CN102778564A - 用于检测莱克多巴胺的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞Rac所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201186。本发明还公开了用于检测莱克多巴胺的酶联免疫方法和试剂盒及其在莱克多巴胺检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别莱克多巴胺，酶联免疫方法及试剂盒能检测更低浓度的莱克多巴胺残留，检测灵敏度、准确度高，精密度好。

Description

用于检测莱克多巴胺的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于检测分析和免疫学技术领域，具体涉及一种用于检测莱克多巴胺的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒。

背景技术

莱克多巴胺属于双苯烷胺类的β－受体兴奋剂，具有广泛的生理效应，常被用于支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病的治疗。它同时又是良好的营养重分配剂和生长促进剂，因此被广泛用于饲料添加剂。莱克多巴胺在动物机体内的残留一旦通过食物链进入人体，会产生极大的危害，特别对心脏病、糖尿病、高血压、甲亢等病人危害更大，甚至会导致死亡。目前，欧盟、日本等许多国家都将其列为违禁药物，禁止在畜禽生产上使用。我国农业部2002年3月农牧发[2002]1号文“关于发布《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》的通知”中明确规定禁止使用莱克多巴胺，农业部、卫生部、国家药品监督管理局2002年第176号公告也明令禁止在饲料和动物饮用水中使用莱克多巴胺。

现有的检测莱克多巴胺的方法主要有仪器分析方法和免疫化学分析方法等。仪器分析方法的样品前处理复杂，成本高，操作繁琐，适用于样品的确证分析，而不适用于大批量样品的筛选及现场检测。免疫化学分析法特别是酶联免疫方法（ELISA）具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选。因此对于快速检测β－受体兴奋剂在动物组织中的残留，ELISA方法更具优势。

Li等（2007）将莱克多巴胺与人血清白蛋白结合制备完全抗原，得到单克隆抗体，其IC₅₀为21.25 ng/mL，最低检测限为1.5 ng/mL。Weilin等（2000）研究建立了莱克多巴胺残留检测的ELISA方法，分别以Rac-hemiglutarate-血蓝蛋白和Rac-hemiglutarate-卵清蛋白为免疫原和包被原，制备多克隆抗体，检测莱克多巴胺IC₅₀值为4.2ng/mL。可见，半抗原的化学结构的细小差异，连接到载体蛋白上的化学位点的不同，交联臂化学性质的不同均是影响小分子化合物抗体性质的决定性因素。上述研究中多克隆抗体的灵敏度较高，但不利于标准化；单克隆抗体利于标准化生产，但是灵敏度又不够。因此，制备一种灵敏度高的能用于检测莱克多巴胺的单克隆抗体和酶联免疫试剂盒，并建立相应的ELISA检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体和检测莱克多巴胺的酶联免疫方法与试剂盒。本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在莱克多巴胺检测中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201186的杂交瘤细胞Rac所分泌的。

所述的杂交瘤细胞Rac，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201186。

所用的免疫原是由半抗原琥珀酸酐莱克多巴胺（RAC-SA）与牛血清白蛋白（BSA）偶联制备的。

所述的单克隆抗体在制备检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒中的应用。

包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

所述试剂盒是用于检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒。

所述的试剂盒在莱克多巴胺检测中的应用。

一种检测莱克多巴胺的酶联免疫方法，包括以下步骤：

（1）将半抗原琥珀酸酐莱克多巴胺（RAC-SA）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原（RAC-SA-BSA）；

（2）将半抗原（RAC-SA）与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被原(RAC-SA-OVA)；

（3）利用步骤（1）的免疫原制备保藏号为CCTCC NO:C201186的杂交瘤细胞Rac；

（4）利用保藏号为CCTCC NO:C201186的杂交瘤细胞Rac制备单克隆抗体；

（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；

（6）样品前处理：猪尿样品加乙腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用乙酸乙酯反萃，再取乙酸乙酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物；

（7）对步骤（6）的待测物进行检测。

所述的酶联免疫方法在莱克多巴胺检测中的应用。

本发明的有益效果是：

1．本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别莱克多巴胺；

2. 本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法灵敏度高，能检测更低浓度的莱克多巴胺残留，同时具有精密度高、灵敏度好的特点。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为本发明的以莱克多巴胺为标准品的间接竞争ELISA反应标准曲线，X轴为莱克多巴胺标准溶液浓度对数值，Y轴为莱克多巴胺标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值（B/B₀）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1 免疫原和包被原的制备

1.1 莱克多巴胺半抗原（RAC-SA）的合成

RAC-SA的合成：7.3g氢化钠溶于100mL无水N，N－二甲基甲酰胺（DMF）中，氮气保护状态下，逐滴加入20g溶于100mLDMF中的4-（4-苯羟基）-2-丁酮，混合物室温搅拌反应1h。准确称取28.5g 4-溴丁酸乙酯溶于50mLDMF中，将其加入上述混合溶液中，于60℃水浴中搅拌反应过夜。用薄层色谱检测原料药反应完全。加入200mL水、200mL乙酸乙酯萃取有机相，之后用无水硫酸钠干燥。已烷与乙酸乙酯4:1过柱纯化得到白色固体。

准确称取上述白色固体7g及章胺盐酸盐6g，溶于200mL甲醇中，加入6.2g三乙胺和2g氰基硼氢化钠，50℃反应过夜。蒸干溶剂，加入60mLHCl(1N)和100mL水，乙醚洗涤萃取杂质。水相用氢氧化钠（6N）调pH值至12-13，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后得到混合物。

称取7g上述混合物溶于90mL甲醇中，加30mL氢氧化钠（2N）室温搅拌反应过夜。将甲醇蒸发掉，加水100mL，并用盐酸（1N）调pH值至3-4，有白色固体析出，过滤，水洗，后烘干，得到莱克多巴胺半抗原（RAC-SA），其化学结构式为（Ⅰ），合成路线如下：

1.2 莱克多巴胺免疫原及包被原的合成

准确称取莱克多巴胺半抗原58mg，溶于2.5mL二甲亚砜中，加入34mgN,N-二环己基碳二亚胺冰浴搅拌反应15min后加入19mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应过夜得到A液。准确称取BSA100mg（或OVA 250mg），使其充分溶解在20mL硼酸盐缓冲溶液（pH8.5）中为B液。冰浴中，磁力搅拌下将A液缓慢滴加到B液中，4℃下搅拌反应过夜，之后装入透析袋，在pH7.4磷酸盐缓冲液中透析72h，期间换透析液6次。低压冻干，即得偶联物RAC-SA-BSA（或RAC-SA-OVA），置-20℃保存，作为免疫原（或包被原）。合成路线如下：

实施例2 单克隆抗体的制备

2.1 小鼠免疫

参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社 2001年版中的方法：以实施例1制备的RAC-SA-BSA偶联物为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基础免疫及数次加强免疫。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠（效价高、灵敏度好）停止免疫以备融合。

2.2 细胞融合与筛选

在融合前3天（最好与上次免疫相隔3周以上）给免疫合格的小鼠腹腔注射含100μg免疫原的蛋白溶液（不加佐剂），强化免疫。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取3～5×107个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合（比例为1:10～5:10）。1500r/min离心5min，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其放置于37℃水浴中，将吸有0.8mL预温至37℃的50%PEG（购自Amersco）的lmL刻度吸管插入到管底，60sec内缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90sec，将离心管插到离心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取10mL预温至37℃的RPMI–1640基础培养液（购自Hyclone）沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，第1分钟逐滴加入1mL（3sec/滴），第2分钟再加2mL，最后加完剩下的7mL（5min内加完）。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加RPMI–1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。1500r/min离心5min，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴/孔。一次融合可接种5块96孔细胞培养板，置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养。从融合当天算起为0d，前面3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基（购自Amersco）并观察集落生长情况；第5d每孔吸出l/2培养上清（100μL），再加入1滴HT完全培养基（购自Amersco）；以后每隔3d同上法吸去l/2培养上清，换入HT完全培养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积1/4左右即可取细胞培养上清，以发明人制备的RAC-SA-OVA偶联物为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌RAC抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株稳定分泌抗莱克多巴胺抗体的杂交瘤细胞株， 对该杂交瘤细胞株进行染色体计数平均值为103.3条，高于亲本细胞的染色体数目（SP2/0骨髓瘤细胞的染色体平均数为58条，脾细胞染色体为40条），说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤细胞命名为Rac，并于2011年9月8日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO∶C201186。

2.3 腹水单抗制备与鉴定

在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI–1640基础培养基悬浮细胞并将细胞数调至1×106个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水，纯化获得单克隆抗体。以鼠单克隆抗体快速ELISA同型检测试剂盒确定单克隆抗体为IgG1 κ亚型。

