CN113341128B - 一种检测妥布霉素的生物传感器及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测妥布霉素的生物传感器，其包括适配体探针、发夹探针H1、发夹探针H2、Klenow Fragment聚合酶、Nt.BbvCI核酸内切酶、缓冲液和氧化石墨烯，适配体探针的序列如SEQ ID No：1所示，适配体探针为序列如SEQ ID No：2所示的适配体Aptamer和序列如SEQ ID No：3所示的扩增模板T杂交而成，发夹探针H1的序列如SEQ ID No：4所示，发夹探针H2的序列如SEQ ID No：5所示。利用该生物传感器检测妥布霉素时，方法简单，实用性好，稳定性高，检测下限达到0.06nM，低于现有的同类传感器，在环境监测和食品安全领域中，具有广阔的应用前景。

Description

一种检测妥布霉素的生物传感器及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测妥布霉素的生物传感器及检测方法。
背景技术
妥布霉素(Tobramycin)是一种氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗由需氧革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌所引起的细菌感染。然而，妥布霉素的滥用可能对人类的生命健康造成不可逆的副作用，包括肾毒性、神经肌肉阻滞和过敏反应。由于妥布霉素的价格较低，所以到目前为止妥布霉素仍然被广泛用于畜牧业，导致在食物链中，如湖水，牛奶，鸡蛋和肉类中还存在潜在的残留。
许多常规分析技术已用于检测抗生素，包括气相色谱，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-质谱(LC-MS)，毛细管电泳和酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而，由于氨基糖苷类抗生素缺乏紫外发色团或荧光基团，因此在妥布霉素的检测方面仍然存在很大的挑战。另外，这些传统技术通常需要昂贵的分析仪器，复杂的样品制备和测试过程，较长的操作时间，有时还具有较高的假阳性率。因此，建立一种高效，快速的农产品和环境中妥布霉素残留测定方法具有重要意义。
适配体是指短的单链寡核苷酸，能够与离子，小分子，多肽甚至细胞等多种靶分子有较高的亲和力和较强的特异性，而被广泛地用作识别元件。目前为止，已经报道了多种针对抗生素的适配体，包括卡那霉素，链霉素，四环素，氯霉素，氧氟沙星和妥布霉素。因此，通过使用不同的信号输出技术，如电化学法，比色法，荧光法和化学发光法，建立各式各样基于适配体的生物传感器。另外，为了实现高灵敏度，核酸生物传感器中还应用了不同的信号放大技术，特别是等温DNA扩增策略引起了科学家们的关注，如滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)和杂交链反应扩增(HCR)。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中妥布霉素的检测方法存在的特异性和灵敏度比较低、成本高、检测周期长的问题，提供一种检测妥布霉素的生物传感器，其成本低，用于检测妥布霉素时，特异性和灵敏度都比较高，并且检测速度快。
本发明的另一目的还在于提供采用上述生物传感器检测妥布霉素的方法。
技术方案
一种检测妥布霉素的生物传感器，包括适配体探针、发夹探针H1、发夹探针H2、Klenow Fragment聚合酶、Nt.BbvCI核酸内切酶、缓冲液和氧化石墨烯；
所述适配体探针的核苷酸序列为：5′-GAG GAA CTG GAG TCA CAA GCT GAG GATGTG ACTCCA GGC ACT TAG TCA CA-3′(SEQ ID No：1)，适配体探针为适配体Aptamer和扩增模板T杂交而成，所述适配体Aptamer的核苷酸序列为：5′-TG ACT CCA GGC ACT TAG TCA-3′(SEQ ID No：2)，所述扩增模板T的核苷酸序列为：5′-GAG GAA CTG GAG TCA CAA GCTGAG GA-3′(SEQ ID No：3)。
