KR20200107055A - 범용성 혼성화연쇄반응을 이용한 핵산 현장 검출용 조성물 - Google Patents

범용성 혼성화연쇄반응을 이용한 핵산 현장 검출용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 핵산을 현장에서 검출하기 위한 조성물과 방법 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특수 장비 없이 상온에서 증폭이 가능하여 안정성이 높으면서 다양한 표적에 대하여 범용성이 있으며 민감하고 정량적인 비색계 신호를 생성함으로써 다양한 병원체를 현장에서 감지하거나, 질병을 진단하는데 활용될 수 있다.

Description

범용성 혼성화연쇄반응을 이용한 핵산 현장 검출용 조성물{Composition for detecting DNA in real field using Universal Hybridization Chain Reaction}
본 발명은 표적 핵산을 현장에서 검출하기 위한 조성물과 방법 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특수 장비 없이 상온에서 증폭이 가능하여 안정성이 높으면서 다양한 표적에 대하여 범용성이 있으며 민감하고 정량적인 비색계 신호를 생성함으로써 다양한 병원체를 현장에서 감지하거나, 질병을 진단하는데 활용될 수 있다.
핵산검사(NAT)는 Watson-Click 상호작용과 DNA 복제를 사용하여 염기서열의 존재, 양 및 변이를 검출함으로써 유전자형을 진단하는 기술로, 단일염기다형성(SNP)을 검출하거나, 비침습적으로 샘플을 채취하여 microRNA(miRNA)를 검출하거나, 혹은 전염병을 예방하기 위하여 바이러스와 같은 병원체를 검출하는데 사용될 수 있다.
주로, PCR(중합효소연쇄반응)을 기반으로 하는 분석법들은 가장 일반적으로 사용되어 왔다. 이는 프라이머 세트를 사용함으로써 높은 특이성과 우수한 감도와 같은 다양한 장점들을 가지나, 특수한 장비가 요구되고, 효소와 같은 비싼 실험재료를 필요로 하며, 분석과정이 복잡하여 현장에서 바로 검출이 불가능하다.
따라서 현장에서의 검출이 가능하도록 온도 사이클링 또는 이와 관련된 제어공정이 필요하지 않는 신호 증폭 기술의 필요성이 대두되었다. 현재까지 개발된 바에 따르면 롤링 서클 증폭기술(rolling circle amplification; RCA), 염기서열 기반 증폭기술(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 루프-매개 등온 증폭기술(loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 및 혼성화연쇄반응 기술(hybridization chain reaction; HCR)들이 공지되었다.
이중에서 HCR 기술은 단백질 효소와 엄격한 온도 제어 없이 PCR과 비슷한 정도의 감도를 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있고 있다. HCR은 2 개의 안정한 헤어핀이 개시제에 의해 중합되어 long-nicked dsDNA 분자를 형성하는 효소 없는 증폭 기술이다. HCR의 원리는 온화한 조건(mild condition) 하에서 신호 증폭을 통해 표적을 민감하게 검출할 수 있다는 장점에도 불구하고, 기존에 HCR 기술은 표적에 따라 매번 헤어핀 세트의 서열을 다시금 설계하여야 하는 치명적인 단점이 있었다. 따라서 본 발명은 G-quadruplex 구조를 형성하는 HCR 기반의 새로운 유전자 바이오센서를 개발하고자 하였고, 이를 위해서는 우선 표적 서열의 변화에 적응할 수 있는 유연한 구성을 새롭게 도입하여야 하는데, 종래에는 표적과 특이적으로 결합하는 헤어핀 세트만을 설계하여 포함시키는 구조로 매우 제한적이기 때문에 기존에 사용해오던 HCR 기술 개발전략으로는 한계가 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2018-0082401호
본 발명자들은 표적 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 방법을 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 특별한 장비나 복잡한 단계 없이 현장에서 검출이 가능하고 단순한 디자인 설계를 통해 다양한 표적을 안정적이고 민감하게 검출할 수 있는 검출 전략을 고안하였고, 이를 위해 G-quadruplex 구조를 형성하는 uHCR(universal hybridization chain reaction)을 기반으로 하는 새로운 유전자 바이오센서를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 특정 표적이 존재할 경우 표적 핵산과 트리거 단량체(Tr)가 특이적으로 결합하고,표적-결합 트리거 단량체(target-binding trigger hairpin)가 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체에 의해 증폭되고, 헤민과의 결합을 통해 특정 장비 없이도 현장에서 바로 검출이 가능한 비색 신호를 생성할 수 있는 핵산 검출용 조성물과 이를 통해 핵산을 증폭시키는 방법 및 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 검출용 조성물, 헤민 용액 및 발색반응 기질을 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 특정 표적이 존재할 경우 표적 핵산과 트리거 단량체(Tr)가 특이적으로 결합하고, 표적-결합 트리거 단량체(target-binding trigger hairpin)가 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체에 의해 증폭되고, 헤민과의 결합을 통해 특정 장비 없이도 현장에서 바로 검출이 가능한 비색 신호를 생성할 수 있는 핵산 검출용 조성물과 이를 통해 핵산을 증폭시키는 방법 및 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 표적 핵산을 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 방법을 발굴하고자 노력한 결과, G-quadruplex 구조를 형성하는 uHCR(universal hybridization chain reaction)을 기반으로 하여 특별한 장비나 복잡한 단계 없이 현장에서 낮은 농도 표적 핵산이라도 검출이 가능하고 단순한 디자인 설계를 통해 다양한 표적을 안정적이고 민감하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 측면은, (a) 표적 핵산에 상보적인 제1 영역과 제1 영역과 상보적이면서 스템(stem) 영역을 형성하는 제2 영역 및 루프 영역을 형성하는 서열번호 1로 표시되는 제3 영역이 결합되어 형성된 헤어핀 형태의 트리거 단량체(Tr);
(b) 상기 트리거 단량체와 혼성화할 수 있는 서열번호 7 내지 9 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 제1 헤어핀 단량체(UH1); 및
(c) 상기 제1 헤어핀 단량체과 혼성화할 수 있는 서열번호 10 내지 12 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 제2 헤어핀 단량체(UH2);를 포함하는 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.
표적 물질의 검출을 위하여, 본 발명의 G-quadruplex 형성하는 uHCR 기반의 핵산 검출용 조성물은 헤어핀 형태의 트리거 단량체(Tr), 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체를 포함한다. 상기 트리거 단량체가 표적(target)과 결합하고, 제1, 2 헤어핀 단량체에 의해 신호가 증폭된다. 제1, 2 헤어핀 단량체는 표적과 결합한 트리거 단량체에 의존적으로 혼성화를 형성하기 때문에 표적과 상관없이 범용성 신호를 증폭할 수 있다.
본 발명의 핵산 검출용 조성물을 통한 표적(target; T) 검출원리를 도 1에 나타내었다.
구체적으로 핵산 검출용 조성물에 포함되는 세 개의 헤어핀은 6개의 뉴클레오티드로 이루어진 끝부분(toehold)을 가지도록 설계되었다, 바람직하게 (a) 트리거 단량체(Tr)는 끝부분(toehold)과 스템 영역(stem)에 표적 물질(target)과 혼성화할 수 있는 제1서열(청색)을 가지고, 제1 헤어핀 단량체의 제4서열과 상보적인 루프(loop) 영역으로 제3서열(밝은 청색)로 구성된다.
(b) 제1 헤어핀 단량체(UH1)는 스템 영역의 양 말단에 G-quadruplex 구조를 형성하는 CatG4 서열(제5서열)(보라색)을 포함하는데, 상기 catG4 서열은 스템 영역의 양 말단에 각각 1/3, 2/3의 비율로 나누어져 있다.
표적 물질이 존재하지 않을 경우에는, (a) 트리거 단량체와 (b) 제1 헤어핀 단량체 및 (c) 제2 헤어핀 단량체는 안정된 상태로 닫혀있게 된다. 특히 (b) 제1 헤어핀 단량체(UH1)의 스템 영역에 분할된 G-quadruplex 구조를 형성하는 catG4 서열도 1/3만 존재하게 되므로, G-quadruplex 구조를 형성할 수 없다.
