CN114113264B - 基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用 - Google Patents
基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114113264B CN114113264B CN202111510911.5A CN202111510911A CN114113264B CN 114113264 B CN114113264 B CN 114113264B CN 202111510911 A CN202111510911 A CN 202111510911A CN 114113264 B CN114113264 B CN 114113264B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tobramycin
- reaction
- buffer
- double
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于电化学生物传感器领域，涉及妥布霉素的检测，特别是指基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用。当被检测物与适配体结合时，引发链1（T1）被释放，该引发链能够引发EXOⅢ辅助的核酸链循环，并产生大量的引发链2（T2）。随后，在T2的作用下，发夹探针H2和H3被相继打开，从而发生CHA反应，产生大量的H2‑H3复合物，该复合物能够与通过PolyA固定在电极表面的信号探针进行杂交，使得电化学信号降低，从而达到对目标物进行定量的目的。本方法操作简便，条件温和，灵敏度高，线性范围宽。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物传感器领域，涉及妥布霉素的检测，特别是指基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用。
背景技术
妥布霉素是一种具有广谱抗菌活性的氨基糖苷类抗生素，在人类治疗以及兽药领域具有很长的一段使用历史，并且主要用于抗感染治疗。然而，抗生素的滥用不仅会导致药物在人体内的残留，也会使各种动物类食品当中出现抗生素残留的现象，这些抗生素的残留直接威胁到了人类的健康。所以，对各种残留的抗生素进行灵敏的定量定性检测非常有必要。
至今为止，已经开发了多种用于检测妥布霉素的方法，例如荧光分析法、光电化学分析法、表面等离子体共振分析法、分子印迹法以及比色分析法等。这些已开发的方法都能够对妥布霉素进行灵敏的检测，并且分析方法可靠，但这些方法仍然存在一些不足之处，比如分析过程操作复杂、分析过程耗费时间、需要昂贵的分析仪器、样本制备过程复杂等。所以，需要开发一种分析效率更高、检测更灵敏的分析检测策略用于检测妥布霉素。
电化学传感器有着快速响应、高灵敏度以及易操作等优点，现在已被广泛使用于各种目标物的检测。为了提高电化学生物传感器的灵敏度，人们开发了各种信号放大技术，比如CHA（催化发夹自组装）、HCR（杂交链式反应）、RCA（滚环扩增）、TMSDR（toehold区域介导的链置换反应）、DNA步行器（DNA Walker），以及酶辅助的信号放大方法等。在这些放大方法中，CHA作为一种无酶的等温信号放大方法，受到了广泛关注。通常情况下，CHA反应由一条单链核酸引发链引发，而引发链的量过低的话，则会降低该反应的效率，从而影响传感器的性能。核酸外切酶Ⅲ（EXOⅢ）是一种能够催化带有平末端或凹陷型3’末端的双链核酸进行程序化降解的酶，该酶不能够消解具有长凸出3’末端的双链核酸，以及单链核酸。基于EXOⅢ的这种选择性剪切降解的特点，EXOⅢ可以用来消解特定的双链核酸，实现一种EXOⅢ辅助的核酸链循环，并产生大量的单链核酸。
为了进一步增强生物传感器的性能，科研工作者们又提出了一些方法策略，比如提高电极表面探针密度的可控性。多聚腺嘌呤（PolyA）是一种常用的核酸工具，在生物传感策略中已被广泛应用。一些科研工作者的工作已经表明，PolyA结构能够自组装与金纳米颗粒表面，并且能够通过改变PolyA的长度来调节自组装的探针的密度。基于这种优势，PolyA结构可以使电极表面的探针密度变得更具有调控性，使电极表面的探针更有序化，从而进一步提高传感器的性能。
发明内容
本发明提出一种基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用，目的在于通过EXOⅢ辅助的核酸链循环与CHA反应提高传感方法的灵敏度，并通过PolyA的探针有序性调控能力进一步提升传感器的性能，从而进行便捷快速灵敏的检测妥布霉素。
本发明的技术方案是这样实现的：
基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法，步骤如下：
（1）分别配制适配体链Apt、T1链、发夹探针H1、发夹探针H2和H3以及双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液；
（2）将表面羧基化的Fe3O4磁珠活化，经磁分离后去除上清，PBS洗脱后加入适配体链Apt缓冲溶液，振荡过夜反应后进行磁分离，去除上清后再加入T1链的缓冲溶液，经振荡过夜反应后进行磁分离，去上清、洗脱后，加入PBS重悬完成Fe3O4纳米磁珠的修饰；
（3）向步骤（2）的经修饰的Fe3O4纳米磁珠悬浮液中加入不同浓度的妥布霉素溶液/待测样品溶液，经振荡反应后进行磁分离，取上清液，向其中加入EXOⅢ水溶液、发夹探针H1缓冲溶液，继续反应结束后经高温灭活、冷却后再加入发夹探针H2缓冲溶液、发夹探针H3缓冲溶液，再反应得待检测反应体系；