所述发夹探针H1的核苷酸序列为：5′-GAG GAA CTG GAG TCA CAA GCT GAC ATATCT CAG CTT GTG ACT CCA G-3′(SEQ ID No：4)。
所述发夹探针H2的核苷酸序列为：5′-TCA GCT TGT GAC TCC AGT TCC TCC TGGAGT CAC AAG CTG AGA TATG-3′(SEQ ID No：5)。
适配体Aptamer和扩增模板T杂交为适配体探针，形成一个茎环结构，当加入目标物妥布霉素后，目标物妥布霉素和适配体Aptamer特异性结合，得到适配体-妥布霉素复合体，从而导致适配体的构象转换和扩增模板T的释放，随后，适配体-妥布霉素复合体的3’端作为引物模板，在Klenow Fragment聚合酶的帮助下触发3’端-5’端的延伸反应，延伸反应后的双链结构具有完整的Nt.BbvCI核酸内切酶的识别位点，因此发生触发链取代扩增反应(SDA)，产生大量的单链引物Trigger DNA；单链引物Trigger DNA与H1中的粘性末端碱基互补，通过链置换反应打开H1的发夹结构，H2的粘性末端与打开结构后的H1中的部分碱基互补配对，完成H1和H2的组装，并且不断循环，直到H1和H2耗尽，从而实现无酶的信号放大，通过测量荧光强度来定量检测妥布霉素。
上述生物传感器检测妥布霉素的方法，包括如下步骤：
(1)将适配体Aptamer和扩增模板T杂交为适配体探针，加入水、缓冲液，95℃金属浴中孵育3-5min，然后冷却，得到适配体发夹结构产物；
(2)将发夹探针H1、发夹探针H2、水和缓冲液混合后在95℃金属浴中孵育3-5min，冷却后得到发夹结构产物；
(3)将适配体发夹结构产物、妥布霉素检测物、10x smart cutbuffer，dNTP，Nt.BbvCI核酸内切酶和Klenow Fragment聚合酶混合均匀后金属浴中孵育，然后加入步骤(2)制得的发夹结构产物，混合均匀，得到链置换反应溶液；
(4)往链置换反应溶液中加入氧化石墨烯溶液，金属浴中孵育后，利用荧光分光光度计测量荧光信号。
进一步，步骤(1)中，所述适配体探针用量为1uL、100μM，水的用量为61.5uL，缓冲液为2x T-100Na，用量为62.5uL，所述缓冲液2x T-100Na配方(每L)：25mM Tris,100mMNaCl,pH 7.3。
进一步，步骤(2)中，所述发夹探针H1和H2的摩尔比为1:1，发夹探针H1和H2的总用量为1uL、100μM，水的用量为79uL，缓冲液为5x T-500Na，用量为20uL，所述缓冲液5x T-500Na配方(每L)：25mM Tris,500mM NaCl,pH 7.3。
进一步，步骤(3)中，适配体发夹结构产物用量为1.5uL、800nM，妥布霉素检测物为3uL，10x smart cutbuffer用量为3uL，dNTP为1uL、10mM，Nt.BbvCI核酸内切酶为2U，KlenowFragment聚合酶为0.5U；所述10x smart cut buffer配方为：50mM乙酸钾，20mM三羟基氨甲烷醋酸盐，10mM醋酸镁，100μg/mL牛血清蛋白，pH 7.9。
进一步，步骤(3)中，孵育温度为37℃，时间为1-2h。
进一步，步骤(4)中，加入氧化石墨烯溶液后，氧化石墨烯在链置换反应溶液中的终浓度为25μg/mL。
进一步，步骤(4)中，孵育温度为37℃，时间为1-2h。
进一步，步骤(4)中，设置荧光分光光度计激发波长为480nm，扫描范围为500-650nm。
本发明的有益效果：
本发明的荧光生物传感器线检测下限达到0.06nM，可满足多种应用的灵敏度要求。在检测实际样品时，方法简单，实用性较好，稳定性较高，能够很好地适应复杂样品的检测。本发明的荧光生物传感器对妥布霉素的最低检测限低于目前所报道的同类传感器，在环境监测和食品安全领域中，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的生物传感器检测妥布霉素的原理图；
图2为实施例1的生物传感器的可行性验证结果；
图3为采用不同引物序列长度的适配体探针得到的SDA反应产物的电泳图；
