CN111848507A - 一种异烟肼衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异烟肼的衍生物、检测试剂及制备方法，涉及生物检测技术领域。利用该异烟肼衍生物制备的异烟肼免疫原，免疫原性高，得到的抗体特异性强、效价高；利用该衍生物制备得到的均相酶免疫检测试剂中异烟肼酶标偶联物连接了经基因工程改造过的重组葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶，显著提高了检测灵敏度，可有效检测浓度低至5ng/ml以下的样本，且特异性强，与常见的62种其它药物无交叉反应；可实现在全自动生化分析仪上对异烟肼含量的高通量、快速化检测，检测结果稳定，准确度高，检测方法简单，易于实现和推广使用。

Description

一种异烟肼衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种异烟肼衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法。
背景技术
异烟肼(isoniazid，4-Pyridinecarboxylicacid hydrazide)，化学名4-吡啶甲酰肼，商品名雷米封，其化学结构式如式（Ⅳ）所示：
Figure 532250DEST_PATH_IMAGE001
式（Ⅳ）。
异烟肼是用于治疗结核病的一线药物，异烟肼作为治疗结核病药物的作用机理主要是通过与结核菌的菌体辅酶结合，阻止其相应酶的催化作用，从而达到结核菌菌壁分枝菌酸不能顺利合成的目的，妨碍结核病病菌的生长繁殖。异烟肼对结核分枝杆菌有高度选择性，抗菌作用强，在试管内0.025～0.05mg/L的浓度均可抑菌，较高浓度（10mg/L）对繁殖期细菌有杀菌作用；对静止期的结核杆菌，提高药物浓度或延长接触时间也有杀菌作用，对细胞内外的结核杆菌具有同等的杀灭作用。异烟肼单用易产生耐药性，联合用药可延缓耐药性产生，并增强疗效，异烟肼与其他抗结核药无交叉耐药性。异烟肼主要用于各型肺结核的进展期、溶解播散期、吸收好转期，还可用于结核性脑膜炎和其他各种类型的肺外结核病，如结核性脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎、淋巴、骨骼、肾脏、肠道结核等。异烟肼吸收快而完全，1～2h血药浓度达到峰值，广泛分布于全身体液和组织中，药物穿透力强，可渗入关节腔、胸水、腹水、脑脊液以及纤维化或干酪化的结核病灶中，也易透入细胞内作用于已被吞噬的结核杆菌。异烟肼主要在肝脏内代谢，由乙酰化酶乙酰化为乙酰异烟肼和异烟酸等，最后与少量原形药一同随尿液排出。
结核患者在使用异烟肼治疗过程中可能会引起诸多不良反应，这些副作用与异烟肼用量或长期应用有一定的关系。常见不良反应有：胃肠道症状（食欲不振、恶心、呕吐、腹痛、便秘等）、血液系统症状（贫血、白细胞减少、嗜酸细胞增多、血痰、咯血、鼻出血、眼底出血等）、肝损害、过敏（皮疹或其他）、内分泌失调（男子女性化乳房、泌乳、月经不调、阳痿等）、中枢症状（头痛、失眠、疲倦、记忆力减退、精神兴奋、易怒、欣快感、反射亢进、幻觉、抽搐、排尿困难、昏迷等）、周围神经炎（肌肉痉挛、四肢感觉异常、视神经炎、视神经萎缩等）等。因此，对结合患者异烟肼血药浓度进行监测在用药安全及个体化治疗方面都具有重要意义。
目前异烟肼的检测方法较多，常见的有容量法、紫外可见分光光度法、化学发光法、量子点荧光法、高效液相色谱法等。但是，这些检测方法的检测结果在准确度、稳定性等方面都存在一定问题，且操作复杂、耗时长，不能满足临床治疗药物监测对于高通量、快速化的要求。随着生物检测技术的不断发展，异烟肼的检测方法也在逐渐改进。因此，针对现有技术中存在的缺陷，研发一种质量达到临床要求，且具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、结果准确等优点，可应用于全自动生化分析仪的检测试剂已成为国内外治疗药物监测领域的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异烟肼衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法。该异烟肼均相酶免疫检测试剂具有灵敏度高、稳定性好、特异性强、结果准确等优点，可实现大批量样品全自动快速检测，克服了现有技术存在的缺陷。
本发明一方面提供了一种异烟肼衍生物，所述的异烟肼衍生物的结构式如式（Ⅰ）所示：
Figure 224262DEST_PATH_IMAGE002
式（Ⅰ），
式中X1为-CO-(CH2)n-COOH，其中n为1至20之间的任意整数，优选地，所述X1为-CO-(CH2)2-COOH。
本发明还提供了一种上述异烟肼衍生物的制备方法，由化合物1与能够引入连接基团X1的化合物X1-A反应得到，包括以下步骤：
Figure 349824DEST_PATH_IMAGE003
，
将化合物1溶解于甲苯中，再加入化合物X1-A制成反应混合物溶液，将反应混合物溶液回流搅拌过夜，然后对反应混合物进行浓缩，最后使用快速色谱纯化，得到式（Ⅰ）所示的异烟肼衍生物，所述化合物X1-A为能够引入连接基团X1的相应有机酸或有机酸酐。
优选地，上述异烟肼衍生物的制备方法，包括以下步骤：
Figure 810892DEST_PATH_IMAGE004
将2 g化合物1溶解于100 ml甲苯中，再加入1.4 g琥珀酸酐制成反应混合物溶液，将反应混合物溶液回流搅拌过夜，然后对反应混合物进行浓缩，最后使用快速色谱纯化得到异烟肼衍生物。
本发明还提供了一种异烟肼均相酶免疫检测试剂，所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂包括R1试剂和R2试剂；
所述的R1试剂包括抗异烟肼特异性抗体和均相酶底物溶液；
所述的R2试剂包括异烟肼酶标偶联物和R2缓冲液；
所述的抗异烟肼特异性抗体是由异烟肼免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体；
所述的实验动物是哺乳动物；优选地，所述的哺乳动物是兔子、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、豚鼠、驴、马或骆驼中的一种；更优选地，所述的哺乳动物是兔子。
所述的异烟肼免疫原是由式（Ⅰ）所示的异烟肼衍生物与载体连接得到的化合物，其结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 116103DEST_PATH_IMAGE005