（4）在玻碳电极表面沉积AuNPs，然后滴加步骤（1）配制的双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液至电极表面，反应结束后用MCH封闭液封闭电极表面未修饰的活性位点得修饰后的电极，将步骤（3）得到的待检测反应体系滴加至电极表面反应后，再进行DPV测定电化学信号，通过检测步骤（3）得到的不同浓度的妥布霉素溶液的待检测反应体系对应的DPV信号强度，建立浓度与电信号强度变化之间的线性关系方程式；
（5）将步骤（4）中的待检测反应体系替换为步骤（3）的待测样品溶液的待检测反应体系，测得的DPV信号强度代入步骤（4）的线性方程，即为待检测样品溶液中的妥布霉素浓度。
所述步骤（1）中适配体链Apt的序列如SEQ ID No.1所示，其3'端与氨基相连；T1碱基序列如SEQ ID No.2所示；发夹探针H1碱基序列如SEQ ID No.3所示；发夹探针H2碱基序列如SEQ ID No.4所示；发夹探针H3碱基序列如SEQ ID No.5所示；双链DNA探针C1-C2中的C1碱基序列如SEQ ID No.6所示、C2碱基序列如SEQ ID No.7所示，其5'端与二茂铁相连。
所述适配体链Apt和T1链的缓冲溶液是用PBS缓冲液稀释至1μM；发夹探针H1的缓冲溶液是用TM缓冲液稀释至500nM；发夹探针H2和H3的缓冲溶液是用TM缓冲液分别稀释至1μM；双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液包括单链DNA探针C1的TE缓冲液和单链DNA探针C2的TE缓冲液。
所述步骤（2）中适配体链Apt缓冲溶液的体积为200μL，振荡反应的温度为37℃；T1链的缓冲溶液的体积为200μL；PBS重悬所用的PBS缓冲溶液的体积为200μL。
所述步骤（3）中Fe3O4纳米磁珠悬浮液与不同浓度的妥布霉素溶液/待测样品溶液的反应体积均为10μL。
所述步骤（3）中EXOⅢ水溶液的浓度为2U/μL，体积为10μL；发夹探针H1、H2和H3的缓冲溶液的体积均为20μL。
所述步骤（3）中反应的温度为37℃，高温灭活的温度为85℃、时间为30min。
所述步骤（4）中双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液是将2μM的单链DNA探针C1和C2的缓冲溶液等体积混合后，37℃振荡过夜得到的；MCH封闭液的浓度为1mM。
所述步骤（4）中经过DPV测定电化学信号的电极表面探针的再生方法为将经过DPV测定电化学信号的电极用超纯水清洗后，在将单链DNA探针C2缓冲溶液滴至清洗后的电极表面，37℃孵育2h，完成电极表面探针的再生过程。
上述的妥布霉素双放大检测方法对于妥布霉素检测的线性范围为1-300nM，检出限为0.11nM。
本发明的工作原理是：当检测对象妥布霉素存在时，磁珠上与适配体链会与妥布霉素结合，从而使T1链被置换下来。经过磁分离后，磁珠以及与磁珠结合的适配体链会被分离出去，得到含有T1的上清液。T1能将加入体系的发夹探针H1打开形成带有平末端的双链T1-H1。在蛋白酶EXOⅢ辅助下，T1-H1被程序化消解，产生一条H1被部分消解后的单链T2，以及一条完整的T1链。经酶消解后产生的两条单链中，T1继续去打开下一个H1，在酶辅助下继续产生T2，从而完成EXOⅢ辅助的核酸链循环。经过EXOⅢ辅助的核酸链循环产生的T2作为CHA的引发链，能够引发H2和H3之间的CHA反应，产生大量的H2-H3双链复合物。当在修饰了C1C2信号探针的电极表面孵育反应液后，经过循环反应产生的H2-H3双链复合物中的Toehold区域能够与C2中暴露出的一段单链结合，形成C2-H2-H3复合物，使电极表面的二茂铁数量减少，从而使电化学信号降低，达到对妥布霉素浓度进行响应的目的。另外，通过在电极表面再一次滴加修饰了二茂铁的探针C2，可以使得电极表面双链探针再生，实现核酸耗材的再利用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提出了一种通过结合EXOⅢ辅助的核酸链循环与CHA反应的可再生型双放大电化学传感器策略用于灵敏检测妥布霉素。EXOⅢ辅助的核酸链循环能够促进CHA引物的释放并进一步增强信号的变化。在EXOⅢ的作用下，大量的能够引发CHA的T1被产生出来。CHA由T1催化引发，并产生H2-H3复合物，该复合物能够结合电极表面的信号探针，使电流信号产生变化。
2、本发明设计的传感器方法展示出了良好的性能，对于妥布霉素检测的线性范围为1-300nM，检出限为0.11nM，为妥布霉素分析提供了一个有前景的平台。另外，通过适当的对核酸序列进行改变再设计，该策略有望应用于其他分析物的电化学检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的检测原理示意图。
图2为本发明的不同浓度DPV响应信号叠加图，以及线性关系图；(A)传感器检测不同浓度妥布霉素的DPV信号响应曲线叠加图。(B) 不同浓度的妥布霉素与对应的信号变化量关系图（0.1-500nM），插图为妥布霉素浓度的对数与对应的信号变化量的线性关系图（1-300nM）。
图3为传感器特异性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法，步骤如下：
（1）核酸链的预处理
每种DNA分别用缓冲溶液稀释至固定浓度：
适配体链Apt用PBS缓冲液稀释至1μM，所述适配体链Apt碱基序列为：GGGACTTGGTTTAGGTAA TGAGTCCC TTTTT-NH2（SEQ ID No.1）；
