CN113614514B - 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途 - Google Patents

Abstract

6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途。6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含以下突变的组合：56C、306C和454C。使用6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

Description

6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。

小分子抗原(或半抗原)因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是样本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。样本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

目前已知的半抗原检测方法主要有：放射免疫分析法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。

均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原与非标记抗原，竞争与定量的抗体进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中半抗原的含量。

现有技术的方法依赖于对半抗原(如小分子药物)自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的偶联方法会出现同一葡萄糖六磷酸脱氢酶上链接有多个小分子药物的情况，且偶联位点难以确保一致性，难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。

发明内容

鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备检测试剂中的用途。

根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。相较于野生型，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变组合：56C、306C和454C。

本申请的突变体，区别于已发表专利中的6磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，例如US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphatedehydrogenases)，也不同于CN110174363A中公开的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型包含D306C、D375C或G426C的单突变体。

根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是以下序列所示：SEQ ID No.2。

根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。

根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。

根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。

根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：m偶联而成。

在一些实施方案中，m是1至10，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

在一些具体的实施方案中，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：3的定向偶联。

在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。

根据本申请，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本申请中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。

半抗原选自：小分子药物(如抗生素、精神药物)、激素、代谢物、糖、脂质、氨基酸、短肽(分子量小于4000kDa时，或氨基酸长度不超过50个氨基酸残基)。

半抗原，例如但不限于：

-抗癌或抗肿瘤药物：紫杉烷、紫杉醇及其衍生物、多烯紫杉醇、多西他赛、伊立替康、SN38、拓扑替康、盐酸拓扑替康、托泊替康、顺铂、卡铂、奥沙利铂、喜树碱及其衍生物、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、吐根碱、盐酸吐根碱、秋水仙碱、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、戊柔比星、阿霉素或盐酸阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、道诺霉素、丝裂霉素、阿克拉霉素、伊达霉素、博来霉素、培洛霉素、光辉霉素、雷帕霉素、争光霉素、链脲霉素、鬼臼毒素、放线菌素D、美登木素、阿米卡星、米托蒽醌、全反式维A酸、长春地辛、长春瑞滨、吉西他滨、卡培他滨、克拉曲滨、培美曲塞二钠、替吉奥、来曲唑、阿那曲唑、氟维司群、戈舍瑞林、曲普瑞林、亮丙瑞林、布舍瑞林、替莫唑胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、吉非替尼、舒尼替尼、埃罗替尼、埃克替尼、拉帕替尼、索拉非尼、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、西罗莫司、依维莫司、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、羟基脲、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、阿糖胞苷、依托泊苷、氮杂胞苷、替尼泊苷、普萘洛尔、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、蓓萨罗丁、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、甲基苄胼、噻替派；

-抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物：大环内酯物、防御素、多粘菌素E甲磺酸、多粘菌素、多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、短杆菌肽、两性霉素B、氨基糖苷类抗生素、庆大霉素、草履虫素、妥布霉素、卡那霉素、氨基羟丁基卡那霉素A、新霉素、链霉素、制霉菌素、棘白霉素类、羧苄青霉素、青霉素、青霉素敏感药剂、青霉素G、青霉素V、青霉素酶抵抗剂、甲氧苯青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、萘夫西林、青霉烯、羟氨苄青霉素、万古霉素、达托霉素、蒽环霉素、氯霉素、环酯红霉素、黄霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、克拉霉素、红霉素、地红霉素、罗红霉素、氮红霉素、阿奇霉素、氟红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、美地加霉素、白霉素、米欧卡霉素、罗他霉素、多西环素、思维奴利德A、替考拉宁、兰普拉宁、麦地拉宁、克利斯汀、氟代胞嘧啶、咪康唑、益康唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、克霉唑、联苯苄唑、奈替米星、阿米卡星、卡泊芬净、米卡芬净、特比萘芬、氟喹诺酮、洛美沙星、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲氟沙星、阿拉曲沙星、莫西沙星、格帕沙星、加替沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星、西他沙星、伊达比星、妥舒沙星、雷莫拉宁、核苷抗病毒药、利巴韦林、抗单假胞菌青霉素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、氨苄西林、海他西林、格拉皮西林、阿莫西林、头孢菌素、头孢泊肟酯、头孢丙烯、头孢丁烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑啉、头孢娄利定、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星、头孢呋辛、头孢雷特、头孢噻肟、头孢乙氰、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、氯碳头孢、拉氧头孢、头孢布坦、先锋霉素II、头孢三嗪、氰乙酰头孢菌素、单内酰环类、氨曲南、碳青霉烯、亚胺培南、戊烷脒羟乙磺酸盐、伊米配能、美洛培南、喷他脒爱瑟硫脲、沙丁胺醇硫酸盐、利多卡因、奥西那林硫酸盐、氯地米松、间羟异丙肾上腺素硫酸盐、二丙酸倍氯米松、去炎松乙酰胺、丁地去炎松、布地奈德丙酮化合物、氟替卡松、异丙托溴化物、氟尼缩松、色甘酸钠、环孢素、环胞菌素A、酒石酸麦角胺；