式（Ⅱ）；
式中X2为-CO-(CH2)n-CO-，其中n为1至20之间的任意整数，优选地，所述X2为-CO-(CH2)2-CO-；
所述的载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；
优选地，所述的具有免疫原性的蛋白质或多肽为血清蛋白、卵清蛋白、丙种球蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种；更优选地，所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为牛血清白蛋白。
所述的均相酶底物溶液是由葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂配制得到；
所述的异烟肼酶标偶联物是由式（Ⅰ）所示的异烟肼衍生物与重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如式（Ⅲ）所示：
Figure 731629DEST_PATH_IMAGE006
式（Ⅲ）；
式中X2为-CO-(CH2)n-CO-，其中n为1至20之间的任意整数，优选地，所述X2为-CO-(CH2)2-CO-；
式中sG6PDH为重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，所述重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
所述R2缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂配制得到。
优选地，所述的异烟肼免疫原的制备方法包括以下步骤：
（A1）载体溶液的制备：将载体溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体溶液；
（A2）异烟肼衍生物溶液的制备：将上述的异烟肼衍生物、二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到异烟肼衍生物溶液；
（A3）异烟肼免疫原的合成：将步骤（A2）得到的异烟肼衍生物溶液加入到步骤（A1）得到的载体溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到异烟肼免疫原。
具体地，所述的异烟肼免疫原的制备方法包括以下步骤：
（A1）载体溶液的制备：将载体蛋白溶解于0.2M的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，载体蛋白的终浓度为3-5mg/mL，得到载体溶液；
（A2）异烟肼衍生物溶液的制备：将100-300mg上述的异烟肼衍生物、2-6mL二甲基甲酰胺、2-6mL乙醇、3-10mL的磷酸钾缓冲液（10mM，pH=5.0）、100-300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、20-80mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应30-120min，得到异烟肼衍生物溶液；
（A3）异烟肼免疫原的合成：将步骤（A2）得到的异烟肼衍生物溶液加入到步骤（A1）得到的载体溶液中，并在0-8℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到异烟肼免疫原。
优选地，所述的抗异烟肼特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（B1）将上述的异烟肼免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对上述的实验动物进行多点注射；
（B2）3-6周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；
（B3）对步骤（B2）完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗异烟肼特异性抗体。
具体地，所述的抗异烟肼特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（B1）将上述的异烟肼免疫原用0.01M磷酸钠缓冲液（pH=6.0）稀释至终浓度为1.0-3.0mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（B2）4周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔4周注射一次，共计注射5-8次；
（B3）对步骤（B2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗异烟肼特异性抗体。
优选地，所述的异烟肼酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：
（C1）重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2和NaCl混合溶解于Tris缓冲液中，再加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸、卡必醇和二甲基亚砜，搅拌溶解，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（C2）异烟肼衍生物溶液的制备：将上述的异烟肼衍生物溶解于二甲基甲酰胺中，降温至-10℃以下，加入三丁胺和氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到异烟肼衍生物溶液；
（C3）异烟肼酶标偶联物的合成：将步骤（C2）得到的异烟肼衍生物溶液逐滴加入到步骤（C1）得到的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，搅拌反应，经凝胶层析柱纯化，得到异烟肼酶标偶联物。
具体地，所述的异烟肼酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：
