CN101455958A - 自动物样品中提取喹诺酮类和磺胺类化合物的方法及其专用免疫亲和吸附剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提取喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物的方法及其专用免疫亲和吸附剂。该免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的诺氟沙星单克隆抗体和/或磺胺甲噁唑单克隆抗体组成；所述诺氟沙星单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆抗体分别是以诺氟沙星半抗原和磺胺甲噁唑半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体；所述喹诺酮类化合物为下述13种化合物中的至少一种：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹；所述磺胺类化合物为下述6种化合物中的至少一种：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑。

Description

自动物样品中提取喹诺酮类和磺胺类化合物的方法及其专用免疫亲和吸附剂

技术领域

本发明涉及一种自动物样品中提取喹诺酮类和磺胺类化合物的方法及其专用免疫亲和吸附剂。

背景技术

随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(IAC，Immunoaffinity chromatography)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术(如HPLC，GC)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。

喹诺酮类(Quinolones，QNs)是一类人工合成的广谱杀菌性抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点而广泛应用于动物和人类的多种感染性疾病的预防和治疗。但过量或不当使用会导致动物性产品中喹诺酮类药物残留，除其本身的毒副作用对人体造成直接危害外，更为严重的是人类长期食用含较低浓度喹诺酮类药物的动物性食品，容易诱导耐药性的传递，从而影响该类药物的临床疗效。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。我国农业部、欧盟、美国等都制定了该类药物在各种动物性食品中的最高残留限量(MRL)。

磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)属都是以对氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物。磺胺类药物其抗菌谱广，毒性小、口服易吸收、生产量大，价格低廉，供应充足，抑菌效果强，广泛应用于畜牧业。但由于不合理使用甚至滥用兽药，造成磺胺类药物于动物性食品中残留现象较为严重，极大地影响了人们的健康，也影响我国畜产品的正常出口贸易，发展兽药残留监控和检测技术，有利于保障人民健康，促进畜牧业的可持续发展和正常的畜禽产品的国际贸易。

近几十年来，各学者针对食品和饲料中磺胺类药物的残留分析进行了深入全面的研究。其化学检测方法包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、气谱-质谱联机(GC/MS)、高压液相色谱法(HPLC)、高压液相色谱-质谱联机(HPLC/MS)等。喹诺酮类药物在动物组织中的残留分析方法主要有酶联免疫吸附测定法(ELISA)，高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱—质谱分析法(LC-MS)。这些方法的前处理利用液—液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。免疫亲和技术是90年代在分析领域得到应用的新技术，但用免疫亲和柱同时净化基质中的喹诺酮类药物和磺胺类药物未见报道，更无商品化的IAC柱出售。

发明内容

本发明的目的是提供一种能自动物样品中提取如下13种喹诺酮类化合物中的至少一种(Quinolones，QNs)和/或6种磺胺类化合物(Sulfonamides，SAs)中的至少一种的方法及其专用免疫亲和吸附剂。所述13种喹诺酮类化合物(Quinolones，QNs)为喹诺酮类的环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、诺氟沙星(Norfloxacin，NOR)、培氟沙星(Pefloxacin，PEF)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFL)、依诺沙星(Enoxacin，ENO)、麻保沙星(Marbofloxacin，MAR)、洛美沙星(Lomefloxacin，LOM)、单诺沙星(Danofloxacin，DAN)、恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)、沙拉沙星(Sarfloxacin，SAR)、二氟沙星(Difloxacin，DIF)、噁喹酸(Oxolinic acid，OXO)和氟甲喹(Flumequine，FLU)；所述6种磺胺类化合物(Sulfonamides，SAs)为磺胺嘧啶(Sulfadimidine，SD)、磺胺噻唑(Sulfathiazole，ST)、磺胺吡啶(Sulfapyridine，SP)、磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole，SMT)、磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine，SMM)和磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)。

本发明所提供的用于自动物样品中提取喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物的免疫亲和吸附剂，它是由固相载体和与其偶联的诺氟沙星单克隆抗体和/或磺胺甲噁唑单克隆抗体组成；所述诺氟沙星单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆抗体分别是以诺氟沙星半抗原和磺胺甲噁唑半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体；所述喹诺酮类化合物为下述13种化合物中的至少一种：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹；所述磺胺类化合物为下述6种化合物中的至少一种：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑。

