CN103288963A - 吉他霉素残留检测用单克隆抗体及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体及制备方法和应用，杂交瘤细胞KA/2A9，CCTCC，NO:C201184。步骤：A、将半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；B、将半抗原吉他霉素与卵清蛋白偶联得到包被原；C、利用免疫原制备得到杂交瘤细胞株KA/2A9所分泌的单克隆抗体；D、用包被原包被固相载体；E、将待测样品用偏磷酸/乙醇下提取、乙酸乙酯反萃取，氮气吹干、样品稀释液得到待测物；F、对待测物进行酶联免疫检测。一种吉他霉素残留检测的试剂盒及应用，包括：包被有包被原kitasamycin-AOAA-OVA的酶标板；吉他霉素标准品溶液；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；浓缩磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液；底物混合液；终止液。方法具有简便、快速、灵敏、准确的特点。

Description

吉他霉素残留检测用单克隆抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体，同时还涉及一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的制备方法，还涉及一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的用途。 

背景技术

吉他霉素属于大环内酯类抗生素，广泛用于猪和禽的生产。不正确的使用会导致其在动物体内的残留，导致消费者+使用后出现一系列不良反应。主要有轻微的胃肠道反应如腹泻、恶心、呕吐、过敏、肝毒性、耳鸣、听觉障碍和心脏毒性等(舒刚等，2006)。吉他霉素残留还会引起人体内细菌产生耐药性，直接影响人类疾病治疗(Deguchi et al.，1990；刘秀昌和赵学良，2009)。Nakae等在临床样本细菌耐药性实验中证实，临床细菌吉他霉素耐药很严重，97.6～100％临床分离菌株对其耐药(Nakae et al.，1999)。 

考虑到吉他霉素的危害，我国规定其在猪和鸡各组织的残留限量均为200μg/kg(中华人民共和国农业部公告第235号，2002)。各种吉他霉素制剂在猪和鸡的休药期均为7d，产蛋鸡禁用(中华人民共和国农业部公告第278号，2003)。日本肯定列表制度规定吉他霉素在猪、鸡各组织的最高残留限量均为200μg/kg(日本肯定列表，2006)。 

现有的吉他霉素检测方法主要是高效液相色谱方法和高效液相色谱方法与质谱联用方法(He et al.，2009；Gonzalez Huebra MJ et al.，2005，2007；Horie et al.，1998，2003)。仪器检测方法测定结果准确，而且能够对残留物质进行定性分析，是残留检测的确证方法。但仪器方法样品处理一般比较复杂、耗时长、所用仪器成本高，很难在基层普及。ELISA检测方法具有简便、快速、低成本和高通量的特点，适合样品的广泛筛选。目前尚未检索到关于吉他霉素特异性抗原、抗体、酶联免疫方法和试剂盒的报道。制备吉他霉素的单克隆抗体、建立ELISA检测方法和试剂盒，有利于监控吉他霉素的残留。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体，该抗体是首次制备的能特异性识别吉他霉素的单克隆抗体。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的制备方法，该方法是由半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联制备的免疫原免疫小鼠，经细胞融合与克隆筛 选后，获得了能特异性分泌吉他霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株KA/2A9，CCTCCNO：C201184。 

本发明的再一个目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测的试剂盒，该试剂盒能广泛应用于动物可食性组织中吉他霉素的残留检测，准确提供动物可食性组织中吉他霉素的残留量信息 

本发明的再有一个目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测试剂盒在动物源性食品中吉他霉素残留检测中的应用。为动物源性食品中吉他霉素的残留监控提供了可靠地技术手段。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

一种能识别吉他霉素的单克隆抗体，其特征在于，杂交瘤细胞株KA/2A9，CCTCC，NO：C201184。 

上述杂交瘤细胞KA/2A9，保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201184。 

所用的免疫原是由半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联制备的。 

进一步，本发明提出了一种适用于吉他霉素残留检测的酶联免疫(ELISA)方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的前处理等步骤，一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的制备方法，其步骤是： 

A、将半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联得到免疫原； 

B、将半抗原吉他霉素与卵清蛋白偶联得到包被原； 

C、利用步骤A的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO：C201184杂交瘤细胞株KA/2A9所分泌的单克隆抗体； 