이와 달리 표적 물질이 존재할 경우, 상기 (a) 트리거 단량체(Tr)가 표적 물질과 혼성화함으로써 닫혀있던 구조가 열리게 되고, 결과적으로 상기 (a) 트리거 단량체(Tr)의 제1 헤어핀 단량체(UH1)-결합부위가 노출되게 된다. 그 결과 (b) 제1 헤어핀 단량체(UH1)와 (a) 트리거 단량체(Tr)가 혼성화되고, (b) 제1 헤어핀 단량체(UH1)에 존재하는 제2 헤어핀 단량체(UH2) 결합부위가 개방된다. 따라서, 제1 헤어핀 단량체(UH1)와 제2 헤어핀 단량체(UH2)가 혼성화된다. 상기 과정이 반복되고, 이에 따라, 제1 헤어핀 단량체(UH1)와 제2 헤어핀 단량체(UH2)가 서로 계속 결합함으로써 긴 선형의 DNA 이중가닥(장쇄)이 형성되며, 이와 같은 과정을 HCR(혼성화연쇄반응)라고 한다. 이때 제1 헤어핀 단량체(UH1)의 스템 영역(stem)에 폐쇄되어 있던 catG4 서열이 노출되고, 완전한 G-quadruplex 구조가 형성되므로, 상기 핵산 검출용 조성물에 의해 형성된 긴 선형 DNA strands에는 많은 G-quadruplex 구조가 존재하게 된다.
따라서 본 실험은 헤민을 처리함으로써, G-quadruplex 구조와 헤민 사이의 결합에 의해 유도된 퍼옥시데이즈 활성을 사용하여 표적을 검출할 수 있게 되는 것이다.
본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물은 다양한 표적 핵산을 검출할 수 있는 현장에서 사용가능한 G-quadruplex 형성을 기반으로 하는 uHCR 바이오센서로서, 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 헤어핀 형태의 트리거 단량체(Tr)를 도입함으로써, 간단한 설계 변경을 통해 네 가지 서로 다른 종양 바이오 마커(miR-21, miR-125b, KRAS-Q61K 및 BRAF-V600E)를 모델로 한 서열을 타겟으로 하였을 때 이들을 각각 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 트리거 단량체가 표적 핵산과 결합한 후, 이를 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체를 통해 증폭하고, 상기 결합 과정을 통해 형성된 퍼옥시데이즈 활성을 사용하여 별다른 장비 없이 헤민과 TMB를 통해, 안정성은 우수하면서 민감하고 정량적인 비색 신호를 생성할 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물은 uHCR에 기반한 바이오센서로 활용가능하고, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)도 분명히 구별할 수 있는 우수한 특이성을 가지고 있을 뿐만 아니라, FBS가 혼합되어 있는 생물학적 유체에서도 표적 핵산을 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
다시 말해 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물은 단순한 설계 변경을 통해(트리거 단량체의 제1, 제2영역을 표적 핵산에 맞춰 설계) 다양한 표적 핵산을 정확하고 빠르게 검출할 수 있고, 비색 신호를 통해 별다른 장치 없이 현장에서 검출, 평가, 분석이 모두 가능하며, 반응시 특수 장비 또는 복잡한 단계가 필요 없다는 매우 큰 장점들을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에서의 핵산 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 등은 uHCR 바이오센서로써, 다양한 병원체를 현장에서 긴급 감지하거나, 환자가 직접 측정이 가능하므로 원격 진단이 가능하게 하며, 다양한 연구에서 스크리닝 과정이 효율적일 것이며, 식품 또는 제품의 감시 등에 활용될 수 있다.
상기 트리거 단량체(Tr)에서 상기 제1 영역은 표적 핵산을 검출하기 위해, 표적 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열로 이루어져 있고, 상기 제1 영역의 길이는 표적 핵산의 길이와 매치되도록 선택될 수 있다. 바람직하게 상기 제1 영역은 상보적인 10 내지 50 개의 염기서열로 포함할 수 있다.
상기 트리거 단량체(Tr)에서 상기 제2 영역은 제1 영역과 상보적인 염기서열을 포함하여 헤어핀 형태에서 스템 영역을 형성하게 한다. 헤어핀 구조를 유지하기 위하여, 상기 제2 영역에서 상기 제1 영역과 상보적인 염기서열 말단에 1 내지 10 개의 염기서열 꼬리 부분을 더 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게 상기 꼬리 부분은 제1 영역에서 채용되지 않은 표적 핵산의 나머지 서열 혹은 이와 상보적인 염기서열일 수 있다. 제2 영역은 상기 조건을 충족한다면 트리거 단량체(Tr)의 물리 혹은 화학적 특성에 영향을 미치지 않으므로 표적 핵산의 서열에 맞춰 적절히 설계 및 디자인될 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물은 특이성이 높아, 더 많은 수의 표적 핵산 정량이 가능하고, 표적 핵산의 서열을 달리하면 각 표적 핵산마다 정량 및 정성 분석이 가능하게 되며, 많은 종류의 트리거 단량체를 사용하면 검출 가능한 표적 핵산의 수는 달라질 수 있다.
상기 트리거 단량체(Tr)의 제3 영역은 제1 영역과 제2 영역 사이에 연결되어 있고, 헤어핀 형태에서 루프 영역을 형성하는 것으로, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.
상기 제1 헤어핀 단량체(UH1)는 상기 트리거 단량체와 혼성화할 수 있고, 양 말단에 catG4 서열을 포함하고 있는 것을 특징으로 하며, 서열번호 7 내지 9 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 것일 수 있다.
상기 제2 헤어핀 단량체(UH2)는 상기 제1 헤어핀 단량체와 혼성화할 수 있는 서열로 이루어져 있으며, 서열번호 10 내지 12 중에서 선택되는 어느 하나로 표시될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물이 더 강한 신호와 더 작은 잡음을 갖도록 하기 위해서 상기 제1, 제2 헤어핀 단량체는 서열번호 9 및 서열번호 12로 표시되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 트리거 단량체는 네 가지 서로 다른 종양 바이오 마커(RNA와 SNP)를 검출하기 위해, 간단한 설계 변경을 통해 제작하였고, 이는 구체적으로 서열번호 2 내지 5로 표시되는 트리거 단량체를 사용하였다. 즉, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체는 그대로 유지하고, 트리거 단량체의 제1, 제2 영역을 표적 핵산 또는 단일염기다형성(SNP)에 상보적인 서열로 설계한다면, 해당하는 핵산을 별다른 장치 없이 현장에서 바로 신속하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
상기 핵산 검출용 조성물은 트리거 단량체가 표적 핵산과 특이적으로 결합하면, 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체에 의한 HCR 증폭이 일어나며 표적 핵산의 증폭산물이 형성되는 과정에 사용되는 것이다. 이 때 핵산 증폭이란 표적 핵산의 임의의 배열에 대하여 특이적인 트리거 단량체, 상기 트리거 단량체에 특이적인 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체를 이용하여 시료 중의 표적 핵산을 증폭시키는 것을 의미한다.
이러한 핵산 검출용 조성물을 사용하여 표적 핵산이 시료 중에 미량 밖에 존재하지 않는 경우에도 추출 및 정제 과정의 손실이 생기지 않는다. 따라서 검출 감도의 저하를 초래하지 않고, 미량의 표적 핵산을 검출하는 것이 가능하게 된다. 이에 작업의 간단화를 도모할 수 있고, 작업 시간을 단축할 수 있다.
전술한 핵산 검출용 조성물은 시료로부터 회수된 핵산에 첨가되어 핵산 증폭 반응을 수행하는 것으로서 시료로부터 핵산 추출하는 방법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 트리거 단량체는 100 내지 1000 nM 농도로 포함될 수 있고, 후술하는 실험예에서 트리거 단량체의 농도를 변화시켰을 때, 500 nM에서 혼성화연쇄반응 공정이 가장 많이 진행되었으므로, 상기 트리거 단량체의 농도는 500 nM로 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 표적 핵산은 감염성 미생물, 인간, 포유류 또는 식물로부터 유래된 핵산으로, 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA일 수 있다. 예컨대, 표적 핵산은 임의의 세포, 조직 또는 유기체, 시험관내, 화학적 합성기 등으로부터 수득될 수 있다. 상기 표적 핵산은 당업계에서 승인받은 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에서 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 중합체, 또는 이의 유사체에 상응할 수 있는 중합체를 지칭한다. 핵산은, 예를 들어, 염색체 또는 염색체 분절, 벡터 (예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 의 생성물, 올리고뉴클레오타이드, 탐침, 및 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있으나 임의의 특정 길이에 한정되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시되는 임의의 서열 외에도 상보 서열을 포함하거나 이를 코딩한다.
핵산은 당업계에 널리 공지된 방법 및 키트를 사용하여 공급원 또는 샘플로부터 추출, 단리, 또는 정제될 수 있다.
또한 본 발명은 특정 핵산을 증폭시켜, 직접적인 표적 핵산의 분석이 가능하므로, 이와 관련하여 유전자 변이 특이적 증폭도 가능하므로, SNP 분석에도 활용될 수 있다. 상기 SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G 또는 C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 말한다.
