CN103288960B - 吉他霉素残留检测用基因工程抗体及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种吉他霉素残留检测用基因工程抗体及制备方法和应用，其步骤：A、取液氮保存的杂交瘤细胞株KA/2A9，提取脾细胞总RNA，得到mRNA，在逆转录得到cDNA。B、扩增得到重链可变区、轻链可变区基因；以重链和轻链抗体片段互为引物，利用多肽链将抗体重链和轻链连接；C、将酶切scFv连接入E.coliTG1中，加入M13K07培养，得到吉他霉素特异性抗体的噬菌体抗体文库。D、将噬菌体加入到处于对数生长期的E.coliHB2151中，IPTG诱导，得到特异性噬菌体抗体。E、验证的大肠杆菌表达菌株测序，得到单链抗体氨基酸和核苷酸序列。方法易行，操作简便，便于基因工程抗体的大批量生产。广泛应用于动物可食性组织中吉他霉素的残留检测，提供动物可食性组织中吉他霉素的残留量信息。

Description

吉他霉素残留检测用基因工程抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽药残留分析和基因工程抗体技术领域，具体涉及一种能检测吉他霉素的基因工程抗体，同时还涉及一种吉他霉素残留检测用基因工程抗体的制备方法，还涉及该吉他霉素残留检测用基因工程抗体中的用途。

背景技术

吉他霉素属于大环内酯类抗生素，广泛用于猪和禽的生产。吉他霉素会引起人的不良反应，主要包括轻微的胃肠道反应如腹泻、恶心、呕吐、过敏、肝毒性、耳鸣、听觉障碍和心脏毒性等。吉他霉素残留会引起人体内细菌产生耐药性，直接影响人类疾病治疗。临床样本细菌耐药性实验中证实，临床细菌吉他霉素耐药很严重，97.6～100％临床分离菌株对其耐药。我国规定在动物可食性组织以吉他霉素做为其残留标示物。猪和鸡各组织残留限量均为200μg/kg(中华人民共和国农业部公告第235号，2002)。各种吉他霉素制剂在猪和鸡的休药期均为7d，产蛋鸡禁用(中华人民共和国农业部公告第278号，2003)。日本肯定列表制度规定吉他霉素在猪、鸡各组织的最高残留限量均为200μg/kg(日本肯定列表，2006)。

建立简便，快速的检测方法有利于控制该类药物的残留。酶联免疫分析方法具有快速，简便，高通量和低成本的特点。抗体是酶联免疫分析方法的核心内容。目前用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗体，其制备必须通过免疫动物、细胞培养等获得。整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作。基因工程抗体是指将抗体的重链和轻链可变区基因通过特定的方式连接，在其他种属进行高效表达。在大肠杆菌体内表达抗体具有低成本，高产量的特点。同时基因工程抗体的生产不使用实验动物，能够很好的避免动物福利的问题。

本发明以吉他霉素检测用杂交瘤细胞株KA/2A9(CCTCC，NO：C201184)为基本材料，采用RT-PCR方法扩增所有抗体基因的重链和轻链可变区序列，进一步拼接成单链抗体基因，将单链抗体基因插入特异性的噬菌体展示载体，结合噬菌体展示和体外特异性筛选技术，获得能特异性识别吉他霉素的基因工程抗体以及抗体的重链和轻链可变区序列。以上两点构成了本类发明的核心。根据文献检索结果，未获得与本研究主题相关的专利文献。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测用基因工程抗体，该基因工程抗体能特异性识别吉他霉素，与其它药物无交叉反应性。同时，该基因工程抗体有利于建立更加经济快捷的吉他霉素残留ELISA检测方法及试剂盒；有利于阐明抗体与药物的识别机理；还可应用于其它小分子药物抗体的制备。

本发明的另一个目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测用基因工程抗体的制备方法。方法易行，操作简便，该方法采用原核表达系统，可便于基因工程抗体的大批量生产。同时，该基因工程抗体的生产不使用实验动物，能够很好的避免动物福利的问题。