图4为发夹探针环长度对HCR反应影响的电泳结果；
图5为氧化石墨烯浓度对荧光淬灭效果影响的荧光图谱；
图6为荧光强度与妥布霉素浓度关系的荧光图谱；
图7为本发明的生物传感器检测妥布霉素的标准曲线；
图8为本发明的生物传感器检测妥布霉素的特异性分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中，Klenow Fragment聚合酶、Nt.BbvCI核酸内切酶购于NEB(北京)有限公司，但不限于此。
实施例1
一种检测妥布霉素的生物传感器，包括适配体探针、发夹探针H1、发夹探针H2、Klenow Fragment聚合酶、Nt.BbvCI核酸内切酶、缓冲液和氧化石墨烯；
所述适配体探针的序列为：5′-GAG GAA CTG GAG TCA CAA GCT GAG GAT GTG ACTCCA GGC ACT TAGTCACA-3′(SEQ ID No：1)，适配体探针为适配体Aptamer和扩增模板T杂交而成，所述适配体Aptamer的核苷酸序列为：5′-TG ACT CCA GGC ACT TAG TCA-3′(SEQ IDNo：2)，所述扩增模板T的核苷酸序列为：5′-GAG GAA CTG GAG TCA CAA GCT GAG GA-3′(SEQ ID No：3)。
所述发夹探针H1的核苷酸序列为：5′-GAG GAA CTG GAG TCA CAA GCT GAC ATATCT CAG CTT GTG ACT CCA G-3′(SEQ ID No：4)。
所述发夹探针H2的核苷酸序列为：5′-TCA GCT TGT GAC TCC AGT TCC TCC TGGAGT CAC AAG CTG AGA TATG-3′(SEQ ID No：5)。
适配体Aptamer和扩增模板T杂交为适配体探针，形成一个茎环结构，当加入目标物妥布霉素后，目标物妥布霉素和适配体Aptamer特异性结合，得到适配体-妥布霉素复合体，从而导致适配体的构象转换和扩增模板T的释放，随后，适配体-妥布霉素复合体的3’端作为引物模板，在Klenow Fragment聚合酶的帮助下触发3’端-5’端的延伸反应，延伸反应后的双链结构具有完整的Nt.BbvCI核酸内切酶的识别位点，因此发生触发链取代扩增反应(SDA)，产生大量的单链引物Trigger DNA；单链引物Trigger DNA与H1中的粘性末端碱基互补，通过链置换反应打开H1的发夹结构，H2的粘性末端与打开结构后的H1中的部分碱基互补配对，完成H1和H2的组装，并且不断循环，直到H1和H2耗尽，从而实现无酶的信号放大，通过测量荧光强度来定量检测妥布霉素。
适配体探针、H1、H2以及单链引物Trigger DNA的核苷酸序列见表1：
表1寡核苷酸序列
Figure GDA0003140660810000051
注：(1)DNA序列的方向均为5'端至3'端。
(2)斜体表示区域为适配体Aptamer序列；黑色加粗表示Nb.BbvCI酶切位点；波浪下划线表示H1和H2中环长部分；直线下划线表示H1和H2的粘性末端。
(3)FAM表示荧光基团修饰。
表1中的寡核苷酸序列(包括适配体探针(适配体Aptamer和扩增模板T)、发夹探针H1、发夹探针H2)均由生工生物工程(上海)股份有限公司通过HPLC纯化方式提供。
实施例2
本发明的生物传感器检测妥布霉素的原理图见图1。
利用实施例1的生物传感器检测妥布霉素的方法，包括如下步骤：
(1)将适配体Aptamer和模板T杂交为适配体探针，1uL(100μM)适配体探针、61.5uL水、62.5uL 2x T-100Na(25mM Tris,100mM NaCl,pH 7.3)，于95℃金属浴中孵育3-5min，然后缓慢冷却1-2h，得到适配体发夹结构产物；
(2)将1uL(100μM)带有荧光基团修饰的H1和H2、79uL水和20uL 5x T-500Na(25mMTris,500mM NaCl,pH7.3)，混合后在95℃金属浴中孵育3-5min，缓慢冷却1h后得到发夹结构产物；整个反应过程要注意避光；
