CN101639477B - 多西环素残留的elisa检测方法及试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫分析技术领域。具体涉及一种用于多西环素(DOX)残留检测的酶联免疫方法及试剂盒。本发明的方法主要包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品前处理和ELISA检测方法的建立。本发明的试剂盒主要由抗DOX特异性抗体，DOX标准品、包被有DOX-OVA偶联物的酶标板组成。本发明的试剂盒和方法具有简便、快速、灵敏、准确等优点，适合用于动物可食性组织中DOX残留的检测。

Description

多西环素残留的ELISA检测方法及试剂盒与应用

技术领域

本发明属于免疫化学分析技术领域。具体涉及多西环素残留酶联免疫(ELISA)检测方法及试剂盒与应用，适用于可食性动物组织中(肌肉、肝脏等)多西环素药物的残留快速检测。 

背景技术

多西环素是一种广谱抗生素，对许多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制或杀灭作用，如：链球菌、炭疽杆菌、某些葡萄球菌、破伤风杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌、克雷伯氏菌和嗜血杆菌等。除此之外多西环素还对一些衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体等有一定的抑制作用。但多西环素也有很多的副作用，如：诱发低血糖、引起颅内高压、致光敏反应、致肝损伤。多西环素在动物组织中残留会威胁食品安全，对人体健康造成危害。为此，欧盟在2003年7月对多西环素在猪体内的最高残留量作了规定，肌肉、脂肪、肝脏和肾脏的最高残留量分别为100ug/kg、300ug/kg、300ug/kg和600ug/kg；中华人民共和国农业部235号公告《动物食品中兽药最高残留限量》，对多西环素在动物组织中残留也制定了最高残留限量。 

目前在动物性食品中多西环素的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用法、微生物法、酶联免疫法。但微生物方法存在检测时间长、缺乏特异性，容易导致假阳性和假阴性产生。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费时、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。近年来，ELISA法以其灵敏、快速、特异、简便等优点，在兽药、农药残留检测领域已被广泛应用。目前还没有针对多西环素ELISA检测方法及试剂盒报道。 

本发明应用免疫学技术筛选出抗多西环素(DOX)的多克隆抗体(DOX pAb)，研制针对多西环素药物残留快速检测试剂盒，并对其性能进行测定。试剂盒检测范围较宽，假阳性低，检测灵敏、准确、可靠，适用于动物可食性组织如肌肉、肝脏中多西环素检测。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，制备一种抗多西环素多克隆抗体。利用该多克隆抗体，建立一种特异性强、灵敏度高、且操作简单，对样品简单处理即可检测多西环素残留的ELISA检测方法。同时组装一种多西环素药物残留的ELISA试剂盒，作为对可食性动物组织中多西环素药物残留的ELISA检测试剂盒中的应用。 

本发明的技术方案是： 

一种多西环素药物残留的ELISA检测方法，包括制备免疫原、包被原、抗体、酶标板和样品前处理，其步骤如下： 

(1)将半抗原多西环素用对氨基苯甲酸作连接臂，再与牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵清白蛋白(OVA)偶联合成免疫原(DOX-PABA-BSA)； 

(2)将半抗原多西环素采用赫夫曼消除反应后，再与牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白偶联合成包被原 (DOX-OVA)； 

(3)将步骤(1)合成的多西环素免疫原免疫兔，得到特异性兔多克隆抗体； 

(4)将步骤(2)合成的多西环素包被原包被固相载体(酶标板)； 

(5)将待检可食性动物组织进行处理，用样品稀释液得到检测样品； 

(6)对步骤(5)的待测样品进行ELISA测定。 

其中(5)所述样品稀释液0.01M pH7.4 PBS的组分及配比为：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9gNa₂HPO4·12H₂O，0.2g KH₂PO4，加蒸馏水至1000mL。 

