CN102766212B

CN102766212B - 用于检测氟喹诺酮类药物残留的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

Info

Publication number: CN102766212B
Application number: CN201210176496.9A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 曹光彩; 彭大鹏; 王玉莲; 陈冬梅; 陶燕飞; 刘振利
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: CN102766212A

Abstract

本发明公开了一种能识别氟喹诺酮类药物的特异性单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞5B11所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201149。本发明还公开了检测氟喹诺酮类药物残留的酶联免疫方法与试剂盒及其在氟喹诺酮类药物残留检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备得到的单克隆抗体能识别15种氟喹诺酮类药物，特别是能够同时识别二氟沙星和沙拉沙星，因此适用范围广。本发明建立的酶联免疫方法与试剂盒灵敏度、精密度高、准确性好。

Description

用于检测氟喹诺酮类药物残留的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于检测分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能检测氟喹诺酮类药物残留的单克隆抗体及酶联免疫方法（ELISA）与试剂盒。

背景技术

氟喹诺酮类药物是一族人工合成的抗菌药，由于其抗菌谱广，抗菌力强而被广泛应用于畜牧业及养殖业。但是由于不合理用药及滥用药物，该类药物的不良反应及耐药菌株的出现给人类健康带来了潜在的危害，因此欧盟和我国农业部分别对该类药物规定了最大残留限量（MRL）。

建立残留检测方法是控制药物残留的重要手段，目前报道的氟喹诺酮类药物的残留检测分析方法主要有理化方法、仪器分析法、微生物法及酶联免疫法等。理化法缺乏专一性及敏感性，在残留分析中应用不多；微生物法的灵敏度不高，仅限于样品的初筛（王莹，2006；李岩松，2005；卢圣欣，2007）；气相色谱、液相色谱、质谱及其联用技术很高的灵敏度和准确度，但需要昂贵的仪器设备、复杂的样品前处理，不适用于大批量样品的残留分析；90年代发展起来的酶联免疫分析法不但具有较高的灵敏度和特异性，而且经济、快速且操作简单，比较适合于大量样品的残留检测。

目前关于检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫分析大部分是通过3位的羧基与蛋白偶联制备免疫原免疫动物后获得抗体，如Holtzapple等（1997）首次报道了以沙拉沙星（SAR）为半抗原获得的单克隆抗体能识别5种氟喹诺酮类药物（诺沙星、诺氟沙星、萘啶酸、曲伐沙星及二氟沙星）；Duan等（2001）以环丙沙星为半抗原制备的多克隆抗体LOD为0.32 ppb，对诺氟沙星的交叉反应率为44.6%；Watanabe等（2002）以恩诺沙星为半抗原与蛋白通过碳二亚胺法偶联后制备的单抗能够在MRL水平以下以亲和色谱的形式识别恩诺沙星；魏东（2007）分别以环丙沙星、达氟沙星、诺氟沙星及沙拉沙星为半抗原合成免疫原制备抗血清，最终获得了以沙拉沙星为免疫原的多克隆抗体，该抗体能够识别6种氟喹诺酮类药物：沙拉沙星（100%）、诺氟沙星（91.83%）、环丙沙星（85.7%）、恩诺沙星（77.09%）、达氟沙星（38.37%）及培氟沙星（47.94%）。可见，上述抗体识别的氟喹诺酮类药物种类不多，难以满足族特异性检测的需求。

近年来， Bucknall等（2003）制备了族特异性多克隆抗体，该抗体能够识别9种该类药物，其交叉反应率分别为：诺氟沙星（100%）、萘啶酸（15%）、恩诺沙星（6%）、氟甲喹（6%）、环丙沙星（9%）、氧氟沙星（17%）、恶喹酸（40%）、吡哌酸（18%）、依诺沙星（143%）。Huet A C等（2006）以SAR为免疫原，以诺氟沙星卵清蛋白偶联物（NOR-OVA偶联物）为包被原，获得的抗体能识别12种氟喹诺酮类药物：SAR（100%）、诺氟沙星（105%）、二氟沙星（64%）、环丙沙星（17%）、培氟沙星（30%）、氧氟沙星（55%）、达氟沙星（88%）、恩诺沙星（66%）、马波沙星（45%）、洛美沙星（24%）、依诺沙星（27%）、萘啶酸（14%）。Wang等（2007）获得了能够识别12种氟喹诺酮类药物的单克隆抗体，分别是环丙沙星（100%）、恩诺沙星（82%）、诺氟沙星（71%）、氧氟沙星（54%）、达氟沙星（54%）、培氟沙星（49%）、氨氟沙星（51%）、洛美沙星（40%）、依诺沙星（45%）、氟甲喹（35%）、恶喹酸（40%）、马波沙星（41%）。