D、用步骤B的包被原包被固相载体(如酶标板)； 

E、将待测样品用偏磷酸/乙醇下提取、乙酸乙酯反萃取，氮气吹干、样品稀释液重新溶解得到待测物； 

F、对步骤E的待测物进行酶联免疫检测； 

步骤E样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.00g，KH₂PO4 0.20g，Na₂HPO4·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，加双蒸水定容至1000mL。 

发明人以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组装成能同时检测猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏中吉他霉素残留的酶联免疫试剂盒，对酶联免疫方法进行了验证，实现了本发明的任务，从而完成了本发明。 

一种吉他霉素残留检测的试剂盒，它包括： 

A、包被有包被原kitasamycin-AOAA-OVA的酶标板； 

B、吉他霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20μg/L； 

C、KA/2A9单克隆抗体工作液； 

D、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液； 

E、浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.00g，KH2PO4 2.00g，Na2HPO4·12H2O 29.00g，KCl 2.00g，加双蒸水至1000mL； 

F、浓缩洗涤液：NaCl 80.00g，KH2PO4 2.00g，Na2HPO4·12H2O 29.00g，KCl2.00g，Tween 205mL，加双蒸水至1000mL 

G、底物混合液：购自武汉市飞远科技有限公司。 

H、终止液：2mol/L硫酸溶液。 

一种酶标板制备的制备方法，其步骤是： 

A、包被：用碳酸盐缓冲液将kitasamycin-AOAA-OVA稀释成8μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。 

B、洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。 

C、封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。 

D、洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。 

E、烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。 

F、封装：酶标板烘干后和干燥剂(硅胶、无水氯化钙)一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。 

一种吉他霉素残留检测的试剂盒在动物源性食品中吉他霉素残留检测中的应用。其步骤是：取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架；加标准液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置；加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min；甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30sec，甩净PBST，在吸水纸上拍干。重复洗涤3～5次。加酶标抗体液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min；甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30sec左右，甩净PBST，在吸水纸上拍干。重复洗涤3～5次。加底物液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min；加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。 

本发明的主要优点是： 

本发明制备的单克隆抗体能识别吉他霉素，而现有专利和文献均无报道识别这种药物的抗体。 

本发明设计的样品处理路线相对简单，所用有机试剂少，适用范围广，操作简便。 

本发明建立的酶联免疫方法与试剂盒可以检测多种动物组织中吉他霉素残留，适用范围广。 

附图说明

图1为一种本发明的单克隆抗体与吉他霉素标准品的间接竞争ELISA反应曲线示意图。 

X轴为吉他霉素标准溶液浓度对数值，Y轴为吉他霉素标准品溶液的光密度值除以“0”孔光密度值(B/B₀)。 

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。 

实施例1：免疫原和包被原的制备 

准确称取吉他霉素(kitasamycin)标准品20mg，5mL甲醇溶解。称取氧羧甲基羟胺(AOAA)10mg，1mL水溶解。将AOAA溶液缓慢加入吉他霉素甲醇溶液中，搅拌反应过夜。反应溶液60℃旋转蒸干。准确吸取1mL DMF溶解蒸干物，加入DCC 100mg搅拌反应过夜。 

准确称取牛血清白蛋白(BSA)100mg，量取PBS 10mL溶解蛋白。吸取DCC活化药物溶液1mL，缓慢滴加到蛋白溶液中，搅拌反应过夜。反应溶液8000r/min离心10min，4℃在生理盐水溶液透析3d，每12h更换透析液。透析后反应溶液小瓶分装，冷冻干燥。-20℃密封保存。此为免疫原kitasamycin-AOAA-BSA。 

准确称取卵清蛋白(OVA)100mg，量取PBS 10mL溶解蛋白。吸取DCC活化药物溶液1mL，缓慢滴加到蛋白溶液中，搅拌反应过夜。反应溶液8000r/min离心10min，4℃在生理盐水溶液透析3d，每12h更换透析液。透析后反应溶液小瓶分装，冷冻干燥。-20℃密封保存。此为包被原kitasamycin-AOAA-OVA。 