实施例3 间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1 试剂配制

碳酸盐缓冲液（pH9.6）：准确称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

洗涤液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加入Tween 20 0.50mL，定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入磷酸盐缓冲液1000mL，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。

底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司）10mL，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀，现配现用。

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。

3.2 方阵滴定法

采用方阵滴定法初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液将RAC-SA-OVA包被原倍比稀释成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，从第一至第七行依次横向加入96孔酶标板，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭2h；洗涤3次，拍干，单克隆抗体使用磷酸盐缓冲液倍比稀释成1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1024000，从第一至第八列依次纵向加入96孔酶标板加入酶标板，37℃孵育30min；洗涤3次，拍干，各孔加入用磷酸盐缓冲液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（简称二抗，以下所指二抗均为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞羿生物技术有限公司）100μL，37℃孵育30min；洗涤4次，拍干，各孔加入底物混合液100μL，避光显色15min；加入终止液50μL；用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值（OD值）。方阵滴定结果见表1，初步选择几个OD值接近2.0，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。结果表明，可选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合：（0.5，128000）和（1，256000）。

表1单克隆抗体方阵滴定

3.3 最佳包被浓度的选择

以方阵滴定选择的包被浓度和抗体稀释度组合分别作抑制曲线，RAC标准品浓度设置为0、0.375、0.75、1.5、3、6 μg/L，其“0”孔与IC₅₀值见表2。抗原抗体的比例是影响其灵敏度的关键，若出现抗原或抗体过剩都将造成IC₅₀偏高，由数据可见，最佳包被浓度为0.5μg/mL，抗体稀释度初步确定为1: 256000

表2 最佳包被浓度优化

包被浓度 (μg/mL)	抗体稀释度（1∶X）	“0”孔OD值	IC50 (μg/L)
				0.5	128000	2.07	2.14
1	256000	1.65	1.26

3.4 最佳抗体稀释度的选择

以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1: 180000为中心浓度设计3个稀释梯度，其0孔与IC₅₀值见表3。随着抗体稀释度的增加，IC₅₀值降低，但是“0”孔值也降低，因此选择1: 180000为最佳抗体稀释度。

表3最佳抗体稀释度优化

抗体稀释度（1∶X）	“0”孔OD值	IC50 (μg/L)
			150000	2.16	2.12
180000	1.81	1.17
			250000	1.69	1.08

3.5 标准曲线的建立

将莱克多巴胺标准品配制成0、0.375、0.75、1.5、3、6 μg/L等6个浓度梯度，按照上面确定的间接竞争ELISA方法测定，绘制标准曲线（见附图2）。间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为：y＝－0.4820x＋1.0039，r²＝0.991，IC₅₀值为1.15±0.037 μg/L（n＝5），线性范围为0.375～6 μg/L。

3.6 特异性

分别将各种β-受体兴奋剂类药物标准品倍比稀释成浓度梯度进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC₅₀值，与莱克多巴胺标准品IC₅₀值对比得到交叉反应率，结果见表4。该单克隆抗体对莱克多巴胺和利托君有识别能力。

表4单克隆抗体对β-兴奋剂类药物的交叉反应率

药物	IC50(μg/L)	交叉反应率（%）
			莱克多巴胺	1.15	100
利托君	9.8	11.7
			沙丁胺醇	＞10000	＜0.005
西马特罗	＞10000	＜0.005
			马布特罗	＞10000	＜0.005
克伦丙罗	＞10000	＜0.005
			马喷特罗	＞10000	＜0.005
妥洛特罗	＞10000	＜0.005
			特布他林	＞10000	＜0.005
克伦特罗	＞10000	＜0.005
			多巴胺	＞100	＜0.46
异丙肾上腺素	＞100	＜0.46
			马波特罗	＞10000	＜0.005
非诺特罗	＞100	＜0.46

实施例4： 本发明ELISA检测试剂盒的组装

4.1试剂盒组成成分

⑴ 包被有包被原RAC-SA–OVA的酶标板；

⑵莱克多巴胺标准品溶液6瓶，浓度分别为0、0.375、0.75、1.5、3、6 μg/L；

⑶杂交瘤细胞Rac单克隆抗体工作液；

⑷ 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

⑸ 浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

⑹ 浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween-20 5mL，加双蒸水至1000mL；

⑺ 底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司）10mL，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀，现配现用；