上述抗体及相应的ELISA检测方法在一定程度上能满足氟喹诺酮类药物残留检测的需要，但由于不能识别兽医上常用的二氟沙星和沙拉沙星，且对个别药物的交叉反应率差异较大，导致检测的准确度难以控制。因此制备一种能够识别包括二氟沙星和沙拉沙星的族特异性单克隆抗体，并建立相应的ELISA检测方法和试剂盒具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种能识别氟喹诺酮类药物的单克隆抗体和检测氟喹诺酮类药物残留的酶联免疫方法与试剂盒。本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测氟喹诺酮类药物残留的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在氟喹诺酮类药物残留检测中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别氟喹诺酮类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201149的杂交瘤细胞5B11所分泌的。

所述的杂交瘤细胞5B11，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:C201149。

所述的单克隆抗体在制备检测氟喹诺酮类药物残留的酶联免疫试剂盒中的应用。

包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

所述的试剂盒，是检测氟喹诺酮类药物残留的酶联免疫试剂盒。

所述的试剂盒在氟喹诺酮类药物残留检测中的应用。

一种检测氟喹诺酮类药物残留的酶联免疫方法，其步骤如下：

（1）将半抗原诺氟沙星与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原（NOR–BSA偶联物）；

（2）将半抗原诺氟沙星与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被原（NOR–OVA偶联物）；

（3）利用步骤（1）的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201149的杂交瘤细胞5B11；

（4）利用保藏号为CCTCC NO:C201149的杂交瘤细胞5B11制备单克隆抗体；

（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体（如酶标板）；

（6）将待测样品用乙腈在碱化条件下提取、氮气吹干、正己烷去脂和含0.05体积%吐温-20的磷酸盐缓冲液重新溶解得到待测物；

（7）对步骤（6）的待测物进行酶联免疫检测。

所述的酶联免疫方法在氟喹诺酮类药物残留检测中的应用。

本发明的有益效果是：

（1）本发明制备的单克隆抗体能够识别15种氟喹诺酮类药物，现有技术中还没有单克隆抗体能识别这么多氟喹诺酮类药物，特别是能够同时识别兽医上常用的二氟沙星和沙拉沙星，因此适用范围广；

（2）本发明建立的检测氟喹诺酮类药物残留的酶联免疫方法与试剂盒灵敏度、精密度高、准确性好；

（3）本发明涉及的样品处理方法简便，易操作，样品处理所用的主要有机试剂为乙腈和正己烷，对操作者身体健康危害较小。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为本发明的单克隆抗体与达氟沙星标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为达氟沙星（DNA）标准溶液浓度对数值，Y轴为达氟沙星标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值（B/B0）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1 免疫原和包被原的制备

免疫原（NOR–BSA偶联物）的合成：准确称取诺氟沙星32.4mg溶解于1.5mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，溶液在4℃的冰浴中冷却25min后加入碳二亚胺（EDC）192.42mg和N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）16.05mg，然后4℃反应过夜（A液）。准确称取BSA57.86mg溶解于15ml碳酸盐缓冲液（CBS）中（B液）。然后将A液逐滴缓慢滴入B液中，于4℃反应过夜后将反应混合物移入处理过的透析袋内，用0.01mol 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4)在4℃的条件下透析，期间不断换液，以移走游离的诺氟沙星小分子物质。将所得产物低压冻干，于﹣20℃保存备用。

包被原（NOR–OVA偶联物）的合成：称取诺氟沙星16.3mg溶解于2mLDMF中，充分溶解后，加入NHS 20mg，EDC 192mg，反应在避光条件下进行24h（A液）。准确称取OVA 39.75mg溶解于20mL PBS（pH7.4）中（B液）。将A液逐滴滴入B液中，反应在4℃条件下过夜最后将该反应液转入透析袋中，在PBS液（pH7.4）中4℃透析，每天不断更换透析液，直至透析完全为止。

实施例2 单克隆抗体的制备

2.1 小鼠免疫

以实施例1制备的NOR–BSA偶联物为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基础免疫及数次加强免疫。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠（效价高、灵敏度好）停止免疫以备融合。