-胞松弛素B、氨甲苯酸、对氨马尿酸钠、氨鲁米特、氨基酮戊酸、氨基水杨酸、帕米膦酸、安吖啶、阿那格雷、阿纳托唑、左咪唑、白消安、卡麦角林、柳菩林、西司他丁钠、氯屈膦酸二钠、胺碘酮、恩丹西酮、去乙酰环丙氯地孕酮、甲地孕酮、睾酮、雌莫司汀、依西美坦、氟羟甲基睾丸素、己烯雌酚、非索非那定、氟达拉滨、氟氢可的松、氟替卡松、去铁胺、氟他胺、必卡他胺、沙利度胺、L-多巴、甲酰四氢叶酸、赖诺普利、左甲状腺素钠、氮芥气、安宫黄体素、间羟基去甲麻黄碱二酒石酸盐、美西律、米托坦、烟碱、尼鲁米特、奥曲肽、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆、泼尼松、丙卡巴肼、普鲁氯哌嗪、雷替曲噻、链脲佐菌素、西罗莫司、他可莫司、它莫西芬、替尼泊苷、四氢大麻酚、硫鸟嘌呤、塞替派、多拉司琼、格拉司琼、福莫特罗、美法仑、咪达唑仑、阿普唑仑、舒马曲坦、低分子量肝素、阿米福汀、卡莫司汀、吉西他汀、洛莫司汀、泰福斯汀、阿司匹林、水杨酸、保泰松、吲哚美辛、萘普生、双氯芬酸、美洛昔康、萘丁美酮、依托度酸、舒林酸、阿西美辛、双醋瑞因、氨多索韦、氰尿蓝、氨基芳酮、氨基己酸、氨基苯乙哌啶酮、氨基乙酰丙酸、甲磺酸丁二醇二酯、氯甲双磷酸、氯甲双磷酸二钠、L-二羟基苯丙氨酸、二氯甲基二乙胺、间羟胺酒石酸氢盐、邻对二氯苯二氯乙烷、普鲁氯嗪、昂丹司琼、雷替曲塞、他克罗姆、三苯氧胺、塔尼普斯德、四氢大麻醇、芳酰基腙、舒马普坦、美欧卡霉素、螺他霉素、苯芥胆甾醇、哌泊舒凡、盐酸依匹斯汀、胰岛素、反义核苷酸、小分子RNA、

-维生素D、25羟维生素D、1，25双羟维生素D、叶酸、强心甙、酶酚酸、乙胺碘复酮、甲胺喋呤、他克莫司、血清氨基酸、胆汁酸、甘胆酸、苯丙氨酸、乙醇、尼柯丁代谢产物、尿吗啡、尿单羟酚衍生物、神经肽酪氨酸、血浆甘丙素、多胺、组织胺、促甲状腺激素、泌乳素、胎盘泌乳素、生长激素、促卵泡刺激素、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、降钙素、降钙素原、甲状旁腺激素、甲状腺素、三碘甲状原氨酸、反三碘甲状原氨酸、游离甲状腺素、游离三碘甲状原氨酸、皮质醇、尿17-羟皮质类固醇、尿17-酮类固醇、脱氢表雄酮及硫酸酯、醛固酮、尿香草苦杏仁酸、血浆肾素、血管紧张素、促红细胞生成素、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、17α羟孕酮、雌酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素原、C肽、胃泌素、血浆前列腺素、血浆6-酮前列腺素F1α、前列环素、肾上腺素、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、胆囊收缩素、纳素、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、血管活性肽、生长抑素、促胰液素、P-物质、神经降压素、血栓素A2、血栓素B2、5羟色胺、神经肽Y、骨钙素。

