CN103698532A - 包被免疫球蛋白（IgG）酶标条的保存处理方法 - Google Patents

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Abstract

一种包被免疫球蛋白（IgG）酶标条的保存处理方法，其步骤如下：处理液制备：取0.01moL/LpH7.2磷酸盐缓冲溶液1L，加热至沸腾并保持3分钟；然后冷却至室温；然后依次加入牛血清蛋白10～40g、卵清蛋白（OVA）10～40g，搅拌混合均匀；再加入叠氮钠0.010～0.040g、硫柳汞钠盐0.1～0.60g，搅拌混合均匀，即制得处理液处理包被有免疫球蛋白IgG的酶标条。经处理液处理的酶标条，其制备成本低，且保存期限长。

Description

包被免疫球蛋白(IgG)酶标条的保存处理方法
技术领域
本发明涉及农药免疫检测技术，尤其是应用于食品检测领域中，对于农药残留成分检测。在通过酶联免疫检测农药残留时，酶联免疫检测时的包被免疫球蛋白（IgG）酶标条需要保持活性。本发明具体涉及的是包被免疫球蛋白酶标条的保存处理方法。 
背景技术
ELISA检测技术是近几十年发展起来的新技术，其核心是抗原抗体结合反应。在直接竞争法酶联免疫吸附测定（ELISA，Enzyme-linked immunosorbent assay）过程中，需要将特异性抗体（IgG,Immunoglobulin，免疫球蛋白）包被在酶标条上，然后进行相关的实验。由于免疫球蛋白属于活性蛋白，包被在酶标条上后如果不进行适当的技术处理，很快就会因为细菌等污染而变质，失去活性，导致酶标条失效。目前，生产包被免疫球蛋白的酶联免疫试剂盒的公司在试剂盒组分上大都申请专利公开技术进行保护，但是对于酶标条的保存处理技术，作为核心技术，在文献中都没有公开。 
申请人作为出入境检验单位，需要经常对各种食品的农药残留进行检测。目前采用农药免疫检测技术进行检测。首先要将农药分子与载体蛋白质连接起来，人工合成农药-载体蛋白质结合物免疫原，然后以此免疫动物制备特异性抗血清。在直接竞争ELISA法的实验中，要将特异性抗血清的IgG分离出来并人工合成酶标半抗原，进而建立免疫学检测方法。农药免疫学检测方法与传统的农药分析方法相比，具有不需要复杂昂贵的仪器设备，操作简便，样品前处理简单，检测快速，检测容量大，成本低廉等特点，因此具有潜在的广泛的应用价值。目前农药免疫检测技术中酶联免疫吸附检测技术已经被广泛应用于食品中农药残留检测。由于经常需要应用到包被免疫球蛋白的酶标条，由于外购成本高昂，因此需要自制，但是自制的酶标条如果当下不使用，则无法保存，因此在每次检验测试前都需制备酶标条，造成检测时间比较长。因此如何保持自制的酶标条的长期内保持活性，成了难题。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种包被免疫球蛋白IgG的酶标条的保存处理方法，该保存处理方法简单，能够保证自制的酶标条活性达4个月之久。 
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是一种包被免疫球蛋白（IgG）酶标条的保存处理方法，其步骤如下：1）处理液制备：取0.01moL/L pH7.2磷酸盐缓冲溶液1L，加热至沸腾并保持3分钟；然后冷却至室温；然后依次加入牛血清蛋白10～40g、卵清蛋白 （OVA）10～40g，搅拌混合均匀；再加入叠氮钠0.010～0.040g、硫柳汞钠盐0.1～0.60g，搅拌混合均匀，即制得处理液备用； 
2)利用步骤2）制备的所述处理液处理包被有特异性抗体免疫球蛋白IgG的酶标条，在所述酶标条每孔中加入所述处理液400μL，于37℃条件下水浴1h；将所述酶标条甩干，拍干残余的水分；装进铝箔袋充入氮气在4℃保存。 
所述酶标条制备方法为，首先将免疫球蛋白IgG50ul用PH9.1碳酸盐缓冲液按照1:100稀释比进行稀释获得免疫球蛋白IgG稀释使用液；在酶标条每孔中加入100ul包被缓冲液，然后用免疫球蛋白IgG稀释使用液从酶标条第1孔开始横向倍比稀释，5℃包被过夜，次日倒掉包被缓冲液，每孔加250ul磷酸盐缓冲溶液0.01moL/L pH7.2洗涤三次，每次间隔三分钟，制得所述酶标条。碳酸盐缓冲液配制：0.10.1mol/L的碳酸钠1.1mL,加入8.9mL0.1mol/L碳酸钠中，混合后加水定容至100mL。 
本发明的包被有免疫球蛋白IgG的酶标条通过处理液处理进行保存，通过实验测试可知，处理过的酶标条在2～8℃条件下至少可以保存4个月之久。本发明的处理液处理的酶标条，通常用于进行食品中农药残留检测。 
对于经本发明的处理液处理过的包被免疫球蛋白IgG的酶标条的活性检测应用的ELISA直接竞争法。其检测原理，以农药甲霜灵的检测为例。首先制备甲霜灵免疫原，然后进行动物免疫制备特异性抗体免疫球蛋白IgG，然后进行在在酶标条上包被免疫球蛋白IgG，在包被的酶标条中加入待测标本和酶标记的半抗原中进行竞争反应结合，加入酶底物显色液、终止液，利用酶标仪读取吸光光度值，根据标准曲线进行定量。进行处理过的酶标条活性测试时，将待测标本替换为浓度已知的甲霜灵抗原标本，与测试结果的浓度对比可知酶标条的活性保持程度。 
具体实施方式
现结合实例对本发明的包被免疫球蛋白IgG的酶标条保存处理方法进行具体说明。本发明涉及的试剂均为分析纯。 
特异性抗体免疫球蛋白IgG制备为本领域公知技术。通过免疫原（完全抗原）对动物进行免疫得到特异性抗血清，通过血清分离提纯获得特异性抗体免疫球蛋白IgG，并在-20℃下保存用于后续试验试用。在本实施例中以农药甲霜灵为例。甲霜灵由于是小分子，其需要和载体蛋白结合成为免疫原，载体蛋白一般选择牛血清蛋白或卵清蛋白。利用制备的免疫原对家兔免疫，免疫四次，持续时间约4个月，获得特异性血清，对特异性血清分离，获得甲霜灵多克隆抗体，即特异性抗体免疫球蛋白IgG，于-20℃下保存。 
由于本发明对包被有免疫球蛋白IgG的酶标条保存处理方法，因此，首先需要制备免疫球蛋白IgG酶标条的包被，在本实施例中酶标条。 
首先取-20℃保存的免疫球蛋白IgG50μL，加入PH9.1碳酸盐缓冲液450μL，稀释成1∶10的储备液，然后再用碳酸盐缓冲液稀释至1∶100的使用液。在酶标条每孔中加入100μL碳酸盐缓冲液，然后用1∶100免疫球蛋白IgG的使用液在酶标条上从第1孔开始横向倍比稀释，共8个稀释度，每孔100μL，5℃包被过夜。次日用0.01moL/L pH7.2的PBS溶液，即磷酸盐缓冲液进行清洗，清洗3次，每次每孔加250μL，每次间隔3分钟，清洗完毕后等待进一步技术处理。碳酸盐缓冲液配制：0.10.1mol/L的碳酸钠1.1mL,加入8.9mL0.1mol/L碳酸钠中，混合后加水定容至100mL。 
制备处理液：取0.01moL/L pH7.2的PBS溶液1L，在电加热板上加热至沸腾，并保持3分钟。盖上无菌的表面皿冷却至室温。依次加入牛血清蛋白（BSA）10～40g、卵清蛋白（OVA）10～40g，盖上无菌的表面皿，然后在磁力搅拌器上搅拌10分钟。然后再加入叠氮钠0.010～0.040g、硫柳汞钠0.1～0.60g，搅拌10分钟，备用。 
向上述包被有免疫球蛋白IgG的酶标条每孔中加入制备的处理液400μL，于37℃烘箱中水浴1h。将酶标条甩干，并将其在预先灭菌过的卷纸上拍干残余的水分。装进铝箔袋充入一定量的氮气4℃保存。 
处理液制备中，维持无菌的环境很重要，首要对磷酸盐缓冲液进行灭菌，在处理液中加入牛血清蛋白及卵清蛋白，可以封闭酶标条上包被的免疫球蛋白IgG的自由基，同时利用叠氮钠和硫柳汞钠盐作为防腐剂进行进一步处理。 
经处理液处理的包被有免疫球蛋白IgG酶标条的活性检测实例 
为了保持实验的准确性，采用的酶标半抗原为-20℃甘油保存确保它的原始活性，而且有关酶标条的综合实验都采用直接竞争ELISA法，标记酶为辣根过氧化物酶，底物溶液为商用的TMB商用的TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）,终止液为2moL/L硫酸，测定其活性变化。 
经处理液处理的免疫球蛋白IgG包被的酶标条在37℃时的保存期限 
免疫球蛋白IgG包被过的酶标条必须经过处理液适当的处理，才能在2-8℃条件下放置4个月左右。不经过处理的酶标条在37℃的环境中不超过24小时就会丧失全部的活性。大量的实验表明，处理后的酶标条在37℃的环境中72小时后，仍然能保持良好的活性。实验结果见表一。表一为经处理液处理的包被免疫球蛋白IgG的酶标条在37℃条件下保存期限测试的吸光光度值。检测标准品为8瓶甲霜灵系列浓度标准溶液，标准溶液甲霜灵浓度为25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.7812ng/ml、0.3906ng/ml、 0ng/ml。 
表一 
Figure DEST_PATH_GDA0000454583560000041
由表一可知，经处理液处理的酶标条活性在37℃的环境中72小时其吸光光度值为0.76，和刚处理制备好的酶标条的活性相比较，仍旧保持69%活性。 
经处理液处理的免疫球蛋白IgG包被的酶标条在30℃时的保存期限 
处理后的酶标条在30℃的环境中活性测试，测试条件除了环境温度外，其他与37℃时的测试方法相同。见表二。表二为为经处理液处理的包被免疫球蛋白IgG的酶标条在30℃条件下保存期限的吸光光度值。 
表二 
Figure DEST_PATH_GDA0000454583560000051
由表二可知，经处理液处理的酶标条活性在30℃的环境中保存10天，其吸光光度值为0.81，和刚处理制备好的酶标条的在30℃条件下的活性相比较，仍旧保持84.38%活性。 
包被的酶标条在不同温度变化下的保存实验 
试剂盒的包装性能不能充分满足低温运输的要求，在运输途中出现了短时间的温度升高，就有可能对试剂盒的使用效果造成危害。本实施例模拟在温度不断变化的情况下，酶标条的活性变化。具体操作如下：包被好的酶标条先测定一下活性，然后再放到不同的温度环境中测定其变化，其中25℃96小时至30℃48小时至8℃90天。参看表三。 
表三为包被免疫球蛋白IgG的酶标条在不同温度变化下的保存实验的吸光光度值数据。 
Figure DEST_PATH_GDA0000454583560000061
由表三数据可知，温度从25℃96小时到30℃48小时再到8℃90天的温度变化期间，酶标条依然保持有良好的活性。 
由以上试验数据可知，通过本发明的制定的处理液对包被有免疫球蛋白IgG的酶标条进行处理，酶标条的活性有了显著的提高，在4℃条件下充一定量氮气在密封铝塑袋中保存至少可以保存4个月以上，而不丧失活性。通过本发明的处理液处理的酶标条不仅可以长期保存，且制备的成本低廉，可以满足一般检测机构、实验室自制酶标条需求。 