所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体蛋白。

诺氟沙星和磺胺甲噁唑是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明将诺氟沙星半抗原和磺胺甲噁唑半抗原分别与载体蛋白偶联得到免疫原。半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，诺氟沙星半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为36.4:1和25：1，磺胺甲噁唑半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为31.8:1和22：1。

所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。

所述诺氟沙星单克隆抗体具体可为诺氟沙星鼠单克隆抗体，所述诺氟沙星鼠单克隆抗体优选为由保藏号为CGMCC No.2573的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2产生的对如下13种喹诺酮类化合物都具有交叉反应的抗体：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹。

诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2已于2008年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC No.2573。

所述磺胺甲噁唑单克隆抗体具体可为磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体，所述磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体优选为由保藏号为CGMCC No.2572的磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1产生的对如下6种磺胺类化合物都具有交叉反应的抗体：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑。

磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1已于2008年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC No.2572。

所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中制成免疫亲和色谱柱，该免疫亲和色谱柱也属于本发明的保护范围。

含有上述免疫亲和吸附剂或免疫亲和色谱柱的试剂盒也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒中还包括洗脱液、洗涤液和保存液；所述洗脱液由甲醇、纯水和28％氨水(体积百分含量)溶液组成，所述洗脱液中，甲醇、纯水和28％氨水溶液的体积比为90:9.8:0.2；

所述洗涤液为0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液，1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl。

所述保存液为在所述洗涤液中添加NaN₃得到的溶液。

该免疫亲和吸附剂以及含有该免疫亲和吸附剂的色谱柱基于免疫反应和色谱反应，适合从生物样品(如肌肉、肝等)中净化如上13种喹诺酮类化合物中的至少一种和/或6种磺胺类化合物中的至少一种，便于残留分析。在该免疫亲和吸附剂中，两种单克隆抗体的混合抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率是91.6％。偶联有诺氟沙星鼠单克隆抗体和磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体的免疫亲色谱柱对环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑的动态柱容量分别为1976、2135、2035、1933、1987、1589、1738、1448、1793、1645、1498、1425、1632、1048、1117、1235、1400、1391、1328ng/mL，绝对柱容量分别为395、427、407、396、397、319、347、289、358、329、299、285、326、225、240、265、301、299、285ng/mg，使用了15次后柱容量为总柱容量的35％左右，保存期为1年。

本发明所提供的自动物样品中提取喹诺酮类和磺胺类药物的方法，包括以下步骤：

1)样品的前处理：

取动物组织样品匀浆物，加入提取液进行提取，然后进行离心力是2000g-3000g的离心，取上清液作为样品溶液；所述提取液由甲醇和水组成，所述提取液中甲醇和水的体积比为4：1；所述离心力优选为2400-2500g；

2)将步骤1)得到的样品溶液与上述洗涤液混合，过上述免疫亲和色谱柱，然后依次用上述洗涤液、水、上述洗脱液进行洗脱，收集得到喹诺酮类和/或磺胺类药物溶液；

所述喹诺酮类化合物为下述13种化合物中的至少一种：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹；所述磺胺类化合物为下述6种化合物中的至少一种：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑。

本发明的免疫亲和吸附剂及色谱柱具有高选择性，使样品前处理过程大大简化，尤其适用于肌肉、肝等动物组织中微量喹诺酮类和磺胺类药物的前处理。免疫亲和吸附剂的高选择性使得喹诺酮类和磺胺类药物分析方法的检测限将主要取决于取样量，这是单纯理化手段难以达到的；本发明的免疫亲和色谱柱对待测组分有很强的保留和浓缩能力，只要加样量不超过柱容量，在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受样品体积或组分浓度的影响。本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的方法水相操作，操作简单，净化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能节省大量的有机溶剂，降低分析成本和环境污染。本发明的净化方法结合色谱法高效检测喹诺酮类和磺胺类药物的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。

附图说明

图1为诺氟沙星半抗原合成图

图2为磺胺甲噁唑半抗原合成图

图3为空白鸡肌肉组织的选择离子色谱图

图4为添加鸡肌肉组织的选择离子色谱图

图5为空白猪肌肉组织的选择离子色谱图

图6为添加猪肌肉组织的选择离子色谱图

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特别说明，均从商业途径得到。

实施例1、净化喹诺酮类和磺胺类化合物的免疫色谱柱的制备

一、诺氟沙星和磺胺甲噁唑两种鼠单克隆抗体的制备

1、诺氟沙星半抗原和磺胺甲噁唑半抗原的制备

A、诺氟沙星半抗原的制备

如图1所示，包括以下步骤：

1)取0.5g诺氟沙星(NOR)(H010197，中国兽医药品监察所)于干燥的50ml圆底烧瓶中，在氮气流中加入干燥的三氯甲烷20ml搅拌使原料完全溶解，滴加0.5ml吡啶催化，混合均匀后逐滴加入1mol/L的二氯亚砜，室温搅拌3h得中间体氯化诺氟沙星。