在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素或其衍生物。

虽然以妥布霉素作为一个具体的示例，但是技术人员可以理解，本申请的技术效果不依赖于半抗原的特定类型，其适用于任何可以借助竞争法进行免疫学检测的半抗原。

在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素衍生物，其带有巯基反应基团，例如来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜或氮丙啶。

在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素衍生物，如式I所示：

m为0至20的整数，优选1至10的整数，优选1至6的整数；

X选自：马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、氮丙啶；

更优选地，X是马来酰亚胺。

在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素衍生物，如式II所示：

根据一些实施方案，提供了一种试剂，其包含本申请的偶联物。

根据一些实施方案，提供了本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在制备检测试剂中的用途。

根据一些实施方案，提供了本申请的偶联物在制备检测试剂中的用途。

在具体的实施方案中，所述的检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。

在具体的实施方案中，所述的检测试剂优选是基于竞争法检测的试剂。

根据一些实施方案，提供了一种半抗原检测试剂盒，其包含：

-第一试剂，所述第一试剂包含底物和半抗原抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；

-第二试剂，所述第二试剂包含本申请的偶联物；

-任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液和半抗原；以及

-任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液和半抗原。

根据一个的实施方案，提供了一种半抗原检测试剂盒，其包含：

第一试剂，其包含：

10mM至500mM缓冲液、

5mM至25mM底物、

0.01μg/L至1mg/L半抗原抗体、

10mM至300mM NaCl、

0.1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L防腐剂；

第二试剂，其包含：

10mM至500mM缓冲液、

0.01μg/L至1mg/L本申请的偶联物、

0.1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L防腐剂。

根据一些具体的实施方案，提供了一种妥布霉素检测试剂盒，其包含：

-第一试剂，所述第一试剂包含底物和妥布霉素抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；

-第二试剂，所述第二试剂包含本申请的偶联物；

-任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、已知浓度的妥布霉素；以及

-任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、已知浓度的妥布霉素。

根据一个的实施方案，提供了一种妥布霉素检测试剂盒，其包含：

第一试剂，其包含：

10mM至500mM缓冲液、

5mM至25mM底物、

0.01μg/ml至10μg/ml妥布霉素抗体、

10mM至300mM NaCl、

0.1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L防腐剂；

第二试剂，其包含：

10mM至500mM缓冲液、

0.01μg/ml至10μg/ml本申请的偶联物、

0.1g/L至5g/L稳定剂、

0.1g/L至5g/L表面活性剂、

0.1g/L至5g/L防腐剂。

在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选，磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为10mmol/L至500mmol/L，优选100mM；所述缓冲液的pH为6.5至8.0，优选7.2或者7.0。

在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；优选牛血清白蛋白。

在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：Brij23、Brij35、Triton X-100、Triton X-405、Tween20、Tween30、Tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、AEO7，优选Tween20。

在一些实施方案中，所述的防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、MIT、PC-300、硫柳汞；所述叠氮化物选自：叠氮钠、叠氮锂。

在一些实施方案中，所述底物包含：6-磷酸葡糖糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

根据一些实施方案，提供了一种偶联物的制备方法，包括步骤：

1)提供根据本申请的半抗原或其衍生物，尤其是在非质子性溶剂(例如但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜)中提供根据本申请的半抗原或其衍生物；

2)提供本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，优选在缓冲液(其提供反应环境，例如但不限于PBS、Tris、TAPS、TAPSO，所述缓冲液pH为6.0至8.0)中提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

3)在18℃至28℃，将所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体和所述半抗原或其衍生物按照摩尔比1：n接触1小时至4小时(优选2小时至3小时)使得所述半抗原或其衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体发生偶联，得到所述种偶联物；

4)根据需要，任选对所述种偶联物进行纯化，例如脱盐处理等。

在一些实施方案中，n是1至500，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或任意数值间的范围。

在一些具体的实施方案中，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体和所述半抗原或其衍生物按照摩尔比1：30至1：120接触，可以提及1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：110、或1：120。