T1用PBS稀释至1μM，所述T1碱基序列为：GGGACTCA TTACCTAA TACGCATC CTTCCTT（SEQ ID No.2）；
所述缓冲液PBS成分为: 0.1M Na2HPO4, 0.1M NaH2PO4, 0.1M NaCl, 0.1M KCl,pH 7.4。
H1用TM缓冲液稀释至500nM，所述发夹探针H1碱基序列为：TTACCTAA TACGCATCTGACTGAC GATGCGTA TTAGGTAA TGAGTCCC（SEQ ID No.3）；
所述缓冲液TM成分为: 10 mM Tris-HCl, 0.1M NaCl, 10 mM MgCl2, pH 7.4。
H2、H3用TM缓冲液稀释至1μM，所述发夹探针H2、H3碱基序列分别为：
H2：GTCAGTCA GATGCGTA TTAGGTAA ATCACACAAGG TTACCTAA TACGCATCGTGGATTATTACAGAG（SEQ ID No.4）；
H3：TTAGGTAA CCTTGTGTGAT TTACCTAA TACGCATC ATCACACAAGG（SEQ ID No.5）；
C1、C2用TE缓冲液稀释至2μM。所述C1碱基序列为：GTGGATTATTACAGAG AAAAAAAAAA（SEQ ID No.6）；
所述C2碱基序列为：Fc-CTCTGTAATAATCCAC GATGCGTA（Fc为二茂铁）（SEQ IDNo.7）；
所述缓冲液TE成分为： 10 mM Tris-HCl, 1M NaCl, 1mM EDTA, pH7.4。
C1、C2稀释之后等体积混合，在37℃下振荡过夜，得到C1C2。
（2）构建修饰适配体链以及T1链修饰的Fe3O4纳米磁珠
取50μL 表面羧基化的Fe3O4磁珠加入离心管中，经磁分离后，用含0.02% 吐温-20的PBS缓冲液洗脱三次，每次200μL。随后再用不含吐温-20的PBS洗脱三次，每次200μL。经磁分离去除溶液后，向管中加入100μL 20mg/ml的EDC溶液和100μL 40mg/ml的NHS溶液，在37℃下振荡活化1h。活化结束后进行磁分离，去除上清液，用PBS洗脱三次，之后向管中加入浓度为1μM的氨基修饰的适配体链Apt 200μL，在37℃下振荡过夜。反应结束后对溶液进行磁分离，去除上清液，向管中加入200μL 1μM的T1链溶液，并在37℃下振荡反应1h。反应结束后，进行磁分离，去除上清液，用PBS洗脱三次，最后向管中加入200μL PBS，重新悬浮修饰完成的磁珠，储存于4℃备用。
（3）均相溶液中的链扩增过程
在200μL的离心管中，加入10μL的上述磁珠悬浮液，分别再加入10μL不同浓度的妥布霉素水溶液，在37℃振荡反应1h。反应结束后对溶液进行磁分离，去除磁珠，保留上清液。随后，向上清液中加入10 μL 2U/μL的EXOⅢ水溶液、20μL 500nM的H1溶液，在37℃反应2h。反应结束后，在85℃下对EXOⅢ进行灭活30分钟，再在室温下冷却30分钟。灭活结束后，向上述反应液中加入20μL 1μM的H2溶液和20μL 1μM的H3溶液，在37℃反应2h。
（4）电极表面的探针修饰及信号放大过程
玻碳电极经0.3μm和0.05μm的抛光粉处理并超声清洗后，在1% HAuCl4溶液中使用恒电位沉积法在-0.2V下电沉积40s，在玻碳电极表面沉积AuNPs。沉积金结束后，将信号探针C1C2溶液滴至电极表面，37℃孵育过夜。孵育结束后，在电极表面孵育10μL 1mM的MCH 40分钟，封闭未修饰的活性位点。封闭结束后，取10μL 反应液滴至电极表面，在37℃反应2h。反应结束后，在含有NaClO4的PBS缓冲液中进行DPV测定电化学信号。通过测定不同浓度的妥布霉素反应溶液对应的DPV信号强度，建立浓度与电信号强度变化之间的线性关系方程式。线性方程为△I=0.42637logC+0.15513，线性关系图见附图2，其他参数见表1。
表1.妥布霉素标准溶液工作曲线
实施例2：特异性实验
取6支微量离心管，按照实施例1的操作方法，除了每个离心管内加入的被测物质不同，其他实验操作一致。所测物质分别为超纯水、卡那霉素(100nM)、四环素(100nM)、头孢氨苄(100nM)、阿莫西林(100nM)和妥布霉素(10nM)。样本反应液制作完毕后，按照同样的测定方法，测量相对应的电流强度。传感器特异性测量结果见附图3。从附图3可知，当其他抗生素的浓度为妥布霉素的10倍时，DPV信号与空白信号相近，说明该传感器对妥布霉素具有优秀的特异性。
应用例1：正常人血清的检测
取3支微量离心管，每管加入1μL正常人血清样本，再加入49μL超纯水稀释至50μL。随后，分别向每管加入不同浓度的妥布霉素标准溶液。取10μL处理后的加标样本，按照实施例1的操作方法，制备反应液，再通过DPV测定相对应的电化学信号，根据线性方程计算对应的回收量、回收率和RSD值。实验结果见下表2。
表2正常人血清加标回收实验结果
从上表2可以看出，本实施例2测试结果的相对标准偏差（RSD）为2.00-8.33%，加标回收率为97.50-104.84 %，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。
应用例2：牛奶的检测
取1ml超市售卖纯牛奶，加入1ml 10%三氯乙酸，再10000r离心5min,取上清液。取三份等量的离心后牛奶上清，分别加入不同浓度的妥布霉素标准溶液，制备成标准牛奶样品。
按照实施例1的操作方法，制备标准牛奶样品的反应液，通过DPV测定相对应浓度样品的电化学信号，根据线性方程计算对应的回收量、回收率和RSD值。实验结果见下表3。
表3牛奶样本加标回收实验结果