2)向反应液中加入1.2mol/L的6-氨基正己酸，补加10ml吡啶，充分搅拌后，油浴升温70℃反应9h。

3)反应停止后，旋蒸除去溶剂，加适量水调节pH值到5，用(30ml×2)乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥，蒸干得粗品。粗品经过硅胶柱纯化(洗脱液为：乙酸乙酯：石油醚＝1：1)得到诺氟沙星半抗原。(图1)

B、磺胺甲噁唑半抗原制备

如图2所示，包括以下步骤：

1)取0.5g磺胺甲噁唑(美国Sigma公司，商品目录号：723-46-6)于50ml圆底烧瓶中，加15ml吡啶溶解

2)取1.2mol/L的琥珀酸酐用5ml吡啶溶解，在搅拌下逐滴加入上述溶液中，继续搅拌5min，升温65℃反应8h。

3)反应结束后，停止加热，冷却至室温，旋蒸出去吡啶，得到磺胺甲噁唑半抗原。

2、免疫原的合成：

A、诺氟沙星半抗原与蛋白质载体的偶联物BSA-NOR或OVA-NOR的合成

采用混合酸酐法，合成NOR与BSA的偶联物作为免疫原。具体步骤为：①100mg的诺氟沙星半抗原溶解于10mL的甲酰二甲胺(DMF)中，超声使之完全溶解，然后用冷乙醇冷却溶液；②30μL三乙胺和40μL氯甲酸异丁酯加入到上述溶液中，室温搅拌反应20min；③3mL浓度为5mg/mL BSA的碳酸缓冲液(pH9.6)逐滴加入到步骤②得到的溶液中，继续搅拌反应6h；④然后将反应液装入透析袋，在4℃用生理盐水溶液透析48小时，换水6次。将透析液在无菌条件下通过0.2μm的滤膜，分装于安培瓶中，得到诺氟沙星半抗原与BSA的偶联物BSA-NOR，-20℃保存。

以活性酯法合成NOR与OVA的偶联物，具体步骤为：①15mg NOR(H010197，中国兽医药品监察所)溶解于5mL甲酰二甲胺(DMF)中，超声使之完全溶解，并以冷乙醇冷却；②20mg碳化二亚胺(EDC)和20mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入到上述NOR溶液中，室温反应过夜；③OVA 15mg溶解于5mL碳酸溶液中(pH8.0)，逐滴加入到上述溶液中，继续搅拌4h；④然后将反应液装入透析袋，在4℃用生理盐水溶液透析48小时，换水6次。将透析液在无菌条件下通过0.2μm的滤膜，分装于安培瓶中，得到诺氟沙星半抗原与OVA的偶联物OVA-NOR，-20℃保存。利用紫外吸收光谱对半抗原与载体蛋白进行鉴定，并按下面的公式计算结合比(每分子载体蛋白连接的半抗原数目)。

诺氟沙星半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为36.4:1和25：1。

B、磺胺甲噁唑半抗原与蛋白质载体的偶联物BSA-SMZ或OVA-SMZ的合成

用活性酯法合成BSA-SMZ免疫抗原。具体步骤为：将制备的磺胺甲噁唑半抗原10mg、40mg脂溶性碳化二亚胺(DCC)和15mg N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)充分溶解于1mL DMF中，在加热条件下搅拌24h，得到反应液I液；称取BSA 25mg，使之充分溶解在3.0mL PBS(pH8.2)中，得到反应液II液；将I液缓慢加入到II液中，并于室温下搅拌5h，用0.01mol/L PBS缓冲液透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质，以12000rpm的速度离心30min，收集上清，得到磺胺甲噁唑半抗原与BSA的偶联物BSA-SMZ，分装，于-20℃保存备用。

采用活性酯法合成OVA-SMZ包被抗原。具体方法与上同，但需将BSA溶液换为OVA溶液。

利用紫外吸收光谱对半抗原与载体蛋白进行鉴定，结果表明磺胺甲噁唑半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为31.8:1和22：1。