在一些具体的实施方案中，步骤1)和2)可互换或并行。

在一些具体的实施方案中，在偶联之前，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶包含一个游离的巯基，从而允许和半抗原或其衍生物实现1：3的定向反应。

附图说明

图1.G6PDH(野生型)氨基酸序列(SEQ ID No.1)；源自明串珠菌属假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides。

图2.G6PDH突变体(SEQ ID No.2)。

具体实施方式

实施例

实施例1.妥布霉素衍生物的合成

将妥布霉素(98mg，0.21mmol)和化合物1(64mg，0.21mmol)溶于水5mL中，室温搅拌5h。HPLC分离得到妥布霉素衍生物。合成路线如下所示：

按常规方法确认合成物结构。本实施例的作用在于使得小分子抗原(或半抗原)带有一个可以和酶结合的基团，本申请的技术效果不依赖于特定的半抗原衍生物。

实施例2.突变体的制备

采用公知的基因工程方法，例如合成所需DNA，插入到适当的表达载体中(例如大肠杆菌表达载体)，在表达宿主中进行表达，并纯化(如亲和纯化)，获得SEQ ID No.2所示的酶突变体。

实施例3.妥布霉素衍生物与G6PDH突变体的偶联

根据本申请的G6PDH-妥布霉素偶联物，按照以下方式进行偶联：妥布霉素衍生物分子上的巯基反应性基团(如马来酰亚胺基团)与G6PDH分子上的巯基共价结合。

将实施例2的G6PDH酶突变体(或现有技术中的对照G6PDH酶突变体)的溶液(5mg/mL酶、100mmol PB、100mmol NaCl，pH＝8.0)4μl、200μl PB溶液、800μl实施例1制备的妥布霉素衍生物在室温(18至28℃，优选20至25℃)震荡反应2.5h。

脱盐柱处理(脱盐溶液100mM PB、0.1％NaN3、1％NaCl，pH＝8.0)，收集蛋白峰，得到G6PDH-妥布霉素偶联物。

实施例4.试剂盒的制备

制备以下检测妥布霉素的试剂盒，其包含：

1.第一试剂的制备：

2.第二试剂的制备：

3.校准品：

妥布霉素纯品由缓冲溶液(100mM HEPES缓冲液)稀释所得，其浓度分别为0、0.6、2.0、4.0、6.0、10.0mg/L(或按需加入)；

4.质控品：

妥布霉素纯品由缓冲溶液(100mM HEPES缓冲液)稀释所得，其浓度分别为1.5mg/L、3mg/L、8mg/L(或按需加入)。

检测例

表1.全自动生化仪参数

检测例1.妥布霉素检测试剂盒定标吸光度

表2.妥布霉素检测试剂盒定标吸光度

检测例2.妥布霉素检测试剂盒重复性

重复性测定高、中、低质控品分别检测20次。本发明试剂盒的重复性CV在2.61％以下，重复性较好。

表3.重复性

测次	质控1	质控2	质控3
				1	1.62	2.89	8.10
2	1.67	2.85	8.13
				3	1.65	2.86	8.04
4	1.64	2.89	8.01
				5	1.67	2.89	8.28
6	1.60	2.82	8.35
				7	1.62	2.82	8.19
8	1.56	2.82	8.09
				9	1.62	2.84	8.17
10	1.59	2.88	8.25
				11	1.55	2.81	8.04
12	1.58	2.83	8.17
				13	1.66	2.85	8.03
14	1.59	2.84	8.06
				15	1.51	2.87	8.28
16	1.58	2.85	8.16
				17	1.61	2.86	7.94
18	1.57	2.75	8.02
				19	1.59	2.77	8.15
20	1.58	2.85	8.10
				均值	1.60	2.84	8.13
STD	0.04	0.04	0.11
				CV	2.61％	1.31％	1.30％

检测例3.妥布霉素检测试剂盒线性

筛选低值样本与高值样本按照等差稀释的方法进行稀释，每个样本重复检测3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行回收率分析，结果偏差小于10％，线性能达到10μg/ml。