（C1）重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将5-20mg的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、5-15mg MgCl2和50-150mg NaCl混合溶解于5-20mL Tris缓冲液（1M，pH=6.8）中；再加入100-400mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、50-250mg葡萄糖-6-磷酸、0.3-1.5mL卡必醇和1-3mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（C2）异烟肼衍生物溶液的制备：将5-15mg上述的异烟肼衍生物溶解于300-900µL二甲基甲酰胺中，降温至-18℃，加入1.5-4.5µL三丁胺和1-3µL氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到异烟肼衍生物溶液；
（C3）异烟肼衍生物溶液的制备：将步骤（C2）得到的异烟肼衍生物溶液逐滴加入到步骤（C1）得到的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，2-8℃搅拌反应过夜，经凝胶层析柱纯化，得到异烟肼酶标偶联物。
本发明另一方面提供了一种上述的异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（D1）均相酶底物溶液的制备：将葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂溶解于纯化水中，制得均相酶底物溶液；
（D2）R1试剂的制备：将上述的抗异烟肼特异性抗体与步骤（D1）得到的均相酶底物溶液混合均匀，得到R1试剂，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:50-5000；
（D3）R2缓冲液的制备：将三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂溶解于纯化水中，制得R2缓冲液；
（D4）R2试剂的制备：将上述的异烟肼酶标偶联物溶解于R2缓冲液中，得到R2试剂，所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:50-5000。
优选地，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:800；所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:1200。
具体地，所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（D1）均相酶底物溶液的制备：将2-8g葡萄糖-6-磷酸、5-15g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、10-80mg三羟甲基氨基甲烷、0.5-2.5g氯化钠、0.5-2.5g氯化镁、50-300mg牛血清白蛋白与10-50mg防腐剂溶解于1-3L纯化水中，调节pH至8.5，制得均相酶底物溶液；
（D2）R1试剂的制备：将上述的抗异烟肼特异性抗体与步骤（D1）得到的均相酶底物溶液混合均匀，得到R1试剂，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:800；
（D3）R2缓冲液的制备：将10-80mg三羟甲基氨基甲烷、0.5-2.5g氯化钠、0.5-2.5g氯化镁、50-300mg牛血清白蛋白与10-50mg防腐剂溶解于1-3L纯化水中，调节pH至8.0，制得R2缓冲液；
（D4）R2试剂的制备：将上述的异烟肼酶标偶联物溶解于步骤（D3）得到的R2缓冲液中，得到R2试剂，所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:1200。
本发明的有益效果为：提供了一种异烟肼衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法。由该衍生物制备得到的抗体特异性强、效价高，利用该衍生物制备得到的均相酶免疫检测试剂中的异烟肼酶标偶联物连接了经基因编辑技术改造过的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（sG6PDH），显著提高了检测灵敏度，可有效检测浓度低至5ng/ml以下的样本；可实现在全自动生化分析仪上对异烟肼含量的高通量、快速化检测，检测的稳定性好、准确度高、特异性强，与62种常见药物无交叉反应，检测效率显著提高，检测方法简单，易于实现和推广使用。
附图说明
图1是本发明的实施例12中异烟肼均相酶免疫检测的标准曲线。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1：异烟肼衍生物的合成
异烟肼衍生物的合成路径如下：
Figure 944436DEST_PATH_IMAGE003
。
异烟肼衍生物的制备方法，具体步骤如下：
将2 g化合物1溶解于100 ml甲苯中，再加入1.4 g琥珀酸酐制成反应混合物溶液，将反应混合物溶液回流搅拌过夜，然后对反应混合物进行浓缩，最后使用快速色谱纯化得到0.9g固体异烟肼衍生物。
通过的1H NMR（Varian mercury plus 400 MHz）光谱扫描分析（TMS作为内标）与LC-MS（Agilent 1200A）进行衍生物结构鉴定，结果表明：该异烟肼衍生物即为结构式如式（Ⅴ）所示的异烟肼衍生物。
Figure 964738DEST_PATH_IMAGE007
式（Ⅴ）。
实施例2：异烟肼免疫原的制备
异烟肼免疫原的制备方法包括以下步骤：
（A1）载体溶液的制备：将载体蛋白溶解于0.2M的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，载体蛋白的终浓度为4mg/mL，得到载体溶液；
（A2）异烟肼衍生物溶液的制备：将200mg上述的异烟肼衍生物、4mL二甲基甲酰胺、4mL乙醇、5mL的磷酸钾缓冲液（10mM，pH=5.0）、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应90min，得到异烟肼衍生物溶液；
（A3）异烟肼免疫原的合成：将步骤（A2）得到的异烟肼衍生物溶液加入到步骤（A1）得到的载体溶液中，并在4℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到异烟肼免疫原。