2.2 细胞融合与筛选

在融合前3天（最好与上次免疫相隔3周以上）给免疫合格的小鼠腹腔注射含100μg免疫原的蛋白溶液（不加佐剂），强化免疫。融合前1天取未免疫的Balb/C鼠一只制备饲养细胞。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取3～5×107个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合（比例为1:10～5:10）。1500r/min离心5min，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其放置于37℃水浴中，将吸有0.8mL预温至37℃的50%聚乙二醇（ PEG，购自Amersco）的lmL刻度吸管插入到管底，60sec内缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90sec，将离心管插到离心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取10mL预温至37℃的RPMI–1640基础培养液（购自Hyclone）沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，第1分钟逐滴加入1mL（3sec/滴），第2分钟再加2mL，最后加完剩下的7mL（5min内加完）。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加RPMI–1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。1500r/min离心5min，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴/孔。一次融合可接种5块96孔细胞培养板，置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养。从融合当天算起为0d，前面3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基（购自Amersco）并观察集落生长情况；第5d每孔吸出l/2培养上清（100μL），再加入1滴HT完全培养基（购自Amersco）；以后每隔3d同上法吸去l/2培养上清，换入HT完全培养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积1/4左右即可取细胞培养上清，以发明人制备的NOR–OVA偶联物为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌抗氟喹诺酮抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株稳定分泌抗氟喹诺酮抗体的杂交瘤细胞株，对该杂交瘤细胞株进行染色体计数平均值为94.4条，高于亲本细胞的染色体数目（SP2/0骨髓瘤细胞的染色体平均数为58条，脾细胞染色体为40条），说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤细胞株命名为5B11，并于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO∶C201149。

2.3 腹水单抗制备与鉴定

在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI–1640基础培养基悬浮细胞并将细胞数调至1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水，纯化获得单克隆抗体。以单克隆抗体亚型鉴定试纸条确定单克隆抗体为IgG1亚型。

实施例3 间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1 试剂配制

碳酸盐缓冲液（pH9.6）：准确称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

洗涤液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加入Tween 20 0.50mL，定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入磷酸盐缓冲液1000mL，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。

底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司）10mL，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀，现配现用。

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。

3.2 方阵滴定法

采用方阵滴定法初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液将NOR-OVA包被原倍比稀释成32、16、8、4、2μg/mL，从第一至第五列依次纵向加入96孔酶标板，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭2h；洗涤3次，拍干，单克隆抗体使用磷酸盐缓冲液倍比稀释成1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200，从第一至第七行依次横向加入96孔酶标板，37℃孵育30min；洗涤3次，拍干，各孔加入用磷酸盐缓冲液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（简称二抗，以下所指二抗均为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞羿生物技术有限公司）100μL，37℃孵育30min；洗涤4次，拍干，各孔加入底物混合液100μL，避光显色15min；加入终止液50μL；用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值（OD值）。方阵滴定结果见表1，初步选择几个OD值接近2.0，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。结果表明，可选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合：（8，6400）和（16，12800）

表1 5B11单克隆抗体方阵滴定

3.2 最佳包被浓度的选择

以达氟沙星为竞争物，设置为0、6.25、12.5、25、50、100、200μg/L为浓度梯度，分别以3.1方阵滴定法选择的包被浓度及对应的抗体稀释度组合进行间接竞争ELISA。以竞争物浓度的对数值作为横坐标、B/B0（以无药物抑制时的OD值为B0，相应浓度药物抑制时的OD值为B值）作为纵坐标绘制抑制曲线。结果见表2，以“0”孔OD值和IC₅₀值作为判定指标，确定最佳包被原浓度。抗原抗体的比例是影响其灵敏度的关键，如果出现抗原或抗体过剩都将造成IC₅₀偏高，由数据可见，最佳包被浓度为16μg/mL，抗体稀释度初步确定为1:6400。

表2 最佳包被浓度优化

包被原浓度（μg/mL）	抗体系数倍数（1:X）	0孔OD值	IC₅₀值（μg/L）
				8	3200	1.86	44
16	6400	1.93	37

3.3 最佳抗体稀释度的选择

以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1: 6400为基础浓度等差设计4个稀释梯度，其0孔与IC₅₀值见表3。随着抗体稀释度的减少，IC₅₀值发生不同的变化，综合零孔OD值和IC₅₀值最终选定1: 6000为最佳抗体稀释度。

表3最佳抗体稀释度优化

抗体系数倍数（1:X）	0孔OD值	IC₅₀值（μg/L）
			5800	2.05	38.78
6000	1.96	36.5
			6200	1.89	77.31
6400	1.65	51.4

3.4 标准曲线的建立

将达氟沙星标准品配制成0、6.25、12.5、50、100、200μg/L等6个浓度梯度，按照上面确定的间接竞争ELISA方法测定，绘制标准曲线（见图2）。间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为：y＝－0.4606x＋1.2196，R2 = 0.9959，IC50值为40±5.2（n＝5），线性范围为6.25～200μg/L。

3.5 交叉反应实验

分别将各种氟喹诺酮类药物或代谢物标准品倍比稀释成浓度梯度进行间接竞争ELISA，计算IC₅₀值，与达氟沙星标准品IC₅₀值对比得到交叉反应率，结果见表4。结果表明，本研究建立的间接竞争ELISA方法对15种氟喹诺酮类药物有一定交叉反应，达到了多残留分析的目的。