(2)诺氟沙星和磺胺甲噁唑两种鼠单克隆抗体的制备

动物免疫：采用BALA/C小鼠作为免疫动物，以诺氟沙星半抗原与蛋白质载体的偶联物BSA-NOR为免疫原，以磺胺甲噁唑半抗原与蛋白质载体的偶联物BSA-SMZ为免疫原，分别免疫，免疫剂量为50μg/只(体积为0.1mL)加等体积的完全弗氏佐剂乳化，进行首次免疫。一个月后，取同样量免疫抗原加不完全弗氏佐剂，乳化，进行加强免疫，再过一个月后同法再次进行加强免疫，二免后10天采血，测定抗体效价和交叉反应后，取脾细胞。

细胞融合：脾细胞按5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。

杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到完全同质的诺氟沙星单克隆抗体和稳定的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573和完全同质的磺胺甲噁唑单克隆抗体和稳定的磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCCNo.2572。

单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572分别置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到抗磺胺喹噁啉的单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠得到的培养基，其中，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

单克隆抗体的保存：在液氮-20℃下保存，使用时37℃水浴快速解冻。

3、IgG的纯化：

采用饱和硫酸铵盐法(SAS)和DEME纤维素离子交换层析法纯化细胞培养液，首先用饱和硫酸铵法将IgG进行粗提和浓缩，再用DEAE52纤维素阴离子交换法将IgG进一步纯化。其具体步骤如下：

粗提：分别取3mL诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573、磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572的细胞培养液与3mL PBS(0.01M，pH7.0)混匀，吸取饱和硫酸铵溶液6mL，边缓慢滴加边搅拌加入细胞培养液中，使硫酸铵溶液的饱和度达到50％。4℃放置60min后，3000g离心15min。将所得沉淀再溶于3mL PBS(0.01M，pH7.0)中，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液1.6mL，使硫酸铵溶液饱和度达35％。4℃放置20min后，以3000g离心15min。沉淀再用上述方法在饱和度为35％的硫酸铵溶液中沉淀一次。

脱盐：将沉淀溶于(0.0175M，pH6.7)PBS中，装入透析袋，并将透析袋置于1000mL的PBS(0.0175M，pH6.7)溶液中于4℃下搅拌透析24小时，在此过程中置换缓冲液3次，得到粗提的IgG溶液。

纯化：称取2g DE-52(DEAE-52)纤维素粉末，置于盛有重蒸馏水的烧杯中，充分搅拌，静置后去掉多余溶液，然后加入0.5mol/L NaOH溶液，搅拌均匀，1h后布氏漏斗抽滤，接着用重蒸水充分洗涤至中性。再用0.5mol/L HCl溶液以同样的方法处理。最后换用0.5mol/LNaOH溶液处理一次，充分水洗至中性，然后将处理的DEAE-52装入层析柱中(2.0×20cm)，于0.0175M，pH6.7的PBS中平衡。将盐析所得粗提的IgG溶液滴入层析柱，待全部样本进入柱后，关闭柱下口，并在柱上覆盖3-5cm0.0175M，pH6.7的PBS洗脱，连接洗脱瓶，控制流速为1.0mL/min，用紫外检测器收集蛋白组分。将含有抗体蛋白的洗脱液用50％的饱和硫酸铵进行沉淀，所得沉淀脱盐后，得到诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573产生的单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572产生的单克隆抗体。将抗体分装并于-20℃保存。

间接竞争ELISA方法测定诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573产生的诺氟沙星单克隆抗体对环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹的交叉反应。抗体抑制物分别采用倍比稀释的MAR、ENO、OFL、PEF、NOR、CIP、LOM、DAN、ENR、DIF、SAR、OXO、FLU；具体步骤为：①用包被液稀将抗原(NOR)释成适当浓度，以每孔100μL的量加入酶联反应板中；②放入37℃温箱中2h，取出后倒掉余液并用200μL/孔的洗液洗板三次，间隔每次3min，之后拍干；③每孔加入150μL的封闭液放入37℃温箱2h，取出后直接拍干；④每孔加入倍比稀释的MAR、ENO、OFL、PEF、NOR、CIP、LOM、DAN、ENR、DIF、SAR、OXO、和FLU溶液中的任一种化合物的任一稀释度溶液50μl和诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCCNo.2573产生的诺氟沙星单克隆抗体溶液50μl，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；⑤每孔加入100μL的一定浓度的酶标二抗，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；⑥每孔加入四甲基联苯胺(TMB)溶液100μL，放入37℃温箱15min，取出后每孔加入50μL终止液；⑦用酶标仪中测定光密度值。根据以下公式，分别根据IC₅₀(ng/mL)计算交叉反应率：

诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573产生的诺氟沙星单克隆抗体对环丙沙星(104％)、诺氟沙星(100％)、培氟沙星(69％)、氧氟沙星(76％)、依诺沙星(63％)、麻保沙星(58％)、洛美沙星(57％)、单诺沙星(76％)、恩诺沙星(94％)、沙拉沙星(4.1％)、二氟沙星(4.4％)、噁喹酸(57％)、氟甲喹(49％)都具有交叉反应。其中，括号内的数值为三次重复实验的平均交叉反应率。

间接竞争ELISA方法测定磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572产生的磺胺甲噁唑单克隆抗体对磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑的交叉反应。抗体抑制物分别采用倍比稀释的SD、SP、ST、SMT、SMM、SMZ；具体步骤为：①用包被液稀将抗原(SMZ)释成适当浓度，以每孔100μL的量加入酶联反应板中；②放入37℃温箱中2h，取出后倒掉余液并用200μL/孔的洗液洗板三次，间隔每次3min，之后拍干；③每孔加入150μL的封闭液放入37℃温箱2h，取出后直接拍干；④每孔加入倍比稀释的SD、SP、ST、SMT、SMM和SMZ溶液中的任一种化合物的任一稀释度溶液50μl和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572产生的磺胺甲噁唑单克隆抗体溶液50μl，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；⑤每孔加入100μL的一定浓度的酶标二抗(说明书推荐浓度)，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；⑥每孔加入四甲基联苯胺(TMB)溶液100μL，放入37℃温箱15min，取出后每孔加入50μL终止液；⑦用酶标仪中测定光密度值。分别根据IC₅₀(ng/mL)计算交叉反应率。

磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572产生的磺胺甲噁唑单克隆抗体对磺胺嘧啶(58％)、磺胺噻唑(111％)、磺胺吡啶(31％)、磺胺甲噻二唑(62％)、磺胺间甲氧嘧啶(58％)、磺胺甲噁唑(100％)都具有交叉反应。其中，括号内的数值为三次重复实验的平均交叉反应率。

4、免疫色谱柱(IAC)的制备

基质的准备：取溴化氰活化的Sepharose 4B干冻粉，在盛有1.0mmol l^-1HCl的G₃漏斗中膨胀。

偶联反应：将上述膨胀的凝胶用0.1mol/L NaHCO₃溶液平衡后，与20mg的上述纯化抗体(溶于5mL 0.1mol/L NaHCO₃溶液)混合，在4℃搅拌20h。其中，由保藏号为CGMCC No.2573的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2产生的诺氟沙星鼠单克隆抗体与由保藏号为CGMCC No.2572的磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1产生的磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体的质量比为1：1。

反应液转入G3漏斗中，用100mL 0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液(1L水溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)洗涤，收集洗涤液，紫外鉴定，将洗涤液适当稀释分别测其260nm、280nm的紫外吸光度。计算IgG量的公式为：

IgG量＝(1.45×OD_280nm—0.74×OD_260nm)×稀释倍数×溶液的体积

计算偶联率计算公式为：

三次重复实验的偶联率检测结果表明，诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2CGMCC No.2573分泌的单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCCNo.2572分泌的单克隆抗体的混合抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率是91.6％。

活化位点的封闭：将上述偶联后的凝胶转入盛有0.1mol/L、pH8.0的Tris—HCl缓冲液中，混合，4℃下缓慢搅拌2h，以封闭未偶联的活化位点。

洗涤：凝胶用5倍体积的0.1mol/L、pH4.0醋酸盐缓冲液和0.1mol/L、pH8.0Tris—HCl缓冲液交替冲洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)平衡后，抽干的凝胶转入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN₃磷酸盐缓冲液(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN₃1.0g)中，4℃下存放备用。

装柱：将偶联有诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573分泌的单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572分泌的单克隆抗体的免疫吸附剂转入到含G₃滤板的玻璃柱里(100mm×8mm)，制成免疫色谱柱(IAC柱)。