实施例2：单克隆抗体的制备 

杂交瘤细胞株的制备：参照朱立平和陈学清《免疫学常用实验方法》，以实施例1制备的免疫原kitasamycin-AOAA-BSA免疫Balb/C小鼠，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化，最后于融合前三天腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％(体积比)酒精中浸泡5min消毒。将3～5×10⁷SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞悬液加入到 50mL离心管中，混匀，1500r/min离心5min。弃上清，并用灭菌的滤纸吸干。轻轻敲击管底，使管底细胞松动。将离心管置于37℃水浴中，1min内缓慢加入预温至37℃的50％(质量体积比)PEG 0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完后继续搅拌30sec，静置1min。缓慢加入37℃预温的RPMI-1640基础液10mL。具体方法为：第1min逐滴加1mL，第2min加2mL，之后缓慢加入剩余的RPMI-1640基础液，边加边轻摇离心管。缓慢加入40mL RPMI-1640基础液，加完后，缓慢上下颠倒混匀，1500r/min离心5min。弃上清，10mL滴管吸取含饲养细胞HAT培养基，沿管壁缓慢滴加，用滴管缓慢机械搅拌，缓慢吸取融合细胞，接近饲养细胞液面滴加，机械搅拌混匀。接种于6块96孔培养板中，约150μL/孔，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。 

从融合当天起计为0d，3d后每个培养孔滴加1滴HAT培养基，5d后有规律地每隔2d吸去1/2体积的培养基，换入等量HT培养基。在融合后4d，开始对融合细胞进行跟踪观察，标记和记录有杂交瘤细胞生长的培养孔，并计算融合率。在融合后6～7d，待孔内细胞长至孔底1/10～1/5时，取培养上清，用间接竞争ELISA方法筛选阳性细胞孔。包被原浓度为10mg/L。每个细胞培养孔设置0孔和200μg/L药物孔，每孔中加入50μL培养上清进行间接竞争ELISA检测。选择4～6个上清检测呈强阳性且只有1～2个形态良好集落生长的孔，用有限稀释法进行亚克隆。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌吉他霉素特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。申请人将该杂交瘤细胞株命名为KA/2A9，杂交瘤细胞株KA/2A9，CCTCC，NO：C201184。并于2011年9月8日送交位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：C201184。 

腹水单抗制备与鉴定：在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI-1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO：C201184的杂交瘤细胞株KA/2A9扩大培养的细胞，并将细胞数调至1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京：人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。 

实施例3：吉他霉素间接竞争ELISA检测方法的建立和方法考核 

3.1ELISA相关试剂配制 

碳酸盐缓冲液配制：准确称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g、Proclin300 300μL于500mL烧杯中，加超纯水300mL搅拌至溶解完全，转入1000mL容量瓶中，烧杯用少量超纯水冲洗两次(皆倒入容量瓶中)，超纯水定容至1000mL。上下颠倒混匀，即为pH9.5～9.7碳酸盐缓 冲液。 

PBS配制：准确称取NaCl 8.00g、KH₂PO₄ 0.20g、Na₂HPO₄.12H₂O 2.90g和KCl 0.20g于500mL烧杯中，加超纯水300mL搅拌溶解完全，转入1000mL容量瓶中，超纯水定容至1000mL，上下颠倒混匀，即为pH7.3～7.5PBS。 

PBST配制：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.90g，KCl 0.20g于500mL烧杯中，加超纯水300mL搅拌溶解完全，转入1000mL容量瓶中，加入Tween 200.50mL，超纯水定容至1000mL，上下颠倒混匀，即为pH7.3～7.5PBST。 

封闭液配制：准确称取卵清蛋白10.00g于2000mL烧杯内，准确量取1000mL PBS，加入到烧杯内，搅拌混匀直至蛋白完全溶解，即为封闭液。 

0.9％偏磷酸溶液：准确称取偏磷酸9.0g，500mL去离子水煮沸溶解，定容至1000mL，室温(20-25℃，上下相同)保存。 

组织提取液：量取0.9％(质量体积比)偏磷酸溶液600mL，乙醇400mL，混匀后即为组织提取液，室温保存。 

底物液购自武汉飞远科技有限公司。 

终止液：2mol/L硫酸。 

3.2包被原浓度和抗体工作浓度的确定 

包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定：采用方阵滴定初步确定包被原浓度和抗体工作浓度，抗原浓度设置1、2、4、8、16、32、64mg/L。抗体浓度为1、2、4、8、16、32、64，128×10⁴。酶标板每孔加入50μL PBS和50μL抗体，选择OD值接近2.0，且相邻孔OD值出现较大变化的包被浓度和抗体浓度做为最佳抗原、抗体组合。 