从上表3可以看出，本实施例3测试结果的相对标准偏差（RSD）为1.04-1.78%，加标回收率为94.50-103.18 %，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 郑州大学
<120> 基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用
<141> 2021-12-11
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gggacttggt ttaggtaatg agtccctttt t 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
gggactcatt acctaatacg catccttcct t 31
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ttacctaata cgcatctgac tgacgatgcg tattaggtaa tgagtccc 48
<210> 4
<211> 67
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
gtcagtcaga tgcgtattag gtaaatcaca caaggttacc taatacgcat cgtggattat 60
tacagag 67
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
ttaggtaacc ttgtgtgatt tacctaatac gcatcatcac acaagg 46
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
gtggattatt acagagaaaa aaaaaa 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
ctctgtaata atccacgatg cgta 24
Claims (9)
1.基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）分别配制适配体链Apt、T1链、发夹探针H1、发夹探针H2和H3以及双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液；其中适配体链Apt的序列如SEQ ID No.1所示，其3'端与氨基相连；T1碱基序列如SEQ ID No.2所示；发夹探针H1碱基序列如SEQ ID No.3所示；发夹探针H2碱基序列如SEQID No.4所示；发夹探针H3碱基序列如SEQ ID No.5所示；双链DNA探针C1-C2中的C1碱基序列如SEQ ID No.6所示、C2碱基序列如SEQ ID No.7所示，其5'端与二茂铁相连；
（2）将表面羧基化的Fe3O4磁珠活化，经磁分离后去除上清，PBS洗脱后加入适配体链Apt缓冲溶液，振荡过夜反应后进行磁分离，去除上清后再加入T1链的缓冲溶液，经振荡过夜反应后进行磁分离，去上清、洗脱后，加入PBS重悬完成Fe3O4纳米磁珠的修饰；
（3）向步骤（2）的经修饰的Fe3O4纳米磁珠悬浮液中加入不同浓度的妥布霉素溶液/待测样品溶液，经振荡反应后进行磁分离，取上清液，向其中加入EXOⅢ水溶液、发夹探针H1缓冲溶液，继续反应结束后经高温灭活、冷却后再加入发夹探针H2缓冲溶液、发夹探针H3缓冲溶液，再反应得待检测反应体系；
（4）在玻碳电极表面沉积AuNPs，然后滴加步骤（1）配制的双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液至电极表面，反应结束后用MCH封闭液封闭电极表面未修饰的活性位点得修饰后的电极，将步骤（3）得到的待检测反应体系滴加至电极表面反应后，再进行DPV测定电化学信号，通过检测步骤（3）得到的不同浓度的妥布霉素溶液的待检测反应体系对应的DPV信号强度，建立浓度与电信号强度变化之间的线性关系方程式，线性方程式为△I=0.42637logC+0.15513；
（5）将步骤（4）中的待检测反应体系替换为步骤（3）的待测样品溶液的待检测反应体系，测得的DPV信号强度代入步骤（4）的线性方程，即为待检测样品溶液中的妥布霉素浓度。
2.根据权利要求1所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述适配体链Apt和T1链的缓冲溶液是用PBS缓冲液稀释至1μM；发夹探针H1的缓冲溶液是用TM缓冲液稀释至500nM；发夹探针H2和H3的缓冲溶液是用TM缓冲液分别稀释至1μM；双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液包括单链DNA探针C1的TE缓冲液和单链DNA探针C2的TE缓冲液。
3.根据权利要求2所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中适配体链Apt缓冲溶液的体积为200μL，振荡反应的温度为37℃；T1链的缓冲溶液的体积为200μL；PBS重悬所用的PBS缓冲溶液的体积为200μL。
4.根据权利要求3所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中Fe3O4纳米磁珠悬浮液与不同浓度的妥布霉素溶液/待测样品溶液的反应体积均为10μL。
5.根据权利要求4所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中EXOⅢ水溶液的浓度为2U/μL，体积为10μL；发夹探针H1、H2和H3的缓冲溶液的体积均为20μL。