5、IAC柱容量的确定

将步骤4制备的偶联有诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573分泌的单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱，用保存液(保存液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl，0.02gNaN₃的溶液)洗柱，平衡。轻轻上下晃动IAC柱，赶走柱里的气泡。将10mL含有环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑各300ng/mL的混合标准品的保存液连续加到免疫亲和色谱柱上，自然重力下流出。当柱达到饱和后(流出液中样品浓度和加样液浓度相同)，先后用20mL磷酸盐缓冲液，15mL水洗涤免疫亲和色谱柱，除去干扰杂质。最后用4mL洗脱液将上述13种喹诺酮类药物和上述6种磺胺类药物洗脱，自然重力下流出，收集，吹干，进行高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定。其中，HPLC色谱条件：C₁₈反相色谱柱，Symmetry Shield RP18(3μm，150×2.1mmi.d.)；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈溶液(B)-甲醇(C)，梯度洗脱(0min，A：95％，B：5％，C：0％；5min，A：85％，B：5％，C：10％；10min，A：70％，B：20％，C：10％；15min，A：10％，B：80％，C：10％；16min，A：10％，B：90％，C：0％；17min，A：95％，B：5％，C：0％；30min，A：95％，B：5％，C：0％)；流速为0.2mL/min；进样量为20μL；MS/MS条件为：离子源，电喷雾离子源；扫描方式，正离子扫描；检测方式，多级反应检测(MRM)；电喷雾毛细管电压，3.2Kv；电离源源温，80℃；去溶剂温度，300℃；喷雾源气体流速，28L/h；去溶剂气体流速，450L/h；倍增器电压，650伏；二级碰撞气，氩气。计算出动态柱容量和绝对柱容量。

动态柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升柱床体积对待测物的最大吸收值。其计算公式为：

绝对柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗体对待测物的最大结合容量。其计算公式为：

结果表明偶联有诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573分泌的单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱的动态柱容量和绝对柱容量分别为1976ng/mL，395ng/mg IgG(环丙沙星)；2135ng/mL，427ng/mgIgG(诺氟沙星)；2035ng/mL，407ng/mg IgG(培氟沙星)；1933ng/mL，396ng/mg IgG(氧氟沙星)；1987ng/mL，397ng/mg IgG(依诺沙星)；1589ng/mL，319ng/mg IgG(麻保沙星)；1738ng/mL，347ng/mgIgG(洛美沙星)；1448ng/mL，289ng/mg IgG(单诺沙星)；1793ng/mL，358ng/mgIgG(恩诺沙星)；1645ng/mL，329ng/mg IgG(沙拉沙星)；1498ng/mL，299ng/mgIgG(二氟沙星)；1425ng/mL，285ng/mg IgG(噁喹酸)；1632ng/mL，326ng/mgIgG(氟甲喹)；1048ng/mL，225ng/mg IgG(磺胺嘧啶)；1117ng/mL，240ng/mgIgG(磺胺噻唑)；1235ng/mL，265ng/mg IgG(磺胺吡啶)；1400ng/mL，301ng/mgIgG(磺胺甲噻二唑)；1391ng/mL，299ng/mg IgG(磺胺间甲氧嘧啶)；1328ng/mL，285ng/mg IgG(磺胺甲噁唑)。

其中，该步骤中的洗脱液为甲醇-纯水-28％氨水溶液(90:9.8:0.2，v:v:v)。洗涤液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl。保存液为在上述洗涤液中添加NaN₃至其终浓度为0.02g/L得到的溶液。

实施例2、含有偶联有鼠单克隆抗体的免疫色谱柱的试剂盒的制备及其对喹诺酮类和/或磺胺类药物的提纯净化效果

1、含有免疫色谱柱的试剂盒的制备

该试剂盒主要由盒体，免疫色谱柱(IAC柱)，环丙沙星标准溶液，诺氟沙星标准溶液，培氟沙星标准溶液，氧氟沙星标准溶液，依诺沙星标准溶液，麻保沙星标准溶液，洛美沙星标准溶液，单诺沙星标准溶液，恩诺沙星标准溶液，沙拉沙星标准溶液，二氟沙星标准溶液，噁喹酸标准溶液，氟甲喹标准溶液，磺胺嘧啶标准溶液，磺胺噻唑标准溶液，磺胺吡啶标准溶液，磺胺甲噻二唑标准溶液，磺胺间甲氧嘧啶标准溶液，磺胺甲噁唑标准溶液，洗涤液，洗脱液，保存液，海绵托架所组成，海绵托架上设有孔和凹槽。海绵托架的凹槽内装有分别盛放上述13种喹诺酮类和6种磺胺类药物标准溶液、洗涤液、洗脱液、保存液的试剂瓶，海绵托架的孔内装有IAC柱。其中免疫色谱柱为实施例1制备的偶联有诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCCNo.2573分泌的单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱。

其中，洗脱液为甲醇-纯水-28％氨水溶液(90:9.8:0.2，v:v:v)。

保存液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl，0.02g NaN₃的溶液；

洗涤液为磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl。

将该试剂盒在4℃存放。

2、喹诺酮类和/或磺胺类药物提纯净化效果实验

IAC提取原理是，将对13种喹诺酮类药物都具有交叉反应的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573分泌的单克隆抗体和对6种磺胺类药物都具有交叉反应的磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572分泌的单克隆抗体和惰性基质偶联，制备免疫吸附剂，装柱。当含13种喹诺酮类和6种磺胺类药物标准溶液的混合物流过IAC柱时，固定抗体选择性地结合13种喹诺酮类和6种磺胺类药物，其它不被识别的样品杂质则不受阻碍地流出IAC柱，经洗涤后，将抗原-抗体复合物解离洗脱，13种喹诺酮类和6种磺胺类药物得到净化。IAC柱经再生处理后可重复使用。

检测样品的处理：分别取动物组织样品(猪、鸡肌肉、肝等)匀浆物2.0±0.01g，于50mL塑料离心管中，每个样本分别添加以下19种化合物：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑，使每种化合物的终浓度均为10ng/g，静置15min后，加入提取液(甲醇：水，4：1，v/v)8mL，涡动3min，3800rpm(2500g)离心10min，取上清液，重复提取一次，合并上清液，涡动混匀，取4mL，与20mL的上述洗涤液(0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L水溶液中含有0.2gKH₂PO₄，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.8g NaCl，0.02g NaN₃的溶液)混合，作为样品溶液。

将偶联有诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2 CGMCC No.2573分泌的单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1 CGMCC No.2572分泌的单克隆抗体的免疫亲和色谱柱平衡到室温，然后将上述的样品溶液过柱，自然重力下流出，先后用20mL洗涤液，15mL水，最后用4mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。用0.1％甲酸水溶液(v/v)定容至0.5mL，过0.22μm针筒滤膜，进行高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定。其中，HPLC色谱条件：C18反相色谱柱，Symmetry Shield RP18(3μm，150×2.1mm i.d.)；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈溶液(B)-甲醇(C)，梯度洗脱(0min，A：95％，B：5％，C：0％；5min，A：85％，B：5％，C：10％；10min，A：70％，B：20％，C：10％；15min，A：10％，B：80％，C：10％；16min，A：10％，B：90％，C：0％；17min，A：95％，B：5％，C：0％；30min，A：95％，B：5％，C：0％)；流速为0.2mL/min；进样量为20μL；MS/MS条件为：离子源，电喷雾离子源；扫描方式，正离子扫描；检测方式，多级反应检测(MRM)；电喷雾毛细管电压，3.2Kv；电离源源温，80℃；去溶剂温度，300℃；喷雾源气体流速，28L/h；去溶剂气体流速，450L/h；倍增器电压，650伏；二级碰撞气，氩气。用完的IAC柱用20ml的保存液平衡保存在4℃冰箱里备用。结果如图3-图6所示，表明用IAC进行样品净化，不干扰药物色谱峰，能够完全分离，说明本发明制备的IAC非特异性吸附极小。图3和图4中的样品来自于同一肌肉组织，编号1-19中，同一编号为同一通道的结果；图5和图6中的样品来自于同一肌肉组织，编号1-19中，同一编号为同一通道的结果。

图3中的鸡肌肉组织样品为未添加上述19种化合物的空白样品，图5中的猪肌肉组织样品为未添加上述19种化合物的空白样品。

图4中的鸡肌肉组织样品为添加了上述19种化合物的样品，CIP表示环丙沙星的检测结果，NOR表示诺氟沙星的检测结果、PEF表示培氟沙星的检测结果、OFL表示氧氟沙星的检测结果、ENO表示依诺沙星的检测结果、MAR表示麻保沙星的检测结果、LOM表示洛美沙星的检测结果、DAN表示单诺沙星的检测结果、ENR表示恩诺沙星的检测结果、SAR表示沙拉沙星的检测结果、DIF表示二氟沙星的检测结果、OXO表示噁喹酸的检测结果、FLU表示氟甲喹的检测结果、SD表示磺胺嘧啶的检测结果、ST表示磺胺噻唑的检测结果、SP表示磺胺吡啶的检测结果、SMT表示磺胺甲噻二唑的检测结果、SMM表示磺胺间甲氧嘧啶的检测结果和SMZ表示磺胺甲噁唑的检测结果。