表4.线性

检测例4.准确性

美国药典妥布霉素纯品溶解至不同浓度储液，以相同倍数稀释至血清中(稀释倍数最少20倍)，配置成不同浓度血清妥布霉素溶液，用本发明的试剂盒测定并计算与理论值偏差，结果回收率偏差小于6％，准确性好。

表5.准确性

USP	测值1	测值2	测值3	均值	绝对偏差	相对偏差
							1.00	1.06	1.08	1.04	1.06	0.06	6.00％
1.50	1.59	1.52	1.51	1.54	0.04	2.67％
							2.00	2.02	1.98	2.04	2.01	0.01	0.67％
4.00	3.04	2.94	2.97	2.98	-0.02	-0.56％
							8.00	5.09	4.95	4.99	5.01	0.01	0.20％
10.00	10.12	10.01	10.05	10.06	0.06	0.60％

检测例5.抗体抑制率

1.抗体抑制率的检测原理

当抗体与G6PDH-妥布霉素偶联物结合时，由于空间位阻导致G6PDH酶活性受到影响，从而使得其催化NAD转化为NADH的效率降低，通过检测NADH量的变化，从而比较加入抗体与未加入抗体的实验组的差异，这种差异即体现为抗体对G6PDH的抑制能力。

2.反应体系：

表6.抗体抑制率的检测试剂制备

表7.抗体抑制率检测上机参数

检测机型	日立7180
		分析/时间/点	2点速率/10min/10-15个点
R1/S	150:25
		波长(副/主)	405/340
反应类型	递增

3.结果：

比较加入抗体与未加入抗体时，分别检测G6PDH-妥布霉素偶联物吸光度测值，即可得到抗体对G6PDH的抑制情况。

其中ΔA是指反应曲线两个测试时间点之间的吸光度差值。

表8.不同G6PDH突变体的抗体抑制率

虽然不限于具体理论，但是可以部分地解释为：和现有技术中的G6PDH突变体相比，本申请酶突变体(K56C/D306C/D454C)中突变位点(即引入游离巯基的位点)是和半抗原(比如激素、小分子药物等)发生偶联的位置所在。半抗原在这个位置上与半抗原特异性抗体结合时，所构成的空间位阻对G6PDH酶的活性影响最大，同时在引入突变后，还不能实质上影响分子的空间折叠。因此，这个突变位点的位置非常重要，需要同时兼顾G6PDH酶的活性、偶联分子的空间折叠、以及半抗原表位的充分暴露。

由于酶的突变体在抗体抑制率上有明显的提高，在定标吸光度上能够有明显的优势。将酶的突变体与半抗原偶联后的偶联物配制成试剂盒后，试剂在重复性、总不精密度、线性、特异性等性能方面有明显的性能提升。

序列表

<110> 北京九强生物技术股份有限公司

<120> 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途

<130> 390311CG

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 486

<212> PRT

<213> 假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)

<400> 1

Met Val Ser Glu Ile Lys Thr Leu Val Thr Phe Phe Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Val Phe Asn Leu Tyr Lys

20 25 30

Lys Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln

35 40 45

Ala Leu Asn Asp Asp Glu Phe Lys Gln Leu Val Arg Asp Ser Ile Lys

50 55 60

Asp Phe Thr Asp Asp Gln Ala Gln Ala Glu Ala Phe Ile Glu His Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Arg Ala His Asp Val Thr Asp Ala Ala Ser Tyr Ala Val Leu

85 90 95

Lys Glu Ala Ile Glu Glu Ala Ala Asp Lys Phe Asp Ile Asp Gly Asn

100 105 110

Arg Ile Phe Tyr Met Ser Val Ala Pro Arg Phe Phe Gly Thr Ile Ala

115 120 125

Lys Tyr Leu Lys Ser Glu Gly Leu Leu Ala Asp Thr Gly Tyr Asn Arg

130 135 140

Leu Met Ile Glu Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Ala Glu

145 150 155 160

Leu Gln Asn Asp Leu Glu Asn Ala Phe Asp Asp Asn Gln Leu Phe Arg

165 170 175

Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Val Gln Asn Ile Ala Ala Leu

180 185 190

Arg Phe Gly Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile

195 200 205

Lys Asn Val Gln Val Thr Leu Ser Glu Val Leu Gly Val Glu Glu Arg

210 215 220

Ala Gly Tyr Tyr Asp Thr Ala Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn

225 230 235 240

His Thr Met Gln Ile Val Gly Trp Leu Ala Met Glu Lys Pro Glu Ser

245 250 255

Phe Thr Asp Lys Asp Ile Arg Ala Ala Lys Asn Ala Ala Phe Asn Ala

260 265 270

Leu Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Gly Arg Ala

275 280 285

Gln Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Ala Asp Phe Lys Pro Tyr Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Asp Val Pro Ala Asp Ser Lys Asn Asn Thr Phe Ile Ala Gly Glu

305 310 315 320

Leu Gln Phe Asp Leu Pro Arg Trp Glu Gly Val Pro Phe Tyr Val Arg

325 330 335

Ser Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Val Asp Ile Val Phe

340 345 350

Lys Ala Gly Thr Phe Asn Phe Gly Ser Glu Gln Glu Ala Gln Glu Ala

355 360 365

Val Leu Ser Ile Ile Ile Asp Pro Lys Gly Ala Ile Glu Leu Lys Leu

370 375 380

Asn Ala Lys Ser Val Glu Asp Ala Phe Asn Thr Arg Thr Ile Asp Leu

385 390 395 400

Gly Trp Thr Val Ser Asp Glu Asp Lys Lys Asn Thr Pro Glu Pro Tyr

405 410 415

Glu Arg Met Ile His Asp Thr Met Asn Gly Asp Gly Ser Asn Phe Ala

420 425 430

Asp Trp Asn Gly Val Ser Ile Ala Trp Lys Phe Val Asp Ala Ile Ser

435 440 445

Ala Val Tyr Thr Ala Asp Lys Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Lys Ser Gly

450 455 460

Ser Met Gly Pro Glu Ala Ser Asp Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gly Asp

465 470 475 480

Ala Trp Val Phe Lys Gly

485

<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (56)..(56)

<223> G6PDH突变体,相较于野生型，56位氨基酸替换为C

<220>

<221> VARIANT

<222> (306)..(306)

<223> G6PDH突变体,相较于野生型，306位氨基酸替换为C

<220>

<221> VARIANT

<222> (454)..(454)

<223> G6PDH突变体,相较于野生型，454位氨基酸替换为C

<400> 2

Met Val Ser Glu Ile Lys Thr Leu Val Thr Phe Phe Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Val Phe Asn Leu Tyr Lys

20 25 30

Lys Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln

35 40 45

Ala Leu Asn Asp Asp Glu Phe Cys Gln Leu Val Arg Asp Ser Ile Lys

50 55 60

Asp Phe Thr Asp Asp Gln Ala Gln Ala Glu Ala Phe Ile Glu His Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Arg Ala His Asp Val Thr Asp Ala Ala Ser Tyr Ala Val Leu

85 90 95

Lys Glu Ala Ile Glu Glu Ala Ala Asp Lys Phe Asp Ile Asp Gly Asn

100 105 110

Arg Ile Phe Tyr Met Ser Val Ala Pro Arg Phe Phe Gly Thr Ile Ala

115 120 125

Lys Tyr Leu Lys Ser Glu Gly Leu Leu Ala Asp Thr Gly Tyr Asn Arg

130 135 140

Leu Met Ile Glu Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Ala Glu

145 150 155 160

Leu Gln Asn Asp Leu Glu Asn Ala Phe Asp Asp Asn Gln Leu Phe Arg

165 170 175

Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Val Gln Asn Ile Ala Ala Leu

180 185 190

Arg Phe Gly Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile

195 200 205

Lys Asn Val Gln Val Thr Leu Ser Glu Val Leu Gly Val Glu Glu Arg

210 215 220

Ala Gly Tyr Tyr Asp Thr Ala Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn

225 230 235 240

His Thr Met Gln Ile Val Gly Trp Leu Ala Met Glu Lys Pro Glu Ser

245 250 255

Phe Thr Asp Lys Asp Ile Arg Ala Ala Lys Asn Ala Ala Phe Asn Ala

260 265 270

Leu Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Val Arg Ala

275 280 285

Gln Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Ala Asp Phe Lys Pro Tyr Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Cys Val Pro Ala Asp Ser Lys Asn Asn Thr Phe Ile Ala Gly Glu