一种多西环素药物残留的ELISA检测试剂盒，其包括：盒体(1)，设在盒体内的酶标板(2)，多西环素标准品(3)，抗多西环素抗体(4)，洗涤液(5)，样品稀释液(6)，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体(7)，底物液(8)，底物A储存液(9)，底物B储存液(10)和终止液(11)； 

其中： 

所述的试剂组分及其配比如下： 

包被液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加蒸馏水定容至1000mL； 

浓缩洗涤液为0.05％吐温-20的0.01M pH7.4磷酸缓冲液：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9gNa₂HPO4·12H₂O，0.2g KH₂PO4，0.5mL吐温-20，加蒸馏水至100mL； 

封闭液：鸡卵清白蛋白1g，将该鸡卵清白蛋白溶于100mLpH7.4磷酸缓冲液中； 

底物缓冲液：4.91g柠檬酸.H₂O，19.38g Na₂HPO₄.12H₂O，加三蒸水至1000mL； 

底物A储存液：100mg四甲基联苯胺，50mL无水乙醇； 

底物B储存液：75mg过氧化氢脲，10mL三蒸水； 

底物显色液(10mL)：9.5mL底物缓冲液，32μL底物B储存液，0.5mL底物A储存液； 

终止液：2mol/L H₂SO₄溶液。 

其中多西环素标准品(3)的浓度分别为0μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L和80μg/L(分7瓶分装，以建立多西环素残留ELISA检测方法的标准曲线)。 

附图说明

图1：本发明免疫原合成路线图； 

图2：本发明免疫原紫外扫描图； 

图3：本发明包被原合成路线图； 

图4：本发明多西环素ELISA试剂盒检测的标准曲线图。 

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。 

实施例1抗原制备 

1.1免疫原的合成 

本发明免疫原(DOX-PABA-BSA)合成按照附图1所示技术合成路线。具体方法为：称取对氨基苯甲酸 27.4mg(0.2mmol)溶于4mL 1mol/L的HCl中。在冰水浴中，边搅拌边逐滴加入现配的1mol/L NaNO₂ 0.4mL，4℃避光反应10min，边反应边搅拌；取少量与苯胺反应，若反应体系变成深黄色，表明重氮化反应成功，得溶液A，备用。称取多西环素0.088g(0.2mmol)，溶解在3mL三蒸水中，将A液逐滴加入多西环素溶液中，调节PH 8-9，磁力搅拌反应2h，离心取上清液，加入三丁胺6.8ul到反应液中，混合后再加氯甲酸异丁酯3.8ul，于4℃磁力搅拌反应25min，得B液。称取340mg BSA(5×10^-6mol)先溶于5mLPBS，在冰水浴且磁力搅拌下加入5mL的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液，得C液。在磁力搅拌下将B溶液加入到C液中，置4℃冰箱反应过夜，离心去沉淀，取上清液用0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)透析3天，冻干，于-20℃保存备用。其紫外图谱如图2所示。 

1.2包被原合成 

本发明包被原(DOX-OVA)合成按照附图3所示技术合成路线。准确称取多西环素0.088g(0.2mmol)溶解在3mL超纯水中，然后将4mL溴水碱液加入多西环素溶液中，加热反应2h，4℃预冷。在4℃避光条件下向上述反应体系中缓慢滴加1mol/L的盐酸0.6mL(调pH至2)，在冰水浴中，边搅拌边逐滴加入现配的1mol/LNaNO₂ 0.3mL，加完后置于4℃冰箱阴暗处孵育6h。按照20∶1摩尔比，将220mg OVA(5×10^-6mol)溶于5mLPBS，将偶氮化DOX慢慢滴入OVA溶液中，加完后在4℃冰箱阴暗处孵育过夜。离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用。 