본 발명의 표적 핵산, 표적 핵산의 변이 또는 SNP 검출 방법에서, 표적 핵산은 테스트 샘플에 존재할 수 있으며, DNA, cDNA 또는 RNA, 바람직하게는 유전체 DNA를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 핵산 검출용 조성물을 시료에 접촉시켜, 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
상기 시료는 종래 공지의 생물학적 유체라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 핵산을 추출하는 과정을 거친 것일 수 있다. 핵산 추출방법은 종래 공지의 추출방법을 시료에 따라 적절히 이용할 수 있다.
상기 핵산 증폭 단계는 20 내지 40 ℃에서 수행되는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 핵산 증폭 과정의 실용성을 고려하였을 때 상기 핵산 증폭 단계의 온도조건은 상온일 수 있다.
또한 상기 핵산 증폭 단계는 0.5 내지 10 시간동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 핵산 증폭 단계는 시간이 증가함에 따라 점진적으로 포화되는 경향을 나타내기 때문에 핵산 증폭 과정의 실용성을 고려한다면 상기 핵산 증폭 단계는 2 시간동안 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 표적 핵산의 검출방법에 관한 것이다.
(ⅰ) 시료에 상기 핵산 검출용 조성물을 첨가하여 표적 핵산의 서열을 증폭하는 단계;
(ⅱ) 상기 (ⅰ) 단계로부터 회수한 증폭산물에 헤민 용액을 첨가하여 반응시키는 단계;
(ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계로부터 회수한 반응액에 발색반응 기질을 첨가하고, 650~660 ㎚로 흡광도를 측정하여 표적 핵산 존재여부를 판별하는 단계.
상기 시료는 표적 핵산의 존재유무를 확인하고자 하는 대상으로, 임의의 세포, 조직 또는 유기체, 시험관 내, 액상 또는 고상의 제품, 화학적 합성기 등으로부터 수득된 것일 수 있다. 상기 시료는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 시료는 사실상 임의 유기체(포유동물 샘플이 바람직하고, 인간 샘플이 특히 바람직하다)의, 세포(1차 세포 및 배양된 세포주 포함), 세포 용해물 또는 추출물(제한하는 것은 아니지만, RNA 추출물; 정제된 mRNA 포함), 조직 및 조직 추출물(제한하는 것은 아니지만, RNA 추출물; 정제된 mRNA 포함); 체액(제한하는 것은 아니지만, 혈액, 소변, 혈청, 림프, 담즙, 뇌척수액, 간질액, 수양액 또는 유리체액, 초유, 객담, 양수, 타액, 항문 및 질 분비액, 땀 및 정액 포함), 누출물, 삼출물(예컨대, 농양, 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 수득된 액), 또는 관절(예컨대, 정상 관절, 또는 질환, 예컨대, 류머티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 화농성 관절염에 의해 이환된 관절)로부터 수득된 액; 환경 샘플(제한하는 것은 아니지만, 공기, 농업상, 물 및 토양 샘플 포함); 생물학전 작용제 샘플; 세포외 액, 세포 배양물로부터의 세포외 상등액, 박테리아 봉입체, 세포 구획, 세포 주변세포질, 미토콘드리아 구획을 비롯한 연구용 샘플을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의 개수의 것을 포함할 수 있다.
또한 상기 시료는 당업계에 널리 공지된 방법 및 키트를 사용하여 핵산을 추출, 단리 또는 정제하는 단계를 거친 것일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 검출방법은 도 1에서와 같이 표적 핵산(T)와 트리거 단량체(Tr)가 결합되고, 이를 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체에 의해 증폭되어 긴 선형의 DNA strands(장쇄)가 형성되는 HCR(혼성화연쇄반응)의 특성을 이용한다. 구체적으로 상기 HCR을 통해 형성된 긴 선형의 DNA strands에는 제1 헤어핀 단량체의 스펨 영역에 존재하던 catG4 서열에 의해 G-quadruplex 구조가 형성되고, 상기 G-quadruplex 구조와 헤민이 상호작용함으로써, 이의 퍼옥시데이즈 활성을 관찰하기 위해 발색반응 기질을 사용하며, 이의 흡수파장에서 증가된 흡광도를 나타내게 된다. 이렇게 발생하는 색 차이를 이용해 표적 핵산의 존재 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 헤민 농도는 목적하는 표적 핵산 혹은 주위 환경에 따라 적절히 선택될 수 있으므로 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 100 내지 1000 nM로 포함될 수 있고, 후술하는 실험예에서 500 nM 미만일 때 잡음대 신호 비율이 비례하여 유의하게 증가하는 경향을 보였으므로, 상기 헤민 농도는 500 내지 1000 nM인 것이 더욱 바람직하다. 또한 최고 농도에서는 신호가 포화되어 더 이상 증가하지 않으므로, 헤민 농도는 500 nM인 것이 가장 바람직하다.
여기서, 상기 발색반응 기질은 당업계에서 일반적으로 사용되는 발색반응 기질이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine)일 수 있다. 상기 TMB를 발색반응 기질로 사용할 경우, 이로부터 발생하는 650 내지 660 nm(652 nm)에서의 흡광도가 증가하게 되며, 이러한 광학적인 차이를 통해 표적 핵산의 존재 유무를 검출할 수 있음을 후술하는 실험예를 통해 확인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표적 핵산은 질병과 관련된 유전자, 감염 (세균성, 바이러스성 등)과 관련된 유전자, 유전자 재조합 생물체 (GMO; genetically modified organisms)에 관련된 유전자, 법의학 수사를 위한 유전자 또는 이들의 하나 이상의 혼합물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 신속하고 간편하게 보편적으로 핵산을 감지할 수 있는 진단 방법을 제공할 뿐만 아니라 현장진단을 위한 바이오센서로 이용될 수 있는 가능성을 제공한다. 또한, 위 현상을 이용하여 핵산의 검출뿐 아니라, 생체물질 및 화학물질의 검출에도 적용될 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명은 표적 핵산의 존재를 검출할 뿐만 아니라, 표적 핵산에 특이적으로 결합하기 때문에 이를 이용하면 시료 중에 포함된 표적 핵산의 양도 정확하게 측정할 수 있다.
구체적으로 표적 핵산의 양 측정은, 본 발명의 핵산 검출용 조성물을 표적 핵산의 농도에 따라 검출되는 흡광도값이 비례한다는 점을 이용하여 표적 핵산 스탠다드 물질에 대한 검량선을 제조한 후, 상기 검량선에 상기 (ⅲ) 단계를 통해 얻은 흡광도를 대입하여 표적 핵산의 농도를 분석하여 수행될 수 있다.
또한, 유전적 변이를 검출하는 방법 역시 상술한 표적 핵산의 검출 과정과 동일하게 진행하여 검출할 수 있고, 구체적으로 유전적 변이를 갖는 핵산에 상보적인 서열을 검출함으로써, 유전적 변이를 갖는 핵산의 존재를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 표적 핵산 내의 서열 사이에 일어나는 1개 이상의 염기 변이를 식별할 수 있는 것으로, 표적 핵산 뿐만 아니라 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 검출방법은 트리거 단량체(Tr)의 제1, 2 영역 서열만을 표적 핵산 혹은 단일염기다형성(SNP)에 맞춰 상보적으로 설계하면 되므로, 디자인을 편리하게 하고, 종래 DNA 중합효소를 사용하는 종래의 검출방법에 비해 표적 핵산을 보다 민감하고 정확하게 측정할 수 있다. 또한, 별도의 장비없이 육안으로 비색 신호를 확인할 수 있으므로 별도의 분석장치 없이 표적 핵산의 존재 유무 및 유전적 변이(SNP)를 검출할 수 있어 분석비용을 절감할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 핵산 검출용 조성물, 헤민 용액 및 발색반응 기질을 포함하는 표적 핵산 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 핵산 검출용 키트는 기재 상의 또는 바이오칩 상의 웰 또는 마이크로 채널 내의 용액으로 제공될 수 있다.
상기 기재는 당업계에 공지된 임의의 고체 지지체, 예를 들어 표적 핵산을 고정화시킬 수 있는 코팅된 슬라이드 및 미세유체 장치일 수 있다. 상기 기재는 표면, 막, 비드, 다공성 물질, 전극 또는 어레이일 수 있다.
본 발명의 상기 헤민 농도는 100 내지 1000 nM로 포함될 수 있고, 후술하는 실험예에서 500 nM 미만일 때 잡음대 신호 비율이 비례하여 유의하게 증가하는 경향을 보였으므로, 상기 헤민 농도는 500 내지 1000 nM인 것이 바람직하다. 또한 최고 농도에서는 신호가 포화되어 더 이상 증가하지 않으므로, 헤민 농도는 500 nM인 것이 가장 바람직하다.