本发明的另一个目的是在于提供了一种吉他霉素的基因工程抗体在动物源性食品中吉他霉素残留检测中的应用，能广泛应用于动物可食性组织中吉他霉素的残留检测，准确提供动物可食性组织中吉他霉素的残留量信息。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种吉他霉素残留检测用基因工程抗体的制备方法，其步骤是：

A、取液氮保存的杂交瘤细胞株KA/2A9(CCTCC，NO：C201184)，Trizol一步法提取脾细胞总RNA，纯化得到mRNA，在逆转录得到cDNA。

B、以此为模板，分别扩增得到重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因；以重链和轻链抗体片段互为引物，利用多肽链(Gly₄Se)₃将抗体重链和轻链连接为scFv。

C、将酶切scFv连接入E.coli TG1中，加入M13K07培养，经2～3次筛选，得到能展示吉他霉素特异性抗体的噬菌体抗体文库。

D、将此噬菌体加入到处于对数生长期的E.coliHB2151中(购自杭州远方生物)，IPTG诱导，得到特异性噬菌体抗体。

E、取步骤D中经可溶性表达验证的大肠杆菌表达菌株测序，得到单链抗体氨基酸序列和单链抗体核苷酸序列。获得了一种分离的基因工程抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；一种分离的基因工程抗体，其重链可变区序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；一种分离的基因工程抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；一种分离的基因工程抗体，其重链可变区序列为SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列。

一种吉他霉素的基因工程抗体在动物源性食品的吉他霉素残留检测中的应用。其步骤是：

A、用包被原包被固相载体(如酶标板)；

B、利用上述方法制备噬菌体抗体；

C、组织样品经偏磷酸/乙醇提取、乙酸乙酯反萃取，氮气吹干、样品稀释液重新溶解得到待测物；

D、对步骤C的待测物进行酶联免疫检测。

步骤C样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO4·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水定容至1000mL。

本发明的主要优点是：本发明制备的吉他霉素特异性基因工程抗体能够灵敏识别吉他霉素，其可变区核苷酸和蛋白质序列在国内外是首次报道。本发明的单链抗体是用基因工程方法将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中很经济的大规模生产，从而使得免疫检测抗体的生产变得非常容易、简便和经济，检测准确率高(95％以上)，进而大大减少检测试剂的费用，比杂交瘤细胞培养得到单抗的方法要简单的多。本发明为食品中吉他霉素残留检测方法的建立提供高效价、高特异性的抗体来源。

附图说明

图1为一种基因工程抗体是本发明基因工程抗体与吉他霉素标准品的间接竞争反应曲线示意图。

图中：X轴为吉他霉素标准品的浓度对数值，Y轴为吉他霉素对光密度值的抑制百分率。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1：KA/2A9细胞株噬菌体抗体文库构建

取液氮保存的单克隆杂交瘤细胞株KA/2A9(该杂交瘤细胞株KA/2A9，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：C201184，)，40℃水浴快速解冻，10ml RPMI-1640溶解，1000rpm水平离心细胞，弃上清，吸取1ml Trizol(Invitrogen，USA)到离心管中，上下颠倒混匀，室温(20-25℃，以下相同)静置5min。加入400μL三氯甲烷，剧烈振荡15s，室温放置10min。12000r/min 4℃离心10min，此时可见明显三层。小心取上清600μL，转入一新EP管中，加入600μL预冷的异丙醇。颠倒混匀，室温放置10min。12000r/min 4℃离心10min。弃去上清，将沉淀用体积比为75％的乙醇1mL重悬，7500r/min离心5min。弃去上清，在超净工作台上风干10min，然后用DEPC处理水60μL溶解沉淀。

采用mRNA纯化试剂盒对mRNA样品进行纯化。Total RNA量30ug，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water补足到250μL。加入适当250μLOBB Buffer和10μL Oligotex Suspension，轻弹1.5ml离心管彻底混匀。置于70℃水浴中3min。取出置于室温10min13000rpm室温离心2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。用移液器取400μL OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到SpinColumn中，RT，13000rpm，离心1min。将Spin Column转移到一个新的1.5ml离心管中，加400μL OW2，RT，13000rpm，离心1min。将Spin Column转移到一个新的1.5ml管中，取出25μL OER Buffer到Column中，用移液器吹打3-4次树脂，室温13000rpm，离心1min。