实施例2兔抗多克隆抗体制备 

2.1动物免疫 

将新西兰大白兔用免疫原(DOX-PABA-BSA)进行免疫。基础免疫时将免疫原用灭菌PBS溶解稀释，加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，注射时采用颈背部多点皮下注射，加强免疫方法同基础免疫，佐剂为不完全佐剂。从第3次加强免疫开始，免疫后第8d，耳静脉采血测定抗体效价和特异性。达到一定效价后，采心脏全血，分离抗血清(先于室温静置1h，再置于4℃冰箱数小时后，4000r/min冷冻离心10min)。经饱和硫酸铵分级沉淀得到纯化后的抗DOX多克隆抗体。 

2.2 DOXpAb的纯化 

按照常规方法，取步骤2.1制备的兔抗血清，5000r/min 4℃离心30min；取上清液加入等量PBS，对0.01mol/L pH 5.4PB液透析24h沉淀优球蛋白，3000r/min4℃离心30min；取上清加入浓度为50％的SAS，37℃搅拌下作用2h，3000r/min离心30min，弃去上清液；沉淀用双蒸水溶解，加入浓度为35％的饱和硫酸铵(SAS)，37℃搅拌下作用2h，3000r/min离心30min；沉淀用双蒸水溶解，再加入浓度为33％的SAS，使终浓度达33％，37℃搅拌下作用2h，3000r/min离心30min，弃去上清；加入与原血清量等体积的双蒸水溶解沉淀，4℃对PBS透析72h，期间换液4～6次；收集透析后的蛋白液即为DOX pAb，测定蛋白含量后分装-20℃保存备用。 

实施例3间接ELISA方法建立 

3.1包被浓度和抗体效价试验 

采用方正滴定初步得到包被浓度和相应抗体效价作为建立方法工作浓度。根据ELISA方法建立确定的最佳包被原包被浓度为0.8ug/ml，抗体效价为1∶32000。 

3.2标准曲线的建立和最低检测线 

准确量取DOX适量标准品储备液，将DOX用PBS释成0、2.5、5、10、20、40和80μg/L系列浓度，每个实验重复5孔，用间接竞争ELISA测定DOX mAb对不同浓度DOX标准品的抑制吸光值，重复测定3次。所获得的标准品吸光值的平均值除以B0标准的吸光值(抑制率)，以DOX溶液浓度的对数为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，计算IC₅₀值(抑制率为50％所对应药物浓度)。本试剂盒IC₅₀值为：10.65μg/L。 

标准曲线最低检测限：制作标准曲线，测定20个0μg/L标准溶液，计算OD值的平均值 和标准差(SD)，根据最低检测限公式 

计算抑制率B/B₀，在标准曲线上查出B/B₀所对应的浓度，即为标准品最低检测限，结果见表1。最低检测线(LOD)为1.79μg/L，检测范围为1.79～80.0μg/L。 

表1 标准曲线的最低检测限测定 

3.3抗体特异性 

采用间接竞争ELISA程序进行检测，测定各抑制物的IC₅₀值，计算交叉反应率(CR％)，以交叉反应率为指标判定抗体特异性。交叉反应结果见表2。结果表明，随着DOX药物浓度的增加，抑制率明显下降，药物浓度在2.5～80μg/L，抑制率由77.32％下降至11.51％，IC₅₀为10.65μg/L；间接竞争ELISA对四环素类药物在系列浓度(10、25、50、100、250、500、1000μg/L)有较低交叉反应，交叉反应结果为：OTC为5.07％、TC为2.34％、CTC为1.46％、EM小于0.1％。 

表2本发明抗体特异性 

实施例4样品处理方法 

样品处理方法：选取任何不含抗菌药物的健康的可食性动物组织，将经筛选后的空白组织剪碎，用匀浆机4000r/min均质5min，称取组织均质物1.0g于50mL离心管中，加入3％三氯乙酸(肉4mL，肝9ml)，旋涡混匀，颠倒振荡20min，室温10000rpm离心10min。取上清液200μL于1.5mL离心管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液20μL，旋涡混匀，加入样品缓冲液(肉180μL，肝380μL)混匀，以10000r/min离心5min，上清液作为试样溶液。肌肉稀释因子为10，肝脏稀释因子为30。 