表4 单克隆抗体对氟喹诺酮类药物或代谢物的交叉反应率

药物名称	IC₅₀ （μg/L）	交叉反应率
			达氟沙星	37.27	100%
环丙沙星	11.2	333%
			恩诺沙星	13	234.4%
加替沙星	32.87	113.54%
			诺氟沙星	34	109.59%
培氟沙星	50.87	73.27%
			洛美沙星	51.62	69.46%
依诺沙星	62.31	59.81%
			氧氟沙星	65.68	56.74%
西诺沙星	54.1	53.25%
			马波沙星	73.73	50.55%
二氟沙星	84.13	44.3%
			沙拉沙星	99	37.65%
氟罗沙星	62.25	44.48%
			氟甲喹	64.41	57.86
奥比沙星	135.52	27.5%
			恶奎酸	196.44	18.97%
左氧氟	258.9	14.39%
			萘啶酸	332.06	11.22%
斯帕沙星	﹥2000	﹤2%

实施例4：本发明ELISA检测试剂盒的组装

4.1试剂盒组成成分

⑴ 包被有包被原NOR–OVA偶联物的酶标板；

⑵ 达氟沙星标准品溶液6瓶，浓度分别为0、6.25、12.5、50、100、200μg/L；

⑶杂交瘤细胞5B11单克隆抗体工作液；

⑷ 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

⑸ 浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.00g，KCl 2.00g，加双蒸水至1000mL；

⑹ 浓缩洗涤液：NaCl 80.00g，KH₂PO₄ 2.00g，Na₂HPO₄·12H₂O29.00g，KCl 2.00g，Tween 20 5mL，加双蒸水至1000mL

⑺ 底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司）10mL，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀，现配现用。

⑼ 终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备

⑴ 包被：用碳酸盐缓冲液将NOR–OVA偶联物稀释成16μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。

⑵ 洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

⑶ 封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。

⑷ 洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

⑸烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。

⑹封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。

实施例5：试剂盒在检测动物可食性组织中氟喹诺酮类药物残留量中的应用

5.1试剂配制

洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用双蒸水10倍稀释后使用。

样品稀释液配制：准确称取NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KCl 0.2g于500mL烧杯中，加少量超纯水溶解，双蒸水定容至1000mL。

底物混合液配制：根据每次所需用量，取适量的底物A液与B液按1:100的比例混匀，现配现用。

5.2组织样品处理

准确称取均质样品2±0.05g于50mL离心管中，加入8ml乙腈，立即漩涡混合5min使样品分散完全。加入1mol/L的氢氧化钠100μL后漩涡混合5min。4000r/min离心10min，吸取上清液6mL于另一10mL离心管中，于50～60 ℃水浴氮气流下吹干。向残渣中加入正己烷3mL，漩涡混合30s，再加入磷酸盐缓冲液（含有0.5%吐温，即PBST）3mL，漩涡混合1min后4000r/min离心5min。去除上层正己烷与中间的杂质层，取下层水相150μL用于分析。

5.3 ELISA测定程序

⑴ 取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架。

⑵ 加达氟沙星标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

⑶ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。

⑷ 加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

⑸ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30s左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤5次。

⑹ 加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37 ℃孵育15min。

⑺ 加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。

5.4结果判定

将标准液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100 %，即为抑制率。在6.25 ~ 200μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中氟喹诺酮类药物的残留浓度。

实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

6.1本发明试剂盒的灵敏度

取20份空白组织样品，进行ELISA检测，测定OD值，计算空白样品OD值的平均值（

）。将代入标准曲线上查出对应的浓度（C），并计算标准差（SD）。根据公式Z＝C＋3×SD计算Z值，得到鸡蛋样品的最低检测限为9.79μg/kg。

6.2本发明试剂盒的精密度

将达氟沙星标准品稀释成0、6.25、12.5、50、100、200μg/L 6个浓度，各浓度3个平行孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，将各标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表5。

表5 本发明试剂盒的精密度

6.3本发明试剂盒的准确度

取空白组织样品，按照药物在各种组织中的最大残留限量分别进行添加实验，使组织中添加药物的浓度为25、50和100μg/kg，每个样品浓度设置5个平行样。然后进行样品处理，ELISA测定药物浓度，重复3批，计算回收率，回收率按下面公式计算，并计算批内和批间变异系数。测定结果见表6。

表6 鸡蛋中氟喹诺酮类药物添加回收率与变异系数

我国农业部要求兽药残留酶联免疫试剂盒的回收率范围在60%～120%之间，批内和批间变异系数分别小于25%和30%。本研究将单个氟喹诺酮类药物分别添加到组织样品中，药物回收率在60%～120%之间，批内和批间差异均小于25%，表明本发明试剂盒准确度好。