实施例3：异烟肼免疫原的制备
异烟肼免疫原的制备方法包括以下步骤：
（A1）载体溶液的制备：将载体蛋白溶解于0.2M的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，载体蛋白的终浓度为3mg/mL，得到载体溶液；
（A2）异烟肼衍生物溶液的制备：将100mg上述的异烟肼衍生物、2mL二甲基甲酰胺、2mL乙醇、3mL的磷酸钾缓冲液（10mM，pH=5.0）、100mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、20mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应30min，得到异烟肼衍生物溶液；
（A3）异烟肼免疫原的合成：将步骤（A2）得到的异烟肼衍生物溶液加入到步骤（A1）得到的载体溶液中，并在0℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到异烟肼免疫原。
实施例4：异烟肼免疫原的制备
异烟肼免疫原的制备方法包括以下步骤：
（A1）载体溶液的制备：将载体蛋白溶解于0.2M的磷酸钾缓冲液（pH=8.5）中，载体蛋白的终浓度为5mg/mL，得到载体溶液；
（A2）异烟肼衍生物溶液的制备：将300mg上述的异烟肼衍生物、6mL二甲基甲酰胺、6mL乙醇、10mL的磷酸钾缓冲液（10mM，pH=5.0）、300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、80mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应120min，得到异烟肼衍生物溶液；
（A3）异烟肼免疫原的合成：将步骤（A2）得到的异烟肼衍生物溶液加入到步骤（A1）得到的载体溶液中，并在8℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到异烟肼免疫原。
实施例5：抗异烟肼特异性抗体的制备
抗异烟肼特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（B1）将上述的异烟肼免疫原用0.01M磷酸钠缓冲液（pH=6.0）稀释至终浓度为2.0mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（B2）4周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔4周注射一次，共计注射6次；
（B3）对步骤（B2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗异烟肼特异性抗体。
实施例6：抗异烟肼特异性抗体的制备
抗异烟肼特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（B1）将上述的异烟肼免疫原用0.01M磷酸钠缓冲液（pH=6.0）稀释至终浓度为1.0mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（B2）4周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔4周注射一次，共计注射5次；
（B3）对步骤（B2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗异烟肼特异性抗体。
实施例7：抗异烟肼特异性抗体的制备
抗异烟肼特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（B1）将上述的异烟肼免疫原用0.01M磷酸钠缓冲液（pH=6.0）稀释至终浓度为3.0mg/mL，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；
（B2）4周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔4周注射一次，共计注射8次；
（B3）对步骤（B2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗异烟肼特异性抗体。
实施例8：异烟肼酶标偶联物的制备
异烟肼酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：
（C1）重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将12mg的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、10mg MgCl2和100mg NaCl混合溶解于12mL Tris缓冲液（1M，pH=6.8）中；再加入250mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、150mg葡萄糖-6-磷酸、0.8mL卡必醇和2mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（C2）异烟肼衍生物溶液的制备：将10mg上述的异烟肼衍生物溶解于600µL二甲基甲酰胺中，降温至-18℃，加入3.0µL三丁胺和2µL氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到异烟肼衍生物溶液；
（C3）异烟肼衍生物溶液的制备：将步骤（C2）得到的异烟肼衍生物溶液逐滴加入到步骤（C1）得到的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，4℃搅拌反应过夜，经凝胶层析柱纯化，得到异烟肼酶标偶联物。
实施例9：异烟肼酶标偶联物的制备
异烟肼酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：
（C1）重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将5mg的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、5mgMgCl2和50mg NaCl混合溶解于5mL Tris缓冲液（1M，pH=6.8）中；再加入100mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、50mg葡萄糖-6-磷酸、0.3mL卡必醇和1mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（C2）异烟肼衍生物溶液的制备：将5mg上述的异烟肼衍生物溶解于300µL二甲基甲酰胺中，降温至-18℃，加入1.5µL三丁胺和1µL氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到异烟肼衍生物溶液；