实施例5本发明试剂盒在动物可食性组织检测线、精密度、准确性、重复性 

5.1本发明试剂盒组织最低检测限 

组织最低检测限(LOD)计算方法为：用间接竞争ELISA检测方法，制作ELISA标准曲线。分别测定20份空白组织(猪肌肉和肝脏)的OD_450nm值，计算OD值的平均值 

和标准差(SD)，根据最低检测限公式 计算抑制率B/B₀，在标准曲线上查出B/B₀所对应的浓度，即为标准品最低检测限，结果见表3。DOX在鱼肉、猪肌肉和猪肝脏中的最低检测限LOD分别为2.65ug/kg、2.96ug/kg、2.55ug/kg。 

表3空白组织测定结果及最低检测限(n＝20) 

5.2本发明试剂盒精密度试验 

将DOX标准品稀释成0、2.5、5、10、20、40和80μg/L系列浓度，每个标准品溶液重复3孔测试，在不同酶标板之见重复5次测试，按照2.2.1.4标准曲线建立的方法，计算板内系数和板间变异系数(CV)，以板内变异系数和板间变异系数来评价ELISA方法的精密度。结果见表4。结果表明，所建立的ELISA方法重复性好，板内和板间变异系数均＜15％。 

表4标准曲线的板内板间误差 

5.3本发明试剂盒组织添加准确性和重复性 

根据中华人民共和国农业部第235号公报(www.agri.gov.cn)，多西环素在动物性食品中的最高残留限量：在所有食品动物的肌肉中为100μg/kg，肝脏中为300μg/kg，肾脏中为600μg/kg；在猪、羊奶中为100μg/kg；在禽蛋中为200μg/kg；在鱼/虾肉中为100μg/kg。按此规定，根据农业部文件(农医发【2005】17号，参见：www.agri.gov.cn)，将1mg/mL DOX标准品稀释成适当浓度，取空白组织，准确量取DOX适量标准品储备液添加到组织(猪肉、鱼肉和猪肝等组织)中，使其终浓度为0.5×MRL、MRL、2×MRL(即：猪肝为600、300、150μg/kg，猪肉和鱼肉为200、100、50μg/kg)。然后进行样品处理，采用间接竞争ELISA测定样品中DOX浓度。同一天内每一浓度重复5个样，每种样品重复3天。计算回收率，并计算日间平均回收率和批间变异系数。结果见表5。由批内批间误差和回收率的结果看，本发明试剂盒的重复性、精确度、准确度是比较好。 

表5多西环素在可食性动物组织中添加回收率及变异系数 

实施例6 ELISA试剂盒制备 

6.1 ELISA试剂盒组成 

(1)96孔酶标板，包被有DOX-OVA； 

(2)DOX标准液7瓶，浓度分别为0、2.5、5、10、20、40和80μg/L，0.5mL/瓶×7瓶 

(3)DOX抗体液，0.2mL/瓶×1瓶； 

(4)酶标二抗，0.4mL/瓶×1瓶； 

(5)洗涤液(10×浓缩)，50mL/瓶×1瓶； 

(6)磷酸盐缓冲液(10×浓缩)，50mL/瓶×1瓶； 

(7)底物液A(TMB，10mg/mL)，1.2mL/瓶×1瓶； 

(8)底物液B(过氧化氢脲，0.75％)，0.2mL/瓶×1瓶；柠檬酸缓冲液，15mL； 

(8)终止液，15mL/瓶×1瓶；三氯乙酸(10％)，15mL/瓶×1瓶； 

(9)氢氧化钠溶液(5mol/L)，5mL/瓶×1瓶； 

(10)3％三氯乙酸(50×浓缩)，40mL/瓶×1组成。 

6.2所用试剂配制 

(1).包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加蒸馏水定容至1000mL)； 

(2)浓缩洗涤液：含0.05％吐温-20的0.01M pH7.4PBS(8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO4·12H₂O，0.2g KH₂PO4，0.5mL吐温-20，加蒸馏水至100mL)； 