Claims (2)

1.一种包被免疫球蛋白（IgG）酶标条的保存处理方法，其步骤如下：1）处理液制备：取0.01moL/L pH7.2磷酸盐缓冲溶液1 L，加热至沸腾并保持3分钟；然后冷却至室温；然后依次加入牛血清蛋白10～40g、卵清蛋白（OVA）10～40g ，搅拌混合均匀；再加入叠氮钠0.010～0.040 g、硫柳汞钠盐0.1～0.60 g，搅拌混合均匀，即制得处理液备用；
2) 利用步骤2）制备的所述处理液处理包被有特异性抗体免疫球蛋白IgG的酶标条，在所述酶标条每孔中加入所述处理液400μL，于37℃条件下水浴1 h；将所述酶标条甩干，拍干残余的水分；装进铝箔袋充入氮气在4℃保存。
2.根据权利要求1所述的包被免疫球蛋白（IgG）酶标条的保存处理方法，其特征在于所述酶标条制备方法为，首先将免疫球蛋白IgG50ul用PH9.1碳酸盐缓冲液按照1:100稀释比进行稀释获得免疫球蛋白IgG稀释使用液；在酶标条每孔中加入100ul包被缓冲液，然后用免疫球蛋白IgG稀释使用液从酶标条第1孔开始横向倍比稀释， 5OC包被过夜，次日倒掉包被缓冲液，每孔加250ul磷酸盐缓冲溶液0.01moL/L pH7.2洗涤三次，每次间隔三分钟，制得所述酶标条。
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