（C3）异烟肼衍生物溶液的制备：将步骤（C2）得到的异烟肼衍生物溶液逐滴加入到步骤（C1）得到的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，2℃搅拌反应过夜，经凝胶层析柱纯化，得到异烟肼酶标偶联物。
实施例10：异烟肼酶标偶联物的制备
异烟肼酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：
（C1）重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将20mg的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、15mg MgCl2和150mg NaCl混合溶解于20mL Tris缓冲液（1M，pH=6.8）中；再加入400mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、250mg葡萄糖-6-磷酸、1.5mL卡必醇和3mL二甲基亚砜，搅拌溶解，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（C2）异烟肼衍生物溶液的制备：将15mg上述的异烟肼衍生物溶解于900µL二甲基甲酰胺中，降温至-18℃，加入4.5µL三丁胺和3µL氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到异烟肼衍生物溶液；
（C3）异烟肼衍生物溶液的制备：将步骤（C2）得到的异烟肼衍生物溶液逐滴加入到步骤（C1）得到的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，8℃搅拌反应过夜，经凝胶层析柱纯化，得到异烟肼酶标偶联物。
实施例11：异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备
异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（D1）均相酶底物溶液的制备：将5g葡萄糖-6-磷酸、10g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、45mg三羟甲基氨基甲烷、1.5g氯化钠、1.5g氯化镁、150mg牛血清白蛋白与30mg防腐剂溶解于2L纯化水中，调节pH至8.5，制得均相酶底物溶液；
（D2）R1试剂的制备：将上述实施例5制备的抗异烟肼特异性抗体与步骤（D1）得到的均相酶底物溶液混合均匀，得到R1试剂，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:800；
（D3）R2缓冲液的制备：将45mg三羟甲基氨基甲烷、1.5g氯化钠、1.5g氯化镁、150mg牛血清白蛋白与30mg防腐剂溶解于2L纯化水中，调节pH至8.0，制得R2缓冲液；
（D4）R2试剂的制备：将上述实施例8制备的异烟肼酶标偶联物溶解于步骤（D3）得到的R2缓冲液中，得到R2试剂，所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:1200。
实施例12：异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备
异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（D1）均相酶底物溶液的制备：将2g葡萄糖-6-磷酸、5g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、10mg三羟甲基氨基甲烷、0.5g氯化钠、0.5g氯化镁、50mg牛血清白蛋白与10mg防腐剂溶解于1L纯化水中，调节pH至8.5，制得均相酶底物溶液；
（D2）R1试剂的制备：将上述实施例6制备的抗异烟肼特异性抗体与步骤（D1）得到的均相酶底物溶液混合均匀，得到R1试剂，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:50；
（D3）R2缓冲液的制备：将10mg三羟甲基氨基甲烷、0.5g氯化钠、0.5g氯化镁、50mg牛血清白蛋白与10mg防腐剂溶解于1L纯化水中，调节pH至8.0，制得R2缓冲液；
（D4）R2试剂的制备：将上述实施例9制备的异烟肼酶标偶联物溶解于步骤（D3）得到的R2缓冲液中，得到R2试剂，所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:50。
实施例13：异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备
异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
（D1）均相酶底物溶液的制备：将8g葡萄糖-6-磷酸、15g氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、80mg三羟甲基氨基甲烷、2.5g氯化钠、2.5g氯化镁、300mg牛血清白蛋白与50mg防腐剂溶解于3L纯化水中，调节pH至8.5，制得均相酶底物溶液；
（D2）R1试剂的制备：将上述实施例7制备的抗异烟肼特异性抗体与步骤（D1）得到的均相酶底物溶液混合均匀，得到R1试剂，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:5000；
（D3）R2缓冲液的制备：将80mg三羟甲基氨基甲烷、2.5g氯化钠、2.5g氯化镁、300mg牛血清白蛋白与50mg防腐剂溶解于3L纯化水中，调节pH至8.0，制得R2缓冲液；
（D4）R2试剂的制备：将上述实施例10制备的异烟肼酶标偶联物溶解于步骤（D3）得到的R2缓冲液中，得到R2试剂，所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:5000。
