CN105628929A - 同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒，同时本发明也公开了一种环丙沙星半抗原，相应的人工抗原和量子点标记的单克隆抗体的制备方法。本发明所提供的试剂盒是以庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物和环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物为包被原，以量子点标记的庆大霉素的特异性抗体和环丙沙星的特异性抗体的混合物为检测抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高，量子点免疫荧光检测试剂盒具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。本发明可用于食品生产企业的自我质量控制，食品安全监督和检测机构的常规筛查，还可用于科研中动物药理和毒理学研究的辅助手段。

Description

同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种同时检测动物源性食品中庆大霉素和喹诺酮类药物残留的量子点免疫荧光试剂盒。

背景技术

庆大霉素（Gentamycin，GM），是氨基糖苷类抗生素的一种，庆大霉素呈碱性、易溶于水、性状稳定，与硫酸结合成临床上使用的硫酸庆大霉素。它的抗菌谱较广，对绿脓杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素雷杆菌和志贺菌等革兰氏阴性菌有抗菌作用，而且对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌也有很强的抗菌作用；其抗菌作用机理是直接与30S核糖体亚单位16rRNA的解码区的A部位结合，从而导致菌体死亡。但是，随着庆大霉素的广泛使用，一些细菌逐渐对其产生了耐药性。虽然庆大霉素对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效，常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂，但不规范用药会引起畜产品，尤其是泌乳动物的乳汁中有药物残留，对人类的健康构成潜在危害，造成耳毒性和肾脏毒性。国内外相继规定了其在动物性食品中的最高残留限量。我国农业部235号公告规定，庆大霉素在肌肉、脂肪中的最高残留限量为100ppb，在肝中的最高残留限量为2000ppb，在肾中的最高残留限量为5000ppb，在牛奶中的最高残留限量为200ppb。

喹诺酮类（Quinolones，QNs），是一类人工合成的含4-喹诺酮基本结构，对细菌DNA螺旋酶具有选择性抑制的抗生素。1962年最早的喹诺酮类药物萘啶酸首先用于临床，由于其抗菌谱窄、口服吸收差、副作用高等原因现在已很少使用。当前应用的喹诺酮大多为含有氟原子的氟喹诺酮类。这类药物抗菌谱广，对革兰氏染色呈阴性杆菌活性较高，对其他抗生素耐药的德细菌也具有良好的抗菌作用，无交叉耐药性；在体内分布广，体内和组织中药物浓度高；口服吸收好，半衰期长，使用方便；与头孢菌素类药物相比，抗菌作用相似，但价格便宜。目前在兽医临床上常用的药物主要有诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、氟甲喹等十几种，随着应用的增加，其各种毒副作用也逐渐显现出来，主要体现在头晕、低血糖、恶心、胃肠道症状、中枢神经系统和过敏反应。特别是近几年，严重的不良反应发生率约为1.6%~1.8%，引起了全世界的关注。为了保障动物源性食品的安全，欧盟、美国及我国等很多国家都对喹诺酮类药物在动物源性食品中残留制定了最大残留限量（MRL）。我国农业部文件（农质发[2009]3号文件）中规定了2009年我国畜禽产品监测项目，禽肉中4种喹诺酮类药物残留是重要的监测项目之一。

现有的庆大霉素和喹诺酮类药物检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大，再者这些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查，且目前现有的快速检测产品存在一定的局限性，无法同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的残留。量子点免疫荧光检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6~18个月) 等优点，其检测限比ELISA和理化检测方法高。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒，包括包被原、量子点标记的抗体；

所述包被原为庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物的混合物；

所述的庆大霉素半抗原，为式Ⅰ所示的化合物；

式Ⅰ。

所述的喹诺酮药物半抗原，为式Ⅱ所示的化合物；

式Ⅱ。

本发明还公开了式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）称取环丙沙星33.3mg，溶于1.5mL去离子水中，用1M氢氧化钠溶液调pH9.0；

（2）冰浴中加入乙二醇二缩水甘油醚20μL，室温搅拌反应4h，混合液真空干燥，得到的固体即为产物。

本发明提供的庆大霉素抗原，是将式Ⅰ所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等，庆大霉素与BSA的摩尔结合比具体可为8:1。

本发明还公开了所述庆大霉素抗原制备的方法，包括如下步骤：

（1）取26mg庆大霉素，溶于4ml碳酸盐缓冲液（取63.6mg无水NaCO₃和117.6mg NaHCO₃，用纯水定容至20mL)；

（2）取BSA 60mg，溶于6ml 所述碳酸盐缓冲液；

（3）将步骤（1）得到的庆大霉素溶液加到步骤（2）得到的BSA溶液中并室温混匀10min，然后加入487µl 1%（体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌过夜，然后加入NaBH₄溶液（5mgNaBH4溶于500µl纯水）并室温搅拌1h，然后用纯水透析，再然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液。

本发明提供的喹诺酮药物抗原，是将式Ⅱ所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物，环丙沙星与BSA的摩尔结合比具体可为7:1。

本发明还公开了所述喹诺酮药物抗原制备的方法，包括如下步骤：

（1）取11.3mg半抗原溶于1mL0.1M碳酸钠缓冲液；

（2）逐滴加入牛血清白蛋白溶液（50mg牛血清白蛋白溶于5mL0.1M碳酸钠缓冲液）；

（3）室温搅拌过夜后装入透析袋，PBS 4度透析72小时，期间换透析液6次。将透析液在无菌条件下过0.22 μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

所述庆大霉素抗原、喹诺酮药物抗原可以作为免疫原制备相应的特异性抗体，也可以作为包被原制备量子点免疫荧光微孔板。

所述检测抗体为庆大霉素的特异性抗体和喹诺酮药物的特异性抗体的混合物。

所述庆大霉素的特异性抗体为所述庆大霉素药物的单克隆抗体；所述喹诺酮药物的特异性抗体为所述喹诺酮药物的单克隆抗体，具体可为对11种喹诺酮类化合物（恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、依诺沙星）都有交叉反应的环丙沙星单克隆抗体。

本发明还公开了应用庆大霉素抗原、喹诺酮药物抗原和庆大霉素特异性抗体、喹诺酮药物特异性抗体制备得到的量子点免疫荧光酶联免疫试剂盒，包括量子点标记的所述抗体。

庆大霉素特异性抗体的量子点标记物和环丙沙星特异性抗体的量子点标记物的制备方法均如下：

①取2.5mg量子点，用pH4.7、0.1M的MES缓冲液洗涤，然后用1ml pH4.7、0.1M的MES缓冲液重悬，加入0.96mg EDC和1.15mg NHS，37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，即为活化后的量子点；

②取步骤①得到的活化后的量子点，用pH8.5、50mM的硼砂缓冲液洗涤，然后将2.5mg活化后量子点、所述抗体（蛋白质含量为0.15mg）和pH8.5、50mM的硼砂缓冲液混匀（总体积为0.8ml），25℃反应3.5小时；

③取完成步骤②的液相，加入BSA并使其质量百分含量为5%，37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液洗涤，用1ml pH7.4、0.02M的PBS缓冲液重悬；

步骤③得到的液相，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释至65000倍体积。

本发明还保护以上所述试剂盒在检测待测样本中是否含有庆大霉素和喹诺酮类药物中的应用。

以上任一所述喹诺酮类可为诺氟沙星和/或恩诺沙星和/或噁喹酸和/或环丙沙星和/或达氟沙星和/或氟甲喹和/或洛美沙星和/或依诺沙星和/或培氟沙星和/或麻保沙星和/或氧氟沙星。

本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分析物。本发明提供的试剂盒能同时检测样本中是否含有庆大霉素和喹诺酮类药物，具有前处理简单、灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便（对操作人员没有专业要求）、快捷、成本低廉、非常适合现场大批量样本的筛选，可用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为实施例1试剂盒检测庆大霉素含量的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶液中庆大霉素浓度（µg/L），纵坐标为百分荧光强度值（%）。

图2为实施例1试剂盒检测环丙沙星含量的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶液中环丙沙星浓度（µg/L），纵坐标为百分荧光强度值（%）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

庆大霉素原料药：Sigma-Aldrich，G1397。环丙沙星原料药：Sigma-Aldrich，型号：17850 。牛血清白蛋白(BSA)：Sigma-Aldrich，A2058。

庆大霉素半抗原的结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ。

环丙沙星半抗原的结构式如式Ⅱ所示：

式Ⅱ。

实施例1、偶联物、特异性抗体和特异性抗体的的量子点标记物的制备

一、抗原制备

1、庆大霉素-载体蛋白偶联物的制备

（1）取26mg庆大霉素原料药，溶于4ml碳酸盐缓冲液（取63.6mg无水NaCO₃和117.6mgNaHCO₃，用纯水定容至20mL)中。

（2）取BSA 60mg，溶于6ml 所述碳酸盐缓冲液。

（3）将步骤（1）得到的庆大霉素溶液滴加到步骤（2）得到的BSA溶液中并室温混匀10min，然后加入487µl 1%（体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌（400rpm）过夜，然后滴加NaBH4溶液（5mg NaBH4溶于500µl纯水，新制）并室温搅拌1h，然后置于透析袋中用纯水透析（透析参数：4℃、100rpm搅拌、2天、每天换液2次），再然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析（透析过程参数：4℃、100rpm搅拌、2天、每天换液2次)，然后4500rpm离心6min并取上清液（庆大霉素-载体蛋白偶联物溶液），1ml/管分装，-20℃保存。

（4）采用紫外分光光度法测定庆大霉素-载体蛋白偶联物溶液中庆大霉素与载体蛋白的结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010, Vol. 31, No. 10，91-94），庆大霉素与BSA的摩尔结合比为8:1。

2、环丙沙星半抗原的制备

（1）称取环丙沙星33.3mg，溶于1.5mL去离子水中，用1M氢氧化钠溶液调pH9.0；

（2）冰浴中加入乙二醇二缩水甘油醚20μL，室温搅拌反应4h，混合液真空干燥，得到的固体即为产物。

3、环丙沙星-载体蛋白偶联物的制备

（1）取11.3mg半抗原溶于1mL0.1M碳酸钠缓冲液；

（2）逐滴加入牛血清白蛋白溶液（50mg牛血清白蛋白溶于5mL0.1M碳酸钠缓冲液）；

（3）室温搅拌过夜后装入透析袋，PBS 4度透析72小时，期间换透析液6

次，将透析液在无菌条件下过0.22 μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存；

（4）采用紫外分光光度法测定环丙沙星-载体蛋白偶联物溶液中环丙沙星与载体蛋白的结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010, Vol. 31, No. 10，91-94），环丙沙星与BSA的摩尔结合比为7:1。

二、特异性抗体的制备

1、庆大霉素鼠单克隆抗体的制备

（1）动物免疫程序

采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以庆大霉素-载体蛋白偶联物为免疫原，单次免疫剂量为50-100μg/只（以载体蛋白计）。首次免疫时将免疫原溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔2周将免疫原溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，进行加强免疫，颈背部皮下多点注射。第三次加强免疫2周后将免疫原剂量减半用0.5ml灭菌生理盐水稀释后，采用腹腔注射的方法加强免疫一次，3天后取脾细胞。

（2）细胞融合与克隆化

步骤（1）得到的脾细胞，按（4-8）：1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）杂交瘤细胞株的保藏

将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株GEN-2A1（简称杂交瘤细胞GEN-2A1）。杂交瘤细胞GEN-2A1已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8406。

（4）细胞冻存和复苏

用冻存液将杂交瘤细胞GEN-2A1制成细胞浓度为（1-5）×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

（5）单克隆抗体的制备与纯化

细胞培养基（7.4）的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20%（质量百分含量），碳酸氢钠的终浓度为0.2%（质量百分含量）。

将杂交瘤细胞GEN-2A1置于细胞培养基中，37℃培养2天，采用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的细胞培养上清液进行纯化，得到庆大霉素单克隆抗体溶液（-20℃保存）。

庆大霉素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度（mg/ml）=1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为0.8mg/ml。

2、环丙沙星鼠单克隆抗体的制备

用环丙沙星-载体蛋白偶联物代替庆大霉素-载体蛋白偶联物，其他同步骤1。

环丙沙星单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度（mg/ml）=0.6mg/ml。

三、量子点标记的特异性抗体的制备

①取2.5mg量子点，用pH4.7、0.1M的MES缓冲液洗涤，然后用1ml pH4.7、0.1M的MES缓冲液重悬，加入0.96mg EDC和1.15mg NHS，37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，即为活化后的量子点。

②取步骤①得到的活化后的量子点，用pH8.5、50mM的硼砂缓冲液洗涤，然后将2.5mg活化后量子点、单克隆抗体（蛋白质含量为0.15mg）和pH8.5、50mM的硼砂缓冲液混匀（总体积为0.8ml），25℃反应3.5小时（单克隆抗体和量子点形成稳定的肽键共价结合）。

③取完成步骤②的液相，加入BSA并使其质量百分含量为5%（目的是对剩余活性氨基位点进行封闭），37℃反应30分钟，20000rpm离心5min，收集沉淀，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液洗涤，用1ml pH7.4、0.02M的PBS缓冲液重悬，4℃保存待用。

实施例2、同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒的组装

量子点购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为TLS®LumiQDTM20。该量子点的表征如下：粒径为20nm、粒径的CV为15%，量子产率为60%，表面羧基含量为5×10-3mmol/mg，水溶性，CdSe/ZnS核壳结构，激发光波长为345nm，发射波长是620nm；红色荧光量子点。量子点上的羧基与蛋白质上的氨基形成肽键并连接起来。

量子点免疫荧光检测试剂盒包括如下组件：

一、包被了包被原的微孔板

取实施例1制备的包被原溶液，用包被缓冲液稀释（包被缓冲液即pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液），得到蛋白浓度为5ng/mL的包被原稀释液。将10g牛血清白蛋白、0.1mL proclin300和1000mL pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液。

（1）将包被原稀释液加入微孔板（100μL/孔），37℃孵育16小时。

（2）完成步骤（1）后，倾去孔内的液体，洗涤，拍干。

（3）完成步骤（2）后，每孔加入200μL封闭液，37℃温育2h。

（4）完成步骤（3）后，倾去孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

二、量子点标记的抗体工作液

将实施例1制备的单克隆抗体用抗体稀释液稀释65000倍，得到抗体工作液。

抗体稀释液：取BSA10mg，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液溶解并定容至1000mL，得到抗体稀释液。

三、标准品溶液

含不同梯度浓度庆大霉素和环丙沙星的标准品溶液1—6的溶剂为PBS 缓冲液，溶质及其浓度为庆大霉素0—40.5μg/L 和环丙沙星0—24.3μg/L，具体如下：

标准品溶液 1 为含庆大霉素0μg/L 和环丙沙星0μg/L 的PBS 缓冲液；

标准品溶液 2 为含庆大霉素0.5μg/L 和环丙沙星0.3μg/L 的PBS 缓冲液；

标准品溶液 3 为含庆大霉素1.5μg/L 和环丙沙星0.9μg/L 的PBS 缓冲液；

标准品溶液 4 为含庆大霉素4.5μg/L 和环丙沙星2.7μg/L 的PBS 缓冲液

标准品溶液5 为含庆大霉素13.5μg/L 和环丙沙星8.1μg/L 的PBS 缓冲液；

标准品溶液 6 为含庆大霉素40.5μg/L 和环丙沙星24.3μg/L 的PBS 缓冲液。

四、稀释液

pH7.4、0.02M的PBS缓冲液。

五、浓缩洗涤液：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M pH值为7.4。

实施例3、同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒的使用方法

一、样本前处理方法

1、猪肉或鸡肉检测样本溶液的获得：准确称取1±0.01 g 均质后的猪肉或鸡肉样品于50 mL 离心管中；加入20 mL 样品提取液；室温（23-27℃）下，高速涡动1 min；4000 g以上，离心10 min；取50μL 上清即可进行分析。

2、牛奶检测样本溶液的获得：取牛奶样本3000g 以上离心10min，轻吸中间层，用样品稀释液稀释5 倍，取50μL 即可进行分析。

二、应用量子点免疫荧光试剂盒检测

向包被了包被原的微孔板中加入标准品溶液或待测样本溶液50μL，一抗工作液50μL，室温反应30min，弃上清，洗涤3次（每次洗涤过程均如下：每孔中加入250μL洗涤液，30秒后弃上清），用吸水纸拍干，用荧光酶标仪检测其荧光强度数值。荧光酶标仪设置为激发波长345nm，发射波长620nm。每个浓度的标准品溶液的发光强度的平均值（B）除以0溶液的发光强度值（B0），再乘以100%，即结合率。计算公式：结合率（%）=B/B0×100%。以标准品溶液中的庆大霉素浓度（μg/L）的半对数值为X轴，B/B0为Y轴，绘制标准曲线图（见图1）；以标准品溶液中的环丙沙星浓度（μg/L）的半对数值为X轴，B/B0为Y轴，绘制标准曲线图（见图2）。根据标准曲线的回归方程可以求出待测样本溶液中庆大霉素和环丙沙星的浓度。本发明中检测结果的分析可以利用专业软件，可以实现大量样本的快速分析，整个检测过程只需60分钟就可以完成。结合率（B/B0）为50%时对应的标准品溶液中的庆大霉素和环丙沙星的浓度即为IC50值。根据标准曲线图，庆大霉素的IC50=2.5μg/L，环丙沙星的IC50=1.0μg/L。

三、样品中庆大霉素和环丙沙星浓度的测定

用每个检测样品溶液的荧光强度平均值除以0溶液的发光强度平均值，再乘以100%，得到抑制率。相对应每一个检测样品溶液的抑制率，则可从标准曲线上读出检测样品溶液的半对数值，再根据样品溶液的半对数值换算出样品溶液中庆大霉素和环丙沙星的残留量，最后再乘以各样品前处理过程的稀释倍数，即可计算出样本中庆大霉素和环丙沙星的浓度。

实施例4、同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒检测效果评价

一、试剂盒灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白样品进行检测，计算空白样品荧光强度的平均值，并将此平均值带入标准曲线得到对应的样品浓度，计算各对应浓度值的标准差（SD），由平均值加三倍标准差即为该样品的最低检测限（LOD）。

结果：试剂盒检测庆大霉素的最低检测限为0.5ng/g；喹诺酮药物的最低检测限为0.3ng/g。

二、准确度试验

向不含庆大霉素和喹诺酮类药物的猪肉、鸡肉、牛奶样品中分别添加不同浓度的庆大霉素和环丙沙星，使庆大霉素在样品中的终浓度分别为1μg/kg（L）、2μg/kg（L），环丙沙星的终浓度分别为1μg/ kg（L）、2μg/ kg（L），将添加后的样品分别按照所述方法进行前处理，得到检测样品溶液。

从3个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个样品重复5次，分别计算回收率。结果分别见表1-2。

表1 试剂盒的庆大霉素样本检测准确度试验结果

表1结果表明，牛奶样品庆大霉素的添加回收率在81.6%-92.1%之间；鸡肉样品的庆大霉素的添加回收率在72.6%-90.5%之间；猪肉样品的庆大霉素的添加回收率在79.5%-101.2%之间。

表2 试剂盒的环丙沙星样本检测准确度试验结果

表2结果表明，牛奶样品环丙沙星的添加回收率在70.4%-96.5%之间；鸡肉样品环丙沙星的添加回收率在75.2%-94.5%之间，猪肉样品环丙沙星的添加回收率在78.9%-99.1%之间，说明试剂盒的准确度良好。

三、精密度试验

将不含庆大霉素和喹诺酮类药物的猪肉、鸡肉和牛奶样本分别按照相应方法进行处理后获得样品溶液，添加庆大霉素和环丙沙星，使二者的终浓度都为10μg/kg（或μg/L）。从3个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒（即3个酶标板），每个实验重复5次，按照试验方法获得各样品的荧光强度值，计算变异系数。结果如表3-表5所示。

表3 牛奶的精密度试验结果（添加浓度10μg/L）

表4 猪肉的精密度试验结果（添加浓度10μg/ kg）

表5 鸡肉的精密度试验结果（添加浓度10μg/kg）

结果表明：猪肉、鸡肉、牛奶样品的批内批间变异系数均＜15%，说明试剂盒的精密性良好。

四、试剂盒的保存期试验

试剂盒的保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大荧光强度值（零标准）、50%抑制浓度、庆大霉素药物和喹诺酮类药物添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃条件下放置8天，进行加速老化试验，结果表明该试剂盒的上述各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒在-20℃条件下放置8天，上述各项指标完全符合要求。

五、交叉反应率试验

1、在试剂盒的酶标板中每孔加入50 μL庆大霉素的结构类似物标准品溶液（溶剂为PBS缓冲液，庆大霉素的结构类似物的浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔）或环丙沙星的结构类似物标准品溶液（溶剂为PBS缓冲液，环丙沙星的结构类似物的浓度分别为0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L、24.3μg/L，将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔），每个浓度设置3个复孔。庆大霉素的结构类似物和环丙沙星的结构类似物如表6所示。

2、将采用各个浓度的结构类似物得到的对应的荧光强度值（三个复孔的平均值）除以对照孔的荧光强度值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的结构类似物浓度（μg/L）的半对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50%时对应的结构类似物浓度（μg/L），即结构类似物的IC50值。用下式分别计算试剂盒对庆大霉素和喹诺酮类药物结构类似物的交叉反应率，结果如表6所示。

交叉反应率（%）=（庆大霉素的IC50值/待测药物的IC50值）×100%

交叉反应率（%）=（环丙沙星的IC50值/待测药物的IC50值）×100%

表6 试剂盒交叉反应率

药物名称	交叉反应率（%）
		庆大霉素	100
小诺霉素	120
		西索米星	2
新霉素	<0.1
		卡那霉素	<0.1
新霉胺	<0.1
		链霉素	<0.1
安普霉素	<0.1
		大观霉素	<0.1

表7 试剂盒交叉反应率

药物名称	交叉反应率（%）
		环丙沙星	100
诺氟沙星	150
		恩诺沙星	95
氧氟沙星	120
		达氟沙星	89
氟甲喹	88
		恶喹酸	95
麻保沙星	90
		氨氟沙星	120
培氟沙星	180
		依诺沙星	60
二氟沙星	<1
		沙拉沙星	<1
萘啶酸	<1

试验结果表明，本发明试剂盒对庆大霉素和喹诺酮类药物的特异性好，即本发明试剂盒可以同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物。

Claims (10)

1.一种同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒，包括包被原、量子点标记的抗体。

2.一种环丙沙星半抗原，为式Ⅱ所示化合物：

式Ⅱ。

3.本发明还公开了式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）称取环丙沙星33.3mg，溶于1.5mL去离子水中，用1M氢氧化钠溶液调pH9.0；

（2）冰浴中加入乙二醇二缩水甘油醚20μL，室温搅拌反应4h，混合液真空干燥，得到的固体即为产物。

4.权利要求1所述包被原为庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物和环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物的混合物。

5.权利要求4所述的环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物的制备方法，包括如下步骤：

（1）取11.3mg环丙沙星半抗原溶于1mL 0.1M碳酸钠缓冲液；

（2）逐滴加入牛血清白蛋白溶液（50mg牛血清白蛋白溶于5mL0.1M碳酸钠缓冲液）；

（3）室温搅拌过夜后装入透析袋，PBS 4度透析72小时，期间换透析液6次，将透析

液在无菌条件下过0.22 μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

6.权利要求4或5所述庆大霉素抗原和环丙沙星抗原在制备庆大霉素特异性抗体和环丙沙星特异性抗体中的应用。

7.应用权利要求4或5所述庆大霉素抗原和环丙沙星抗原制备得到的量子点标记的特异性抗体。

8.权利要求7所述抗体为庆大霉素的特异性抗体和环丙沙星的特异性抗体的混合物。

9.权利要求4或5所述抗原、权利要求7或8所述特异性抗体在检测庆大霉素和喹诺酮类药物中的应用。

10.应用权利要求4或5所述抗原、权利要求7或8所述特异性抗体制备得到的量子点免疫荧光检测试剂盒。