(3)将1.5uL(800nM)适配体发夹结构产物、3uL妥布霉素检测物、3uL 10xsmartcut buffer，1uL(10mM)dNTP，2U Nt.BbvCI核酸内切酶和0.5U Klenow Fragment聚合酶混合均匀后于37℃金属浴中孵育1-2h，然后加入10uL(10μM)步骤(2)制得的发夹结构产物，混合均匀，得到链置换反应溶液；
所述10x smart cut buffer配方为：50mM乙酸钾，20mM三羟基氨甲烷醋酸盐，10mM醋酸镁，100μg/mL牛血清蛋白，pH7.9。
(4)往链置换反应溶液中加入氧化石墨烯溶液，石墨烯的终浓度为25μg/mL，37℃金属浴中孵育1-2h后，利用荧光分光光度计测量荧光信号。激发波长为480nm，扫描范围为500-650nm。整个反应过程均要注意避光。
实施例3
图2为实施例1的生物传感器的的可行性验证结果，图中，---·线代表只加入荧光发夹H1；……线代表加入荧光发夹H1/H2；-·-·-线代表加入适配体探针和荧光发夹H1/H2，以上三个样品均未加入靶标物妥布霉素。-··-···代表加入妥布霉素，适配体探针和荧光发夹H1；-·-·-·-·线代表加入妥布霉素和荧光发夹H1/H2；——代表加入妥布霉素，适配体探针以及荧光发夹H1/H2，以上三个样品均加入了靶标物妥布霉素。所有样品在检测前均加入了过量的氧化石墨烯。实验结果表明，仅在妥布霉素、适配体探针和H1/H2同时存在时，能够测到强烈的荧光信号，与检测原理相一致。实验结果进一步证实了荧光发夹探针(H1或H2)能够紧密吸附在氧化石墨烯表面，使得荧光基团能够被有效的淬灭。在不加妥布霉素的对照组中，H1和H2的荧光信号很弱，说明只有在妥布霉素加入后，适配体的结构才能被打开，启动SDA反应生成触发链，H1和H2之间的HCR反应才会启动。
虽然加入了妥布霉素，但由于HCR反应的失败和氧化石墨烯对荧光信号的吸收，H1/H2仍保留少量荧光信号(-·-·-·-·线)。为了验证荧光信号确实是妥布霉素的加入而触发HCR反应产生的，而不是仅通过荧光发夹直接产生。本次试验中做了一个仅以H1为发夹探针的实验。从图2中可以看到，只使用H1为探针时，只产生了非常微弱荧光信号。这清楚地表明，当靶标物存在时，是由于HCR反应，才能够产生大量的荧光信号。这一结果表明，我们设计的荧光法对妥布霉素的痕量检测是可行的。
实施例4
本发明的生物传感器的核心在于适配体探针的设计，该探针包含一个适配体序列和一个扩增模板。多功能适配体探针存在妥布霉素时会发生构象变化，形成具有引物序列的妥布霉素-适配体复合物。为了保证引物序列能够有效触发SDA的延长，我们对多功能适配体探针的引物序列长度进行探究。在本发明中，共设计了三种多功能适配体探针，引物序列长度分别为5bp、7bp和9bp。
图3为采用不同引物序列长度的适配体探针得到的SDA反应产物的电泳图，图中，Lane 1为适配体链，Lane 2为Trigger DNA对照链，从Lane 3到lane 9，适配体浓度和两种酶的酶量均保持不变，唯一变量是妥布霉素的浓度。妥布霉素的工作浓度逐渐增加，浓度分别为0nM、10nM、100nM、300nM、500nM、700nM、1000nM。如图3(B)中显示，在不同浓度的妥布霉素条件下，适配体发夹结构在妥布霉素作用下良好的进行了SDA反应，生成产物TriggerDNA链，并且随着妥布霉素浓度的增加，Trigger DNA对应位置处的条带条带亮度越来越深，表明所得到Trigger DNA链的量也呈现逐渐增加的趋势。这也进一步证明了作为本次构建的生物传感器能够通过妥布霉素辅助特异性的进行SDA反应获得所需要的目标序列。值得注意的是，在Lane3中，在不存在妥布霉素时，在产物Trigger DNA的位置处，也产生了一条暗淡的浅灰色条带，这可能是发夹结构在SDA反应中，由于发夹结构在酶反应buffer加入后，离子条件发生变化所造成结构的转换。故在后续荧光测定的数值中，需要将这一背景进行扣除。通过图3可以看出，在相同浓度下，当引物序列为7bp时，切割产物位置处产生条带的颜色更深，表明SDA反应产物有效增多；而引物序列为5bp时，即使是在1000nM的妥布霉素作用下，生产的产物条带也很暗淡，这可能是由于引物序列过短，难以有效的触发SDA的后续反应；而引物序列为9bp时，再不同靶标浓度下产物条带颜色梯度关系并不是很好。