实施例14：尿液样本的异烟肼均相酶免疫检验
（1）建立异烟肼均相酶免疫检验标准曲线
按照表1设置迈瑞BS-480全自动生化分析仪反应参数。所用异烟肼均相酶免疫检测试剂为实施例11制备得到的检测试剂。先加入R1试剂，再加入标准品，最后加入R2试剂。加入R2试剂后，测定不同时间点的OD340吸光值，计算出不同标准品浓度时的反应速率，绘制成反应标准曲线，如图1所示。
表1：迈瑞 BS-480全自动生化分析仪反应参数
项目名称 异烟肼
R1试剂 160µL
R2试剂 40µL
样本量 10µL
分析方法 终点法
主波长 340nm
次波长 410nm
反应时间 10分钟
孵育时间 5分钟
反应方向 上升
结果 ng/ml
结果精度 0.01
定标方法 Polygonal
标准品浓度 0.00，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00 ng/ml
（2）待测样本检测：
待测样本是将异烟肼标准品溶解于健康人尿液中，调整至浓度分别为3.75 ng/ml、7.50ng/ml、15.00ng/ml。重复测定低、中、高浓度待测样本10次，根据图1所示的反应标准曲线，计算每个样本中异烟肼的含量，并计算精密度和回收率，回收率=（检测浓度平均值/样本浓度）×100%，结果如表2所示。
表2：样本测定及精密度和回收率评估
尿液样本 低值 中值 高值
样本浓度 (ng/ml) 3.75 7.50 15.00
Rep.1 3.68 7.42 14.95
Rep.2 3.95 7.05 14.65
Rep.3 3.74 7.56 14.75
Rep.4 3.65 7.62 14.38
Rep.5 3.85 7.34 15.91
Rep.6 3.42 7.52 15.66
Rep.7 3.65 7.62 15.87
Rep.8 3.51 7.49 15.44
Rep.9 3.55 7.58 14.95
Rep.10 3.71 7.38 14.99
平均值(ng/ml) 3.67 7.46 15.16
标准差（SD） 0.157 0.173 0.533
精密度（CV%） 4.27 2.32 3.52
回收率 % 97.9 99.5 101.1
检测结果：本发明的异烟肼均相酶免疫检测试剂测定异烟肼样本的精密度较高，CV均低于5%；准确度较高，回收率达到95%-105%。
另外，本发明还用实施例12、13制备的异烟肼均相酶免疫检测试剂进行了尿液样本的异烟肼均相酶免疫检验。结果表明：本发明其它实施例制备的检测试剂进行异烟肼样本测定的精密度均较高，CV均低于5%；准确度均较高，回收率均能达到95%-105%。
实施例15：常见其它药物交叉反应实验
选取62种常见其它药物进行交叉反应检测，将待测药物纯品溶解于健康人尿液中，调整待测药物浓度至10.00ng/ml，采用实施例14中的异烟肼均相酶免疫检测方法进行检测，根据图1所示的反应标准曲线得到相应药物的浓度。62种常见其它药物名称以及测定结果详见表3。
表3：常见药物交叉反应实验结果
序号 化合物名称 等价于异烟肼的浓度(ng/ml) 序号 化合物名称 等价于异烟肼的浓度(ng/ml)
1 阿司匹林 0.00 2 苯丙醇胺 0.00
3 β-苯基乙胺 0.00 4 普鲁卡因酰胺 0.00
5 安非他命 0.00 6 普鲁卡因 0.00
7 氨苄青霉素 0.00 8 奎尼丁 0.00
9 甲氨二氮卓 0.00 10 佐美酸 0.00
11 氯丙嗪 0.00 12 苯肾上腺素 0.00
13 氯拉卓酸 0.00 14 桂皮酰艾克宁 0.00
15 二甲苯氧庚酸 0.00 16 芽子碱 0.00
17 非诺洛芬 0.00 18 地西洋 0.00
19 甲基苯丙胺 0.00 20 可替宁 0.00
21 龙胆酸 0.00 22 阿替洛尔 0.00
22 吉非贝齐 0.00 24 心得安 0.00
25 氢可酮 0.00 26 苯乙哌啶酮 0.00
27 布洛芬 0.00 28 苯基丁氮酮 0.00
29 丙咪嗪 0.00 30 麦角酸二乙基酰胺 0.00
31 二氨基二苯砜 0.00 32 大麻酚 0.00
33 萘普生 0.00 34 洛哌丁胺 0.00
35 氢氯噻嗪 0.00 36 异克舒令 0.00
37 哌替啶 0.00 38 苯基丙氨酸 0.00
39 烯丙羟吗啡酮 0.00 40 盐酸氟西汀 0.00
41 麻黄素 0.00 42 柳丁氨醇 0.00
43 烟酰胺 0.00 44 青霉素 0.00
45 甲胺呋硫 0.00 46 甲基二乙醇胺 0.00
47 异戊巴比妥 0.00 48 二亚甲基双氧苯丙胺 0.00
49 甲撑二氧苯丙胺 0.00 50 琥珀酸多西拉敏 0.00
51 四氢大麻酚 0.00 52 纳布啡 0.00
53 制霉菌素 0.00 54 去甲吗啡 0.00
55 乙酰吗啡 0.00 56 羟考酮 0.00
57 苄非他明 0.00 58 克他命 0.00
59 异丙嗪 0.00 60 苯海拉明 0.00
61 阿司帕坦 0.00 62 苯丁胺 0.00
测定结果显示：上述62种常见其它药物等价于异烟肼的浓度均为0.00 ng/ml。由此可见，本发明提供的异烟肼均相酶免疫检验试剂的特异性强，与62种常见其它药物无任何交叉反应。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 湖南苏阳医疗科技有限公司
<120> 一种异烟肼衍生物、均相酶免疫检测试剂及制备方法
<130> 1
<140> 1
<141> 2020-07-22
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial)
<400> 1
Met Val Ile Pro Glu Asn Ser Ser Ile Val Ile Phe Gly Ala Ser Gly
1 5 10 15
Asp Leu Thr Tyr Arg Lys Leu Ile Pro Ala Leu Tyr His Leu Tyr Ala
20 25 30
Ser Gln Gln Leu Pro Lys Ser Phe Ala Ile Leu Gly Val Ser Arg Thr
35 40 45
Glu Tyr Ser Asp Glu Thr Tyr Arg Glu Cys Leu Lys Arg Ser Leu Gln
50 55 60
Glu Leu Glu Lys Thr Glu Pro Ala Ile Leu Asp Ala Phe Met Gln His