根据选择的不同包被原浓度下OD值接近2.0的抗体浓度，设置4个梯度，确定不同抗原浓度下OD值接近2.0的抗体浓度。吉他霉素做为竞争药物，以标准曲线IC₅₀值做为判定指标，确定最佳包被原工作浓度。 

实验结果显示包被原浓度达到32mg/L时，抗原抗体反应基本达到饱和。方阵滴定结果见表1，分别以4、8、16，32mg/L包被酶标板，在OD值在2.0附近的抗体工作浓度附近，等差设置3个抗体浓度，确定OD值在1.8～2.0之间的对应抗体工作浓度。以确定的抗体浓度建立抑制曲线，药物浓度设置1.25～40μg/L，选择呈线性的浓度范围建立抑制曲线，计算抑制曲线的IC₅₀。以IC₅₀最低的包被浓度确定为最佳包被浓度，以该包被浓度下的抗体工作浓度确定为最佳抗体浓度。结果显示最佳包被浓度为8mg/L，抗体工作浓度4×10⁴。 

表1抗体方阵测定结果 

3.3标准曲线的建立 

在优化的条件下，将标准品配成系列浓度，每个浓度重复3个孔，用间接竞争ELISA检测。以标准溶液浓度对数值为横坐标，药物孔与0孔OD值之比B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数。计算IC₅₀值，重复测定5次，取平均值。如图1所示，标准曲线回归方程为y＝-0.610+0.995，标准曲线在1.25～20μg/L浓度范围内呈线性，标准曲线半数抑制率IC₅₀值为5.7±1.4μg/L(n＝5)。 

3.4交叉反应率测定 

将大环内酯类的吉他霉素、泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素、琥乙红霉素、麦迪霉素、交沙霉素、DES、OMT、23-amino-OMT、罗红霉素、阿维菌素和伊维菌素等配成适当浓度，间接竞争ELISA方法测定各药物对抗体的IC₅₀值，利用公式1计算交叉反应率。结果如表2所示。 

(公式1) 

表2本发明ELISA检测方法的特异性 

结果表明，本发明建立的吉他霉素残留ELISA检测方法对吉他霉素具有很高的灵敏度，同时对结构相似物交沙霉素和麦迪霉素存在一定交叉反应，其他大环内酯类药物交叉反应率小于0.1％，可用于动物组织中吉他霉素残留量的检测。 

实施例4：一种吉他霉素残留检测的试剂盒，它由以下物质组成： 

4.1试剂盒组分 

A、包被有包被原kitasamycin-AOAA-OVA的酶标板； 

B、吉他霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20μg/L； 

C、KA/2A9单克隆抗体工作液； 

D、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液； 

E、浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl 2.00g，加双蒸水至1000mL； 

F、浓缩洗涤液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl 2.00g，Tween 205mL，加双蒸水至1000mL 

G、底物混合液：购自武汉市飞远科技有限公司。 

H、终止液：2mol/L硫酸溶液。 

一种酶标板的制备方法，其步骤是： 

a)包被：用碳酸盐缓冲液将kitasamycin-AOAA-OVA稀释成8μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。 

b)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。 

c、封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。 

d、洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。 

e、烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。 

f、封装：酶标板烘干后和干燥剂(硅胶、无水氯化钙)一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。 

实施例5： 

一种吉他霉素残留检测的试剂盒在动物源性食品中吉他霉素残留检测中的应用。其步骤是： 

1试剂配制 

洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用双蒸水10倍稀释后使用。 

样品稀释液配制：准确称取NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KCl 0.2g于500mL烧杯中，加少量超纯水溶解，双蒸水定容至1000mL。 

0.9％(质量体积比)偏磷酸溶液：准确称取偏磷酸9g，500ml去离子水煮沸溶解，定容至1000ml，室温保存。 

组织提取液：准确量取偏磷酸溶液600ml，乙醇400ml，混匀后即为组织提取液，室温保存。 

2组织样品处理 

称取均质猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏样品2.00±0.02g于50mL离心管中，加入组织提取液10mL，漩涡5min，4000r/min离心5min。取上清液0.5mL于10mL离心管中，加入4mL乙酸乙酯，漩涡混匀1min。4000r/min离心5min。取下层乙酸乙酯于10mL离心管，40±5℃水浴，氮气吹干。加入PBS 2mL，漩涡混匀1min。取澄清水相检测，样品稀释倍数为20。 