(3).封闭液：1g OVA  ，溶于100mL pH7.4PBS； 

(4).底物缓冲液：4.91g柠檬酸.H₂O，19.38g Na₂HPO₄.12H₂O，加三蒸水至1000mL；(5).(5)底物A储存液：100mg四甲基联苯胺(TMB)，50mL无水乙醇，避光，4℃保存； 

(6).底物B储存液：75mg过氧化氢脲，10mL三蒸水，4℃避光保存。 

(7).底物显色液(10mL)：9.5mL底物缓冲液，32μL底物B储存液，0.5mL底物A储存液，混匀即可，现配现用。 

(8).终止液(2mol/L H₂SO₄)：量取浓H₂SO₄ 55.5mL，加入到400mL蒸馏水中，冷却后，定容至500mL。 

(9)浓缩样品稀释液：0.01M pH7.4PBS(8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO4·12H₂O，0.2g KH₂PO4，加蒸馏水至100mL)。 

6.3酶标板制备 

将包被原DOX-OVA用包被液稀释为1μg/mL，每孔加100uL，4℃过夜，倾去孔内包被液，用洗涤液洗3次，拍干，然后用封闭液封闭，37℃孵育1小时，倾去孔内封闭液，洗涤液洗涤3次，拍干，用铝膜真空封闭保存、备用。 

实施例7本试剂盒检测程序 

7.1工作液配制 

样品稀释液：根据将试剂盒中提供的磷酸盐缓冲液用三蒸水10倍稀释。 

DOX系列浓度标准溶液：取DOX标准母液(1mg/mL)80μL加入到样品稀释液1mL中，即得80μg/L的标准溶液；然后倍比稀释，配制40μg/L、20μg/L、10μg/L、5、2.5μg/L、0μg/L的标准溶液。 

DOX抗体工作液：根据每次所需用量，将DOX抗体液用稀释后的磷酸盐缓冲液200倍稀释后使用。 

酶标二抗工作液：根据每次所需用量，酶标二抗用稀释后的磷酸盐缓冲液100倍稀释后使用。 

洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水10倍稀释后使用。 

底物混合液：取底物液A 0.5mL，底物液B 32μL，三蒸水4.5mL，柠檬酸缓冲液5mL混匀，现配现 用。 

7.2 ELISA操作步骤 

剪开密封袋，取出酶标板回温至室温10min。每孔加230uL洗涤液洗2次，拍干。加入各浓度的DOX标准品或处理好的样品液50μL到各自微孔中，每个标准品和样品必须使用新的枪头。加DOX抗体：加入DOX抗体工作液50μL到每一个微孔中充分混合，枪头不要接触到孔的液体，在37℃培养箱中孵育30min后，倒出孔中的反应液，洗涤液洗涤3次并拍干。加酶标二抗：每孔加入酶标二抗工作液100μL到每一微孔中充分混合，在37℃培养箱中孵育40min，倒出孔中的液体，洗涤3次并拍干。加底物：每孔中加入底物混合液100μL，充分混合后，在37℃培养箱中孵育15～20min。终止：每孔中加入终止液50μL。测定：加入终止液后30min内，在450nm处测量光密度(OD)值。从标准曲线计算样品中的DOX含量。 

7.3结果判定 

所获得的标准品的吸光度值(B)除以“0”标准的吸光值(B₀)，即为抑制率(B/B₀)。以DOX浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标作标准曲线，进行线性回归，给出回归方程，曲线在2.5μg/L～80μg/L范围内趋近直线。相对应每个样品浓度可以从标准曲线读出。 