取DEPC处理PCR管，准确吸取2.5μL随机六聚引物，5μL mRNA，2.5μL 10mM dNTP，RNase Free水加到36.5μL。65℃热激5min，冰浴1min。加入10μL 5×First-Strand buffer，2.5μL0.1M DTT，1μL Superscript^TM III反转录酶。反应条件为50℃90min，70℃5min。

以反转录的cDNA为模板扩增重链和轻链可变区序列引物序列见表1、表2、表3、表4，表5。PCR反应体系为1μL重链或轻链引物Mix，1μL cDNA，1μL 10mM dNTP，5μL 10×Buffer，0.5μL Taq酶，补加去离子水至50μL。PCR条件：95℃2min，94℃1min，50℃1min，72℃1min，35circles，72℃5min。1.5％琼脂糖电泳，回收400bp左右的片断。

表1VL扩增正向引物

表2VL扩增反向引物

表3VH扩增正向引物

表4VH扩增反向引物

表5ScFv扩增及测序引物

分别取500ng重链和轻链片断，以重链和轻链抗体片段互为引物，利用15个氨基酸的多肽链(Gly4Ser)3将抗体重链和轻链连接。拼接条件为：500ng重链和轻链片断，1μL 10mMdNTP，5μL 10×Buffer，0.5μL Taq酶，补加去离子水至50μL。PCR条件：95℃2min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，20circle，72℃5min。1.5％(质量百分比)琼脂糖电泳，回收800bp左右的片断。

以回收的单链抗体基因为模板，采用模板两端引物Y15和Y16进行扩增，扩增条件为1μL单链抗体片断、1μL 10mM dNTP、5μL10×Buffer、0.5μL Taq酶，补加去离子水至50μL。PCR条件：95℃2min，94℃1min，45℃1min，72℃1min，30circle，72℃5min。1.5％(质量百分比)琼脂糖电泳，回收800bp左右的片断。

分别采用SfiI和NotI限制性内切酶(NEB，USA)对PCANTAB5E载体(购自杭州远方生物)和扩增回收的单链抗体片断进行双酶切，1％(质量百分比)琼脂糖电泳回收目的片断。采用T4连接酶连接单链抗体片段和双酶切载体，采用PCR产物回收试剂盒(Qiagen，Germany)回收连接产物。

将100μl感受态E.coli TG1细胞与连接体系回收产物混匀，转移50μl的细菌到预冷处理过的0.1cm的电击杯中，加入10μl(PUC18/pCANTAB5E)，振荡到杯底，冰上放置1min。将电穿孔仪的程序设为25μF，1.7kV，200ohms擦干杯表面放入电击室中，电击一次。(应该在4.5-5毫秒时间内产生一个脉冲)。立即加入1mL新鲜的SOC培养基到杯中，盖上杯盖，翻转混匀重悬细菌，转移至无菌EP管中，在37℃，200pm复苏培养1h。复苏菌液3000r/min离心，将菌液体积最后定容为500μL。分别取100μl涂SOBAG平板。30℃倒置培养16-20h。用2×YT-AG液体培养基冲洗平皿上菌落，混匀保存。此混合菌液即为该细胞株抗体文库，文库库容量为1.9×10⁶。

实施例2：特异性抗体筛选

取冷冻保存的文库200μl，加入到250mL三角瓶中，加入50mL 2×YT-AG液体培养基(100mg/L和2％(质量百分比)葡萄糖)，37℃，250r/min培养至OD600＝0.8。取2×1010 M13K07辅助噬菌体(NEB，USA)加入到菌液中。37℃，250r/min培养1h。1000g离心10min，小心吸取上清。用20mL 2×YT-AK(100，50)液体培养基重悬样品，30℃，250r/min培养过夜。1000g离心20min。将上清转移到100mL的离心管中，50％PEG沉淀，冰上静置1h。4℃，10000r/min离心10min，3mL磷酸盐缓冲液进行沉淀溶解。