实施例5
在HCR反应过程中，发夹结构的茎环长度对于HCR反应的效率有较大的影响。在本发明中，所设计的荧光发夹结构探针，包含三个部分：可自身互补的颈长，中间的环长和露出的触角。为了保证HCR反应的顺利进行，我们对荧光发夹结构探针的环长进行探究。对此，我们设计了三组荧光发夹，环长分别为5bp，6bp，7bp。如图4，lane 1为H1(5bp)+H2(5bp)，lane 2为Trigger DNA+H1(5bp)+H2(5bp)，lane 3为H1(6bp)+H2(6bp)，lane 4为TriggerDNA+H1(6bp)+H2(6bp)，lane 5为H1(7bp)+H2(7bp)，lane 6为Trigger DNA+H1(7bp)+H2(7bp)。根据电泳分析结果，由lane 4可以明显看出当环长为6bp时候，能够在胶图的上方产生了大量的HCR反应产物。相较于环长为5bp和7bp的发夹，环长为6bp的发夹结构在相同的时间内，在触发链的辅助下发夹结构更容易打开，HCR反应更加活跃。故在后续的实验中，荧光发夹结构选用H1(6bp)和H2(6bp)。
实施例6
在本发明中，利用氧化石墨烯能够吸附单链DNA并且淬灭荧光基团这一特性，作为信号输出元件。但氧化石墨烯能否有效淬灭发夹H1和H2的荧光是设计HCR-氧化石墨烯检测方法的关键。在本实验HCR中，荧光发夹H1和H2的最终浓度均为50nM。当荧光发夹H1和H2浓度固定时，本课题组设置了不同的氧化石墨烯浓度梯度，分别为0，5，10，15，20，25，30，40，50μg/mL，来探究最适淬灭荧光的石墨烯浓度。如图5所示，当不加入氧化石墨烯时，荧光发夹H1和H2所发射的荧光信号达到13000+。而随着氧化石墨烯浓度的增加，荧光发夹H1和H2的荧光强度明显降低，表明石墨烯淬灭荧光基团正在有序进行；当氧化石墨烯浓度高于25μg/mL时，荧光信号强度逐渐趋于稳定，最终不再发生变化。这说明在本发明中信号输出元件所需要的氧化石墨烯量已经饱和，有足够的氧化石墨烯能够将荧光信号控制在稳定的数值。因此，本发明中采用25μg/mL氧化石墨烯进行分析，以保证较高的检测效率。
实施例7
将不同浓度的妥布霉素(浓度分别为0nM,0.5nM,1nM,3nM,5nM,10nM,15nM,20nM,30nM,50nM,100nM)加入到本发明设计的生物传感器中，并根据荧光分光光度计测定所获得的荧光信号强度与妥布霉素浓度间的线性关系来验证妥布霉素定量分析，确定本研究中所开发的荧光传感器对妥布霉素检测的灵敏度。本研究检测限的计算公式，根据Vashist团队的检测限(LOD)的计算方法：最低检测限对应的吸光度值＝平均空白吸光度值+3σ(标准偏差)的空白值，也称为3σ原理。
荧光强度与妥布霉素浓度关系的荧光图谱见图6，可以看出，在0-100nM的范围内，随着妥布霉素增加，荧光光谱在F520处的吸收峰也随之增加。
实施例8
标准曲线的绘制：
将不同浓度的妥布霉素(浓度分别为0nM,0.5nM,1nM,3nM,5nM,10nM,15nM,20nM,30nM,50nM,100nM)加入到本发明设计的生物传感器中，对不同浓度的妥布霉素所对应的荧光信号进行分析，同一组样品重复进行三次测定，将所测得的荧光信号数据，借助Origin绘图软件，进行标准曲线的绘制，如图8所示。
经过统计分析显示，当妥布霉素的浓度在0.5nM至30nM之间时，妥布霉素浓度和荧光信号值之间呈正相关(R2＝0.996)，存在良好的线性关系。线性回归方程为方程可表示为y＝158.21x+31.68，其中x为妥布霉素的浓度(nM)；y表示不同浓度的妥布霉素所对应的荧光信号值(ΔF＝F-F0,F代表测得荧光信号值；F0代表背景信号值；ΔF代表测得荧光信号值减去背景信号值)。通过LOD值计算，本次设计的荧光生物传感器对妥布霉素的检测限为0.06nM(N/S＝3)，远远低于我国饮用水中规定的妥布霉素限制浓度。
实施例9
特异性测试：
为了评估本次发明所设计的生物传感器的特异性，在最佳检测条件下，选择妥布霉素、卡那霉素、四环素、链霉素、新霉素、氨苄青霉素、庆大霉素这七种抗生素，并应用实施例1的生物传感器进行同时检测，并通过比较检测结果来验证该传感器的特异性。在实验中，妥布霉素的浓度为1nM，其他对照样品的浓度分别为1nM，10nM，100nM。通过荧光分光光度仪在520nm波长处测量荧光信号强度。并将检测后的每种抗生素之间的F520的差值进行比较，以评估本研究中所设计的荧光生物传感器的特异性。