여기서, 상기 발색반응 기질은 당업계에서 일반적으로 사용되는 발색반응 기질이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine)일 수 있다. 상기 TMB를 발색반응 기질로 사용할 경우, 이로부터 발생하는 650 내지 660 nm(652 nm)에서의 흡광도가 증가하게 되며, 이러한 광학적인 차이를 통해 표적 핵산의 존재 유무를 검출할 수 있음을 후술하는 실험예를 통해 확인하였다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
본 발명에 따른 표적 핵산을 검출할 수 있는 조성물, 증폭방법 및 검출방법은 검출하고자 하는 표적 핵산을 정확하게 증폭하며, 헤어핀 구조를 갖는 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체를 사용하여 표적 핵산을 검출할 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 검출방법은 검출하고자 하는 표적 핵산을 현장에서 바로 분석 및 확인가능하며, 생물학적 유체에서 정확하게 표적 핵산을 검출할 수 있으므로 분석비용을 절감할 수 있는 이점이 있다.
따라서, 본 발명의 표적 핵산 검출용 조성물 및 검출방법은 다양한 질병의 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물이 표적 핵산을 증폭시키고, 검출하는 과정을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때, 표적 물질(miR-21)과의 반응을 통해 형성된 증폭산물을 겔 전기영동으로 확인한 이미지이다.
도 3a는 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체의 다른 설계 구조(실시예 1, 2, 3)을 도시한 것이다.
도 3b는 실시예 1 내지 3의 핵산 검출용 조성물로 표적 물질을 검출하였을 때, 측정한 신호 및 잡음을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 트리거 단량체의 농도를 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 4b는 헤민(hemin; H)의 농도를 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 4c는 HCR 과정의 반응온도를 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 4d는 HCR 과정의 반응시간을 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 5a는 다양한 농도(0-200 nM)의 표적 물질 존재 하에서, 실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때에 대한 흡수 스펙트럼이다. 상기 오차막대는 3번의 각 실험을 세 번 반복한 데이터의 표준편차이다.
도 5b는 다양한 농도(0-200 nM)의 표적 물질 존재 하에서, 실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때에 대한 검량선(652 ㎚)이다. 상기 오차막대는 3번의 각 실험을 세 번 반복한 데이터의 표준편차이다.
도 6은 다양한 표적 물질에 대하여 실시예 3, 4, 5, 6의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때, 각각 표적 물질에서의 신호/잡음 평가 결과이다.
도 7은 실시예 6의 핵산 검출용 조성물을 사용하여 표적 핵산을 검출함에 따른, 방법의 특이성 평가를 측정하여 나타낸 것이다. M1, M2, M3은 각각 하나, 둘, 세 개의 염기가 표적 핵산(T) 서열에서 돌연변이된 것으로 구체적인 서열은 표 2에 나타내었다. 실험조건은 도 2와 동일하게 하여 수행하였고, 통계 분석은 t-distribution을 통해 수행하였다(n=4). ***은 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 8은 본 발명에 따른 실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 이용하여, 생물학적 유체(5% FBS 포함)로부터 표적 물질을 검출한 결과를 나타낸 것이다. 상기 생물학적 유체는 5% FBS(소태아혈청)을 포함하는 SPSC 완충액(pH 7.5)을 제조한 것을 사용하였고, 상기 생물학적 유체에 다양한 농도의 표적 핵산(BRAF-V600E)을 첨가하여 실험하였다. 실험 조건은 500 nM Tr/UH1/UH2을 포함하는 핵산 검출용 조성물(실시예 6), 100 nM 표적 핵산(BRAF-V600E), 500 nM 헤민을 사용하였고, HCR은 상온에서 2시간동안 수행하였다. 상기 발색 반응은 기질로 TMB를 사용하여 1시간동안 수행되었다. 오차 막대는 적어도 세 번의 실험에서의 표준편차를 나타냈다. 통계분석은 t-distribution으로 수행하였다. *, ** 및 ***은 각각 0.05, 0.01 및 0.001 미만의 p값을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험재료 및 방법
<실험재료>
본 발명에서 사용되는 모든 합성 뉴클레오타이드는 Cosmogenetech Co., Ltd(Seoul, Korea)로부터 얻었고, 이를 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물로 희석하여 20 μM의 저장용액(stock solution)을 제조하였다.
20 bp DNA ladder는 Takara Bio Inc(Kusatsu, Shinga, Japan)에서 구입한 것을 사용하였다. 헤민(hemin)과 과산화수소(30% w/w)는 Sigma-Aldrich, Inc(Saint Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)는 Alfa aesar(Ward Hill, MA, USA)로부터 구입하였다. DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물은 Biosesang Co., Ltd(Seongnam, Korea)에서 구입한 것을 사용하였다. FBS(Fetal bovine serum)은 PAN-Biotech(Aidenbach, Germany)에서 구입하였다.
모든 화학물질은 별도의 언급이 없는 한 분석 등급으로 사용하였다. SPSC 완충액(50 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, pH7.5)은 실험 전반에 걸쳐 사용되었고, TMB 용액(working solution)은 비색 검출을 위하여 인산-구연산 완충액(phosphate-citrate buffer)(9 mL, pH 5.0), TMB 저장용액(stock solution)(1 mL) 및 과산화수소(hydrogen peroxide)(2 μL)를 혼합해 제조되었다. 헤민(5 mM) 및 TMB 저장용액(1 mg/mL)은 DMSO에 첨가한 다음, 빛이 차단된 -20 ℃에 보관하였다. 본 발명에서 사용한 뉴클레오타이드의 서열을 하기 표 1에 정리하였다.
타겟유전자 구분 번호 서열(5'-3')
제3 영역 Tr 1 TTCTGGCTGCGCGTGGGTAG AGAAGA
miR-21 Tr 2 ATCAGACTGATGTTGATGTTCTGGCTGCGCGTGGGTAG AGAAGATCAACATCAGTCTGATAAGCTA
miR-125b Tr 3 AGACCCTAACTTGTGATGTTCTGGCTGCGCGTGGGTAG AGAAGATCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA
KRAS Tr 4 AGGTCAAGAGGAGTATGTTCTGGCTGCGCGTGGGTAG AGAAGATACTCCTCTTGACCTGCTGTG
BRAF Tr 5 ACAGTGAAATCTCGATGTTCTGGCTGCGCGTGGGTAG AGAAGATCGAGATTTCACTGTAGCTAG
miR-21-변이
(G->C)
(C->G)		 Tr 6 ATCAGACTGATGTTGATCTTGTCCGTGCGCGTGGGTAGGG AGAAGATCAACATCAGTCTGATAAGCTA
conditon 1 UH1 7 TGGGAAATCTTCTCTACCCACGCGCAGCC CAGACA GGCTGCGCGTGGGTAGGGCGGGT
conditon 2 UH1 8 TGGGAAATCTTCTCCCTACCCACGCGCACCG CAGACA CGGTGCGCGTGGGTAGGGCGGGT
conditon 3 UH1 9 TGGGAAATCTTCTCTACCCACGCGCAGCCAG CAGACA CTGGCTGCGCGTGGGTAGGGCGGGT
conditon 1 UH2 10 GGCTGCGCGTGGGTAG AGAAGA ACGCGCAGCCTGTCTG
conditon 2 UH2 11 CGGTGCGCGTGGGTAGGG AGAAGA ACGCGCACCGTGTCTG
conditon 3 UH2 12 CTGGCTGCGCGTGGGTAG AGAAGA ACGCGCAGCCAGTGTCTG
miR-21 Target 13 TAGCTTATCAGACTGATGTTGAa
miR-125b Target 14 TCCCTGAGACCCTAACTTGTGAa
KRAS Target 15 CACAGCAGGTCAAGAGGAGTA
M1 16 CACAGCAGGTAAAGAGGAGTA
M2 17 CACAGCAGGTAAAGACGAGTA
M3 18 CAGAGCAGGTAAAGACGAGTA
BRAF Target 19 CTAGCTACAGTGAAATCTCGA
상기 표 1에서, 굵은 글자는 표적 서열의 끝부분과 트리거 뉴클레오티드의 끝부분이고, 이탤릭체는 루프 영역이며, 청색은 G-quadruplex를 형성하는 서열(catG4)이며, 적색은 표적과 트리거 뉴클레오티드가 불일치하는 부분이다. 표적으로 사용된 핵산은 동일한 서열의 DNA로부터 구축한 것이다.