305 310 315 320

Leu Gln Phe Asp Leu Pro Arg Trp Glu Gly Val Pro Phe Tyr Val Arg

325 330 335

Ser Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Val Asp Ile Val Phe

340 345 350

Lys Ala Gly Thr Phe Asn Phe Gly Ser Glu Gln Glu Ala Gln Glu Ala

355 360 365

Val Leu Ser Ile Ile Ile Asp Pro Lys Gly Ala Ile Glu Leu Lys Leu

370 375 380

Asn Ala Lys Ser Val Glu Asp Ala Phe Asn Thr Arg Thr Ile Asp Leu

385 390 395 400

Gly Trp Thr Val Ser Asp Glu Asp Lys Lys Asn Thr Pro Glu Pro Tyr

405 410 415

Glu Arg Met Ile His Asp Thr Met Asn Gly Asp Gly Ser Asn Phe Ala

420 425 430

Asp Trp Asn Gly Val Ser Ile Ala Trp Lys Phe Val Asp Ala Ile Ser

435 440 445

Ala Val Tyr Thr Ala Cys Lys Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Lys Ser Gly

450 455 460

Ser Met Gly Pro Glu Ala Ser Asp Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gly Asp

465 470 475 480

Ala Trp Val Phe Lys Gly

485

Claims (24)

1.一种偶联物，其是6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与妥布霉素衍生物按照摩尔比1：1至1：3偶联而成；

所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，相较于假肠膜明串珠菌的野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶，其包含以下突变的组合：56C、306C和454C；

所述妥布霉素衍生物是式I所示：

式I

m为0至20的整数；

X选自以下任一种或多种：马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、氮丙啶；

所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的偶联物，所述摩尔比是1：3。

3.根据权利要求1所述的偶联物，其中m为1至10的整数。

4.根据权利要求1所述的偶联物，其中m为1至6的整数。

5.根据权利要求1所述的偶联物，其中X是马来酰亚胺。

6.一种试剂，其包含权利要求1至5中任一项所述的偶联物。

7.权利要求1至5中任一项所述的偶联物在制备检测装置中的用途，其中所述检测装置是针对妥布霉素的检测装置。

8.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是酶联免疫法检测装置。

9.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是化学发光免疫法检测装置。

10.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是均相酶免疫法检测装置。

11.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是胶乳增强免疫比浊法检测装置。

12.根据权利要求7所述的用途，所述检测装置是试剂盒。

13.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是孔板。

14.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是试纸。

15.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是磁珠。

16.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是胶乳颗粒。

17.根据权利要求7所述的用途，所检测装置是芯片。

18.一种偶联物的制备方法，其包括步骤：

1）提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

2）提供半抗原；

3）所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与所述半抗原按照摩尔比1：3形成偶联；

步骤1）和步骤2）是并行的或互换顺序；

所述半抗原是妥布霉素衍生物；

所述妥布霉素衍生物是式I所示：

式I

m为0至20的整数；

X选自以下任一种或多种：马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、氮丙啶；

相较于假肠膜明串珠菌的野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含以下突变的组合：56C、306C和454C；

所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是SEQ ID No.2所示。

19.根据权利要求18所述的偶联物的制备方法，其中m为1至10的整数。

20.根据权利要求18所述的偶联物的制备方法，其中m为1至6的整数。

21.根据权利要求18所述的偶联物的制备方法，其中X是马来酰亚胺。

22.根据权利要求18所述的偶联物的制备方法，其中步骤3）按照以下条件进行：

在18°C至28°C，将所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体和所述半抗原按照1：30至1：120的摩尔比接触1小时至4小时。

23.根据权利要求18所述的偶联物的制备方法，其中：

在步骤1）中，在缓冲液中提供所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

在步骤2）中，在非质子性溶剂中提供所述半抗原；

所述缓冲液选自以下任一种：PBS、Tris、TAPS、TAPSO，

所述缓冲液pH为6.0至8.0；

所述非质子性溶剂选自以下任一种或组合：乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。

24.根据权利要求18所述的偶联物的制备方法，其还包括步骤：

4）对所得的偶联物进行脱盐。

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