实施例8本发明试剂盒考核 

本发明试剂盒与HPLC方法进行比较，结果见表6。结果表明ELISA和HPLC具有较好的相关性。 

表6 ELISA和HPLC测定DOX添加回收率和变异系数比较 

实施例8本发明试剂盒的应用 

选择12头15Kg左右的长大二元杂交去势健康仔猪，随机分为6组，第一组为对照组，其它5组为试验组。试验前隔离预饲7天，饲喂不含其他任何抗菌物质的饲料，自由饮水。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料，试验组以2.5mg/kg体重剂量的多西环素注射液在仔猪颈部肌内注射，一日1次，连用4天。停药后0d、3d、6d、10d、16d分别屠宰试验组猪2头，对照组分别在停药0d、、10d屠宰1头，采肌肉和肝脏，同时用ELISA法和HPLC法测定，其中ELISA检测值在肝脏、肌肉最低检测线以下时作为未检出处理。测定结果(见表7)显示停药0d肝脏和肌肉中的DOX残留量最高，停药3d残留量急剧下降，停药16d则检测不出。两种方法测定结果都能反映出DOX在动物组织中的残留量随时间的延长逐渐降低；相关性分析结果表明ELISA和HPLC方法对于实际样品猪肝脏和肌肉中DOX的检出量具有较好的相关性，相关系数分别为R²＝0.999，符合残留酶联免疫分析要求。本发明ELISA试剂盒具有高的灵敏度，可用于定量检测动物性食品中的DOX残留。 

表7本发明试剂盒与HPLC检测注射用药后各组织中的DOX残留量比较 

注：(“ND”为未检出药物)。 

Claims (3)

1.一种多西环素药物残留的ELISA检测方法，包括制备免疫原、包被原、抗体、酶标板和样品前处理，还包括制备试剂盒中的包被液，浓缩洗涤液，封闭液，底物缓冲液，底物A储存液，底物B储存液，底物显色液，终止液和样品稀释液，其具体步骤如下：

(1)将半抗原多西环素用对氨基苯甲酸作连接臂，再与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；

(2)将半抗原多西环素采用赫夫曼消除反应后，再与鸡卵清白蛋白偶联得到包被原；

(3)将步骤(1)合成的多西环素免疫原免疫得到特异性兔多克隆抗体；

(4)将步骤(2)合成的多西环素包被原包被所述的酶标板；

(5)制备包被液，浓缩洗涤液，样品稀释液，封闭液，底物缓冲液，底物A储存液，底物B储存液，底物显色液和终止液；

(6)将待检可食性动物组织进行处理，用0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液稀释处理得到待测样品；

(7)对步骤(6)待测样品进行ELISA测定；

其中：

步骤步骤(1)所述的免疫原的制备方法如下：

称取对氨基苯甲酸27.4mg溶于4mL1mol/L的HCl中，在冰水浴中，边搅拌边逐滴加入现配的1mol/L NaNO₂ 0.4mL，4℃避光反应10min，边反应边搅拌；取少量与苯胺反应，若反应体系变成深黄色，表明重氮化反应成功，得溶液A，备用；称取多西环素0.088g，溶解在3mL三蒸水中，制成多西环素溶液，将溶液A逐滴加入多西环素溶液中，调节pH8-9，磁力搅拌反应2h，离心取上清液，加入三丁胺6.8μL到离心上清液中，混合后再加氯甲酸异丁酯3.8μL，于4℃磁力搅拌反应25min，得溶液B；称取340mg牛血清白蛋白先溶于5mL磷酸盐缓冲液(PBS)，在冰水浴且磁力搅拌下加入5mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，得溶液C；在磁力搅拌下将溶液B加入到溶液C中，置4℃冰箱反应过夜，离心去沉淀，取上清液用0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析3天，冻干，于-20℃保存，备用；