特异性测试结果见图8，可以看出，即便是在高浓度条件下，在妥布霉素的存在下所获得的荧光强度也远高于检测其他抗生素时的荧光强度。因此，所构建的荧光生物传感器对妥布霉素具有优良的特异性。
实施例10
应用测试：
以湖水(湖水取自南京玄武湖水样)和牛奶(卫岗纯牛奶)为实际样本，用实施例1的生物传感器进行实际样品检测分析。选取1mL实际样品，用1％(v/v)三氯乙酸将其pH值调至4.6后，用高速离心机12000r/min离心15min后，再用0.2μm的过滤膜过滤，并重复上述实验两次，所获得滤液放置在-4℃备用。将制得的湖水和牛奶样品用超纯水稀释100倍后，加入不同浓度的妥布霉素溶液标准品，最后取3uL样品溶液(1nM、5nM、10nM、20nM)，通过本发明所设计的生物传感器进行实际检测。
实验结果显示表2：
表2
Figure GDA0003140660810000101
由表2可以看出，样品牛奶的平均回收率为94.1％～106.3％，RSD(相对标准偏差＝标准偏差/算术平均值)范围为2.5％～4.5％；样品湖水的平均回收率为98.20％～103.63％，RSD范围为2.03％～2.67％。实验结果表明，不管是在牛奶样品，还是湖水样品中，通过本次所设计的荧光生物传感器，对实际样品的加标回收率的误差均在10％以内，且RSD均小于5％，表明此方法能够有效的适用于实际样品的准确检测。
序列表：
SEQ ID No：1
适配体探针的序列
5′-gaggaactggagtcacaagctgaggatgtgactccaggcacttagtcaca-3′
SEQ ID No：2
适配体Aptamer的序列
5’-tgactccaggcacttagtca-3’
SEQ ID No：3
扩增模板T的序列
5’-gaggaactggagtcacaagctgagga-3’
SEQ ID No：4
发夹探针H1的核苷酸序列
5’-gaggaactggagtcacaagctgacatatctcagcttgtgactccag-3’
SEQ ID No：5
发夹探针H2的核苷酸序列
5’-tcagcttgtgactccagttcctcctggagtcacaagctgagatatg-3’
序列表
<110> 江苏第二师范学院
<120> 一种检测妥布霉素的生物传感器及检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 妥布霉素(Tobramycin)
<400> 1
gaggaactgg agtcacaagc tgaggatgtg actccaggca cttagtcaca 50
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 妥布霉素(Tobramycin)
<400> 2
tgactccagg cacttagtca 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 妥布霉素(Tobramycin)
<400> 3
gaggaactgg agtcacaagc tgagga 26
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 妥布霉素(Tobramycin)
<400> 4
gaggaactgg agtcacaagc tgacatatct cagcttgtga ctccag 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 妥布霉素(Tobramycin)
<400> 5
tcagcttgtg actccagttc ctcctggagt cacaagctga gatatg 46

Claims (9)

1.一种检测妥布霉素的生物传感器，其特征在于，包括适配体探针、发夹探针H1、发夹探针H2、Klenow Fragment聚合酶、Nt. BbvCI核酸内切酶、缓冲液和氧化石墨烯；