65 70 75 80
Val His Tyr Gln Ala Leu Asn Thr Ser Glu Val Ser Asp Tyr Gln His
85 90 95
Leu Ala Thr Arg Leu Asp Thr Leu Ala Ser Asp Tyr Gln Phe Glu Gln
100 105 110
Arg Asn Thr Leu Phe Tyr Leu Ala Thr Pro Pro Ser Leu Tyr Gly Val
115 120 125
Ile Pro Ala Cys Leu Ala Ala His Gly Leu Asn Asp Glu Ser Gln Gly
130 135 140
Trp Lys Arg Leu Ile Ile Glu Cys Pro Phe Gly Tyr Asp Leu Gln Ser
145 150 155 160
Ala Gln Asp Leu Asp Val Glu Ile His His His Phe Cys Glu His Gln
165 170 175
Ile Tyr Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Cys Glu Thr Val Gln Asn Leu
180 185 190
Leu Val Phe Arg Phe Ala Asn Gly Met Phe Glu Pro Leu Trp Ser Arg
195 200 205
Asn Phe Ile Asp Tyr Val Glu Ile Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Val
210 215 220
Glu Glu Arg Gly Gly Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Ala Val Arg Asp Met
225 230 235 240
Phe Gln Asn His Leu Leu Gln Val Leu Ala Met Val Gly Met Glu Pro
245 250 255
Pro Ala Ala Ile Asn Ala Asp Ser Ile Arg Asn Glu Val Asn Cys Val
260 265 270
Leu Gln Ser Leu Gln Pro Leu Ser Glu Ser Asp Leu Arg Asn Asn Leu
275 280 285
Val Leu Gly Gln Tyr Thr Glu Ser Glu Val Arg Gly Gln Phe Leu Pro
290 295 300
Ser Tyr Arg Asn Glu Pro Gly Val Ala Ala Asp Ser Arg Thr Glu Thr
305 310 315 320
Tyr Val Ala Leu Cys Met Phe Ile Asn Asn Trp Arg Trp Asn Gly Val
325 330 335
Pro Phe Tyr Val Arg Ser Gly Cys Arg Leu Pro Thr Arg Val Thr Glu
340 345 350
Val Val Ile His Phe Cys Arg Thr Pro His Pro Val Phe Gly Gln Asn
355 360 365
Ala Pro Glu Asn Lys Leu Ile Ile Arg Ile Gln Pro Asp Glu Gly Ile
370 375 380
Leu Met Ser Phe Gly Leu Cys Glu Pro Gly Ala Gly Phe Cys Ala Lys
385 390 395 400
Glu Val Ser Met Asn Phe His Tyr Ala Ser Leu Glu Gln Ile Cys Met
405 410 415
Leu Thr Ala Tyr Glu Arg Leu Leu Leu Asp Ala Leu Asn Gly Asp Ala
420 425 430
Thr Leu Phe Ala Arg Thr Asp Ala Val Glu Ala Lys Trp Cys Phe Val
435 440 445
Gln Pro Ile Leu Asp Phe Lys Gln Asp Pro Gln Ser Leu Tyr Gly Tyr
450 455 460
Ala Cys Gly Thr Trp Gly Pro Cys Glu Ser Asp Asp Leu Leu Arg Arg
465 470 475 480
Asp Gly Arg Glu Trp Arg Phe Pro Lys Cys Asn Leu Thr Asn Thr Asp
485 490 495
Tyr Lys Glu Leu
500

Claims (10)

1.一种异烟肼衍生物，其特征在于，所述的异烟肼衍生物的结构式如式（Ⅰ）所示：
Figure 316580DEST_PATH_IMAGE001
式（Ⅰ），
式中X1为-CO-(CH2)n-COOH，其中n为1至20之间的任意整数，优选地，所述X1为-CO-(CH2)2-COOH。
2.一种权利要求1所述的异烟肼衍生物的制备方法，其特征在于，由化合物1与能够引入连接基团X1的化合物X1-A反应得到，包括以下步骤：
Figure 458979DEST_PATH_IMAGE002
，
将化合物1溶解于甲苯中，再加入化合物X1-A制成反应混合物溶液，将反应混合物溶液回流搅拌过夜，然后对反应混合物进行浓缩，最后使用快速色谱纯化，得到式（Ⅰ）所示的异烟肼衍生物，所述化合物X1-A为能够引入连接基团X1的相应有机酸或有机酸酐。
3.一种异烟肼均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂包括R1试剂和R2试剂；
所述的R1试剂包括抗异烟肼特异性抗体和均相酶底物溶液；
所述的R2试剂包括异烟肼酶标偶联物和R2缓冲液；
所述的抗异烟肼特异性抗体是由异烟肼免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体；
所述的实验动物是哺乳动物；
所述的异烟肼免疫原是由权利要求1所述的异烟肼衍生物与载体连接得到的化合物，其结构式如式（Ⅱ）所示：
Figure 533246DEST_PATH_IMAGE003
式（Ⅱ）；
式中X2为-CO-(CH2)n-CO-，其中n为1至20之间的任意整数，优选地，所述X2为-CO-(CH2)2-CO-；
所述的载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；
所述的均相酶底物溶液是由葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂配制得到；
所述的异烟肼酶标偶联物是由权利要求1所述的异烟肼衍生物与重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如式（Ⅲ）所示：
Figure 77491DEST_PATH_IMAGE004
式（Ⅲ）；
式中X2为-CO-(CH2)n-CO-，其中n为1至20之间的任意整数，优选地，所述X2为-CO-(CH2)2-CO-；
式中sG6PDH为重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，所述重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
所述R2缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂配制得到。
4.根据权利要求3所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的哺乳动物是兔子、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、豚鼠、驴、马或骆驼中的一种；所述的具有免疫原性的蛋白质或多肽为血清蛋白、卵清蛋白、丙种球蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种。
5.根据权利要求3-4任一项所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的哺乳动物是兔子；所述具有免疫原性的蛋白质或多肽为牛血清白蛋白。
6.根据权利要求3所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的异烟肼免疫原的制备方法包括以下步骤：
（A1）载体溶液的制备：将载体溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体溶液；
（A2）异烟肼衍生物溶液的制备：将权利要求1所述的异烟肼衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到异烟肼衍生物溶液；
（A3）异烟肼免疫原的合成：将步骤（A2）得到的异烟肼衍生物溶液加入到步骤（A1）得到的载体溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到异烟肼免疫原。
7.根据权利要求3所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的抗异烟肼特异性抗体的制备方法包括以下步骤：
（B1）将权利要求3中所述的异烟肼免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对权利要求3中所述的实验动物进行多点注射；
（B2）3-6周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；
（B3）对步骤（B2）完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗异烟肼特异性抗体。
8.根据权利要求3所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的异烟肼酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：
（C1）重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2和NaCl混合溶解于Tris缓冲液中，再加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸、卡必醇和二甲基亚砜，搅拌溶解，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
（C2）异烟肼衍生物溶液的制备：将权利要求1所述的异烟肼衍生物溶解于二甲基甲酰胺中，降温至-10℃以下，加入三丁胺和氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到异烟肼衍生物溶液；
（C3）异烟肼酶标偶联物的合成：将步骤（C2）得到的异烟肼衍生物溶液逐滴加入到步骤（C1）得到的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，搅拌反应，经凝胶层析柱纯化，得到异烟肼酶标偶联物。
9.一种权利要求3所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（D1）均相酶底物溶液的制备：将葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂溶解于纯化水中，制得均相酶底物溶液；
（D2）R1试剂的制备：将权利要求3中所述的抗异烟肼特异性抗体与步骤（D1）得到的均相酶底物溶液混合均匀，得到R1试剂，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:50-5000；
（D3）R2缓冲液的制备：将三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白与防腐剂溶解于纯化水中，制得R2缓冲液；
（D4）R2试剂的制备：将权利要求3中所述的异烟肼酶标偶联物溶解于R2缓冲液中，得到R2试剂，所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:50-5000。
10.根据权利要求9所述的异烟肼均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的R1试剂中抗异烟肼特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:800；所述的R2试剂中异烟肼酶标偶联物与R2缓冲液的体积比为1:1200。
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