CN115856278B - 妥布霉素检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及妥布霉素检测试剂盒。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含以下突变的组合：56C、306C和454C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的妥布霉素检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

Description

妥布霉素检测试剂盒
本申请要求2020年01月07日提交的专利申请(申请号2020100134247)的优先权；本申请是2020年11月04日提交的专利申请(申请号2020800240009)《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在检测试剂盒中的应用。
背景技术
半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。
半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。
小分子抗原(或半抗原)因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是样本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。样本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
目前已知的半抗原检测方法主要有：放射免疫分析法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。
均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原与非标记抗原，竞争与定量的抗体进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中半抗原的含量。
现有技术的方法依赖于对半抗原(如小分子药物)自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的偶联方法会出现同一葡萄糖六磷酸脱氢酶上链接有多个小分子药物的情况，且偶联位点难以确保一致性，难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。
发明内容
鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备检测试剂中的用途。
根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。相较于野生型，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变组合：56C、306C和454C。
本申请的突变体，区别于已发表专利中的6磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，例如US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphatedehydrogenases)，也不同于CN110174363A中公开的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型包含D306C、D375C或G426C的单突变体。
根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是以下序列所示：SEQ ID No.2。
根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。
根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。
根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。
根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：m偶联而成。
在一些实施方案中，m是1至10，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
在一些具体的实施方案中，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：3的定向偶联。
在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。
根据本申请，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本申请中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。
在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素或其衍生物。
在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素衍生物，其带有巯基反应基团，例如来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜或氮丙啶。
在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素衍生物，如式I所示：
m为0至20的整数，优选1至10的整数，优选1至6的整数；
X选自：马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、氮丙啶；
更优选地，X是马来酰亚胺。
在具体的实施方案中，半抗原是妥布霉素衍生物，如式II所示：
根据一些实施方案，提供了一种试剂，其包含本申请的偶联物。
根据一些实施方案，提供了本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在制备检测试剂中的用途。
根据一些实施方案，提供了本申请的偶联物在制备检测试剂中的用途。
在具体的实施方案中，所述的检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。
在具体的实施方案中，所述的检测试剂优选是基于竞争法检测的试剂。
根据一些实施方案，提供了一种半抗原检测试剂盒，其包含：
-第一试剂，所述第一试剂包含底物和半抗原抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；
-第二试剂，所述第二试剂包含本申请的偶联物；
-任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液和半抗原；以及
-任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液和半抗原。
根据一个的实施方案，提供了一种半抗原检测试剂盒，其包含：
第一试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
5mM至25mM底物、
0.01μg/L至1mg/L半抗原抗体、
10mM至300mM NaCl、
0.1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L防腐剂；
第二试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.01μg/L至1mg/L本申请的偶联物、
0.1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L防腐剂。
根据一些具体的实施方案，提供了一种妥布霉素检测试剂盒，其包含：
-第一试剂，所述第一试剂包含底物和妥布霉素抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；
-第二试剂，所述第二试剂包含本申请的偶联物；
-任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、已知浓度的妥布霉素；以及
-任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、已知浓度的妥布霉素。
根据一个的实施方案，提供了一种妥布霉素检测试剂盒，其包含：
第一试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
5mM至25mM底物、
0.01μg/ml至10μg/ml妥布霉素抗体、
10mM至300mM NaCl、
0.1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L防腐剂；
第二试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.01μg/ml至10μg/ml本申请的偶联物、
0.1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L防腐剂。
在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选，磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为10mmol/L至500mmol/L，优选100mM；所述缓冲液的pH为6.5至8.0，优选7.2或者7.0。
在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；优选牛血清白蛋白。
在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：Brij23、Brij35、Triton X-100、Triton X-405、Tween20、Tween30、Tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、AEO7，优选Tween20。
在一些实施方案中，所述的防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、MIT、PC-300、硫柳汞；所述叠氮化物选自：叠氮钠、叠氮锂。
在一些实施方案中，所述底物包含：6-磷酸葡糖糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
根据一些实施方案，提供了一种偶联物的制备方法，包括步骤：
1)提供根据本申请的半抗原或其衍生物，尤其是在非质子性溶剂(例如但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜)中提供根据本申请的半抗原或其衍生物；
2)提供本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，优选在缓冲液(其提供反应环境，例如但不限于PBS、Tris、TAPS、TAPSO，所述缓冲液pH为6.0至8.0)中提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；
3)在18℃至28℃，将所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体和所述半抗原或其衍生物按照摩尔比1：n接触1小时至4小时(优选2小时至3小时)使得所述半抗原或其衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体发生偶联，得到所述种偶联物；
4)根据需要，任选对所述种偶联物进行纯化，例如脱盐处理等。
在一些实施方案中，n是1至500，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或任意数值间的范围。
在一些具体的实施方案中，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体和所述半抗原或其衍生物按照摩尔比1：30至1：120接触，可以提及1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：110、或1：120。
在一些具体的实施方案中，步骤1)和2)可互换或并行。
在一些具体的实施方案中，在偶联之前，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶包含一个游离的巯基，从而允许和半抗原或其衍生物实现1：3的定向反应。
附图说明
图1.G6PDH(野生型)氨基酸序列(SEQ ID No.1)；源自明串珠菌属假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides。
图2.G6PDH突变体(SEQ ID No.2)。
具体实施方式
实施例
实施例1.妥布霉素衍生物的合成
将妥布霉素(98mg，0.21mmol)和化合物1(64mg，0.21mmol)溶于水5mL中，室温搅拌5h。HPLC分离得到妥布霉素衍生物。合成路线如下所示：
按常规方法确认合成物结构。本实施例的作用在于使得小分子抗原(或半抗原)带有一个可以和酶结合的基团。
实施例2.突变体的制备
采用公知的基因工程方法，例如合成所需DNA，插入到适当的表达载体中(例如大肠杆菌表达载体)，在表达宿主中进行表达，并纯化(如亲和纯化)，获得SEQ ID No.2所示的酶突变体。
实施例3.妥布霉素衍生物与G6PDH突变体的偶联
根据本申请的G6PDH-妥布霉素偶联物，按照以下方式进行偶联：妥布霉素衍生物分子上的巯基反应性基团(如马来酰亚胺基团)与G6PDH分子上的巯基共价结合。
将实施例2的G6PDH酶突变体(或现有技术中的对照G6PDH酶突变体)的溶液(5mg/mL酶、100mmol PB、100mmol NaCl，pH＝8.0)4μl、200μl PB溶液、800μl实施例1制备的妥布霉素衍生物在室温(18至28℃，优选20至25℃)震荡反应2.5h。
脱盐柱处理(脱盐溶液100mM PB、0.1％NaN3、1％NaCl，pH＝8.0)，收集蛋白峰，得到G6PDH-妥布霉素偶联物。
实施例4.试剂盒的制备
制备以下检测妥布霉素的试剂盒，其包含：
1.第一试剂的制备：
HEPES缓冲液 100mM，PH 7.0
抗妥布霉素抗体 0.5μg/ml
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型 15mmol/L
葡萄糖-6-磷酸 15mmol/L
牛血清白蛋白 1g/L
Tween 20 1g/L
叠氮钠 1g/L；
2.第二试剂的制备：
PB缓冲液 100mM，PH8.0
G6PDH-妥布霉素偶联物 0.1μg/ml
牛血清白蛋白 1g/L
Tween 20 1g/L
叠氮钠 1g/L。
3.校准品：
妥布霉素纯品由缓冲溶液(100mM HEPES缓冲液)稀释所得，其浓度分别为0、0.6、2.0、4.0、6.0、10.0mg/L(或按需加入)；
4.质控品：
妥布霉素纯品由缓冲溶液(100mM HEPES缓冲液)稀释所得，其浓度分别为1.5mg/L、3mg/L、8mg/L(或按需加入)。
检测例
表1.全自动生化仪参数
检测例1.妥布霉素检测试剂盒定标吸光度
表2.妥布霉素检测试剂盒定标吸光度
检测例2.妥布霉素检测试剂盒重复性
重复性测定高、中、低质控品分别检测20次。本发明试剂盒的重复性CV在2.61％以下，重复性较好。
表3.重复性
测次 质控1 质控2 质控3
1 1.62 2.89 8.10
2 1.67 2.85 8.13
3 1.65 2.86 8.04
4 1.64 2.89 8.01
5 1.67 2.89 8.28
6 1.60 2.82 8.35
7 1.62 2.82 8.19
8 1.56 2.82 8.09
9 1.62 2.84 8.17
10 1.59 2.88 8.25
11 1.55 2.81 8.04
12 1.58 2.83 8.17
13 1.66 2.85 8.03
14 1.59 2.84 8.06
15 1.51 2.87 8.28
16 1.58 2.85 8.16
17 1.61 2.86 7.94
18 1.57 2.75 8.02
19 1.59 2.77 8.15
20 1.58 2.85 8.10
均值 1.60 2.84 8.13
STD 0.04 0.04 0.11
CV 2.61％ 1.31％ 1.30％
检测例3.妥布霉素检测试剂盒线性
筛选低值样本与高值样本按照等差稀释的方法进行稀释，每个样本重复检测3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行回收率分析，结果偏差小于10％，线性能达到10μg/ml。
表4.线性
测值1 测值2 测值3 均值 理论值 相对偏差 绝对偏差
1 0.53 0.51 0.57 0.54 0.55 -0.02 -2.81％
2 1.51 1.48 1.53 1.51 1.53 -0.03 -1.73％
3 2.49 2.40 2.46 2.45 2.51 -0.06 -2.55％
4 3.46 3.48 3.43 3.46 3.50 -0.04 -1.10％
5 4.48 4.50 4.46 4.48 4.48 0.00 0.08％
6 5.53 5.33 5.47 5.44 5.46 -0.01 -0.25％
7 6.53 6.50 6.51 6.51 6.44 0.08 1.17％
8 7.61 7.60 7.61 7.61 7.42 0.19 2.53％
9 8.51 8.56 8.47 8.51 8.40 0.11 1.35％
10 9.56 9.48 9.48 9.51 9.38 0.13 1.34％
11 10.02 10.10 9.92 10.01 10.36 -0.35 -3.37％
检测例4.准确性
美国药典妥布霉素纯品溶解至不同浓度储液，以相同倍数稀释至血清中(稀释倍数最少20倍)，配置成不同浓度血清妥布霉素溶液，用本发明的试剂盒测定并计算与理论值偏差，结果回收率偏差小于6％，准确性好。
表5.准确性
USP 测值1 测值2 测值3 均值 绝对偏差 相对偏差
1.00 1.06 1.08 1.04 1.06 0.06 6.00％
1.50 1.59 1.52 1.51 1.54 0.04 2.67％
2.00 2.02 1.98 2.04 2.01 0.01 0.67％
4.00 3.04 2.94 2.97 2.98 -0.02 -0.56％