<실험장비>
흡광도 측정은 96-웰 플레이트(Nest biotechnology Co., Ltd, Jiangsu, China)를 사용하여 EPOCH2 마이크로 플레이트 분광 광도계(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)에서 수행하였다. 아가로스 겔 분석은 Mupid-2plus 전기영동 시스템(Optima Inc., Tokyo, Japan)을 사용하여 수행하였다. 겔 전기영동 이미지는 Gel Documentation system LSG1000(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 사용하여 얻었다.
<실시예 1> G-quadruplex 형성하는 uHCR를 기반으로 하는 핵산 검출용 조성물 제작(condition 1)
본 실험예에서는 종양 발생과 관련된 miRNAs(miR-21)(제13서열)을 표적 물질로 하였다.
상기 표적 물질에 맞춰 (a) 트리거 단량체는 제2서열을 설계 및 사용하였고, (b) 제1 헤어핀 단량체는 제6서열, (c) 제2 헤어핀 단량체는 제9서열을 사용하였다. 상기 (a, b, c)의 합성 뉴클레오티드는 Cosmogenetech Co., Ltd(Seoul, Korea)로부터 얻었고, 이들은 각각 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물로 희석하여 20 μM의 저장용액(stock solution) 상태로 보관하였다.
<실시예 2> G-quadruplex 형성하는 uHCR를 기반으로 하는 핵산 검출용 조성물 제작(condition 2)
본 실험예에서는 종양 발생과 관련된 miRNAs(miR-21)(제13서열)을 표적 물질로 하였다.
상기 표적 물질에 맞춰 (a) 트리거 단량체는 제2서열을 설계 및 사용하였고, (b) 제1 헤어핀 단량체는 제7서열, (c) 제2 헤어핀 단량체는 제10서열을 사용하였다. 상기 (a, b, c)의 합성 뉴클레오티드는 Cosmogenetech Co., Ltd(Seoul, Korea)로부터 얻었고, 이들은 각각 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물로 희석하여 20 μM의 저장용액(stock solution) 상태로 보관하였다.
<실시예 3> G-quadruplex 형성하는 uHCR를 기반으로 하는 핵산 검출용 조성물 제작(condition 3)
본 실험예에서는 종양 발생과 관련된 miRNAs(miR-21)(제13서열)을 표적 물질로 하였다.
상기 표적 물질에 맞춰 (a) 트리거 단량체는 제2서열을 설계 및 사용하였고, (b) 제1 헤어핀 단량체는 제8서열, (c) 제2 헤어핀 단량체는 제11서열을 사용하였다. 상기 (a, b, c)의 합성 뉴클레오티드는 Cosmogenetech Co., Ltd(Seoul, Korea)로부터 얻었고, 이들은 각각 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물로 희석하여 20 μM의 저장용액(stock solution) 상태로 보관하였다.
<실시예 4 내지 6> G-quadruplex 형성하는 uHCR를 기반으로 하는 핵산 검출용 조성물 제작(다양한 표적 핵산)
본 실시예에서는 표적 핵산에 따라 제조된 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다. 표적으로 하는 핵산에 따라 트리거 단량체의 서열을 다음과 같이 설계 및 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 모두 동일하게 제조되었다.
제14서열의 miR-125b을 표적 물질로 하면 (a) 트리거 단량체는 제3서열을 설계 및 사용하였고(실시예 4), 제15서열의 KRAS를 표적 물질로 하면 (a) 트리거 단량체는 제4서열을 설계 및 사용하였고(실시예 5), 제19서열의 BRAF를 표적 물질로 하면 (a) 트리거 단량체는 제5서열을 설계 및 사용하였고(실시예 6)을 사용하였다. 상기 (a)의 합성 뉴클레오티드는 Cosmogenetech Co., Ltd(Seoul, Korea)로부터 얻었고, 이들은 각각 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 물로 희석하여 20 μM의 저장용액(stock solution) 상태로 보관하였다.
<실험예 1> 실시예 1의 타당성 검증
실시예 1로부터 구성된 핵산 검출용 조성물의 타당성을 검증하기 위하여, 다양한 농도의 표적 물질을 처리하고, 3% 아가로스 겔 전기영동을 통해 증폭 여부를 확인하였다.
우선, DEPC 처리된 물에 용해하여 저장용액상태로 보관 중인 실시예 1로부터 구성된 핵산 검출용 조성물(트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체)을 각각 SPSC 완충액으로 1/10 배 희석하였다. 희석된 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 용액을 95 ℃에서 2 분간 가열하고 실온(25 ℃)에서 1 시간 이상 서서히 냉각시켰다. 상기와 같은 전처리 과정을 통해 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체(실시예 1)가 헤어핀 형태를 형성하게 된다.
각각 500 nM농도인, 전처리된 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 25 ㎕씩을 다양한 농도(1, 25, 50, 100, 200, 300 nM)의 표적 물질(miR-21) 및 SPSC 완충액에 혼합하여 100 ㎕의 반응액을 제조하였다. 반응액을 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 이때, 상기 표적 물질(miR-21)은 2X 희석하여 사용하였고, 상기 반응액은 SPSC 완충액으로 연속 희석하여 제조하였다.
상기 희석한 용액을 3% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 이는 상기 실시예 1의 핵산 검출용 조성물과 표적 물질(miR-21)의 결합을 통해 장쇄가 형성되었는지를 확인하기 위한 것으로, 상기 반응액 20 ㎕에 6X 로딩액(loading buffer) 4 ㎕를 첨가하여 전기영동을 실시하였다. 40% 글리세롤을 6X 로딩액으로 사용하였고, 1X TAE 완충액(40 mM tris, 20 mM Acetic acid, 1 mM EDTA, pH8.6)을 사용하여 3% 아가로스 겔을 제조하였다. 1X TAE 완충액에서 상기 겔을 100 V, 30분 동안 전기영동시켰고, 이로부터 이미지를 얻었다.
도 2는 실시예 1의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때, 표적 물질(miR-21)과의 반응을 통해 형성된 증폭산물을 겔 전기영동으로 확인한 이미지이다. 왼쪽부터 20 bp ladder, 대조군(blank), 트리거 단량체만 처리한 것(Tr), 다양한 농도의 표적 물질(0, 300, 200, 100, 50, 25 nM)에 대한 결과를 나타낸 것이다. 실시예 1의 핵산 검출용 조성물은 500 nM 트리거 단량체(Tr)/제1 헤어핀 단량체(UH1)/제2 헤어핀 단량체(UH2)을 포함하고, 이를 표적 물질(miR-21)과 함께 상온에서 4시간동안 수행하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 표적 물질(miR-21)이 존재하는 경우에는 실시예 1의 핵산 검출용 조성물에 의해 혼성화연쇄반응(HCR)이 진행되어, 다양한 분자량의 밴드가 확인되었다. 표적 물질의 농도가 증가함에 따라 밴드의 강도도 점차 진해지는 것을 알 수 있다. 그러나 표적 물질이 존재하지 않는 경우(대조군, Tr, 0 nM)에는 혼성화연쇄반응(HCR)의 증폭 산물에 해당하는 밴드가 관찰되지 않았다. 즉 실시예 1의 핵산 검출용 조성물은 표적 물질이 존재하지 않으면 안정적인 상태로 존재하다가 표적 물질이 존재하게 되면 결합부위가 노출되어 혼성화연쇄반응(HCR)이 수행되며, 증폭 산물을 생성한다는 것을 알 수 있다.
<실험예 2> 실시예 1의 핵산 검출용 조성물의 최적화
실시예 1의 핵산 검출용 조성물을 구성하는 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체들은 백그라운드 신호를 최소화하고, 증폭 신호를 최대화할 수 있는 구조로 설계되는 것이 바람직하다. 실시예 1의 핵산 검출용 조성물을 구성하는 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체의 서열은 높은 신호대 잡음을 갖는 G-quadruplex 구조를 고려하여 설계하였고, 일부 변경한 구조(실시예 2, 3)들에 대해서도 비교 실험을 진행하였다.
도 3a는 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체의 다른 설계 구조(실시예 1, 2, 3)을 도시한 것이다. 맨 왼쪽은 스템 영역에 G-quadruplex 구조를 형성하는 catG4 서열 1/3 존재하는 제1 헤어핀 단량체를 포함한다(실시예 1;condition 1). 중간은 스템 영역에 G-quadruplex 구조를 형성하는 catG4 서열이 1/3 이상으로 증가한 제1 헤어핀 단량체를 포함한다(실시예 2;condition 2). 오른쪽은 제2 헤어핀 단량체의 스템 길이가 증가하였다(실시예 3;condition 3).