6.根据权利要求5所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中反应的温度为37℃，高温灭活的温度为85℃、时间为30min。
7.根据权利要求1所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中双链DNA探针C1-C2的缓冲溶液是将2μM的单链DNA探针C1和C2的缓冲溶液等体积混合后，37℃振荡过夜得到的；MCH封闭液的浓度为1mM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中经过DPV测定电化学信号的电极表面探针的再生方法为将经过DPV测定电化学信号的电极用超纯水清洗后，在将单链DNA探针C2缓冲溶液滴至清洗后的电极表面，37℃孵育2h，完成电极表面探针的再生过程。
9.根据权利要求8所述的妥布霉素双放大检测方法，其特征在于：对于妥布霉素检测的线性范围为1-300nM，检出限为0.11nM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111510911.5A CN114113264B (zh) | 2021-12-11 | 2021-12-11 | 基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111510911.5A CN114113264B (zh) | 2021-12-11 | 2021-12-11 | 基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114113264A CN114113264A (zh) | 2022-03-01 |
| CN114113264B true CN114113264B (zh) | 2023-07-07 |
Family
ID=80364249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111510911.5A Active CN114113264B (zh) | 2021-12-11 | 2021-12-11 | 基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114113264B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021139375A1 (zh) * | 2020-01-07 | 2021-07-15 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途 |
| CN113278684A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-20 | 江南大学 | 基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592187B (zh) * | 2019-09-20 | 2022-06-24 | 江南大学 | 基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法 |
| CN111879738B (zh) * | 2020-06-15 | 2023-03-14 | 山东师范大学 | 一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用 |
| CN112226492B (zh) * | 2020-11-06 | 2022-08-19 | 青岛科技大学 | 一种检测miRNA的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系 |
| CN113341128B (zh) * | 2021-06-02 | 2023-05-16 | 江苏第二师范学院 | 一种检测妥布霉素的生物传感器及检测方法 |
| CN113552188B (zh) * | 2021-07-23 | 2022-06-10 | 济南大学 | 一种基于dna四面体的检测赭曲霉毒素a的电化学生物传感器 |
| CN113640268B (zh) * | 2021-08-30 | 2023-03-28 | 南京林业大学 | 一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法 |
-
2021
- 2021-12-11 CN CN202111510911.5A patent/CN114113264B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021139375A1 (zh) * | 2020-01-07 | 2021-07-15 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途 |
