素的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用 |
| CN106434566A (zh) * | 2016-06-28 | 2017-02-22 | 苏州大学 | 抗氟喹诺酮类药物簇特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其产生的单抗和应用 |
| CN106565843A (zh) * | 2016-11-01 | 2017-04-19 | 浙江大学 | 抗黄体酮类兔单克降抗体的制备方法及其用途 |
| CN106645728A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-05-10 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种食品中氟喹诺酮类药物的检测试剂盒 |
| CN108727502A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-11-02 | 华南农业大学 | 一种左旋氧氟沙星抗体的Fab片段制备方法及应用 |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110309 |