步骤(3)所述的特异性兔多克隆抗体的制备方法如下：

用步骤(1)所述的免疫原免疫新西兰大白兔，基础免疫时是将步骤(1)所述的免疫原用灭菌的PBS缓冲液溶解稀释，加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，采用颈背部多点皮下注射；再用前述方法进行加强免疫，其佐剂为不完全佐剂；从第3次加强免疫开始，免疫后第8d，耳静脉采血，测定抗体效价和特异性后，再采血，分离抗血清，经饱和硫酸铵分级沉淀得到纯化后的抗多西环素多克隆抗体；

步骤(5)所述的包被液，浓缩洗涤液，样品稀释液，封闭液，底物缓冲液，底物A储存液，底物B储存液，底物显色液和终止液的组分及其配比如下：

包被液：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加蒸馏水定容至1000mL；

浓缩洗涤液：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂0，0.2g KH₂PO₄，0.5mL吐温-20，加蒸馏水至100mL；

封闭液：鸡卵清白蛋白1g，将该鸡卵清白蛋白溶于100mL pH7.4磷酸缓冲液中；

底物缓冲液：4.91g柠檬酸·H₂O，19.38g Na₂HPO₄·12H₂O，加三蒸水至1000mL；

底物A储存液：100mg四甲基联苯胺，50mL无水乙醇；

底物B储存液：75mg过氧化氢脲，10mL三蒸水；

底物显色液：在体积为10mL的底物显色液中含有9.5mL底物缓冲液，32μL底物B储存液，0.5mL底物A储存液；

终止液：2mol/L H₂SO₄溶液，和

样品稀释液：0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液。

2.一种多西环素药物残留的ELISA检测试剂盒，其包括：盒体，设在盒体内的酶标板，多西环素标准品，抗多西环素抗体，浓缩洗涤液，浓缩样品稀释液，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体，底物缓冲液，底物A储存液，底物B储存液和终止液；

其中：

所述的酶标板上包被有包被原多西环素-卵清蛋白偶联物(DOX-OVA)，其制备方法如下：

准确称取多西环素0.088g溶解在3mL超纯水中，然后将4mL溴水碱液加入多西环素溶液中，加热反应2h，4℃预冷；在4℃避光条件下向上述反应体系中缓慢滴加1mol/L的盐酸0.6mL，调pH至2，在冰水浴中，边搅拌边逐滴加入现配的1mol/L NaNO₂ 0.3mL，加完后置于4℃冰箱阴暗处孵育6h；按照20∶1摩尔比，将220mg鸡卵清白蛋白溶于5M1PBS，将偶氮化DOX慢慢滴入OVA溶液中，加完后在4℃冰箱阴暗处孵育过夜；离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用；

抗多西环素抗体的制备方法如下：

用权利要求1步骤(1)所述的免疫原免疫新西兰大白兔，基础免疫时是将权利要求1步骤(1)所述的免疫原用灭菌的PBS溶液溶解稀释，加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，采用颈背部多点皮下注射；再用前述方法进行加强免疫，其佐剂为不完全佐剂；从第3次加强免疫开始，免疫后第8d，耳静脉采血测定抗体效价和特异性，采血，分离抗血清，经饱和硫酸铵分级沉淀得到纯化后的抗多西环素多克隆抗体；

所述的多西环素标准品的浓度分别为0μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L和80μg/L；

所述的浓缩洗涤液，浓缩样品稀释液，底物缓冲液，底物A储存液，底物B储存液和终止液的组分及其配比如下：

浓缩洗涤液：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，0.5mL吐温-20，加蒸馏水至100mL；

浓缩样品稀释液：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，加蒸馏水至100mL；

底物缓冲液：4.91g柠檬酸·H₂O，19.38g Na₂HPO₄·12H₂O，加三蒸水至1000mL；

底物A储存液：100mg四甲基联苯胺，50mL无水乙醇；

底物B储存液：75mg过氧化氢脲，10mL三蒸水；和

终止液：2mol/L H₂SO₄溶液。

3.权利要求2所述的试剂盒在多西环素残留ELISA检测中的应用。

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