所述适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，适配体探针为适配体Aptamer和扩增模板T杂交而成，所述适配体Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，所述扩增模板T的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；
所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；
所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
2.权利要求1所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将适配体Aptamer和扩增模板T杂交为适配体探针，加入水和缓冲液，95℃金属浴中孵育3-5min，然后冷却，得到适配体发夹结构产物；
（2）将发夹探针H1、发夹探针H2、水和缓冲液混合后在95℃金属浴中孵育3-5min，冷却后得到发夹结构产物；
（3）将适配体发夹结构产物、妥布霉素检测物、10 x smart cut buffer ，dNTP， Nt.BbvCI核酸内切酶和Klenow Fragment聚合酶混合均匀后金属浴中孵育，然后加入步骤（2）制得的发夹结构产物，混合均匀，得到链置换反应溶液；
（4）往链置换反应溶液中加入氧化石墨烯溶液，金属浴中孵育后，利用荧光分光光度计测量荧光信号。
3.如权利要求2所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述适配体探针用量为1 uL、100 μM，水的用量为61.5 uL ，缓冲液为2 x T-100 Na，用量为62.5uL，所述缓冲液 2 x T-100 Na配方：25mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.3。
4.如权利要求2所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发夹探针H1和H2的摩尔比为1:1，发夹探针H1和H2的总用量为1 uL、100 μM，水的用量为79 uL，缓冲液为5 x T-500 Na，用量为20 uL，所述缓冲液5 x T-500 Na配方：25 mM Tris, 500mM NaCl, pH 7.3。
5.如权利要求2所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中，适配体发夹结构产物用量为1.5 uL、800 nM，妥布霉素检测物为3 uL，10 x smart cut buffer用量为3 uL，dNTP为1 uL 、10 mM， Nt. BbvCI核酸内切酶为2 U，Klenow Fragment聚合酶为0.5 U；所述10 x smart cut buffer配方为：50 mM 乙酸钾，20 mM 三羟基氨甲烷醋酸盐，10 mM 醋酸镁，100 μg/mL 牛血清蛋白，pH 7.9。
6.如权利要求2所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中，孵育温度为37 ℃，时间为1-2 h。
7.如权利要求2所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤（4）中，加入氧化石墨烯溶液后，氧化石墨烯在链置换反应溶液中的终浓度为25 μg / mL。
8.如权利要求2所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤（4）中，孵育温度为37 ℃，时间为1-2 h。
9.如权利要求2至8任一项所述生物传感器检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤（4）中，设置荧光分光光度计激发波长为480 nm，扫描范围为500 - 650 nm。
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