取无菌免疫试管，加入3mL包被液，根据最终的包被浓度10mg/L，加入30μl 1mg/mL吉他霉素包被原，4℃包被过夜。PBST洗三次，1％OVA封闭1h，PBST洗三次，4℃保存备用。将3mL噬菌体抗体加入到包被的放射性免疫试管，37℃250r/min培养1h。弃管内溶液，用洗涤液和磷酸盐缓冲液各洗20次。加入盐酸-甘氨酸溶液3mL，静置10min，马上加入2MTris中和，将所有溶液加入对数生长期E.coli TG1细胞10mL，37℃静置培养30min。取100μl菌液做10-2-10-5，涂布SOBAG平板，30℃静置培养过夜。

挑取24个分割良好的单菌落，加入一定量(400μ1)的2×YT-AG液体培养基，30℃，250r/min.培养过夜。在50mL LB-AG培养基中，加入2×10¹⁰ M13KO7辅助噬菌体(NEB，USA)，400μl/管分装，将对应的菌液取40μl加入到管中，37℃，150r/min离心2h。3000r/min离心10min，LB-AK重悬，30℃，250r/min.培养过夜。1000g，离心20min。取上清用于ELISA检测。

取500μL包被原储备液，溶解于50mL的包被缓冲液中，混匀后，包被酶标板，每孔100μL，置湿盒中，4℃过夜(8～12h)；次日，倒出孔中液体，洗涤液洗涤3次，并用吸水纸拍干；每孔加入含1％OVA的PBS溶液250μL，置湿盒中，37℃孵育1h；倒出孔中液体，洗涤液洗涤3次，并用吸水纸拍干，4℃保存备用。将制备的噬菌体抗体取50μl加入对应的酶标板孔中，上下两排分别加入50μL PBS，50μL 10mg/L吉他菌素，37℃静置1h。倒出孔中液体，洗涤液洗涤3次，并用吸水纸拍干。加入100μl anti-M13HRP(GE，USA)二抗，37℃静置1h。倒出孔中液体，洗涤液洗涤5次，并用吸水纸拍干。加入TMB底物溶液，37℃孵育15min。加入50μl 2M H₂SO₄，450nm读取OD值。结果(如表6所示)表明经过一轮特异性筛选噬菌体抗体文库内大部分细菌能展示吉他霉素特异性。

表6KA/2A9文库筛选后噬菌体抗体ELISA鉴定

取2μL经鉴定含有特异性ScFv的噬菌体抗体于400μL对数生长期的E.coli HB2151中，37℃，200r/min培养50min。菌液分区划线SOBAG-N平板，30℃培养过夜，平板上长出的大肠杆菌菌落即为携带有ScFv表达质粒的E.coli HB2151菌株。

实施例3：单链抗体的可溶性表达

挑取平板上单菌落至5mL 2×YT-AG液体培养基中，30℃，250r/min培养过夜。过夜培养物1∶10接种2×YT-AG液体培养基，30℃，250r/min培养1h，1500g离心10min。沉淀重悬于50mL 2×YT-AI液体培养基中，30℃，250r/min诱导表达6～8h。菌液1500g离心20min，2％菌液体积的TES重悬沉淀，加入3％体积1/5×TES，混匀，冰浴40min。12000r/min离心10min，上清即为周质腔提取物。小体积分装后，-20℃保存。

分别取培养上清和细胞周质腔提取物进行效价ELISA测定。分别将细胞周质腔提取物和培养上清倍比稀释，间接ELISA方法检测。不同细胞株可溶性表达菌株选择对应包被原包被酶标板进行鉴定，包被原浓度选择10mg/L。效价测定方法：将不同稀释倍数细胞周质腔提取物和培养上清加入对应的酶标板孔中，37℃孵育1h。倒出孔中液体，PBST洗涤3次，并用吸水纸拍干。加入100μL 1∶20 000anti-E tag HRP，37℃孵育1h。倒出孔中液体，PBST洗涤5次，并用吸水纸拍干。加入完全底物显色溶液(购自武汉飞远科技有限公司)，37℃孵育15min。加入50μL 2mol/L H₂SO₄，450nm读取OD值。以OD值在1.0附近的抗体浓度做为ScFv效价。