3ELISA测定程序 

取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架；加标准液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置；加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min；甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30sec，甩净PBST，在吸水纸上拍干。重复洗涤3～5次。加酶标抗体液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min；甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30sec左右，甩净PBST，在吸水纸上拍干。重复洗涤3～5次。加底物液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min；加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。 

4结果判定 

将标准液或样品液吸光值的平均值除以0标准孔的吸光值再乘以100％，即为抑制率。在1.25～20μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。将样品的抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中吉他霉素的实际浓度。 

实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、准确度和精密度 

1本发明试剂盒的灵敏度 

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏空白样品各20份，按方法进行样品处理，进行ELISA检测，测定OD值。计算空白样品浓度，计算20份样品平均浓度 

和标准差(SD)，计算最低检测限， 

本试剂盒灵敏度见表3。 

表3吉他霉素在各种动物组织样品中的最低检测限 

2本发明试剂盒的准确度和精密度 

称取均质猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏样品2.00±0.02g于50mL离心管中，添加吉他霉素标准溶液，使组织中添加药物的浓度为0.5、1、2倍最高残留限量(MRL)。按照建立的组织处理方法进行样品处理，测定药物浓度。每个样品浓度测定5个平行样，不同的时间重复3次。计算平均回收率(见公式2)，标准差，批内和批间变异系数。结果如表4～表7所示，本试剂盒对组织中吉他霉素的添加回收率均在70～120％之间，批内和批间变异系数小于20％。 

(公式2) 

表4鸡肌肉中吉他霉素添加回收率及变异系数 

表5鸡肝脏中吉他霉素添加回收率及变异系数 

表6猪肌肉中吉他霉素添加回收率及变异系数 

表7猪肝脏中吉他霉素添加回收率及变异系数 

Claims (5)

1.一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体，其特征在于，杂交瘤细胞KA/2A9，CCTCC，NO：C201184。

2.权利要求1所述的一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的制备方法，其步骤是：

A、将半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；

B、将半抗原吉他霉素与卵清蛋白偶联得到包被原kitasamycin-AOAA-OVA；

C、利用步骤A的免疫原制备得到杂交瘤细胞株KA/2A9所分泌的单克隆抗体；

D、用步骤B的包被原包被固相载体；

E、将待测样品用偏磷酸/乙醇下提取、乙酸乙酯反萃取，氮气吹干、样品稀释液重新溶解得到待测物；

F、对步骤E的待测物进行酶联免疫检测；

所述的步骤E样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.00g，KH₂PO4 0.20g，Na₂HPO4·12H₂O2.90g，KCl 0.20g，加双蒸水定容至1000mL。

3.权利要求1所述的一种吉他霉素残留检测的试剂盒，它包括：

(1)包被有包被原kitasamycin-AOAA-OVA的酶标板；

(2)吉他霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20μg/L；

(3)KA/2A9单克隆抗体工作液；

(4)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

(5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.00g，KH2PO4 2.00g，Na2HPO4·12H2O 29.00g，KCl2.00g，加双蒸水至1000mL；

(6)浓缩洗涤液：NaCl 80.00g，KH2PO4 2.00g，Na2HPO4·12H2O 29.00g，KCl 2.00g，Tween 20 5mL，加双蒸水至1000mL；

(7)底物混合液；

(8)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.根据权利要求3所述的一种吉他霉素残留检测的试剂盒，其特征在于：所述的一种酶标板制备的制备方法，其步骤是：

1)包被：用碳酸盐缓冲液将kitasamycin-AOAA-OVA稀释成8μg/mL包被原溶液，吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h；

2)洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次；

3)封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h；

4)洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次；

5)烘干：在吸水纸上拍干后，将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h；

6)封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装；所述的干燥剂为硅胶、无水氯化钙。

5.权利要求3所述的一种吉他霉素残留检测的试剂盒在动物源性食品中吉他霉素残留检测中的应用。

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