상기 실시예 1 내지 3으로부터 구성된 핵산 검출용 조성물을 사용하여 표적 물질(miR-21)을 검출하는 실험을 수행하였다. 실시예 1 내지 3의 핵산 검출용 조성물을 사용하여 각각 실험을 진행하였으며, 실험방법은 동일하게 진행되므로, 후술하는 설명에서는 '핵산 검출용 조성물'이라고 언급하였다.
우선, DEPC 처리된 물에 용해하여 저장용액상태로 보관 중인 핵산 검출용 조성물(트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체)을 각각 SPSC 완충액으로 1/10 배 희석하였다. 희석된 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 용액을 95 ℃에서 2 분간 가열하고 실온(25 ℃)에서 1 시간 이상 서서히 냉각시켰다. 상기와 같은 전처리 과정을 통해 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체가 헤어핀 형태를 형성하게 된다.
각각 500 nM 농도인, 전처리된 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 25 ㎕씩을 100 nM의 표적 물질(miR-21) 및 SPSC 완충액에 혼합하여 100 ㎕의 반응액을 제조하였다. 반응액을 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 이때, 상기 표적 물질은 2X 희석하여 사용하였고, 상기 반응액은 SPSC 완충액으로 연속 희석하여 제조하였다(HCR 과정이라고 한다).
HCR 과정 후에, 헤민(500 nM)을 상기 반응액 또는 희석한 반응액에 첨가하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 혼합물에 100 ㎕ TMB 용액을 발색반응을 유도하기 위해 첨가하여 최종 반응액을 제조하였다. 상기 최종 반응액을 DNAzyme 촉매에 의한 기질 산화를 유도하기 위해 실온에서 1 시간동안 항온 배양하고, 이로부터 생성된 신호는 652 ㎚ 파장에서 흡광도(Absorbance)를 측정하였다.
도 3b는 실시예 1 내지 3의 핵산 검출용 조성물로 표적 물질을 검출하였을 때, 측정한 신호 및 잡음을 나타낸 그래프이다. 실시예 1의 핵산 검출용 조성물은 500 nM 트리거 단량체(Tr)/제1 헤어핀 단량체(UH1)/제2 헤어핀 단량체(UH2)을 포함하고, 이를 표적 물질(100 nM) 및 헤민(500 nM)과 함께 상온에서 2시간동안 수행하였다. 이후 TMB를 기질로 첨가하여 1시간동안 발색 반응을 수행하였다. 오차막대는 각 실험을 네 번 반복한 데이터의 표준편차이고, 통계분석은 t-분포에 의해 수행되었으며, ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 3b에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 핵산 검출용 조성물은 G-quadruplex 구조를 형성하는 catG4 서열이 양 말단에서 분리되도록 설계된 제1 헤어핀 단량체를 포함하고 있다. 특히 실시예 1의 제1 헤어핀 단량체는 catG4 전체 서열의 1/3이 스템 영역에서 차단되도록 설계되어 있다. 제2 헤어핀 단량체는 다른 단량체에 크게 영향을 미치지 않도록 비교적 길이가 짧게 설계되었다.
이를 바탕으로 본 발명에서는 제1 헤어핀 단량체의 스템 영역에서 차단된 G-quadruplex 서열의 비율을 증가시키거나(실시예 2), 제2 헤어핀 단량체의 스템 영역 길이를 증가시킨(실시예 3) 헤어핀 세트를 설계하였다.
그 결과, 실시예 1의 핵산 검출용 조성물(p=.0011)보다 실시예 3의 핵산 검출용 조성물(p=0.000016)이 더 강한 신호와 작은 잡음을 갖는 것으로 확인되었다. 실시예 3의 핵산 검출용 조성물에서 잡음이 감소하는 것은, 제2 헤어핀 단량체가 안정하고 긴 스템 구조를 포함하고 있기 때문으로 여겨진다. 또한 실시예 3의 핵산 검출용 조성물에서 신호가 증가하는 것은 제2 헤어핀 단량체가 증폭 산물의 형성에 안정성을 높이는 긍정적인 영향을 주기 때문으로 여겨진다.
이에 반해 실시예 2의 핵산 검출용 조성물에서 제1 헤어핀 단량체의 스템 영역에서 G-quadruplex 서열의 비율을 증가시키면, GC 함량이 차단된 부분이 증가되기 때문에 HCR 과정에 악영향을 나타내게 되고, 상대적으로 약한 신호를 발생하게 되는 것이라 여겨진다. 결론적으로 실시예 1, 2, 3의 핵산 검출용 조성물 모두 표적 물질의 존재에 따라 발색 반응을 나타내나, 신호대 잡음의 비가 유의적으로 현저한 것은 실시예 1, 3의 핵산 검출용 조성물이고, 실시예 3의 핵산 검출용 조성물이 가장 적합함을 확인하였다.
<실험예 3> HCR 과정 최적화
본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물을 이용한, 표적 물질 검출의 최고 성능 조건을 찾기 위하여, 트리거 단량체 농도, 헤민 농도, 반응온도와 반응시간 등의 파라미터를 변화시켜, 최적화된 조건을 확인하고자 하였다.
1) 트리거 단량체(a) 농도 변화
실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 사용하였고, 이때 트리거 단량체의 농도를 500, 300, 100 nM로 하여 실험을 수행하였다. HCR 실험조건은 트리거 단량체의 농도를 변화시키는 것을 제외하고는 실험예 2와 모두 동일하게 수행하였다.
도 4a는 트리거 단량체의 농도를 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 4a에 나타난 바와 같이, 트리거 단량체 500 nM일 때 혼성화연쇄반응(HCR) 공정이 가장 많이 진행되었음을 확인하였다. 특히 트리거 단량체 500, 300, 100 nM에서 신호와 잡음에 대한 p 수치는 각각 0.00015, 0.00118, 0.0077이였다. 이들의 결과에 기초하면 트리거 단량체는 500 nM이 사용될 때 가장 바람직함을 알 수 있다.
2) 헤민 농도 변화
실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 사용하였고, 이때 헤민의 농도를 100, 250, 500, 1000 nM로 하여 실험을 수행하였다. HCR 실험조건은 트리거 단량체 농도를 500 nM로 하고, 헤민의 농도를 변화시키는 것을 제외하고는 실험예 2와 모두 동일하게 수행하였다.
도 4b는 헤민(hemin; H)의 농도를 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 4b에 나타난 바와 같이, 헤민 농도가 500 nM 미만일 때 잡음대 신호 비율이 비례하여 유의하게 증가하는 경향을 보였다. 다만 최고 농도에서는 포화되므로, 헤민 농도는 500 nM인 것이 가장 바람직함을 확인한 바, 이후 실험에서는 헤민 농도를 500 nM로 고정하여 사용하였다.
3) HCR 반응온도 변화
실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 사용하였고, 이때 HCR 과정의 반응온도를 25 ℃와 37 ℃로 하여 실험을 수행하였다. HCR 실험조건은 트리거 단량체 농도와 헤민 농도를 500 nM로 고정하고, HCR 반응온도만을 변화시키는 것을 제외하고는 실험예 2와 모두 동일하게 수행하였다.
도 4c는 HCR 과정의 반응온도를 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 4c에 나타난 바와 같이, 상온(25 ℃)과 37 ℃ 모두에서 유사한 결과를 나타내었다. 따라서 검출과정의 실용성을 고려하였을 때 상기 반응온도는 상온으로 설정하였고, 이후 실험에서는 반응온도를 상온(25 ℃)로 고정하여 사용하였다.
3) HCR 반응시간 변화
실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 사용하였고, 이때 HCR 과정의 반응시간을 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 시간으로 하여 실험을 수행하였다. HCR 실험조건은 트리거 단량체 농도와 헤민 농도를 500 nM, HCR 반응온도는 25 ℃로 고정하고, HCR 반응시간만을 변화시키는 것을 제외하고는 실험예 2와 모두 동일하게 수행하였다.
도 4d는 HCR 과정의 반응시간을 변화하였을 때, 실험결과를 나타낸 그래프이다. 통계분석은 t-distribution(n=4)로 수행되었다. ** 및 ***은 각각 0.01 및 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
도 4d에 나타난 바와 같이, 시간이 증가함에 따라 점진적으로 포화되는 경향을 나타내었다. 따라서 검출과정의 실용성을 고려하였을 때 상기 반응시간은 2 시간으로 설정하였고, 이후 실험에서는 반응시간을 2 시간으로 고정하여 사용하였다.