灵敏度测定方法：细胞周质腔ScFv含量更高，并且更加稳定。实验中选择细胞周质腔提取物对ScFv灵敏度进行测定，以半数抑制率IC₅₀做为灵敏度判断指标，Kitasamycin特异性ScFv选择吉他霉素进行抑制试验。结果显示KA/2A9表达ScFv对吉他霉素具有很高灵敏度，ScFv对吉他霉素半数抑制率IC₅₀为3.85μg/L，标准曲线见图1。

实施例4：单链抗体基因序列测定

分别取经可溶性表达验证的大肠杆菌表达菌株，采用表达质粒酶切位点两端序列设计引物上游测序引物PCANTAB5-S1：5′-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3，下游测序引物：PCANTAB5-S6：5′-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3进行测序，得到了单链抗体氨基酸序列见SEQ ID NO：1轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO：2重链可变区氨基酸序列。单链抗体核苷酸序列见SEQ ID NO：3轻链可变区核苷酸序列；SEQ ID NO：4重链可变区核苷酸序列。获得了一种分离的基因工程抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；一种分离的基因工程抗体，其重链可变区序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；一种分离的基因工程抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；一种分离的基因工程抗体，其重链可变区序列为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

实施例5：一种吉他霉素的基因工程抗体在动物源性食品的吉他霉素残留检测中的应用，其步骤是：

1间接竞争ELISA方法

酶标板制备方法同实施例2。取吉他霉素母液，分别稀释为0、1.25、2.5、5、10、20ng/mL，每孔加50μL，每个浓度三个重复。取制备的细胞周质腔提取物，1∶100稀释。根据抗体的体积，将Anti-E tag HRP做1∶5000稀释。每孔加入50μL单链抗体和标签二抗的混合溶液，37℃孵育30分钟。洗涤液洗涤5次，并用吸水纸拍干。加入TMB底物溶液，37℃静置15min。加入50μl 2M H₂SO₄，450nm读取OD值。基因工程抗体对吉他霉素的标准曲线见图1。

2组织样品处理方法

称取均质组织样品2.00±0.02g于50mL离心管中，加入组织提取液10mL，漩涡5min，4000r/min离心5min。取上清液0.5mL于10mL离心管中，加入4mL乙酸乙酯，漩涡混匀1min。4000r/min离心5min。取下层乙酸乙酯于10mL离心管，40±5℃水浴，氮气吹干。加入PBS2mL，漩涡混匀1min。取澄清水相检测，样品稀释倍数为20。

3方法的准确度

称取均质猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏样品2.00±0.02g于50mL离心管中，添加吉他霉素标准溶液，使组织中添加药物的浓度为0.5、1、2倍最高残留限量(MRL)。按照建立的组织处理方法进行样品处理，测定药物浓度。每个样品浓度测定5个平行样，不同的时间重复3次。计算平均回收率(见公式2)，标准差，批内和批间变异系数。结果如表7～表10所示，可见，本发明基于吉他霉素基因工程抗体ELISA检测方法对组织中吉他霉素的添加回收率均在70～120％之间，批内和批间变异系数小于20％。

表8猪肌肉吉他霉素添加回收率及变异系数

表9猪肝脏吉他霉素添加回收率及变异系数

表9鸡肌肉吉他霉素添加回收率及变异系数

表9鸡肝脏吉他霉素添加回收率及变异系数

Claims (3)

1.一种分离的基因工程单链抗体，其轻链可变区序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；其重链可变区序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种分离的基因工程单链抗体基因，其轻链可变区对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示；其重链可变区对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。

3.权利要求1所述基因工程单链抗体或权利要求2所述的基因工程单链抗体基因在动物源性食品的吉他霉素残留检测中的应用。