8.00 5.09 4.95 4.99 5.01 0.01 0.20％
10.00 10.12 10.01 10.05 10.06 0.06 0.60％
检测例5.抗体抑制率
1.抗体抑制率的检测原理
当抗体与G6PDH-妥布霉素偶联物结合时，由于空间位阻导致G6PDH酶活性受到影响，从而使得其催化NAD转化为NADH的效率降低，通过检测NADH量的变化，从而比较加入抗体与未加入抗体的实验组的差异，这种差异即体现为抗体对G6PDH的抑制能力。
2.反应体系：
表6.抗体抑制率的检测试剂制备
表7.抗体抑制率检测上机参数
检测机型 日立7180
分析/时间/点 2点速率/10min/10-15个点
R1/S 150:25
波长(副/主) 405/340
反应类型 递增
3.结果：
比较加入抗体与未加入抗体时，分别检测G6PDH-妥布霉素偶联物吸光度测值，即可得到抗体对G6PDH的抑制情况。
其中ΔA是指反应曲线两个测试时间点之间的吸光度差值。
表8.不同G6PDH突变体的抗体抑制率
虽然不限于具体理论，但是可以部分地解释为：和现有技术中的G6PDH突变体相比，本申请酶突变体(K56C/D306C/D454C)中突变位点(即引入游离巯基的位点)是和半抗原(比如激素、小分子药物等)发生偶联的位置所在。半抗原在这个位置上与半抗原特异性抗体结合时，所构成的空间位阻对G6PDH酶的活性影响最大，同时在引入突变后，还不能实质上影响分子的空间折叠。因此，这个突变位点的位置非常重要，需要同时兼顾G6PDH酶的活性、偶联分子的空间折叠、以及半抗原表位的充分暴露。
由于酶的突变体在抗体抑制率上有明显的提高，在定标吸光度上能够有明显的优势。将酶的突变体与半抗原偶联后的偶联物配制成试剂盒后，试剂在重复性、总不精密度、线性、特异性等性能方面有明显的性能提升。

Claims (11)

1.一种妥布霉素检测试剂盒，其包含：
第一试剂，所述第一试剂包含：
-底物、
-妥布霉素抗体、
-缓冲液；
第二试剂，所述第二试剂包含：
-偶联物、
-缓冲液；
所述偶联物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与妥布霉素衍生物按照摩尔比1：1至1：3偶联而成；
相较于假肠膜明串珠菌的野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体包含以下突变的组合：56C、306C和454C；所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是SEQ ID No.2所示；
所述妥布霉素衍生物是式I所示：
其中，
m为0至20的整数；
X选自以下任一种：马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、氮丙啶。
2.根据权利要求1所述的妥布霉素检测试剂盒，所述摩尔比是1:3。
3.根据权利要求1所述的妥布霉素检测试剂盒，其中m为1至10的整数。
4.根据权利要求3所述的妥布霉素检测试剂盒，其中m为1至6的整数。
5.根据权利要求1所述的妥布霉素检测试剂盒，其中X是马来酰亚胺。
6.根据权利要求1所述的妥布霉素检测试剂盒，其还包含校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、已知浓度的妥布霉素。
7.根据权利要求1或6所述的妥布霉素检测试剂盒，其还包含质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、已知浓度的妥布霉素。
8.根据权利要求1所述的妥布霉素检测试剂盒，其包含：
第一试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
5mM至25mM底物、
0.01μg/L至1mg/L妥布霉素抗体、
10mM至300mM NaCl、
0.1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L防腐剂；
第二试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.01μg/L至1mg/L所述偶联物、
0.1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L防腐剂；
所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；
所述第一试剂的缓冲液和所述第二试剂的缓冲液是相同的或不同的；
所述缓冲液的pH为6.5至8.0；
所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；
所述表面活性剂选自以下的一种或组合：Brij23、Brij35、Triton X-100、Triton X-405、Tween20、Tween30、Tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、AEO7；
所述防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、MIT、PC生物防腐剂、硫柳汞；
所述叠氮化物是叠氮钠或叠氮锂；
所述底物包含：6-磷酸葡萄糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
9.根据权利要求8所述的妥布霉素检测试剂盒，所述稳定剂是牛血清白蛋白。
10.根据权利要求8所述的妥布霉素检测试剂盒，所述表面活性剂是Tween20。
11.根据权利要求8所述的妥布霉素检测试剂盒，其包含：
第一试剂，其包含：
100mM至300mM缓冲液、
5mM至25mM底物、
0.01μg/L至1mg/L妥布霉素抗体、
100mM至300mM NaCl、
1g/L至5g/L稳定剂、
1g/L至5g/L表面活性剂、
1g/L至5g/L防腐剂；
第二试剂，其包含：
100mM至300mM缓冲液、
0.05μg/L至0.5mg/L所述偶联物、1g/L至5g/L稳定剂、1g/L至5g/L表面活性剂、1g/L至5g/L防腐剂。
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