图6中的猪肌肉组织样品为添加了上述19种化合物的样品，CIP表示环丙沙星的检测结果，NOR表示诺氟沙星的检测结果、PEF表示培氟沙星的检测结果、OFL表示氧氟沙星的检测结果、ENO表示依诺沙星的检测结果、MAR表示麻保沙星的检测结果、LOM表示洛美沙星的检测结果、DAN表示单诺沙星的检测结果、ENR表示恩诺沙星的检测结果、SAR表示沙拉沙星的检测结果、DIF表示二氟沙星的检测结果、OXO表示噁喹酸的检测结果、FLU表示氟甲喹的检测结果、SD表示磺胺嘧啶的检测结果、ST表示磺胺噻唑的检测结果、SP表示磺胺吡啶的检测结果、SMT表示磺胺甲噻二唑的检测结果、SMM表示磺胺间甲氧嘧啶的检测结果和SMZ表示磺胺甲噁唑的检测结果。

Claims (10)

1、一种用于自动物样品中提取喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物的免疫亲和吸附剂，它是由固相载体和与其偶联的诺氟沙星单克隆抗体和/或磺胺甲噁唑单克隆抗体组成；所述诺氟沙星单克隆抗体和磺胺甲噁唑单克隆抗体分别是以诺氟沙星半抗原和磺胺甲噁唑半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体；所述喹诺酮类化合物为下述13种化合物中的至少一种：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹；所述磺胺类化合物为下述6种化合物中的至少一种：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑。

2、根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述诺氟沙星单克隆抗体为诺氟沙星鼠单克隆抗体；所述磺胺甲噁唑单克隆抗体为磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体。

3、根据权利要求2所述的吸附剂，其特征在于：所述诺氟沙星鼠单克隆抗体由保藏号为C6MCC No.2573的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2产生；所述磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.2572的磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1产生。

4、以权利要求1-3中任一所述的免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱。

5、含有权利要求1-3中任一所述的免疫亲和吸附剂的试剂盒或含有权利要求4所述的免疫亲和色谱柱的试剂盒。

6、根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括洗脱液、洗涤液和保存液；

所述洗脱液由甲醇、纯水和28％氨水(体积百分含量)溶液组成，所述洗脱液中，

甲醇、纯水和28％氨水溶液的体积比为90:9.8:0.2；

所述洗涤液为0.01M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液；

所述保存液为在所述洗涤液中添加NaN₃得到的溶液。

7、一种自动物样品中提取喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物的方法，包括以下步骤：

1)样品的前处理：

取动物组织样品匀浆物，加入提取液进行提取，然后进行离心力是2000g-3000g的离心，取上清液作为样品溶液；所述提取液由甲醇和水组成，所述提取液中甲醇和水的体积比为4：1；所述离心力优选为2400-2500g；

2)将步骤1)得到的样品溶液与权利要求6所述的洗涤液混合，过权利要求4所述的免疫亲和色谱柱，然后依次用权利要求6所述的洗涤液、水、权利要求6所述的洗脱液进行洗脱，收集得到喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物溶液；

所述喹诺酮类化合物为下述13种化合物中的至少一种：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹；所述磺胺类化合物为下述6种化合物中的至少一种：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述动物组织样品包括肌肉、肝。

9、诺氟沙星鼠单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.2573的诺氟沙星单克隆杂交瘤细胞株C-3-2产生；

和/或磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.2572的磺胺甲噁唑单克隆杂交瘤细胞株C-3-1产生；

产生诺氟沙星鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株C-3-2，其保藏号为CGMCC No.2573；

和/或产生磺胺甲噁唑鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株C-3-1，其保藏号为CGMCCNo.2572。

10、一种检测动物样品中喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物的方法，是用权利要求7或8所述的方法从动物样品中提取得到喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物后，再对喹诺酮类化合物和/或磺胺类化合物进行定量检测；所述喹诺酮类化合物为下述13种化合物中的至少一种：环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、麻保沙星、洛美沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹；所述磺胺类化合物为下述6种化合物中的至少一种：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲噁唑。

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