⑼ 终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备：

⑴ 包被：用碳酸盐缓冲液将RAC-SA–OVA稀释成0.5μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。

⑵ 洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

⑶ 封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。

⑷ 洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

⑸烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。

⑹封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。所述的干燥剂为硅胶或无水氯化钙其中的一种。

实施例5：试剂盒在检测动物可食性组织中莱克多巴胺残留量中的应用

5.1试剂配制

0.05mol/L 盐酸：准确量取浓盐酸4.1mL，加入适量去离子水中混匀，定容至1000mL，即为0.05mol/L盐酸。

样品提取液：0.05mol/L 盐酸: 乙腈=6:4。

洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液液用去离子水10倍稀释，置4℃冰箱保存备用。

样本稀释液：将试剂盒中提供的浓缩样本稀释液用去离子水5倍稀释，置4℃冰箱保存备用。

5.2样品处理

猪尿样品 取1mL澄清猪尿（若尿液混浊，4000r/min离心10min后再取样）于10mL离心管中，加乙腈50uL，漩涡1min；4000r/min离心5min，取上清液检测。

猪肉样品 称取均质猪肉3.0±0.03g于50mL塑料离心管中，加入6mL样品提取液，涡旋1min；4000r/min 离心20min，取3mL上层液于10mL塑料离心管中，加入4mL乙酸乙酯于10mL塑料离心管，涡旋30S，4000r/min 离心10min。取乙酸乙酯层于30-50℃氮气吹干。加入1mL 样品稀释液，涡旋30S，再加1mL 正己烷涡旋30S，4000r/min 离心10min，取下层检测。

本方法对猪尿和猪肉样品的稀释倍数为1。

5.3  ELISA测定程序

⑴ 取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。

⑵ 加莱克多巴胺标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

⑶ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。

⑷ 加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37 ℃孵育60min。

⑸ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤5次。

⑹ 加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37 ℃孵育15min。

⑺ 加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。

5.4结果判定

将标准液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100 %，即为抑制率。在0.0375 ~ 6μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中莱克多巴胺的残留浓度。

实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

6.1本发明试剂盒的灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。分别取均质空白组织样品（猪尿和猪肉）各20份，样品处理后ELISA测定。将测定的OD值代入标准曲线，计算空白样品的测定浓度、平均值及标准差。根据公式

+ 3SD，得到莱克多巴胺在各组织样品的最低检测限，结果见表5。本试剂盒对莱克多巴胺在猪尿和猪肉中的最低检测限分别为0.31μg/kg和0.35μg/kg。

表5 试剂盒对各组织的最低检测限

6.2本发明试剂盒的精密度

分别将0.375、0.75、1.5、3、6 μg/L 莱克多巴胺标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表6。结果表明，标准曲线的板内及板间变异系数均＜15%，说明本研究建立的间接竞争ELISA方法具有较好的精密度。

表6 标准曲线的板内与板间变异系数

6.3本发明试剂盒的准确度

试剂盒的准确度用添加回收率来表示。将莱克多巴胺在猪肉和猪尿中分别添加，使其浓度达到0.5μg/kg和1.0μg/kg，样品前处理后用本试剂盒进行测定，每批5个重复，重复测定3批，计算回收率和变异性。结果（见表7-8）显示，本试剂盒在各组织的回收率均在69.8%～118.6%范围内，批内与批间变异系数＜22.3%。

表7 猪尿中莱克多巴胺添加回收率与变异系数

表8 猪肉中莱克多巴胺添加回收率与变异系数

Claims (8)

1.一种能识别莱克多巴胺的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO: C201186的杂交瘤细胞Rac所分泌的。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞Rac，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201186。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是用于检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在莱克多巴胺检测中的应用。

7.一种检测莱克多巴胺的酶联免疫方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将半抗原琥珀酸酐莱克多巴胺与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；

（2）将半抗原与卵清蛋白偶联得到包被原；

（3）利用步骤（1）的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201186的杂交瘤细胞Rac；

（4）利用保藏号为CCTCC NO:C201186的杂交瘤细胞Rac制备单克隆抗体；

（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；

（6）样品前处理：猪尿样品加乙腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用乙酸乙酯反萃，再取乙酸乙酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物；

（7）对步骤（6）的待测物进行检测。

8.权利要求7所述的酶联免疫方法在莱克多巴胺检测中的应用。

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