상기 실험예를 통해 최적화된 HCR 반응 조건은 다음과 같다. 트리거 단량체 농도 500 nM, 헤민(hemin) 농도 500 nM, 반응온도 상온(25 ℃;RT), 반응시간은 2 시간이다.
<실험예 4> 정량 및 민감도 평가
본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물을 통한, uHCR(범용성 혼성화연쇄반응)의 최적화된 실험조건 하에서, 정량적으로 표적 물질의 검출이 가능한지와 검출한계(LOD)를 도출하여 민감도를 평가하고자 하였다.
실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 사용하였고, 이때 표적 물질의 농도를 을 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 nM로 변화시키는 것을 제외하고는 실험예 2와 모두 동일하게 수행하였다. 최종 반응액으로부터 652 ㎚ 파장에서 흡광도(Absorbance)를 측정(도 5b)하고, 500~750 ㎚의 흡광도를 5 ㎚ 간격으로 측정하여 흡수 스펙트럼(도 5a)을 얻었다. 결과는 마이크로플레이트 판독기로 기록하였으며, 도 5a, 5b에 나타내었다.
도 5a는 다양한 농도(0-200 nM)의 표적 물질 존재 하에서, 실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때에 대한 흡수 스펙트럼이다. 도 5b는 다양한 농도(0-200 nM)의 표적 물질 존재 하에서, 실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때에 대한 검량선(652 ㎚)이다. 상기 오차막대는 3번의 각 실험을 세 번 반복한 데이터의 표준편차이다.
도 5a, b에 나타난 바와 같이 실시예 3의 핵산 검출용 조성물은 표적 물질의 농도가 증가함에 따라 흡광도의 최대값이 증가함을 확인하였다. 흡광도의 최대값과 표적 물질의 농도와의 상관관계를 확인하기 위하여 검량선을 작성하였다. 그 결과 표적물질의 농도와 흡광도는 우수한 선형관계를 가지고 있음을 확인하였다. 회귀 방정식은 0.9954의 상관계수(correlation coefficient)를 갖는 y=0.0059x+0.43였고, 여기서 x, y는 각각 표적 물질의 농도와 흡광도를 의미한다. 즉, 본 발명의 핵산 검출용 조성물은 낮은 농도의 표적물질에서부터 높은 농도의 표적물질까지 정량적으로 검출가능할 수 있음을 알 수 있다.
상기 3σ의 신호대 잡음 비율로부터 평가된 LOD는 5.67 nM이였다. 다시 말해 본 발명의 핵산 검출용 조성물과 이를 통해 표적 물질을 검출하는 방법은 표적 물질을 정량적으로 분석할 수 있을뿐더러, 민감도도 우수하여, 별다른 장비 없이도 현장에서 표적 물질 검출에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 5> 범용성 평가
본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물을 통한, uHCR(범용성 혼성화연쇄반응)의 최적화된 실험조건 하에서, 다양한 표적 물질의 검출이 가능한지를 평가하고자 하였다.
표적 물질에 따라 실시예 3, 4, 5, 6의 핵산 검출용 조성물을 사용하였고, 이때 종양 발생과 관련된 SNP(KRAS-Q61K(제14서열) 및 BRAF-V600E(제18서열))을 포함하는 DNA 센스-가닥 서열의 부분과 miRNAs(miR-21, miR125b)(제12서열, 제13서열)의 전체 서열을 표적 물질로 하였다.
상기 서로 다른 표적 물질을 첨가하였을 때, 이에 대한 신호가 모두 증폭되고, 각각 검출되는지를 확인하고자 하였으며, 각각의 경우에 검출하고자 하는 표적에 특이적인 트리거를 사용하여 표적마다 별도로 실험을 수행한 것을 제외하고는 실험예 2와 모두 동일하게 수행하였다.
도 6은 다양한 표적 물질에 대하여 실시예 3, 4, 5, 6의 핵산 검출용 조성물을 처리하였을 때, 각각 표적 물질에서의 신호/잡음 평가 결과이다. 암 발생과 관련된 miR-21, miR-125b, KRAS 및 BRAF 4가지를 표적물질로 하였다. 상기 miR-21 및 miR125b 표적은 모델로 전체 서열을 사용하여 제조하였고, KRAS 및 BRAF 표적은 KRAS-Q61K와 BRAF-V600E를 포함하는 서열로 준비하였다. 상기 실험 조건은 도 2와 같이 수행하였다(n=4).
다중 타겟 검출에 있어서, 다양한 표적 핵산에 대한 효율적인 설계가 가능하다는 것은 매우 강한 이점이 된다. 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물에서, 트리거 단량체의 범용성(universality)은 전략의 독창성에 중요한 요인이다. 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물의 범용성을 증명하기 위하여, miRNAs와 다중 SNP를 사용하여 수행하였다. 앞서 간략하게 설명한 바와 같이 본 실험을 위해 암 발생에 관여하는 것으로 알려져 있는 다음의 표적 핵산들을 사용하였다. SNP(KRAS-Q61K(제14서열) 및 BRAF-V600E(제18서열))을 포함하는 DNA 센스-가닥 서열의 부분과 miRNAs(miR-21, miR125b)(제12서열, 제13서열)의 전체 서열을 표적 물질로 하였다.
도 6에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물은 uHCR 시스템을 기반으로 하는 것으로, 트리거 단량체(제2, 3, 4, 5서열)의 서열을 제외하고는 모두 동일한 실시예 3, 4, 5, 6 핵산 검출용 조성물을 사용함에 따라, 서로 다른 서열을 갖는 상기 표적 핵산들의 신호가 모두 증폭되었음을 확인하였다.
즉, 각각의 표적 핵산이 존재함에 따라, 신호 역시 각각 검출되었음을 확인하였다. 다양한 표적 핵산에 대해 상보적인 트리거 단량체가 결합하여 열린상태로 만들고, 열린 상태의 트리거 단량체가 신호 증폭 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체에 결합함으로 신호가 증폭되는 것으로 여겨진다.
결과적으로 표적 핵산이 다양함에 따라, 표적해야할 서열이 다양하게 되어도, 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물(uHCR)은 성공적으로 작동함을 알 수 있다.
<실험예 6> 특이성 평가(specificity test)
도 7은 실시예 6의 핵산 검출용 조성물을 사용하여 표적 핵산을 검출함에 따른, 방법의 특이성 평가를 측정하여 나타낸 것이다. M1, M2, M3은 각각 하나, 둘, 세 개의 염기가 표적 핵산(T) 서열에서 돌연변이된 것으로 구체적인 서열은 표 2에 나타내었다. 실험조건은 도 2와 동일하게 하여 수행하였고, 통계 분석은 t-distribution을 통해 수행하였다(n=4). ***은 0.001 미만의 p 값을 의미한다.
name 번호 Sequence(5'-3')
T 15 CACAGCAGGTCAAGAGGAGTA
M1 16 CACAGCAGGT A AAGAGGAGTA
M2 17 CACAGCAGGT A AAGA C GAGTA
M3 18 CA G AGCAGGT A AAGA C GAGTA
SNP, miRNA와 같은 표적 핵산을 검출함에 있어서, 특이성(specificity)은 염기 차이를 명확하게 구별할 수 있는 능력에 관한 것으로, 신호를 통해 염기 차이를 구별할 수 있는지를 의미한다. 본 발명에 따른 표적 핵산 검출용 조성물(uHCR 시스템)의 특이성을 확인하기 위하여, 1개의 염기가 변이한 핵산(M1), 2개의 염기가 변이한 핵산(M2) 및 3개 염기가 변이한 핵산(M3)를 대상으로 증폭/신호 발생 여부를 확인하였다.
구체적으로 실시예 6로부터 구성된 핵산 검출용 조성물(제15서열을 타겟으로 하는 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체)을, BRAF(제15서열)의 핵산과 1, 2, 3개의 염기가 변이한 핵산(M1, M2, M3)에 각각 혼합한 후, HCR 반응을 수행하고, 헤민과 TMB 용액을 첨가하여(실험예 2 참고), 각각으로부터 반응하는 신호를 측정하였다. 상기 비색 신호를 통해 본 발명의 핵산 검출용 조성물의 특이성을 평가하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, BRAF(제15서열;T)을 표적 물질로 한 경우에는 신호/잡음 수치가 2.5로 매우 높았는데 반해, 1~3개의 염기가 변이된 핵산(M1, M2, M3)을 표적 물질로 한 경우에는 1.5 미만의 현저히 낮은 수치가 확인되었다.
즉, 완전한 서열을 갖는 표적 물질에서는 높은 신호가 관찰되는데 반해, 표적 물질에서 어느 하나라도 변형된 경우에는 신호가 현저히 낮아짐을 확인한 바, 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물(실시예 6)은 표적 물질의 변이체도 명확하게 구별할 수 있음을 알 수 있다.
특히, BRAF(제15서열;T)로부터 생성된 신호는 M1(p값=0.00047)의 것보다 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. M1로부터 생성된 신호는 M2 및 M3(각각 p값=0.00075, 0.00049)의 것에 비해 통계적으로 유의미한 정도의 차이를 나타냈다. 따라서 본 발명에 따른 uHCR 시스템을 기반으로 하는 핵산 검출용 조성물은 하나이상 염기 불일치도 구별할 수 있는 우수한 특이성을 가지고 있음을 확인하였고, 상동성이 높은 miRNA 또는 SNP를 충분히 검출할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 7> 생물학적 유체에서 표적 물질 검출 능력 평가(Target detection in biological fluid)
도 8은 본 발명에 따른 실시예 3의 핵산 검출용 조성물을 이용하여, 생물학적 유체(5% FBS 포함)로부터 표적 물질을 검출한 결과를 나타낸 것이다. 상기 생물학적 유체는 5% FBS(소태아혈청)을 포함하는 SPSC 완충액(pH 7.5)을 제조한 것을 사용하였고, 상기 생물학적 유체에 다양한 농도의 표적 핵산(miR-21)을 첨가하여 실험하였다. 실험 조건은 500 nM Tr/UH1/UH2을 포함하는 핵산 검출용 조성물(실시예 6), 100 nM 표적 핵산(miR-21), 500 nM 헤민을 사용하였고, HCR은 상온에서 2시간동안 수행하였다. 상기 발색 반응은 기질로 TMB를 사용하여 1시간동안 수행되었다. 오차 막대는 적어도 세 번의 실험에서의 표준편차를 나타냈다. 통계분석은 t-distribution으로 수행하였다. *, ** 및 ***은 각각 0.05, 0.01 및 0.001 미만의 p값을 의미한다.
uHCR을 기반으로 하여 완성된 본 발명의 핵산 검출용 조성물 및 이를 활용한 표적 핵산 검출 방법이 불순물에 의해 영향을 받는지, 실제 생물학적 유체에서 적용이 가능한지를 평가하고자 하였다. 이를 위해, 5% FBS(소태아혈청)가 혼합된 SPSC 완충액(pH 7.5)의 생물학적 유체에 다양한 농도(100, 50, 25, 0 nM)의 표적 핵산(BRAF-V600E)을 첨가한 시료를 준비한다. 여기에 실시예 3의 핵산 검출용 조성물(제13서열을 타겟으로 하는 트리거 단량체, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체)을 각각 혼합한 후, HCR 반응을 수행하고, 헤민과 TMB 용액을 첨가하여(실험예 2 참고), 각각으로부터 반응하는 신호를 측정하였다. 상기 비색 신호를 통해 본 발명의 핵산 검출용 조성물의 특이성을 평가하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 다양한 농도의 표적 핵산을 첨가한 생물학적 유체에 본 발명의 핵산 검출용 조성물(실시예 3)을 처리하여, 표적 핵산에 대한 비색 신호를 측정하였다. 그 결과 표적 핵산(BRAF-V600E)의 농도가 낮아지면 신호의 크기도 점차 감소하는 것을 확인하였다. 즉 FBS가 혼합된 생물학적 유체에서도 본 발명에 따른 핵산 검출용 조성물은 정확하고 특이적으로 표적 핵산(BRAF-V600E)을 검출하고 있음을 알 수 있다.
구체적으로 100, 50, 25 nM의 p 수치는 0.00095, 0.024 및 0.0053이였고, 표적 핵산(BRAF-V600E) 농도가 증가함에 따라 신호도 증가하였으므로, 생물학적 유체에서도 본 발명의 핵산 검출용 조성물이 정확하게 표적 핵산을 검출할 수 있고, 표적 핵산의 농도 정성적으로 확인할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INCHEON UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for detecting DNA using Universal Hybridization Chain Reaction <130> 8295 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trigger hairpin (The third region) <400> 1 ttctggctgc gcgtgggtag agaaga 26 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trigger hairpin (Target miR-21) <400> 2 atcagactga tgttgatgtt ctggctgcgc gtgggtagag aagatcaaca tcagtctgat 60 aagcta 66 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trigger hairpin (Target miR-125b) <400> 3 agaccctaac ttgtgatgtt ctggctgcgc gtgggtagag aagatcacaa gttagggtct 60 caggga 66 <210> 4 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trigger hairpin (Target KRAS) <400> 4 aggtcaagag gagtatgttc tggctgcgcg tgggtagaga agatactcct cttgacctgc 60 tgtg 64 <210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trigger hairpin (Target BRAF) <400> 5 acagtgaaat ctcgatgttc tggctgcgcg tgggtagaga agatcgagat ttcactgtag 60 ctag 64 <210> 6 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trigger hairpin (Target miR-21 mutant) <400> 6 atcagactga tgttgatctt gtccgtgcgc gtgggtaggg agaagatcaa catcagtctg 60 ataagcta 68 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The first hairpin <400> 7 tgggaaatct tctctaccca cgcgcagccc agacaggctg cgcgtgggta gggcgggt 58 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The first hairpin <400> 8 tgggaaatct tctccctacc cacgcgcacc gcagacacgg tgcgcgtggg tagggcgggt 60 60 <210> 9 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The first hairpin <400> 9 tgggaaatct tctctaccca cgcgcagcca gcagacactg gctgcgcgtg ggtagggcgg 60 gt 62 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The second hairpin <400> 10 ggctgcgcgt gggtagagaa gaacgcgcag cctgtctg 38 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The second hairpin <400> 11 cggtgcgcgt gggtagggag aagaacgcgc accgtgtctg 40 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The second hairpin <400> 12 ctggctgcgc gtgggtagag aagaacgcgc agccagtgtc tg 42 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 <400> 13 tagcttatca gactgatgtt ga 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-125b <400> 14 tccctgagac cctaacttgt ga 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS;T <400> 15 cacagcaggt caagaggagt a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS;M1 <400> 16 cacagcaggt aaagaggagt a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS;M2 <400> 17 cacagcaggt aaagacgagt a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS;M3 <400> 18 cagagcaggt aaagacgagt a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF <400> 19 ctagctacag tgaaatctcg a 21

Claims (12)

  1. (a) 표적 핵산에 상보적인 제1 영역과 제1 영역과 상보적이면서 스템(stem) 영역을 형성하는 제2 영역 및 루프 영역을 형성하는 서열번호 1로 표시되는 제3 영역이 결합되어 형성된 헤어핀 형태의 트리거 단량체(Tr);
    (b) 상기 트리거 단량체와 혼성화할 수 있는 서열번호 7 내지 9 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 제1 헤어핀 단량체(UH1); 및
    (c) 상기 제1 헤어핀 단량체과 혼성화할 수 있는 서열번호 10 내지 12 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 제2 헤어핀 단량체(UH2);를 포함하는 핵산 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 영역은 표적 핵산과 상보적인 10 내지 50 개의 염기서열로 구성되고, 상기 제2 영역은 제1 영역과 상보적인 염기서열 외에 1 내지 10 개의 염기서열 꼬리 부분을 더 포함하되, 스템 영역을 형성하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 트리거 단량체는 100 내지 1000 nM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표적 핵산은 표적 핵산은 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA인 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 트리거 단량체는 서열번호 2 내지 4 중에서 어느 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 검출용 조성물은 트리거 단량체가 표적 핵산과 특이적으로 결합하면, 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체에 의한 HCR 증폭으로 증폭산물이 생산되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물.
  7. 제1항에 따른 핵산 검출용 조성물을 시료에 접촉시켜, 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 단계는 20 내지 40 ℃, 0.5 내지 10 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  9. (ⅰ) 시료에 제1항에 따른 핵산 검출용 조성물을 첨가하여 표적 핵산의 서열을 증폭하는 단계;
    (ⅱ) 상기 (ⅰ) 단계로부터 회수한 증폭산물에 헤민 용액을 첨가하여 반응시키는 단계;
    (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계로부터 회수한 반응액에 발색반응 기질을 첨가하고, 650~660 ㎚로 흡광도를 측정하여 표적 핵산 존재여부를 판별하는 단계;를 포함하는 표적 핵산 검출방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (ⅰ)는 20 내지 40 ℃, 0.5 내지 10 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (ⅱ) 헤민 용액의 농도는 400 내지 500 nM인 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출방법.
  12. 제1항에 따른 핵산 검출용 조성물, 헤민 용액 및 발색반응 기질을 포함하는 표적 핵산 검출용 키트.
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