| CN113278684A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-08-20 | 江南大学 | 基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 纳米磁珠-电化学适配体传感技术检测牛奶中氨苄青霉素;朱俊亚;李芳;赵兰馨;李席席;刘云宏;;食品科学(第24期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114113264A (zh) | 2022-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ali et al. | Molecular imprinted polymer combined with aptamer (MIP-aptamer) as a hybrid dual recognition element for bio (chemical) sensing applications. Review | |
| US10605761B2 (en) | Electrochemical biosensor based on aptamer/nano silver probe and EXO I enzyme | |
| Kavita | DNA biosensors-a review | |
| Hassen et al. | An impedimetric DNA sensor based on functionalized magnetic nanoparticles for HIV and HBV detection | |
| Xu et al. | Electrochemical biosensors based on magnetic micro/nano particles | |
| US20170159113A1 (en) | Methods and compositions for detection of analytes | |
| Xu et al. | An aptamer‐based protein biosensor by detecting the amplified impedance signal | |
| Fu et al. | Application progress of microfluidics-integrated biosensing platforms in the detection of foodborne pathogens | |
| Cheng et al. | A simple electrochemical aptasensor for ultrasensitive protein detection using cyclic target-induced primer extension | |
| Xu et al. | Highly sensitive antibody-aptamer sensor for vascular endothelial growth factor based on hybridization chain reaction and pH meter/indicator | |
| CN109211997B (zh) | 一种检测β-淀粉样蛋白的基于THMS的电化学发光适体传感器及其制备方法和应用 | |
| CN110006971B (zh) | 一种双通道输出检测食源性致病菌的适体传感器的制备方法及其应用 | |
| Cao et al. | An ultrasensitive biosensor for virulence ompA gene of Cronobacter sakazakii based on boron doped carbon quantum dots-AuNPs nanozyme and exonuclease III-assisted target-recycling strategy | |
| Tran et al. | Simple label-free electrochemical immunosensor in a microchamber for detecting newcastle disease virus | |
| CN111474224B (zh) | 一种检测痕量卡那霉素的可再生电化学传感器及其制备方法与应用 | |
| CN114113264B (zh) | 基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用 | |
| EP0816850B1 (en) | A method for measuring antigen concentration | |
| CN113584129B (zh) | p53基因检测探针、所得生物传感器及其应用 | |
| Breimer et al. | Integrated capillary fluorescence DNA biosensor | |
| CN102099494A (zh) | 用于检测和/或定量噬菌体的方法和系统,用于检测所述噬菌体的微电子传感器装置的应用以及用于实现所述方法的微电子传感器装置 | |
| Yalcin et al. | Nanobiosensor and food pathogen interaction mechanisms. | |
| Ilhan et al. | Optical Based Transducers for Biosensors | |
| CN113406163A (zh) | 用于灵敏检测痕量镍离子的磁诱导自组装电化学生物传感器及其应用 | |
| Davis et al. | General introduction to biosensors and recognition receptors | |
| CN106399492B (zh) | 一种用bsa等电点封闭液构建可再生dna杂交界面的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |