CN116348614A - 开关寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及寡核苷酸引物组及其在用于扩增和检测寡核苷酸、检测病原体或诊断感染，如SARS‑CoV‑2和Covid‑19的方法中的用途。引物组包括开关寡核苷酸，其适于在低于用于DNA扩增的温度范围的温度下与该组的正向引物或反向引物退火结合。当互补引物结合至开关寡核苷酸时，开关寡核苷酸阻止互补引物的扩增。本发明还提供了一种通过使用这种开关寡核苷酸在使用环介导等温扩增(LAMP)或逆转录环介导等温扩增(RT‑LAMP)检测靶DNA或RNA序列时减少假阳性的方法。

Description

开关寡核苷酸
技术领域
本公开涉及寡核苷酸引物组及其在用于扩增和检测寡核苷酸、检测病原体或诊断感染(如SARS-CoV-2和Covid-19)的方法中的用途。
背景技术
环介导等温扩增(LAMP)是快速的DNA扩增技术(Notomi et al.2000,Tomita etal.2008)，其已应用于病原体(如病毒、细菌和疟疾)检测。LAMP反应通常在恒温下发生，30分钟内即可扩增靶DNA。LAMP方法使用4或6个引物以结合靶DNA的6个区域，并且特异性非常高。因为LAMP仅需要一个恒定的温度，所以装置可以是简单的。起初，LAMP使用4个引物，但后来发现包含两个额外的环引物可以缩短原始LAMP所需的时间，并潜在地增加灵敏度(Nagamine et al.2002)。WarmStart RTx逆转录酶(New England Biolabs,UK)的可用性使得在一个反应(RT-LAMP)中使逆转录和LAMP结合成为可能。
本发明人先前已经开发了一种用于检测SARS-CoV-2的快速COVID-19检测试剂盒，其使用一步RT-LAMP而无需RNA提取(Huang et al.2020)。整个反应于恒定的65℃可以短至20分钟。肉眼可以看到简单的颜色改变指示，以确认病毒RNA扩增的结果。
识别6个不同靶序列的4至6个引物的使用在LAMP方法中提供了高度的特异性和选择性，这在诊断应用中特别重要。尽管如此，一些报告表明，在进行RT-LAMP测定时的遗留污染、引物二聚体的形成和自扩增可以导致假阳性(Baek et al.(2020)；Dao et al.(2020)；Hsieh et al.(2014))。
发明内容
本发明人已经开发了一种具有改进的稳定性和可靠性的LAMP或RT-LAMP方法。所述方法使用设计为开关的短寡核苷酸，其包含与LAMP反应引物之一所使用的序列互补的序列。所述寡核苷酸作为温度依赖性开关以结合LAMP的必需引物。当温度低于LAMP的工作温度(例如65℃)时，开关结合互补引物并抑制非特异性或脱靶扩增。在工作温度下，开关从引物分离，允许它结合靶RNA/DNA进行核酸的逆转录和扩增。
本发明人已经证明了，在使用先前描述的用于检测SARS-CoV-2的RT-LAMP方法检测样本中的病毒RNA时，寡核苷酸开关在提高(RT-)LAMP的稳定性和可靠性以及降低假阳性发生率方面的功效(Huang et al.2020)。本发明人还开发了用于单步RT-LAMP反应的真空干燥的主混合物，简化了最终使用者的操作，并使长期储存和运输变得容易。新的RT-LAMP测定已经用于测试从72名患者提取的RNA样本，证明了相对于RT-qPCR的总体百分比一致性(agreement)为90％。RT-LAMP的结果可以通过比色读数和荧光读数来报告，其可以通过肉眼来确定，并且同时通过荧光强度来量化。这种双重显示可以有助于数据解释与临床诊断。本发明人还验证了RT-LAMP在47个临床口腔-鼻咽拭子样本中直接检测SARS-CoV-2的应用，而没有任何预处理和RNA提取，具有89％的总体百分比一致性。这种改进的、廉价的且快速的比色测定方法比目前标准的RT-qPCR测定方法具有相当大的实际益处，并且具有作为一线筛选工具部署的巨大潜力。
因此，在第一方面，本发明提供了用于扩增DNA的片段的方法的寡核苷酸引物组，所述引物组包含正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)和开关寡核苷酸，其中，所述开关寡核苷酸包含与所述正向引物或所述反向引物中的一个的片段互补的核苷酸序列，其中，所述开关寡核苷酸适于在低于用于DNA扩增的温度范围的温度下与所述互补引物退火结合，并且其中，当互补引物结合至所述开关寡核苷酸时，所述开关寡核苷酸阻止所述互补引物扩增。
在另一方面，本发明提供了一种在使用环介导等温扩增(LAMP)或逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测靶DNA或RNA序列时减少假阳性的方法，其中，所述方法包括在LAMP或RT-LAMP反应中包括开关寡核苷酸，其中，所述开关寡核苷酸包含与用于扩增的正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)或反向外引物(B3)的片段互补的核苷酸序列，其中，所述开关寡核苷酸适于在低于用于扩增的温度范围的温度下与所述互补引物退火结合，并且其中，当互补引物结合至所述开关寡核苷酸时，所述开关寡核苷酸阻止所述互补引物扩增。
在另一方面，本发明提供了一种环介导等温扩增(LAMP)或逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的方法，所述方法包括：(a)将权利要求1的引物组与模板DNA或RNA、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶和任选的逆转录酶在溶液中混合；并且(b)将混合物加热至所述DNA聚合酶的工作温度。
在某些情况下，所述开关寡核苷酸适于阻止在所述开关寡核苷酸的3’端的延伸，和/或包含暗淬灭剂部分。
在另一方面，本发明提供了一种用于扩增DNA的片段的试剂盒，其中，所述试剂盒包含引物组(包括所述开关寡核苷酸)。在某些情况下，所述试剂盒包含其它组分，如(i)DNA聚合酶；(ii)逆转录酶；(iii)pH指示剂和/或比色指示剂；(iv)荧光团；(v)脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)；(vi)缓冲液组分；和/或(vii)使用说明书。在某些情况下，将引物组和任选的所述试剂盒的一种或多种附加组分干燥，并可以组合成试剂混合物。
在另一方面，本发明提供了所述引物组或所述试剂盒在检测或扩增靶DNA或RNA序列的方法中的用途。
在某些情况下，所述方法包括：逆转录RNA以产生cDNA，并且扩增逆转录的cDNA。
在某些情况下，所述方法用于检测样本中病原体(如病毒，如冠状病毒科(Coronaviridae)或SARS-CoV-2)的多核苷酸。
在某些情况下，所述互补引物包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的变体，和/或，其中，所述开关寡核苷酸包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少50％序列同一性的变体。所述引物组还包含：反向内引物(BIP)，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少50％序列同一性的变体；正向外引物(F3)，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少50％序列同一性的变体；反向外引物(B3)，其包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少50％序列同一性的变体；正向环引物(LF)，其包含SEQID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少50％序列同一性的变体；和/或，反向环引物(BF)，其包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少50％序列同一性的变体。在某些情况下，所述引物组包含具有SEQ ID NO:9至14的核苷酸序列的另外六个引物。
在另一方面，本发明提供了一种用于检测SARS-CoV-2或用于诊断受试者的SARS-CoV-2感染或Covid-19的试剂盒，所述试剂盒包含：具有SEQ ID NO:2至8的核苷酸序列的一组6个引物和开关寡核苷酸或具有SEQ ID NO:2至14的核苷酸序列的一组12个引物和开关寡核苷酸，DNA聚合酶，逆转录酶，比色pH指示剂，脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，以及任选的缓冲液，任选地其中，所述试剂盒包含真空干燥的试剂混合物。
在另一方面，本发明提供了一种检测样本中的SARS-CoV-2或诊断受试者的SARS-CoV-2感染或Covid-19的方法，所述方法包括：(i)获得样本或从受试者获得生物样本；(ii)逆转录以从所述样本中的RNA产生cDNA；(iii)使用具有SEQ ID NO:2至8的核苷酸序列的一组6个引物和具有SEQ ID NO:2至14的核苷酸序列的开关寡核苷酸或一组12个引物和开关寡核苷酸来扩增逆转录的cDNA；(iv)检测扩增的DNA；并且确定SARS-CoV-2的存在或诊断受试者的SARS-CoV-2感染或COVID-19。
现在将通过示例而非限制的方式，并参考附图，更详细地描述本公开。当给出本公开时，对于本领域技术人员而言，许多等效的修改和变化将是显而易见的。因此，所阐述的本公开的示例性实施方案被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本公开的范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行各种改变。本文引用的所有文件，无论是上文还是下文，都通过引用的方式明确地以其整体并入本文。
本公开包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许的或者被声明为明确避免的。如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一个引物”通常包括两个或更多个这种引物。
本文使用的部分标题仅为了方便，而不应理解为任何形式的限制。
除非另有定义，否则本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。在本申请的说明书中使用的术语仅仅是出于描述特定的实施方案的目的，而非用于限制本申请。本申请中使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。
以下实施例中没有具体条件的实验方法通常遵循常规条件或制造商推荐的条件。实施例中使用的各种常用的化学试剂均为市售产品。
附图说明
图1改进的RT-LAMP反应混合物的稳定性测试。a，含有O117_N和O117_Q的RT-LAMP反应混合物的稳定性测试。向试管中添加合成的RNA对照2-MN908947.3(“+”)或人类基因组cDNA(“-”)，然后于65℃加热由T表示的时间。A、B和C表示三个技术重复。b(i)干燥的反应混合物可在室温下储存高达3天。(ii)用20μL不含DNase(脱氧核糖核酸酶)/RNase(核糖核酸酶)的水复原干燥的反应混合物，然后添加合成的RNA对照2-MN908947.3(“+”)或人类基因组cDNA(“-”)。(iii)将试管在65℃孵育30分钟。顶行：含有O117_N的干燥的反应混合物；底行：含有O117_Q的干燥的反应混合物。
图2-开关可以在不稳定的加热装置中稳定RT-LAMP性能。在稳定的加热装置中，O117_N和O117_Q在1小时内表现良好。在不稳定的加热装置中，由于人RNA对照样本2中的自扩增和脱靶扩增，O117_N产生假阳性结果。O117_Q对人类RNA对照仍显示阴性。
图3-室温下储存7天的pH校正的脱色试剂盒的RT-LAMP性能。储存7天后，干燥物的颜色变为黄色(a)。可以通过添加KOH来调节试剂盒的pH，并且调节后的混合物的颜色(b)与原始新鲜混合物的颜色(c)相似。pH颜色校正的混合物可以对合成的RNA对照2-MN908947.3(Twist Bioscience)实施比色检测(d和e)。1和2：具有病毒RNA的pH调节的混合物，3.pH调节后与水的混合物的空白对照。4和5：具有病毒RNA的新鲜混合物。6和7：具有水的新鲜混合物的空白对照。(f)pH校正的和新鲜混合物的扩增过程的荧光检测。
图4-在室温下优化的RT-LAMP干燥的反应混合物的长期储存。干燥的混合物在室温下储存7天(a)和14天(b)。(i)将干燥的混合物(ii)用20μL不含DNase/RNase的水复原，然后添加5μL合成的RNA对照2-MN908947.3(Twist Ltd)(样本1、2、3)或人类基因组cDNA(样本4、5)。(iii)将试管在65℃孵育30分钟。c，显示在室温下储存14天的干燥的反应混合物的扩增的实时荧光曲线。将0.5μL荧光染料(New England Biolabs)添加至b(ii)的试管中，并在qPCR仪中于65℃孵育。每个循环表示30秒，并且反应进行30分钟。
图5-改进的RT-LAMP测定的灵敏度分析。每个实验中使用的SARS-CoV-2的RNA转录物和反应混合物标记在每个图像的右上角的白色方框中。“+”表示阳性结果，而“-”表示阴性结果。A、B、C、D、E表示五个技术重复。
图6-改进的RT-LAMP测定的灵敏度和特异性。a，RT-LAMP测定的O117_Q和O117_N制剂的50％终点的确定。将全长转录物在AVE缓冲液中连续稀释，以获得y轴上所示的总RNA输入/反应。每个点表示一个实验复制。短划线表示通过Reed-Muench方法计算的50％终点。试剂盒被干燥，除了指示用于RNA对照2的情况。图中显示了全长转录物。对含有(b)O117_N和(c)O117_Q的干燥的反应混合物进行了抗非SARS人类感染的冠状病毒试验。A和B表示两个技术复制。
图7-通过RT-LAMP从临床RNA提取物中检测SARS-CoV-2。使用含有O117_Q的湿反应混合物的RT-LAMP测定在检测来自临床RNA提取物样本的SARS-CoV-2中的性能。数据收集于2020年5月22日。A1-A10和H1-H8是阴性对照，H11和H12是阳性对照。
图8-pH依赖性比色RT-LAMP读数的定量评估。三种定量方法(a)使用430/560nm比值的吸光度；(b)使用485nm(激发)和500nm(发射)的Syto-9荧光；以及(c)使用Qubit 2.0荧光计的Qubit荧光用于评估RT-LAMP结果。d、e和f分别是RT-qPCR与三种定量评估之间的相关性分析。每个点表示一个实验复制。虚线表示高于阴性对照的3倍标准偏差。
图9-来自口腔-鼻咽拭子样本的SARS-CoV-2的检测。使用含有O117_Q的干燥的反应混合物的RT-LAMP测定在检测来自未处理的和未提取的口腔-鼻咽拭子样本的SARS-CoV-2中的性能。数据收集于a，2020年5月1日；b，2020年5月22日；c，2020年6月3日和d，2020年6月11日。“+”表示阳性对照，而“-”表示阴性对照。e，RT-LAMP检测提取物中和直接来自拭子的SARS-CoV-2的RNA与RT-QCR的Ct值的比较。
图10-一个反应中的两组引物(O117_Q和S17)提高了RT-LAMP测定中SARS-CoV-2病毒的检测灵敏度。具有开关的两组引物显示出增强的灵敏度并且没有假阳性结果，而不具有开关的那些引物则导致了假阳性结果。
图11-开关可以在1小时的孵育时间内稳定RT-LAMP性能。于65℃孵育60分钟后，由于人类RNA对照样本中的自扩增和脱靶扩增，O117_N产生了60％的假阳性结果(12/20反应)。O117_Q在65℃反应长达60分钟对人类RNA对照仍显示阴性。
图12-在室温下优化的RT-LAMP干燥的反应混合物的长期储存。干燥的混合物在室温下储存0天(A)和15天(B)。将干燥的混合物用20μL不含DNase/RNase的水复原，然后添加5μL合成的RNA对照2-MN908947.3(40拷贝/μL，Twist Bioscience)或人类基因组DNA作为阴性对照。(iii)将试管在65℃孵育30分钟。每次进行3个批次，每个批次重复3次。
图13-通过RT-LAMP从444个阴性RNA提取物中检测SARS-CoV-2。使用含有O117_Q的冷冻干燥反应混合物的RT-LAMP测定在检测来自唾液样本的RNA提取物的SARS-CoV-2中的性能。PC：阳性对照，NC：阴性对照。
图14-通过RT-LAMP从444个阴性RNA提取物中检测SARS-CoV-2。使用含有O117_Q的冷冻干燥反应混合物的RT-LAMP测定在检测来自唾液样本的RNA提取物的SARS-CoV-2中的性能。PC：阳性对照，NC：阴性对照。
图15-从来自拭子和唾液样本的RNA提取物中检测SARS-CoV-2。RT-LAMP检测提取物中SARS-CoV-2的RNA与RT-qPCR Ct值的比较。通过比色改变读取RT-LAMP结果(参见图7、13、14)。
具体实施方式
引物
在一些方面，本发明涉及引物组。引物适用于LAMP和/或RT-LAMP的方法。引物是短的通常是化学合成的多核苷酸，典型地为寡核苷酸引物。引物通常在末端糖上具有游离的3’-羟基部分。
核酸聚合酶通常需要与新合成的位点相邻的一段双链核酸的末端糖上的游离3’-羟基部分。引物能够与模板核酸退火结合，通常在具有互补序列的位点处，从而为聚合酶合成反应提供起始位点。在某些情况下，3’修饰(如巯基)可以用于引发合成反应。
引物凭借其特异性碱基配对能力靶向互补序列。在允许自发退火的盐、pH和温度条件下，通常通过将引物与靶核酸在溶液中孵育而形成引物与靶核酸之间的杂交体。
使用的引物通常是DNA。在某些情况下，引物可以是PNA或RNA。引物可以包含天然的或标准的核苷酸(即“天然存在的”或“天然的”核苷酸)的任何组合，其包括腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷。引物也可以包含核苷酸类似物。例如，引物可以包含一个或多个肽核苷酸，其中，在DNA和RNA中发现的磷酸键被肽样N-(2-氨基乙基)甘氨酸替换。肽核苷酸经受普通的Watson-Crick碱基配对，并且与互补的DNA/RNA杂交，与普通的DNA/RNA寡核苷酸相比，具有更高的亲和力和特异性以及更低的盐依赖性，并且可以具有增加的稳定性。引物可以包含一个或多个锁核苷酸(LNA)，其包含2′-O-4′-C-亚甲基桥并且是构象受限的。LNA与DNA和RNA形成稳定的杂交双链体，具有提高的稳定性和更高的杂交双链体解链温度。引物可以包括一个或多个丙炔基dU(也称为pdU-CE亚磷酰胺，或5'-二甲氧基三苯甲基-5-(1-丙炔基)-2'-脱氧尿苷，3'-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。引物可以包括一个或多个未锁的核苷酸(UNA)，它们是核糖核苷酸的类似物，其中C2′-C3键已经被切割。UNA与DNA和RNA形成杂交双链体，但具有降低的稳定性和更低的杂交双链体解链温度。因此，LNA和UNA可以用于微调掺入它们的引物的热力学性质。引物可以包含一个或多个三唑连接的DNA寡核苷酸，其中，一个或多个天然的磷酸盐主链连接被三唑连接替换，特别是当点击化学用于合成引物时。引物可以包含一个或多个2’-O-甲氧基-乙基碱基(2’-MOE)，如2-甲氧基乙氧基A、2-甲氧基乙氧基MeC、2-甲氧基乙氧基G和/或2-甲氧基乙氧基T。引物可以包含一个或多个2’-O-甲基RNA碱基。该引物可以包含一个或多个2’-氟代碱基，例如氟代C、氟代U、氟代A和/或氟代G。核苷酸类似物的其它具体示例包括：2-氨基嘌呤、5-溴dU、脱氧尿苷、2，6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、双脱氧-C、脱氧肌苷、羟甲基dC、反向的dT、异dG、异dC、5-甲基dC、5-硝基吲哚、5-羟基丁炔基-2'-脱氧尿苷(超级T)和8-氮杂-7-脱氮鸟苷(超级G)。在某些情况下，引物可以包括超级T 2，6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)和/或5-甲基dC。引物可以包含一个或多个生物素化的核苷酸。在某些情况下，引物可以包含高达2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多的核苷酸类似物和/或生物素化的核苷酸，或如本文所描述的任何一种类型的核苷酸类似物。在末端和/或倒数第二个连接处使用具有不可水解主链的合成寡核苷酸可能有利于降低反应噪声。可替代的主链可以从大量可用的化学物质中选择，如硫代磷酸盐、吗啉代核酸、锁核酸或肽核酸。
可以根据标准技术合成引物。在某些情况下，修饰的碱基和/或接头主链化学成分可以是理想的和有功能的。在某些情况下，引物可以在它们的5’或3’端被用于各种目的的基团修饰，例如荧光基团、淬灭剂、保护(阻断)基团(可逆或不可逆)、磁性标签、蛋白质、放射性标记等。
引物通常具有高纯度等级，即在被包括在反应混合物中之前。例如，可以使用HPLC纯化的引物，特别是如本文所描述的FIP和BIP引物。
LAMP方法通常使用至少4个引物，这些引物被选择或适于与模板核酸中的6个不同序列杂交/退火结合。
在本文中称为正向内引物(FIP)和反向(反向的)内引物(BIP)的两个内引物，各自含有对应于模板DNA的有义序列和反义序列的两个不同的序列。正向内引物的3’端序列(FIP称为“F2”，BIP称为“B2”)适于通过在对应的互补序列区(称为F2c和B2c)与模板DNA杂交而退火，并引发LAMP扩增的初始聚合酶步骤。
F2和B2的退火位点位于被扩增的模板DNA的区域的末端侧翼并限定该末端。模板DNA的扩增区域的长度通常高达约1kb，或500bp，400bp，300bp或250bp；或在约120bp、或130bp、或140bp、或150bp或160bp和约300bp之间；或300bp；或者在约130bp和300bp之间，或约230bp至270bp，或约240bp至260bp，包括B2/B2c和F2/F2c区域。
被称为“F1c”和“B1c”的FIP和BIP引物的5’端分别与F2c和B2c的序列5’具有高的序列同一性，即F2和B3的退火位点分别位于FIP和BIP的3’端。在从FIP初始链延伸后，如下所述，FIP/新生链从模板被置换，并且FIP的F1c和新生链的互补序列F1自退火，以在链的一端形成环。
内引物的两端通常不富含AT。在某些情况下，末端的三个核苷酸不是A或T。在其它情况下，末端4个核苷酸中的至少3个或末端5个核苷酸中的4个不是A或T”？
在模板DNA中，F1的3’端和F2的3’端之间的距离，以及B1的3’端和B2的3’端之间的距离通常为约30至70个核苷酸长度，或更通常为约40至60个核苷酸长度，或约40个核苷酸长度。
在FIP中的F2与F1c之间(以及在BIP中的B2与B1c之间)是间隔区。F2(或B2)和间隔区(或它们的反向互补序列)一起形成环的一部分，所述环在LAMP反应的初始阶段过程中形成的初始哑铃状结构的每一端形成，并且每个环在循环扩增阶段过程中添加。当引物的5’端与在引物的3’端引发的新互补链自退火结合时，使用与引物的5’端具有高度序列同一性的模板序列作为模板，形成该环。环的剩余部分与F1和F2(或F1c和F2c，或B1和B2，或B1c和B2c)之间的区域互补。如下所述，在某些情况下，此额外的环序列为通过环引物的结合提供了模板。
间隔区/环区的长度通常为至少2个，或至少3或4个核苷酸。间隔区/环区的长度通常小于约50个、或小于约40个、或30个或10个核苷酸。在某些情况下，间隔区/环区可以包含聚胸苷或由聚胸苷组成。在其它情况下，间隔区/环区可以具有本文实施例中举例说明的FIP引物的序列。
正向外引物(“F3”)和反向外引物(“B3”)引物适于通过与模板DNA的单个段(stretch)杂交而退火，通常基本上跨越引物的全长。它们引发聚合酶反应，其使用LAMP方法的初始聚合酶反应中的模板DNA置换FIP或BIP引物以及在内引物的3’端形成的新生链。因此，F3引物与该模板的3′到F2c的序列退火结合，即由FIP引物的F2序列杂交的序列。B3引物与该模板的3′到B2c的序列退火结合，即由BIP引物的B2序列杂交的序列。由正向内引物和正向外引物或反向内引物和反向外引物杂交的序列之间的距离通常为约5至100个核苷酸，例如约10至50个核苷酸。
外引物从模板核酸中置换内引物和新生链的主要目的是形成哑铃状结构，其用作LAMP的循环扩增步骤的初始模板。循环步骤使用另外的正向内引物和反向内引物以引发循环扩增，而外引物通常不再起作用。因此，在典型的反应中，正向内引物和反向内引物过量于正向外引物和反向外引物存在，通常过量约2倍至10倍，或约3倍至5倍，或约4倍。
在某些情况下，还包括一组额外的正向和/或反向引物。Nagamine等人(2002)描述了包含两个额外的环引物(“LF”和“LB”引物)如何能够缩短原始LAMP所需的时间并潜在地提高灵敏度。环引物与上述哑铃状结构的环区杂交，除了对应于或杂交于内引物的序列的部分以外。
通常，LF引物通过杂交与F1和F2区域之间的环区退火结合。可替代地，LF引物可以通过杂交与F1c和F2c区域之间的环区退火结合。通常，LB引物通过杂交与B1和B2区域之间的环区退火结合。可替代地，LB引物可以通过杂交与B1c和B2c区域之间的环区退火结合。
正向环引物通常与正向内引物和反向内引物的数量大致相同，在某些情况下为其+/-50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。
通过杂交与模板DNA的对应的反向互补区域退火结合的F1c、F2、F3、B1c、B2和B3区域中的每一个的长度通常为至少10个，或至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，如从约10个到约60个，约12个到约40个，或约15个到约25个或30个核苷酸。在某些情况下，引物可以包含一种或多种核苷酸类似物，如本文所述的类似物，其形成比天然核苷酸具有更高稳定性的双链杂交体。在这种情况下，原则上，引物可以更短，例如至少6、7、8或9个核苷酸长度。然而，一般而言，较短的区域将具有较低的特异性和选择性，并且可能更倾向于脱靶扩增。通常，内引物比外引物更长，因为它们包括两个单独的模板结合区(F2和F1c；或B2和B1c)以及它们之间的间隔区/环区。因此，内引物通常具有约24或30或35或40、至约100个或90个或80个或70个或60个或50个核苷酸的长度，或约30至70个、或约35至60个、或约40至50个核苷酸的长度。外引物和环引物通常包含基本上跨越其全长的模板结合区，但在某些情况下，在其5’端可以具有额外的核苷酸，如1-5个、或1-10个、或1-15个、或1-20个额外的核苷酸。如上所述，如果引物在它们的5’端包括额外的核苷酸，则这些引物的长度通常在约10至约50个核苷酸之间，例如，约12至约40个，或约15至约25或30个核苷酸，或者更长。
单链区域的选择将部分取决于起始核酸的复杂性，例如，人类基因组可能需要较长的引物，而质粒可能需要短得多的引物。
应当注意，在某些情况下，即使引物与模板核酸不完全互补，只要引物能够与模板DNA的靶区域退火结合，也可以实现扩增。然而，一般而言，将设计引物以结合至模板DNA的保守区域，并将选择反应条件，以实现扩增方法的最大特异性、选择性以及效率。
引物通常被选择为具有最佳用于特定的DNA聚合酶的解链温度(Tm)。典型的Tm值为约50℃至约70℃，更典型地为约55℃至68℃，更典型地为约55℃或60℃至65℃。在某些情况下，内引物的F1c和B1c区域的Tm值被设定为略高于F2和B2区域的Tm值，使得在单链DNA从模板释放后立即形成环。在某些情况下，将外引物(F3和B3)区域的Tm值设定为低于内引物的F2和B2区域的Tm值，以促进从内引物的初始合成。在这两种情况下，Tm值的差异可以独立地高达或约为2℃，1.5℃，1℃，0.5℃，0.2℃或0.1℃。
在某些情况下，本发明的引物可以用于扩增/检测与病原体相关的核酸。引物包含如上所述的序列，其与病原体(如病毒、冠状病毒科或SARS-CoV-2)的核酸序列互补或具有高的序列同一性。
被称为“LAMP引物设计软件，PrimerExplorer”的引物设计支持软件，可在(http://primer explorer.jp/e/)获得。
在某些情况下，该引物用于检测样本中病原体(例如冠状病毒科，如SARS-CoV-2)的寡核苷酸的方法。在某些情况下，所述引物组包含开关寡核苷酸，所述开关寡核苷酸包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％或90％序列同一性的变体，或者由SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％或90％序列同一性的变体组成。在某些情况下，所述互补引物包含SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％、或90％或95％序列同一性的变体或者由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％、或90％或95％序列同一性的变体组成。互补引物可以是FIP引物。引物还可以包含：反向内引物(BIP)，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％、或90％或95％序列同一性的变体；正向外引物(F3)，其包含SEQ IDNO:4的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％、或90％或95％序列同一性的变体；反向外引物(B3)，其包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ IDNO:5具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％、或90％或95％序列同一性的变体；正向环引物(B3)，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％、或90％或95％序列同一性的变体；和/或反向环引物，其包含SEQ IDNO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少50％、或至少60％、70％、75％、80％、或90％或95％序列同一性的变体。在某些情况下，该引物组可以包含具有SEQ ID NO:9至14的核苷酸序列的六个另外的引物，或者可以使用具有Huang等人(2020)的表1中所示的或N1或N17组中任一组的核苷酸序列的六个另外的引物。
开关寡核苷酸
本发明使用开关寡核苷酸。开关寡核苷酸包含与上述引物之一的片段互补的核苷酸序列。通常，开关寡核苷酸序列与互补引物序列在长度为至少10个、或至少11个、或12个核苷酸的区域上互补，如约10至约50个、或至40个、或35个、或30个、或25个核苷酸。在某些情况下，开关寡核苷酸可以包含一种或多种核苷酸类似物，如本文所述的类似物，其形成比天然核苷酸具有更高稳定性的双链杂交体。在这种情况下，原则上，开关寡核苷酸可以更短，例如至少6、7、8或9个核苷酸。
开关寡核苷酸与互补引物的结合是温度依赖性的。因此，在扩增反应过程中(即在溶液中)，开关寡核苷酸用作温度依赖性开关。开关寡核苷酸通常适于在低于寡核苷酸扩增温度范围的温度下，即低于阈值温度下，通过杂交与互补引物退火结合。此温度将取决于用于反应的DNA聚合酶。在许多情况下，反应温度为约60-65℃。在某些情况下，开关寡核苷酸在低于约65℃、或64℃、或63℃、或62℃、或61℃、或60℃、或59℃的温度下基本上与(溶液中的)互补引物退火结合。
寡核苷酸的退火温度由综合因素确定，其包括互补序列的长度和包含的核苷酸(或核苷酸类似物)或它们的序列。本领域技术人员能够使用本领域已知的方法和软件设计具有所需退火温度的寡核苷酸。
开关寡核苷酸可以具有在全部或部分F1c、F2、F3、B1c、B2或B3区域与互补引物互补的序列；或可以与FIP的F1c区的全部或部分、间隔区/环区以及F2区的全部或部分互补，即可以桥接F1c与F2区之间的区域并包括这两个区域的部分或全部；或可以与BIP的B1c区的全部或部分、间隔区/环区以及B2区的全部或部分互补，即可以桥接B1c与B2区之间的区域并包括这两个区域的部分或全部。开关寡核苷酸不需要与F1c、F2、F3、B1c、B2或B3区中的任何一个区域的全部杂交，只要当互补引物结合至开关寡核苷酸时开关寡核苷酸阻止互补引物的扩增。在某些情况下，互补引物的互补序列位于引物的3’端。例如，在某些情况下，开关寡核苷酸包含与互补引物的至少10个或至少11、12、13、14、15、16或17个3’端核苷酸互补的序列。在某些情况下，开关寡核苷酸的5’端序列与互补引物的3’端序列互补。开关寡核苷酸可以具有在全部或部分F1、F2c、F3c、B1、B2c或B3c区与互补引物互补的序列。
在某些情况下，互补引物是内引物FIP或BIP中的一种。在某些情况下，开关寡核苷酸的5’端序列与FIP或BIP的3’端序列互补。
在某些情况下，可以使用多于一种的开关寡核苷酸，其中，如上所述，额外的开关寡核苷酸包含与不同的一种LAMP引物或不同的一个F1c、F2、F3、B1c、B2或B3区互补的序列。
在某些情况下，开关寡核苷酸可以在3’和/或5’端具有额外的核苷酸，其不与互补引物互补，因此不与互补引物杂交。例如，在某些情况下，开关寡核苷酸可以在5’或3’端具有多达1个或多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30个或更多个额外的非互补核苷酸。
在许多情况下，开关寡核苷酸将包含与模板DNA(原始模板DNA或扩增过程中产生的环状DNA)互补的序列。在这种情况下，阻止寡核苷酸引发额外的DNA扩增是有益的。因此，在某些情况下，开关寡核苷酸适于阻止开关寡核苷酸的延伸或扩增，即用作引物。因此，开关寡核苷酸可以包含3’链终止子或末端阻断剂寡核苷酸修饰(即终止子部分)。示例包括：2’，3’-双脱氧腺苷(2，3ddA)、2’，3’-双脱氧胞苷(2，3ddC)、2’，3’-双脱氧胸苷(2，3ddT)、2’，3’-双脱氧鸟苷(2，3ddG)、3’-脱氧胞苷(3’-dA)、3’-脱氧胞苷(3’-dC)、3’-脱氧鸟苷(3’-dG)和3’-脱氧胞苷(3’dT)。可替代地，可以使用3’端的非核苷阻断剂，如3’-间隔区C3、3’-磷酸盐，或1，2-二氢-(3H)-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸三肽。
在某些情况下，开关寡核苷酸的3’端可以用暗淬灭剂分子修饰。暗淬灭剂是一种从荧光团吸收激发能量并耗散该能量的分子，使得荧光信号被淬灭。在某些情况下，荧光团可以作为指示剂包含在反应混合物中，并且暗淬灭剂有助于减少基线荧光。可以使用的暗淬灭剂的示例是Iowa
Figure BDA0004172553660000101
(IBRQ)。
开关寡核苷酸通常以过量于互补引物的量使用。在某些情况下，开关寡核苷酸与互补引物的比例可以是至少或约1.1：1、1.2：1、1.3：1、1.4：1、1.5：1、1.6：1、1.7：1、1.8：1、1.9：1或2：1或更大，如约1.1：1至约10：1，或约1.2：1至约5：1，或约1.3：1至约2：1，或约1.4：1至1.6：1，或约1.5：1。
对于上述反应引物，开关寡核苷酸通常可以具有任何合适的特征。
DNA聚合酶
任何合适的DNA聚合酶都可以用于本文所述的方法。
DNA聚合酶可以是真核生物的聚合酶。可以使用的真核生物的聚合酶的示例包括pol-α、pol-β、pol-δ、pol-ε或其任何功能性变体、类似物、同系物或衍生物及其任何组合。
DNA聚合酶可以是原核生物的聚合酶。可以使用的原核生物的聚合酶的示例包括嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(Bst)DNA聚合酶、BcaBEST DNA聚合酶(TaKaRa)、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I Klenow片段、大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、大肠杆菌DNA聚合酶IV、大肠杆菌DNA聚合酶V、嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶I大片段、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Pol I大片段(Bsu聚合酶)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)DNA聚合酶I、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)DNA聚合酶1(Sau)，或其任何功能性变体、类似物、同系物或衍生物及其任何组合。
DNA聚合酶可以是噬菌体聚合酶。可用于本文所述方法的噬菌体聚合酶的示例包括Phi-29 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、噬菌体T4 gp43 DNA聚合酶，或其任何功能性变体、类似物、同系物或衍生物及其任何组合。
DNA聚合酶含有链置换性质，并且通常具有高的链置换活性。
DNA聚合酶可以使用侵入链的游离3'-羟基，通过掺入新的核苷酸以催化DNA合成。许多聚合酶可以使用侵入链的3’-羟基以催化合成，并且同时在合成发生时置换另一条链。例如，大肠杆菌聚合酶II或III可以用于延伸侵入的D-环。另外，可以使用通常用于大肠杆菌中SOS损伤靶向的突变的大肠杆菌聚合酶V。所有这些聚合酶都可以通过与β-二聚体钳状物以及单链DNA结合蛋白质(SSB)和其它组分的相互作用和合作而变得高度进行性(processive)。来自原核生物、病毒和真核生物的其它聚合酶也可用于延伸侵入链。
许多DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切酶活性，并且一些还具有5’-3’核酸外切酶活性。3’-5’核酸外切酶活性增加了复制反应的保真性。因此，在某些情况下，DNA聚合酶具有3'-5'核酸外切酶活性。
在其它情况下，使用具有3’-5’核酸外切酶活性和/或5’-3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶可能是不可取的，因为随着聚合酶向前移动，它导致渐进地消化一条DNA链，而非置换。当采用具有3’-5’核酸外切酶的聚合酶时，游离的寡核苷酸也可以受到末端依赖性降解。由于聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性而缩短的寡核苷酸也可以导致错误引发，导致增加的反应噪声。因此，在某些情况下，DNA聚合酶不具有3’-5’核酸外切酶活性，和/或不具有5’-3’核酸外切酶活性。
DNA聚合酶可以以10000单位/ml至10单位/ml的浓度存在，如5000单位/ml至500单位/ml。
逆转录酶
在RT-LAMP中，起始模板是RNA，例如病毒的RNA基因组。在这种情况下，作为初始步骤，使用逆转录酶从RNA模板产生cDNA。cDNA为扩增提供了模板。
任何合适的DNA聚合酶都可以用于本文所述的方法。
在许多情况下，将优选使用与所使用的DNA聚合酶具有相似工作温度的逆转录酶。以这种方式，整个方法可以在单一反应温度下实施。在某些情况下，DNA聚合酶与逆转录酶的最佳温度之间的差值高达约+/-10℃、5℃、4℃、3℃、3℃、2℃或1℃。
逆转录酶可以以10000单位/ml至10单位/ml的浓度存在，如5000单位/ml至500单位/ml。
试剂
dNTP
dNTP，例如dATP、dGTP、dCTP和dTTP，及其衍生物和类似物都可以用于本发明。在前导链和滞后链RPA中，ATP、GTP、CTP和UTP也可以被包括用于RNA引物的合成。
在某些情况下，dNTP可以以每种NTP物质1mM至200mM的浓度使用。
可以使用dNTP和ddNTP(ddATP、ddTTP、ddGTP和ddGTP及其衍生物和类似物)的混合物，其中ddNTP的浓度为dNTP浓度的1/100至1/1000(1μM至2mM)，例如用于产生片段梯。
DNA去稳定剂
使DNA螺旋不稳定的化学物质可以提高LAMP的效率。本领域技术人员可以选择合适的化学物质。例如，Notomi等人(2000)报道了0.5M至1.5M甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)或L-脯氨酸，其减少碱基堆积，不仅刺激反应的总速率，而且增加靶选择性，显著减少不相关序列的扩增。
缓冲液
(RT-)LAMP反应中的缓冲溶液可以是Tris-HCl缓冲液、Tris-乙酸盐缓冲液或其组合。缓冲液可以以约10mM至约100mM的浓度存在。优选的缓冲液是以约20mM至约30mM的浓度使用的Tris-HCl缓冲液，最优选25mM。缓冲液的pH可以是6.5至9.0，优选pH 8.3。
缓冲液可以包含约5mM至约50mM，优选约10mM至约40mM的乙酸钾。
在某些情况下，可以包括还原剂，例如DTT。在某些情况下，DTT浓度可以是1mM至10mM，优选1mM。
反应组分
在实施例中描述了反应组分的非限制性示例组。在适当的情况下，示例性反应的不同组分可以独立地选择+/-50％、40％、30％、30％、10％或5％用于本发明的方法或组合物。
反应组分的干燥
本发明人在本文的实施例中证明了包含本发明的引物组和任选的其它反应组分的反应混合物可以制备为干燥的反应混合物。干燥的引物和试剂提供了不需要冷藏以保持活性的优点。例如，一管引物/试剂可以储存在室温下。此优点在冷藏受限的野外条件下特别有用。
可以通过任何合适的方法干燥引物/试剂。在某些情况下，可以真空干燥引物/试剂。在其它情况下，可以冷冻干燥(冻干)引物/试剂。生产真空干燥或冻干试剂的合适方法是本领域已知的。
引物/试剂可以在管的底部，或在珠子或任何其它合适类型的固体支持物上干燥。为了实施反应，冷冻干燥的试剂在缓冲溶液或水中复原，这取决于干燥的试剂的成分。然后添加靶/模板核酸，或疑似含有靶/模板核酸的样本。可替代地，在某些情况下，复原液体也可以含有样本核酸。将复原的反应孵育一段时间，并检测扩增的核酸，如果存在扩增的核酸。
可以在使用前干燥的试剂可以包括DNA聚合酶、逆转录酶、dNTP、ddNTP、还原剂、引物、探针、稳定剂(如核酸稳定剂)、缓冲剂、pH指示剂和/或比色指示剂、细胞裂解试剂和/或阳性或阴性对照核酸模板。
引物可以是本文所述的任何引物。
稳定剂(如葡聚糖、乳糖或海藻糖)可包含在干燥的混合物中，例如在复原的反应中以20mM至200mM、或30mM至150mM、或40mM至80mM的量存在，以改进干燥性能和保质期。可以包含牛血清白蛋白。如果需要，干燥的试剂可以在使用前储存长达2周、3周、1个月、6个月或1年或更长时间。
可以将干燥的混合物重新溶解在水(通常是不含DNase和/或RNase的水)中或本领域技术人员可以确定的任何其它合适的缓冲液中。在某些情况下，可在使用前调节重新溶解的试剂的pH。
试剂盒
本发明还提供了用于扩增或检测寡核苷酸的存在或进行LAMP或RT-LAMP反应的试剂盒。试剂盒包含一组如本文所描述的寡核苷酸引物。
试剂盒还可以包含以任何合适的组合存在的本文所述的任何浓度的任何试剂。在某些情况下，试剂盒可以包含(i)DNA聚合酶；(ii)逆转录酶，如果试剂盒用于需要逆转录的方法；(iii)pH指示剂和/或比色指示剂；(iv)脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)；(v)缓冲组分；和/或(vi)使用说明书。
如本文所描述的，可以干燥试剂盒的试剂。试剂可以组合作为试剂混合物，例如在相同固体支持物(如反应管)之中或之上。试剂可以以任何合适的量提供，使得当复原时达到合适的试剂浓度。
在某些情况下，试剂盒用于检测受试者的SARS-CoV-2或用于诊断受试者的SARS-CoV-2感染或Covid-19。试剂盒可以包含具有SEQ ID NO:2至8的核苷酸序列的一组6个引物和开关寡核苷酸或具有SEQ ID NO:2至14的核苷酸序列的一组12个引物和开关寡核苷酸。试剂盒还可以包含本文公开的任何试剂。在某些情况下，试剂盒还包含DNA聚合酶，任选Bst2.0DNA聚合酶(New England Biolabs)，逆转录酶，任选WarmStart逆转录酶(New EnglandBiolabs)，比色pH指示剂，任选酚红，脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，以及任选的缓冲液；任选地其中，该试剂盒包含真空干燥的试剂混合物。
反应条件
扩增反应可以孵育任何合适的时间长度。典型的反应孵育可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，例如约5分钟至16小时或更长，约15分钟至1或3小时，约20分钟至1小时或2小时，或约30分钟至1小时。
可以实施孵育，直到达到所需的扩增程度。期望的扩增程度可以是10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍或1000000倍扩增或更大。LAMP可以实现高达109个或更多拷贝的靶序列的DNA扩增，或500ug/ml或更高的DNA产率(Nagamine等人(2002))。
最佳时间可以由本领域技术人员使用本领域已知的方法来选择，并且在某些情况下可以取决于所使用的检测方法(如下所述)或扩增的目的。最佳时间通常将是最大化检测测试样本中靶模板RNA或DNA的存在的灵敏度，同时最小化假阳性的时间，例如由于非特异性或脱靶扩增或样本的交叉污染。
LAMP和RT-LAMP的一个益处是反应可以在没有热循环的情况下实施，如PCR所需要的。本发明的另一个优点是维持恒定温度或防止温度下降到可能发生非特异性结合或引物二聚体形成的临界水平以下是不那么重要的。通过至少一种反应引物的这种不期望的结合被与开关寡核苷酸的结合所阻止或抑制，并与之竞争。因此，该反应优选但非必须在恒温(例如+/-1℃、+/-0.5℃、+/-2℃或+/-1℃)下进行，在该温度下DNA聚合酶和在适当情况下的逆转录酶是活性的。本领域技术人员可以根据所用的特定的酶容易地选择合适的温度。
在某些情况下，反应可以在20℃至80℃、50℃至75℃、55℃至70℃，如60℃至65℃实施。
反应产物的检测
LAMP或RT-LAMP反应结束时的产物是对应于靶多核苷酸区域的DNA多联体(扩增子)的混合物。DNA多联体由多个连续的茎环形成，茎环通过在其间有环的相同链中的靶序列的交替反向重复片段之间退火而形成。
可以通过本领域已知的任何合适的方法来检测LAMP扩增或产物，包括检测DNA扩增的直接或间接方法，从而检测靶多核苷酸序列的存在。
在某些情况下，可以通过电泳分离产物来实施检测，例如在琼脂糖或PAGE凝胶上。由于不同大小的DNA多联体，这些产生了特征性的“梯状”或带型。可以通过对产物染色进行检测，例如用溴化乙锭或其它嵌入染料，或通过用合适的探针进行Southern印迹杂交。
在其它情况下，使用一种方法可以是有益的，该方法允许在反应进行时实时检测，或在反应完成后立即检测，具有极少的额外步骤，和/或可以需要极少的专业设备或材料。一些方法允许用肉眼进行分析。LAMP是非常有效的DNA扩增的方法，并且产生高产量的扩增DNA。因此，在某些情况下，可以通过观察或测量由作为反应溶液中扩增的副产物的溶液中焦磷酸镁沉淀引起的白色沉淀或白色沉淀的浊度来确定DNA扩增。可替代地，可以使用光度测定/光度检测方法来测量浊度。
焦磷酸根离子强力结合至金属离子，并形成不溶性盐。因此，用于检测焦磷酸镁的可替代方法是通过添加金属离子(如锰)和金属指示剂，例如荧光金属检测剂，如钙黄绿素(Tomita等人(2008))。
在某些情况下，比色pH指示剂可以用作靶序列的聚合酶扩增的间接指示。例如，酚红会因在(RT-)LAMP反应中的DNA扩增而从粉红色变成黄色。颜色的改变可以通过简单的观察来确定。可替代地，可以测量一个或两个不同波长处的吸光度，并且任选地计算它们之间的比率来确定，其中，选择波长以区分使用对照阳性和阴性样本获得的样本间的颜色(Berecher等人(2020))。
在某些情况下，使用pH指示剂间接确定DNA扩增可能并不合适，例如，当比较由于DNA扩增以外的原因可能具有不同pH的样本时，或者如果使用干扰监测DNA扩增的缓冲液时。这种效果可以通过使用不含DNase和/或RNase的水代替来最小化，或者在可能的情况下使用最少的缓冲液来最小化。
使用荧光可以实现DNA扩增的测量的直接观察测量。嵌入染料(如SYTO 9、SYBR绿或Qubit BR DNA染料)可以用于产生肉眼可见的可视颜色改变，或在适当情况下在紫外线/暴露下产生肉眼可见的可视颜色改变，或可以使用荧光计更精确地测量。嵌入或直接标记DNA的染料的荧光发射/强度可以与最初存在的拷贝的数量相关。因此，这种检测方法也可以是定量的。
在其它情况下，可以使用荧光探针或标记。例如，掺入DNA产物的一个或多个引物(即FIP、BIP、LF和LB引物)可以与荧光团缀合/5’端缀合，例如Huang等人(2020)所述的FAM(6-羧基荧光素)。如上所述的荧光标记和比色指示剂也可被组合，用于增加灵活性并用于不同的情况，也如Huang等人(2020)所述。
在某些情况下，如本文其它地方进一步描述的，暗淬灭剂可以包括在反应中以减少背景荧光并增加灵敏度。
通过肉眼视觉检测LAMP扩增子的另一种方法使用序列特异性互补的金结合的ss-DNA(AuNP)。AuNP与(RT-)LAMP盐的扩增的DNA产物的杂交诱导了金颗粒的聚集，并抑制了正常的红色到紫蓝色的颜色改变，从而为成功的DNA扩增/检测提供了可替代的比色指示剂。
在某些情况下，该方法可以包括，例如，去除反应的一部分，分离未掺入的部分，并检测未掺入的引物。这可以利用未掺入引物的小尺寸和扩增的产物的大得多的尺寸之间的巨大差异来实现。可以使用尺寸排阻色谱法快速实施未掺入的引物的分离，例如离心柱。如果引物被标记，包含离心柱和测量(例如，荧光或放射性)的监测程序可以在不到一分钟内实施。用于分离延伸的引物的另一种可替代方案涉及使用固定化的寡核苷酸。例如，与在扩增的DNA序列中唯一发现的序列同源的寡核苷酸可用于特异地捕获由引物延伸产生的核酸。这些捕获寡核苷酸可以被固定在芯片或其它基质上。通过捕获寡核苷酸对延伸的寡核苷酸的捕获可以通过RecA蛋白介导的方法来实施，或者如果必要的话，通过传统的溶液杂交来实施。
本发明的方法
在一些方面，本发明涉及一种环介导等温扩增(LAMP)或逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的方法。所述方法包括：(a)将如本文所描述的引物组(包括如本文所描述的开关寡核苷酸)与模板DNA或RNA(或疑似包含靶模板DNA或RNA的样本)、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)和DNA聚合酶混合，并且(b)将混合物加热至DNA聚合酶的工作温度。如下所述，如果靶模板DNA或RNA确实存在，那么该方法导致靶DNA或对应于靶RNA的cDNA的扩增。因此，该方法用于扩增DNA。
如果初始模板核酸是RNA，或如果该方法用于检测/确定RNA的存在或不存在，那么也包括逆转录酶。然后，该方法包括逆转录模板RNA以产生cDNA。随后，cDNA为DNA聚合酶的DNA扩增提供初始模板。该方法还可以包括在逆转录与cDNA扩增步骤之间的DNA纯化步骤，但是在许多情况下可以省略该步骤(Huang et al.(2020))。
在许多情况下，DNA聚合酶和逆转录会被选择在相似的温度范围内具有活性。这样具有的优点是，整个反应可以等温进行，基本上在单一温度下进行。然而，在逆转录酶的活性的最佳温度不同于DNA聚合酶的活性的最佳温度的情况下，该反应可以在第一温度孵育，用于模板RNA的逆转录以产生cDNA，然后在第二温度孵育，用于使用cDNA作为初始模板进行DNA扩增。在某些情况下，在第一温度下孵育的持续时间可以是至少或约10、20、30秒或45秒，或者至少或约1、2、3、4、5、7或10分钟，例如10秒或20秒至1分钟或5分钟。在第二温度孵育的持续时间可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟，例如约5分钟至16小时或更长，约15分钟至1或3小时，约20分钟至1小时或2小时，或约30分钟至1小时。第一温度和第二温度将分别由逆转录酶和DNA聚合酶的工作温度确定。在反应开始之前，所有样本优选地保存在冰上。
在某些情况下，本发明的方法用于检测样本中特定的靶DNA或RNA的存在，或者用于确定样本中是否存在特定的靶DNA或RNA。特定的靶DNA是使用该方法扩增的模板DNA，如果存在的话。在初始RNA模板的情况下，使用靶RNA作为初始模板产生cDNA，而对应于靶RNA的cDNA序列是在反应过程中扩增的DNA。如本文所描述的，靶DNA或RNA对应于以下区域或者由以下区域定义：分别与FIP和BIP引物杂交的F2c和B2c区域之间且包括F2c和B2c区域的区域。该方法可能能够检测少于100个、或少于80个、或少于50个、或少于40个、少于30个、或少于20个拷贝的靶病毒RNA。
如果DNA或RNA存在于样本中，则靶DNA或对应于靶RNA的cDNA被扩增。可以检测靶DNA或cDNA的扩增，以确认用于为反应提供初始模板DNA或RNA的样本中靶DNA或RNA的存在。相反，如果反应没有导致DNA的扩增，这可以表明在用作反应的初始模板的样本中不存在靶DNA或RNA。在某些情况下，假阳性可以是由非特异性或脱靶扩增的样本(交叉)污染引起的，尽管使用如本文所描述的本发明减少了这种情况。假阳性的发生也可以通过其它方法来减少，如校准孵育/反应的时长和最小化样本处理。在某些情况下，样本中靶DNA或RNA的存在或不存在可以通过检测预定的扩增阈值量或如本文所述的其指示来确定。例如，阳性样本可被定义为具有阴性对照的标准偏差的至少2倍或至少3倍、4倍、5倍、7倍或10倍的值，和/或阴性对照可被定义为具有阴性对照的数量的小于2倍，或小于3倍、4倍、5倍、7倍或10倍的值。低于阈值的DNA扩增的检测可以是污染或脱靶/非特异性扩增的结果，因此在合适的情况下可以被确定为阴性结果或无结论的。
在某些情况下，本文描述的本发明的任何方法还可以包括检测样本中靶DNA或RNA的存在。可以使用本文描述的或本领域已知的任何合适的检测方法。在其它情况下，该方法可以包括检测步骤，但是如果没有检测到扩增，或者检测到的I低于如上所述的预定阈值，则可以确定阴性结果，即在旨在提供模板的样本中不存在靶DNA或RNA。
在某些情况下，该方法可以用于检测/确定与特定疾病、病症或感染相关的DNA或RNA的存在/不存在。例如，在某些情况下，该方法可以用于检测样本或受试者中或从受试者获得的合适生物样本中的基因突变，其中，该突变与疾病或病症相关，如癌症或其它遗传病症。在其它情况下，靶DNA或RNA可以与病原体相关，并且该方法用于检测/确定样本或受试者中或从受试者获得的合适生物样本中病原体的存在/不存在，或者用于检测或诊断受试者中病原体的感染或病原体的先前感染。通常，靶DNA或RNA包含在病原体的基因组中。如果检测到或确定存在靶DNA/RNA(任选地高于如上所述的预定阈值)，则该方法在一些情况下还可以包括诊断受试者的相关疾病、病症或感染。在某些情况下，该方法还可以包括选择和/或对受试者施用合适的治疗。
在其它情况下，该方法可以包括使用从受试者获得的合适样本作为模板RNA或DNA，其中，该样本疑似包含靶DNA或RNA，其中，靶RNA或DNA与疾病、病症、感染或病原体相关，其中，该方法包括检测/确定该方法不扩增靶DNA或cDNA(或扩增DNA至低于预设阈值的量)，并进一步确定受试者没有疾病、病症或病原体感染。
在某些情况下，本发明的方法是检测从受试者获得的生物样本中与疾病、病症、病原体或感染相关的DNA或RNA的存在，或诊断受试者的疾病、病症或感染的方法，基于从受试者获得的生物样本中靶DNA或RNA(或预定阈值数量的靶DNA或RNA、或扩增的DNA)的检测，其中，靶DNA或RNA与疾病、病症、病原体或感染相关。
该个体可以是人类或非人类动物。非人类动物包括但不限于：啮齿动物(包括小鼠和大鼠)以及其它常见的实验室动物、家畜和农业动物，包括兔、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、两栖动物、爬行动物等。
可以使用任何合适的生物样本。具体地，样本应该是其中靶DNA或RNA存在于患有相关疾病、病症或感染的受试者中的样本。示例包括从鼻、咽、口腔-鼻咽鼻或喉拭子获得的样本。
在某些情况下，样本可以在用于LAMP反应之前进行处理。例如，在某些情况下，可以处理样本以提取DNA或RNA，并且提取的DNA或RNA可以用作LAMP反应的模板。在其它情况下，在LAMP反应中用作模板之前DNA或RNA的提取可以是不必要的，如以下实施例6中所证实的那样。在其它情况下，该方法可以是一步检测方法，使用如本文所描述的任何合适的生物或临床样本作为模板，并在一步反应中包括细胞裂解、RNA提取、RNA逆转录以及LAMP扩增。Huang等人(2020)描述了这种方法。该方法可以在至少55℃、至少60℃或至少65℃进行。该方法可以比使用提取的RNA进行的RT-LAMP多耗费5到20分钟，例如5到10分钟，这是因为细胞需要大约这个时间来裂解并释放核酸。
在某些情况下，病原体可以是病毒、细菌、真菌或原生动物。在某些情况下，病原体可以是具有病毒基因组的病原体。该病毒可以是冠状病毒科，如SARS-CoV-2。靶RNA可以是冠状病毒科或SARS-CoV-2基因组的任何合适的片段。
在某些情况下，该方法为一种检测样本中的SARS-CoV-2或诊断受试者的SARS-CoV-2感染或COVID-19的方法，所述方法包括：(i)获得样本或从受试者获得生物样本；(ii)逆转录以从所述样本中的RNA产生cDNA；(iii)使用具有SEQ ID NO:2至7的核苷酸序列的一组6个寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列的开关寡核苷酸来扩增逆转录的cDNA；(iv)检测扩增的DNA；并且(v)确定SARS-CoV-2的存在或诊断受试者的SARS-CoV-2感染或COVID-19。
在某些情况下，cDNA扩增步骤还可以使用具有SEQ ID NO:9至14的核苷酸序列的另外六个引物，或者可以使用具有Huang等人(2020)的表1中所示的N1或N17组中任一组的核苷酸序列的另外六个引物。
在其它情况下，该方法是确定样本中不存在SARS-CoV-2，或受试者中SARS-CoV-2感染或COVID-19的阴性诊断的方法，所述方法包括：(i)获得样本或从受试者获得生物样本；(ii)逆转录；(iii)LAMP反应，其使用具有SEQ ID NO:2和4至7的核苷酸序列的一组6个寡核苷酸引物和任选的具有SEQ ID NO:9至14的核苷酸序列的另外6个引物；以及具有SEQID NO:1的核苷酸序列的开关寡核苷酸；(iv)确定没有DNA被扩增或低于预定阈值量的DNA量被扩增；并且(v)确定样本中不存在SARS-CoV-2，或受试者中SARS-CoV-2感染或COVID-19的阴性诊断。
在某些情况下，该方法是在检测样本中的靶RNA或DNA或病原体，或诊断疾病、病症或感染(如本文描述的任何一种)中减少假阳性的方法。特别是，当与不包括使用本文所描述的开关寡核苷酸的其它相同方法相比时，所述方法减少了获得假阳性的发生率或可能性，或增加了阳性结果是真阳性的统计确定性。
实施例
实施例1–温度依赖性寡核苷酸开关稳定RT-LAMP测定
为了解决自扩增和脱靶扩增的问题，我们引入了被称为开关的短寡核苷酸，其序列与LAMP反应中使用的一个引物互补，并且其3’端被终止子类似物(例如3’-dA链终止子)或暗淬灭剂分子(Iowa
Figure BDA0004172553660000171
RQ(IBRQ))修饰。开关用作温度依赖性开关以结合LAMP的必需引物(例如FIP)，从而阻止非特异性扩增和引物二聚体。当温度低于LAMP的工作温度(例如65℃)时，开关结合引物以阻止非特异性二聚体扩增。在工作温度下，开关从引物解离，允许它结合靶RNA/DNA进行核酸的逆转录和扩增。
O117引物组(Huang等人2020)用于评估开关的性能。在整个研究中使用了两种引物混合物的制剂：O117_N仅包含最初的六个LAMP引物，而O117_Q包含六个LAMP引物和开关寡核苷酸(表1)。没有靶模板的空白对照先前已经显示由于非模板扩增而导致假阳性。在此研究中，设计了3’端用IBRQ(IDT,UK)修饰的12-bp开关，以在温度低于LAMP工作温度时结合FIP并阻断自扩增或脱靶扩增。使用O117_N或O117_Q引物通过长达1小时的延长孵育来测试合成的SARS-CoV-2的RNA对照2-MN908947.3(Twist biosciences)和对照人类cDNA(Sigma-Aldrich UK)。使用WarmStart比色主混合物(New England Biolabs,UK)用于LAMP测定。在65℃孵育30分钟后，O117_N和O117_Q LAMP引物对200个拷贝的合成RNA对照2显示阳性(黄色)，并且对人类cDNA对照显示阴性(粉红色)(图1a)。然而，O117_N引物混合物在用对照人类cDNA孵育的1小时内变黄，而O117_Q混合物在整个实验中保持粉红色(图1a)。
我们还表明，O117_N引物组在不稳定的加热时也会产生假阳性结果，而O117_Q可以可靠地实施(见图3)。结果表明，O117引物中的开关可以稳定SARS-CoV-2的LAMP测定，并产生可靠的结果而没有假阳性。
表1.O117_N和O117_Q引物混合物中使用的引物序列
Figure BDA0004172553660000181
*IBRQ:Iowa Black暗淬灭剂
实施例2-真空干燥改善了反应混合物的储存和运输
RT-LAMP可部署于发展中国家和农村地区的一个限制是需要试剂的冷链运输。为了克服此限制，我们在一个PCR试管中真空干燥了完整的试剂混合物，包括Bst2.0 DNA聚合酶、WarmStart逆转录酶、比色指示剂、dNTP、引物和缓冲液，以制备干燥的备用反应混合物。在实施RT-LAMP分析之前，通过在室温下储存14天来评估干燥的反应混合物的稳定性(图1b和图3和图4)。在第3天，首先用20μL不含DNase/RNase的水重新溶解干燥的混合物，然后添加阳性对照(合成的SARS-CoV-2的RNA对照2)和阴性对照(1μg人类基因组cDNA)(图1bii)。RT-LAMP反应后，在阳性对照和阴性对照之间显示出明显的颜色差异，表明在室温下干燥储存3天后酶活性的高保持性(图1b iii)。在室温下储存14天的干燥反应混合物显示出相似的酶活性，尽管在干燥试剂盒中从第7天开始颜色改变(参见图3和4)。
实施例3-优化的RT-LAMP反应混合物保持高灵敏度和特异性
使用在缓冲液AVE中连续稀释的3个全长转录物来确定包含O117_N和O117_Q的RT-LAMP测定的干燥试剂盒的50％检测终点(50EP)(表2)。RNA模板是研究试剂19/304(NIBSC)、合成的SARS-CoV-2的RNA对照1-MT007544.1和合成的SARS-CoV-2的RNA对照2MN908947.3(Twist BioScience)。测试结果总结于表2和图5中。结果表明，每个反应(25-μl)，对19/304的50EP为71(O117_Q)和89(O117_N)个拷贝。对于O117_Q和O117_N，对于合成的RNA对照1的EP50分别为131和224个拷贝/反应。对于O117_Q和O117_N，合成的RNA对照2表现出的50EP分别为60和13个拷贝/反应。此外，我们还测试了用于检测湿反应混合物中合成RNA对照2的50EP。湿反应混合物中O117_Q和O117_N的可检测的RNA的水平为71和42个拷贝。含有O117_Q靶向19/304和合成的RNA对照2的干燥的反应混合物的50EP平均为65个拷贝(95％ CI:57.3–72.9)。含有O117_N且靶向19/304和合成的RNA对照2的干燥的反应混合物的50EP平均为51个拷贝(95％ CI:-1.6–104.0)。这些结果表明，O117引物中的寡核苷酸开关对病毒RNA检测的LAMP灵敏度影响最小，并且每25μl反应50EP为60-131。
表2.使用全长转录标准的50％检测终点
Figure BDA0004172553660000191
*每25μl反应的总拷贝数量
使用从4种世界上常见的人类冠状病毒OC43、HKU1、229E和NL63
(https://www.cdc.gov/coronavirus/types.html)中提取的RNA来评估优化的RT-LAMP测定以区分SARS-CoV-2与季节性冠状病毒的能力。来自β-冠状病毒(OC43和HKU1)和α-冠状病毒(229E和NL63)阳性的受感染患者样本的RNA样本被用于O117_Q LAMP测定的特异性测试。即使使用延长的反应时间(40分钟而不是30分钟)，由O117_Q测试的任何季节性冠状病毒的复制都没有产生阳性结果(图6b和6c)。这表明，O117引物组对测试SARS-CoV-2具有高的特异性，而对其它呼吸道疾病的相关冠状病毒无假阳性结果。
实施例4-用来自患者样本的RNA提取物进行临床验证
使用来自鼻咽拭子样本的SARS-CoV-2的RNA提取物评估了含有O117_Q的湿反应混合物的性能。平行地通过RT-qPCR和RT-LAMP评估来自72名患者的临床拭子样本，并且结果显示在表3中。18个阴性对照和2个阳性对照显示了预期的结果(图7)。视觉评估的比色分析显示RT-LAMP分析与荧光读数一致(图8)。RT-LAMP与RT-qPCR测定之间的一致性是14/16SARS-CoV-2阳性样本(阳性百分比一致性，PPA＝87.5％)和51/56SARS-CoV-2阴性样本(阴性百分比一致性，NPA＝91.1％)，这表明90.3％的总体百分比一致性(OPA)(65/72匹配样本)(图7)。两个假阴性样本具有高Ct值(Ct值>34)，其超出了我们的用于病毒RNA检测的RT-LAMP测定的估算检出限。
表3.改进的RT-LAMP测定在检测来自患者样本中分离的RNA提取物的SARS-CoV-2的性能
Figure BDA0004172553660000201
Figure BDA0004172553660000211
实施例5-比色读数的定量评估
比色RT-LAMP测定可以是主观的。为了克服使用视觉评估的比色读数时使用者之间和实验室之间差异的模糊性和可能性，我们试图建立用于区分阳性和阴性样本的定量测量，如图8所示。第一种方法使用430nm和560nm处的吸光度的比率来定量评估相同的72个临床样本的颜色改变(图5)。结果与肉眼的比色读数一致(图8a和8b)。基于SYTO9和Qubit荧光的方法也用于检测LAMP反应的产物。具体地，LAMP产物用SYTO9染色并使用酶标仪(图8c和8d)，或用Qubit BR DNA染料染色并用Qubit荧光计读取(图8e和8f)。阳性样本被定义为具有阴性对照的标准偏差的3倍的值(n＝18)。由于Qubit是一种便携的、紧凑的和精确的荧光读出器(readout)，我们随机选择了一组10个阳性和阴性样本，如之前使用RT-qPCR鉴定的，以验证其对POCT的适用性。基于阴性对照和阴性样本的分布，我们建立了12.5μg/mL Qubit读数的截断值。总体而言，所有三种方法都证明了与pH依赖的比色RT-LAMP读数的良好一致性，验证了它们作为指示RT-LAMP结果的定量测量的用途。具体地，吸光度、Syto-9和Qubit显示了SARS-CoV-2阳性和阴性患者样本之间分别有2.1、2.1和9.4倍的改变。Qubit试剂和荧光计读数显示出良好的性能。
实施例6-直接从口腔-鼻咽拭子样本中检测SARS-CoV-2
RT-LAMP干燥的O117_Q试剂盒用于直接检测口腔-鼻咽拭子，而无需任何预处理或RNA提取。将来自47名患者的口腔-鼻咽拭子放置于通用转移培养基(Universal TransferMedium)(COPAN Diagnostic，USA)或0.85％盐水溶液中，用于平行的直接RT-LAMP和RT-qPCR(见表4)。直接RT-LAMP用于在45分钟内检测拭子样本。对相同的样本进行RNA提取，然后将RNA用于RT-qPCR。总体而言，与RT-qPCR结果相比，干燥的O117_Q试剂盒显示出75％的阳性百分比一致性(PPA)(15/20SARS-CoV-2阳性样本)和100％的阴性百分比一致性(NPA)(27/27SARS-CoV-2阴性样本)，OPA为89.4％(42/47匹配样本)(图9a-d)。假阴性样本具有28.07、32.2、33.6、34.1和29.4的Ct值。图9e和表5总结了优化的RT-LAMP测定对临床RNA提取物和拭子样本的性能。
表4.RT-LAMP对没有任何预处理和RNA提取的口腔-鼻咽拭子样本的性能
Figure BDA0004172553660000212
Figure BDA0004172553660000221
Figure BDA0004172553660000231
*Ct值(说明10倍稀释效应的等效Ct值)20。
表5.临床测试结果的总结
Figure BDA0004172553660000232
*使用PHE RdRp测定相当于Ct＝35
实施例7–使用两组引物提高了SARS-CoV-2的检测灵敏度
使用两组引物O117_Q和S17进行RT-LAMP(Huang等人2020)。与仅仅使用O117_Q引物相比，灵敏度显著提高(图10)。O117_Q中的开关也阻止了使用这两组引物的假阳性(图10)。
讨论
SARS-CoV-2的快速传播，包括向资源有限的区域传播，要求开发新的快速检测个体感染的方法。标准诊断工具RT-qPCR无法在大型诊断实验室之外容易地部署，因为样本制备与处理需要必要的技术专长、复杂的仪器和昂贵的试剂。RT-LAMP测定是一种理想的POCT，因为唯一需要的设备是简单、廉价的加热平台，其可以是加热块、干燥培养箱、水浴槽或热循环仪。该测定易于实施，快速地提供准确的结果，其可通过多种不同的检测系统(包括视觉、荧光和吸光度检测)轻松解读，也可通过POC设置中的简单视觉检查进行解读。
最小化假阳性的短寡核苷酸开关
我们引入了几种改进方法以改进我们之前报道的RT-LAMP测定的性能，其使我们区别于其它已发布的用于SARS-CoV-2检测的RT-LAMP测定。为了将RT-LAMP中二聚体的非特异性扩增导致的假阳性风险降至最低，我们引入了短寡核苷酸开关，其序列与FIP引物互补，在没有靶RNA的情况下，其“锁定”FIP使其不会随机自扩增。在SARS-CoV-2的靶RNA序列存在的情况下，开关竞争性地脱离结合(off-binding)FIP引物，并且RT-LAMP反应继续进行。开关的添加降低了自扩增或脱靶扩增的风险(图1)，并且没有明显地损害测定的灵敏度(图6a)。
该RT-LAMP测定的检出限
我们已经证明RT-LAMP测定对SARS-CoV-2的RNA是敏感的和高度特异性的。O117_N和O117_Q引物组在含有四种季节性冠状病毒的样本的八次反应中均未产生假阳性结果。转录物19/304和RNA对照2的50％终点值很大程度上是一致的，并表明RT-LAMP测定可以容易地检测<100拷贝的SARS-CoV-2的RNA。RNA对照1实质上更高的50％终点可能是由于转录物降解的运输过程中不正确的初始定量。尽管如人们所预料的那样，O117_N的敏感性有增加的趋势，当对19/304和RNA对照2转录物进行平均时，没有发现O117_N与O117_Q制剂之间有统计学上的显著差异，但这可能是低样本量的结果。
RT-LAMP测定证明了在实验室环境中与标准RT-qPCR测定的高的一致性。与RT-qPCR相比，使用RT-LAMP测定测试了来自临床样本的RNA提取物，并显示出合理高水平的OPA(90.3％)。呈现的假阴性样本具有大于34的Ct值(表3)。因此，这表明对于RT-qPCR测定，O117_Q的检出限相当于Ct＝34。
通过我们的RT-LAMP测定从RNA提取物样本中检测到的5个假阳性引起了对RT-LAMP中重复观察到的自扩增和遗留污染的关注。我们寻求通过添加明显地增加反应的稳定性的开关寡核苷酸来减轻这些风险。通过真空干燥试剂盒组分，我们还为最终使用者简化了流程，并限制了现场遗留污染的机会。
检测SARS-CoV-2病毒而不需要费力费时的RNA提取的能力是有吸引力的。使用直接拭子样本的RT-LAMP测定显示出在检测阳性样本方面的高度稳健性——当与RT-qPCR结果比较时，证明没有假阳性。因为所有拭子样本在检测前都稀释了10倍。根据RT-qPCR中Orf1ab基因(O117_Q靶基因)的拷贝数与Ct值之间的校准，这种10倍稀释相当于3.3Ct(Niu等人(2020))。如果我们考虑相当于Ct＝34的稀释效应和检出限，RT-LAMP测定遗漏了两个拭子样本(Ct＝31.37和32.71)，并且，阳性百分比一致性(PPA)可以重新计算为88％(15/17SARS-CoV-2阳性样本)和OPA为95％(42/44匹配样本)(表4)。这些结果与在临床RNA提取物中发现的结果相似，证明了使用口腔-鼻咽拭子代替提取的RNA的有效性，而不损害测定性能。由于盐水会抑制RT-LAMP测定中的酶，并且传统的通用运输介质会干扰比色读数，因此一种改进直接拭子测定的方式可以是将拭子放入无RNase的水中。如果稀释系数降低，则用于RT-LAMP测定的拭子取样的此微小改变可能会检测到具有更高Ct值的拭子样本(Niu等人(2020))。
我们发现包括O117_Q和S17的两组引物可以显著增强灵敏度(图10)。O117_Q中的开关也阻止了使用这两组引物的假阳性。
干燥混合物使得能够室温运输和储存
干燥主混合物(master mix)简化了最终使用者的操作过程——所需要的只是添加水和患者样本。干燥的试剂形式的另一个优点是其在室温下的长期耐久性和储存。干燥的O117_N和O117_Q试剂盒的性能不会因在室温下储存14天而受到损害，尽管由于pH的改变，试剂盒的颜色可能在5天后变为黄色。然而，通过添加2.5μl的10mM KOH，可以将试剂盒的pH值和颜色重新调节为最初的粉红色。pH校正的试剂盒在响应水对照和全病毒RNA转录物时仍然正常工作(图3)。荧光定量读数显示在干试剂盒室温下储存14天后，干试剂盒对病毒RNA反应良好(图4)，表明NEB主混合物中的Bst 2.0DNA聚合酶和WarmStart逆转录酶在干燥储存条件下长时间保持活性。干燥的试剂盒可以在没有冷链限制的情况下运输，降低了运输和储存成本，增加了供应链的弹性，并提供了在标准诊断实验室之外对资源有限的环境和POCT进行测试的途径。
报告RT-LAMP结果的比色和荧光双重显示
比色RT-LAMP检测方法依赖于酚红的pH依赖性颜色改变的定性评估，作为靶序列的聚合酶扩增的间接指示。由于实验结果的视觉解释可能是主观的，我们建立了3种不同的定量方法以克服这些限制。第一种方法利用与酚红相关的吸光度改变作为pH的函数，另外两种方法利用荧光染料和独立于pH的函数。荧光方法特别有吸引力，因为它们的作用独立于pH值的改变并且可能克服与样本收集介质中存在的缓冲液相关的问题，其影响与酚红相关的读数。虽然已经在具有实时荧光的qPCR仪中进行LAMP反应，但使qPCR仪的使用成为必需。在此，我们表明，通过使用对于许多实验室是容易获得的相对便宜的设备，这些读数可以准确地实施。此外，这些方法为最终使用者提供了额外的灵活性，使得可以根据设备可用性和/或通量要求来选择量化方法。当需要更高的通量时，RT-LAMP反应可以使用荧光染料(如Syto9)以针对96或384孔板优化的多孔形式进行，并用酶标仪读取。另一方面，Qubit2.0是一种相对便宜的台式荧光计，其只需要电源，可以很容易地集成到各种不同环境(包括GP诊所和机场)的测试管道中。
因此，鉴于我们的LAMP测定的高准确性、多检测系统(包括如Qubit的便携式选项)的潜在用途以及测定性能的简易性，我们认为这种适应性强的装置可以作为有效的、高度实用的一线筛查工具，并且可以进行进一步的临床研究。
方法
引物设计
如Huang等人(2020)之前所述设计引物。使用PrimerExplorer(http://primerexplorer.jp/e/和Tomita等人(2008))设计靶向SARS-CoV-2的Orf1ab的引物组O117，并且每个引物由Integrated DNA Technologies(IDT，英国)合成。开关由IntegratedDNA Technologies(IDT，英国)合成，在3’端具有Iowa Black暗淬灭剂(见表3)。
通过混合等体积的16μM FIP、16μM BIP、2μM F3、2μM B3、4μM LF和4μM LB制备10XO117_N引物混合物。
通过混合等体积的16μM FIP、16μM BIP、2μM F3、2μM B3、4μM LF、4μM LB和24μM开关制备10X O117_Q引物混合物。
RT-LAMP反应混合物制备和通用过程
在制备反应混合物之前，用70％w/v乙醇(Sigma-Aldrich)和RNaseZapTM(Sigma-Aldrich)喷洒所有设备、层流柜和工作台。在试剂盒制备过程中，所有试剂和PCR管都保存在冰上。
对于湿反应混合物，将12.5μL来自New England Biolabs(NEB)的WarmStartTM比色LAMP 2x主混合物(DNA&RNA)、5μL不含DNase和RNase的分子级水(Thermo Fisherscientific)以及2.5μL 10X O117_N或10X O117_Q引物混合物加入PCR管中并均匀混合。
对于干燥的反应混合物，12.5μL的2X主混合物补充有4μL干燥保护剂，OSD-D1TM(Oxsed，Oxford)，其含有牛血清白蛋白、葡聚糖、乳糖和海藻糖。然后，将2.5μL的10XO117_N或10X O117_Q引物混合物加入PCR管中。用浓缩器(Concentrator Plus，Eppendorf)干燥盖打开的PCR管。干燥后，立即关闭PCR管的盖，并将干燥的反应混合物在-20℃储存。
通过向20μL湿反应混合物或重悬于20μL不含DNase/RNase的水中的干燥的反应混合物中添加5μL目标样本，并在65℃加热反应30分钟，进行RT-LAMP反应。通过pH依赖的比色改变或LAMP产物的产生的确认来确认阳性结果。
全长转录物
在这项研究中使用了3种全长SARS-CoV-2的RNA转录物。研究试剂19/304(NIBSC)是Giada Mattiuzo的善意礼物。合成RNA对照1-MT007544.1(Twist Bioscience)和合成RNA对照2-MN908947.3(Twist Bioscience)是John Taylor(Oxford Medical GeneticsLaboratories)的善意礼物。
临床样本
简而言之，将口腔-鼻咽拭子储存在通用转移培养基(COPAN Diagnostic，USA)或0.85％盐水中，并使用QIAsymphony系统(Qiagen，Hilden Germany)提取。RNA在AVE缓冲液中洗脱。提取后，使用转子基因Q(Qiagen)将5μL样本进行RT-qPCR扩增。使用经英国公共卫生部(Public Health England，PHE)验证的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)基因靶标和靶向E和S基因的RealStar SARS-CoV-2的RT-PCR试剂盒，建立RT-qPCR反应。将5μL洗脱的RNA样本放入含有O117_Q的湿反应混合物中用于RT-LAMP测定。
将用于直接处理的拭子在0.85％盐水溶液中运输，并在48小时内在生物安全3级实验室中处理。将50μL盐水溶液中的样本转移到450μL不含DNase/RNase的水中，充分混合，并将25μL稀释的样本直接放入含有O117_Q的干燥反应混合物中，用于RT-LAMP测定。
分析稳定性、灵敏度和特异性
评估了含有O117_N或O117_Q的湿反应混合物的稳定性。添加5μL的40拷贝/μL的合成的RNA对照2作为阳性对照，添加5μL的0.2μg/μL的人类基因组cDNA作为阴性对照。人类基因组cDNA是从提取自人类骨髓来源的MSC系(Lonza，UK)的全RNA逆转录的。如前所述实施RNA提取(Brinkhof等人(2018年)和Brinkhof等人(2006年))，并使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen,Manchester,UK)实施逆转录。按照制造商的说明，包括基因组DNA清除步骤，将0.5-1μg的全RNA转化为cDNA。最终cDNA样本在不含RNAse/DNAse的水中稀释至0.2μg/L，并在-20℃储存，直至用作RT-LAMP测定的阴性对照。如上所述进行反应，并在0、30和60分钟评估颜色改变。
为了获得分析灵敏度的估算值，使用三个全长SARS-CoV-2转录物评估了LAMP测定的50％终点。19/304使用病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)进行提取，并在AVE缓冲液中洗脱。从重悬于450μL不含RNAse的水中的50μL阴性喉拭子中，取20μL溶液用5μL RNA在AVE缓冲液中的系列稀释液进行加标(spike)。将25μL溶液添加到含有O117_N或O117_Q引物的干燥试剂盒中，并进行平行试验，重复五次。如上所述进行LAMP测定，通过颜色改变进行评估，并通过在用Sybr-Safe(Thermofisher)染色的2％琼脂糖凝胶上LAMP产物的UV-Vis进行确认。使用Reed-Muench方法计算50％终点(Reed和Muench(1938))。
评估了针对其它人类感染性冠状病毒的SARS-CoV-2RNA的LAMP测定的特异性。从对于OC43、HKU1、NL63和229E阳性的生物库呼吸系统样本中提取RNA(之前按照Gaunt等人(2010)所述，使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明收集并处理匹配的样本)。将来自重悬于450μL不含RNAse的水中的50μL阴性喉拭子的20μL溶液，用5μL的RNA洗脱液进行加标。将25μL添加到含有O117_N或O117_Q引物的干燥试剂盒中，并进行平行试验。将LAMP测定在65℃一式两份进行40分钟，并通过颜色改变进行评估。
定量检测方法
评估了将RT-LAMP反应的定性颜色改变输出转换成定量输出的三种方法。使用BMGLabtech Fluorostar Omega酶标仪读取阴性和阳性样本的吸收光谱，并使用430/560nm的比率评估反应结果。也使用嵌入荧光染料Syto-9实施LAMP产物的检测，荧光染料的终浓度为3μM(Thermofisher)，一旦30分钟RT-LAMP反应完成，就将其添加到反应混合物中。分别在485nm和500nm进行激发和发射(BMG Labtech Fluorostar Omega酶标仪)。可替代地，将5μL反应产物装入Qubit dsDNA BR测定试剂盒(Invitrogen)。根据制造商的说明实施测定，并使用Qubit 2.0荧光计读数。吸光度和Syto-9定量测定的阳性结果的截断值被确定为阴性对照的3倍标准偏差以上。对于Qubit，使用阴性样本和阴性对照计算3倍标准偏差。
实施例8–温度依赖性寡核苷酸开关稳定RT-LAMP测定
一些报告已经表明，进行RT-LAMP测定时，遗留污染和脱靶扩增可以导致假阳性(Baek et al.2020,Thi et al.2020,Hsieh et al.2014,Kim et al.2016)。为了解决自扩增和脱靶扩增的问题，引入了被称为开关的短寡核苷酸，其序列与LAMP反应中使用的一个引物互补，并且其3’端被暗淬灭剂分子(Iowa Black RQ(IBRQ))修饰。开关用作温度依赖性开关以结合LAMP的必需引物(例如FIP)，从而限制非特异性扩增和引物二聚体的形成。据信，当温度低于LAMP的工作温度(例如65℃)时，FIP引物结合至开关寡核苷酸。该开关可能通过以比污染核酸更高的亲和力结合FIP引物来阻止样本处理过程中洗脱的非SARS-CoV-2的RNA的非特异性扩增。在工作温度下，该开关与样本RNA竞争结合，允许FIP结合靶RNA/DNA，用于靶核酸的逆转录和扩增。
O117引物组用于评估开关的性能。在整个研究中使用了两种引物混合物的制剂：O117_N包含最初的六个LAMP引物，而O117_Q包含该六个LAMP引物和开关寡核苷酸(表1)。没有靶模板的空白对照先前已经显示由于非模板扩增而导致假阳性(Tanner et al.2015)。在此研究中，设计了3’端用IBRQ(IDT,UK)修饰的12-bp开关，以在温度低于RT-LAMP工作温度时结合FIP并阻断自扩增或脱靶扩增。使用O117_N或O117_Q引物通过长达1小时的延长孵育来测试合成的RNA对照2-MN908947.3(Twist biosciences,US)和人类cDNA(Sigma-Aldrich UK)。使用WarmStart比色主混合物(New England Biolabs,UK)用于RT-LAMP测定。在65℃孵育30分钟后，O117_N和O117_Q LAMP引物对200个拷贝的合成RNA对照2显示阳性(黄色)，并且对人类cDNA对照显示阴性(粉红色)(图1a)。然而，O117_N引物混合物在加热1小时内变黄，表示假阳性，而O117_Q混合物在整个实验中保持粉红色(图1a)。O117_N引物组可以产生高达60％的假阳性结果，而O117_Q可以在65℃孵育1小时后可靠地实施(图11)。结果表明，O117引物中的开关减少了在较低温度的脱靶扩增，并稳定了在反应温度的LAMP测定。
实施例9-冷冻干燥改进了反应混合物的储存和运输
RT-LAMP可部署于发展中国家和农村地区的一个限制是需要试剂的冷链运输。为了克服此限制，我们在一个PCR试管中冷冻干燥了完整的试剂混合物，包括Bst2.0 DNA聚合酶、WarmStart逆转录酶、比色指示剂、dNTP、引物和缓冲液，以制备干燥的备用反应混合物。在实施RT-LAMP分析之前，通过在室温下储存15天来评估干燥的反应混合物的稳定性(图1b和图3和图12)。在第3天，首先将干燥的混合物重悬于20μL不含DNase/RNase的水，然后添加阳性对照(合成的RNA对照2)和阴性对照(1μg人类基因组cDNA)(图1bii)。RT-LAMP反应后，在阳性对照和阴性对照之间显示出明显的颜色差异，表明在室温下干燥储存3天后酶活性的高保持性(图1b iii)。冷冻干燥的样本比真空干燥的样本更稳定。在室温储存15天的冷冻干燥的反应混合物表现出与第0天的混合物一样好的性能，表明干燥的试剂盒可以储存至少15天(图12)。
实施例10-优化的RT-LAMP反应混合物保持高灵敏度和特异性
使用在缓冲液AVE中连续稀释的3个全长转录物来确定包含O117_N和O117_Q的RT-LAMP测定的干燥试剂盒的50％检测终点(50EP)(表2)。RNA模板是研究试剂19/304(NIBSC,UK)、合成的RNA对照1-MT007544.1和合成的RNA对照2MN908947.3(Twist BioScience,US)。测试结果总结于表2、图2a和图5中。结果表明，每个反应(25μl)，对19/304的50EP分别为71(O117_Q)和89(O117_N)个拷贝。对于O117_Q和O117_N，对于合成的RNA对照1的EP50分别为131和224个拷贝/反应。对于O117_Q和O117_N，合成的RNA对照2表现出的50EP分别为60和13个拷贝/反应。此外，测试了用于检测湿反应混合物中合成RNA对照2的50EP。湿反应混合物中O117_Q和O117_N的可检测的RNA的水平为71和42个拷贝。含有O117_Q靶向19/304和合成的RNA对照2的干燥的反应混合物的50EP平均为65个拷贝(95％ CI:57.3–72.9)。含有O117_N且靶向19/304和合成的RNA对照2的干燥的反应混合物的50EP平均为51个拷贝(95％ CI:-1.6–104.0)。这些结果表明，O117引物中的寡核苷酸开关对病毒RNA检测的LAMP灵敏度影响最小，并且每25μl反应50EP为60-131个RNA拷贝。
使用从以前证明感染了呼吸道病原体的储存的临床样本中提取的RNA来评估优化的RT-LAMP测定用于区分SARS-CoV-2与人类感染的季节性冠状病毒的能力。来自β冠状病毒(OC43和HKU1)和α冠状病毒(229E和NL63)阳性的受感染患者样本的RNA样本被用于O117_QLAMP测定的特异性测试。即使使用延长的反应时间(40分钟而不是30分钟)，由O117_Q测试的季节性冠状病毒的复制都没有产生阳性结果(图2b和2c)。此结果表明，O117_Q引物组对SARS-CoV-2具有高的特异性，并且能够区分其它人类感染的冠状病毒。
实施例11-比色读数的定量评估
读取比色RT-LAMP测定具有主观因素。为了克服使用视觉评估的比色读数时使用者之间和实验室之间差异的任何模糊性和可能性，建立了用于区分阳性和阴性样本的定量测量(图8)。第一种方法使用430nm和560nm处的吸光度的比率来定量评估72个拭子样本的颜色改变(图7)。结果与肉眼的比色读数一致(图8a和8b)。荧光染料SYTO 9和Qubit也用于检测RT-LAMP反应的产物。具体地，RT-LAMP产物用SYTO9染色并使用酶标仪读取(图8c和8d)，或用Qubit BR DNA染料染色并用Qubit荧光计读取(图8e和8f)。阳性样本被定义为具有大于阴性样本的标准偏差三倍的值(n＝18)。由于Qubit是便携的、紧凑的并且给出精确的荧光读数，我们随机选择了一组10个阳性和阴性样本，如之前使用RT-qPCR鉴定的，以验证其对POCT的适用性。总体而言，所有三种方法都证明了与pH依赖的比色RT-LAMP读数的良好一致性，验证了它们作为指示RT-LAMP结果的定量测量的用途。具体地，吸光度、SYTO9和Qubit显示了SARS-CoV-2阳性和阴性患者样本之间分别有2.1、2.1和9.4倍的改变。Qubit试剂和荧光计读数显示出良好的性能。
实施例12-用来自患者样本的RNA提取物进行临床验证
使用来自72个鼻咽拭子样本和527个唾液样本的SARS-CoV-2的RNA提取物评估了含有O117_Q的湿反应混合物的性能。平行地通过RT-qPCR和RT-LAMP评估临床RNA样本，并且结果显示在表3和7中。阴性对照和阳性对照显示了预期的结果(表7和图13)。pH依赖性颜色改变的视觉评估与吸光度和荧光测量一致(图8)。
与RT-qPCR相比，RT-LAMP显示出95％的总灵敏度(SARS-CoV-2样本；95％ CI:88.6％至98.3％)和99％的特异性(95％ CI:97.7％至99.7％)(表6)。对于患者来源的样本(洗脱AVE缓冲液，Qiagen UK)，灵敏度为87.5％(95％CI:61.6％至98.4％)，特异性为91.1％(95％CI:80.4％至97.0％)(表6)。对于餐馆工作人员样本(洗脱缓冲液不含Rnase的水)，灵敏度为96.4％(95％CI:89.8％至99.2％)，特异性为100％(95％CI:97.5％)(表6、表3、表7和图14)。这5个假阴性样本可能是由于样本中提取的RNA的降解或低SARS-CoV-2拷贝数引起(图15)。
表6-临床测试结果的总结
Figure BDA0004172553660000291
Figure BDA0004172553660000301
表7-改进的RT-LAMP测定在检测来自患者样本中分离的RNA提取物的SARS-CoV-2的性能
Figure BDA0004172553660000302
Figure BDA0004172553660000311
Figure BDA0004172553660000321
Figure BDA0004172553660000331
Figure BDA0004172553660000341
讨论
SARS-CoV-2的迅速传播对许多国家的检测能力提出了挑战。在英国，爆发早期的检测战略优先鉴定并保护关键工作人员和易受感染的病人，在爆发的高峰时期，只检测那些有症状的人。然而，随着政府开始放松封锁政策，为了有效控制局部爆发，通过分散和快速检测能力实现的更广泛的检测策略将是极其重要的。目前，逆转录、实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测SARS-CoV-2的RNA仍然是诊断COVID-19的金标准。虽然在很大程度上是可靠的并且能够通过高通量过程评估样本，但是RT-qPCR需要训练有素的人员、RNA提取和复杂的仪器，所有这些都限制了RT-qPCR测试用于分散检测。此外，全球对RT-qPCR检测需求的快速增长导致了必需用品的全球短缺，特别是RNA提取试剂盒。
本发明提供了用于检测SARS-CoV-2的RNA的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)测定。RT-LAMP测定是比色核酸扩增测定——靶序列的成功扩增导致颜色从粉红色变为黄色。反应以单管形式进行，并且仅需在65℃加热30分钟用于进行反应。RT-LAMP测定快速、一步即可，并且适用于即时检验(point-of-care-testing，POCT)，因为仅需要的设备是加热平台。可以使用包括颜色改变、荧光以及吸光度的各种输出来评估测定终点(Becherer,L.etal.2020)。通过缩短样本收集、检测和读出时间，POCT RT-LAMP测定特别适于实时结果会直接影响患者护理的环境，包括移动检测中心、急诊科、初级护理机构、住宅以及机场。
几个小组已经报道了用于检测SARS-CoV-2的RNA的RT-LAMP测定(Broughton etal.2020,Park et al.2020,Yang et al.2020,Yu et al.2020,Yan et al.2020)。本发明的RT-LAMP测定方法在本文中显示以可靠地检测20个拷贝的Orf1ab RNA转录物。该方法还被进一步精简为标准诊断实验室之外的POCT。如本文所描述的，使用若干种商业SARS-CoV-2转录物、残留口咽临床样本和来自餐馆工作人员的唾液样本对该制剂进行了验证。
因此，本发明提供了一种优化的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)测定，用于从提取的RNA中检测SARS-CoV-2以供临床应用。本文显示，通过添加温度依赖性开关寡核苷酸以减少自扩增或脱靶扩增改进了RT-LAMP测定的稳定性和可靠性。本文还描述了用于单步RT-LAMP反应的冷冻干燥的主混合物，其简化了最终使用者的操作并改进了长期储存和运输。这种新的RT-LAMP测定已经应用于测试从72名患者的拭子和527名餐馆工作人员的唾液中提取的临床提取的RNA样本，并表现出95％的灵敏度(95％CI 88.9至98.3％)和99％的特异性(95％CI 97.7％至99.7％)。该测定可以检测到<100个拷贝的SARS-CoV2 RNA。没有观察到与其它人类冠状病毒的交叉反应性。RT-LAMP的结果可以通过比色检测和可量化的荧光读数来报告。具有数字化读数数据流的客观测量将允许共享地方或国家监测的结果。
SARS-CoV-2的快速传播，包括向资源有限的区域传播，要求开发新的快速检测个体感染的方法。标准诊断工具RT-qPCR不能在大型诊断实验室之外容易地部署，因为样本制备与处理需要必要的技术专长、复杂的仪器和昂贵的试剂。RT-LAMP测定是一种理想的POCT，因为唯一需要的设备是简单的加热平台，其可以是加热块、干燥培养箱、水浴槽或热循环仪。该测定易于实施，快速地提供准确的结果，其可通过多种不同的检测系统(包括荧光和吸光度检测)轻松解读，或通过POC设置中的简单视觉检查进行解读。有效的监测取决于测试的频率和测试的周转时间，已经证明使用高灵敏度的测试只能略微改善这种情况(Larremore et al.2020)。
最小化假阳性的短寡核苷酸开关
在本发明中已经引入了若干种改变以改进RT-LAMP测定的性能。这些使本发明区别于其它公开的用于SARS-CoV-2检测的RT-LAMP测定。为了将RT-LAMP中由于非特异性扩增或引物二聚体导致的假阳性风险降至最低(Suleman et al.2016,Postel et al.2010,Abbasi et al.2016)，引入了具有与FIP引物互补的序列的短寡核苷酸开关，其在没有靶RNA的情况下“锁定”FIP，使其不会随机自扩增。在SARS-CoV-2的靶RNA序列存在的情况下，开关被竞争性地抑制结合FIP引物，并且RT-LAMP反应继续进行。开关的添加降低了自扩增或脱靶扩增的风险(图1)，并且没有明显地损害测定的灵敏度(图2a)。
该RT-LAMP测定的检出限
本发明的RT-LAMP测定对SARS-CoV-2的RNA是灵敏的且高度特异性的。O117_N和O117_Q引物组在含有四种季节性冠状病毒的样本的八次反应中均未产生假阳性结果。转录物19/304和RNA对照2的50％终点值很大程度上是一致的，并表明RT-LAMP测定可以容易地检测<100拷贝/反应的SARS-CoV-2的RNA。RNA对照1实质上更高的50％终点可能是由于运输或转录物降解过程中不正确的初始定量。尽管如人们所预料的那样，O117_N的敏感性有增加的趋势，当对19/304和RNA对照2转录物进行平均时，没有发现O117_N与O117_Q制剂之间有统计学上的显著差异，但这可能是低样本量的结果。
RT-LAMP测定证明了在实验室环境中与标准RT-qPCR测定的高的一致性。与RT-qPCR相比，使用RT-LAMP测定测试了来自临床样本的RNA提取物，并显示出合理地高水平的OPA(90.3％)。呈现的假阴性样本具有大于31的Ct值(表1)。这表明在RT-qPCR测定中O117_Q的检出限相当于Ct＝约31。
通过我们的RT-LAMP测定从RNA提取物样本中检测到的5个假阳性引起了对RT-LAMP中重复观察到的自扩增和遗留污染的关注(Suleman et al.2016,Postel etal.2010,Abbasi et al.2016)。本发明能够通过添加明显地增加反应的稳定性的开关寡核苷酸来减轻这些风险。通过冷冻干燥试剂盒组分，最终使用者也可以简化该过程，并限制现场遗留污染的机会。
RT-LAMP的应用具有若干局限性。在16个具有较高Ct值(Ct>31)的临床阳性样本中，该测定能够检测到13个(81％)，因此它可能错过鉴定出一些具有低病毒载量的样本。用AVE洗脱可能影响RT-LAMP反应。因此，对于RT-LAMP实验的剩余部分，使用无RNase的水作为洗脱缓冲液可以是有益的。然而，该测定检测来自可能非常具有传染性的患者的绝大多数样本，并且该测定可用于快速鉴定具有中至高病毒载量的个体，以将这些样本从负担过重的诊断实验室转移。一些先前的数据报道Ct＝33的阈值是患者不再被认为具有传染性的阈值，因为从Ct值超过33的患者中分离的活病毒不产生阳性培养物生长(Walsh et al.2020,Scola etal.2020)。有待证实的最近数据表明，传染性病毒在Ct值高于24时没有恢复(Binnicker et al.2020)。本讨论中的一个重要考虑因素是Ct值不可直接比较，并且直接比较时可以相差多达5个循环。还发现了包括O117_Q和S17的两组引物可以显著增强灵敏度(图10)。O117_Q中的开关也阻止了使用这两组引物的假阳性结果。
干燥混合物使得能够室温运输和储存
干燥主混合物简化了最终使用者的操作过程——所需要的只是添加水和患者样本。干燥的试剂形式的另一个优点是其在室温下的长期耐久性和储存。干燥的O117_N和O117_Q试剂盒的性能不会因在室温下储存14天而受到损害，尽管由于pH的改变，试剂盒的颜色可能在5天后变为黄色。然而，通过添加2.5μl的10mM KOH，可以将试剂盒的pH值和颜色重新调节为最初的粉红色。pH校正的试剂盒在响应水对照和全病毒RNA转录物时仍然正常工作(图3)。荧光定量读数显示在干试剂盒室温下储存至少14天后，干试剂盒对病毒RNA反应良好(参见图12)，表明NEB主混合物中的Bst 2.0DNA聚合酶和WarmStart逆转录酶在干燥储存条件下长时间保持活性。干燥的试剂盒可以在没有冷链限制的情况下运输，降低了运输和储存成本，增加了供应链的弹性，并提供了在标准诊断实验室之外对资源有限的环境和POCT进行测试的途径。
报告RT-LAMP结果的比色和荧光双重显示
比色RT-LAMP检测方法依赖于酚红的pH依赖性颜色改变的定性评估，作为靶序列的聚合酶扩增的间接指示。由于实验结果的视觉解释可能是主观的，建立了3种不同的定量方法以克服这些限制。第一种方法利用与酚红相关的吸光度改变作为pH的函数，另外两种方法利用荧光染料和独立于pH的函数。荧光方法特别有吸引力，因为它们的作用独立于pH值的改变并且可能克服与样本收集介质中存在的缓冲液相关的问题，其影响与酚红相关的读数。虽然已经在具有实时荧光测量的qPCR仪中进行RT-LAMP反应，但使qPCR仪的使用成为必需。在此，我们表明，通过使用对于许多实验室是容易获得的相对便宜的设备，这些读数可以准确地实施。此外，这些方法为最终使用者提供了额外的灵活性，使得可以根据设备可用性和/或通量要求来选择量化方法。当需要更高的通量时，RT-LAMP反应可以使用荧光染料(如SYTO9)以针对96或384孔板优化的多孔形式进行，并用酶标仪读取。另一方面，Qubit2.0是一种相对便宜的台式荧光计，其只需要电源，可以很容易地集成到各种不同环境(包括大学、中小学、GP诊所和机场)的测试工作流程中。Qubit的额外优势是允许数据的电子传输，这可以与地方和国家的监测计划联系起来。
因此，鉴于我们的LAMP测定的高精度、多种检测系统(包括便携式选项，如Qubit)的潜在用途、易于检测的性能以及快速的周转时间，该测定可作为一种有效且高度实用的一线筛查工具。这种RT-LAMP测定显示了高准确性、可接受的灵敏度以及快速的周转时间，从而潜在地提供了一种管理SARS-COV-2公共卫生危机的监测的战略性和可负担的方法。
材料与方法
引物设计
如上所述设计引物。使用PrimerExplorer(http://primerexplorer.jp/e/，Tomita等人(2008))设计靶向SARS-CoV-2的Orf1ab的引物组O117，并且每个引物由Integrated DNA Technologies(IDT，英国)合成。该开关由Integrated DNA Technologies(IDT，英国)合成，在3’端具有Iowa Black暗淬灭剂(见表1)。
通过混合等体积的16μM FIP、16μM BIP、2μM F3、2μM B3、4μM LF和4μM LB制备10XO117_N引物混合物。
通过混合等体积的16μM FIP、16μM BIP、2μM F3、2μM B3、4μM LF、4μM LB和24μM开关制备10X O117_Q引物混合物。
RT-LAMP反应混合物制备和通用过程
在制备反应混合物之前，用70％w/v乙醇(Sigma-Aldrich Co.,UK)和RNaseZap(Sigma-Aldrich Co.UK)喷洒所有设备、层流柜和工作台。在试剂盒制备过程中，所有试剂和PCR管都保存在冰上。
对于湿反应混合物，将12.5μL来自New England Biolabs(New England Biolabs,UK)的WarmStart比色LAMP 2x主混合物(DNA&RNA)、5μL不含DNase和RNase的分子级水(Thermo Fisher Scientific Ltd)以及2.5μL 10X O117_N或10X O117_Q引物混合物加入PCR管中并均匀混合。
对于干燥的反应混合物，12.5μL的2X主混合物补充有7.5μL干燥保护剂，OSD-D1TM(Oxsed Ltd，Oxford)，其含有蔗糖、葡聚糖、乳糖和海藻糖。然后，将2.5μL的10X O117_N或10X O117_Q引物混合物加入PCR管中。用冷冻干燥机(VirTis Genesis Pilot冻干机，SPScientific)干燥盖打开的PCR管。干燥后，通入氮气以释放真空。在氮气环境下密封PCR试管的盖子。将干燥的反应混合物立即储存于-20℃。
通过向20μL湿反应混合物或重悬于20μL不含DNase/RNase的水中的干燥的反应混合物中添加5μL目标样本，并在65℃加热反应30分钟，进行RT-LAMP反应。通过pH依赖的比色改变或使用吸光度或荧光确认LAMP产物的产生来确认阳性结果。
全长转录物
在这项研究中使用了3种全长SARS-CoV-2的RNA转录物。研究试剂19/304(NIBSC,UK)是Giada Mattiuzo的善意礼物。合成RNA对照1-MT007544.1(Twist Bioscience Ltd)和合成RNA对照2-MN908947.3(Twist Bioscience Ltd)是John Taylor(Oxford MedicalGenetics Laboratories)的善意礼物。
临床样本
我们确认所有的方法都是根据相关的指导方针和规则进行的。所有的实验方案都由牛津大学批准。从所有受试者处获得知情同意，如果受试者未满18岁，则从父母和/或法定监护人处获得知情同意。来自牛津大学医院NHS基金会信托微生物部(OxfordUniversity Hospitals NHS Foundation Trust,Department of Microbiology)的72名有症状的患者的临床试验的残留样本被包括在内。该研究被注册并接受为牛津大学医院管理系统(Oxford University Hospitals Governance System)Ulysses register(CSS-MICRO-6330)的服务评估。来自餐厅员工的样本(527个唾液样本)被招募作为由香港食物环境卫生署(Food and Environmental Hygiene Department，FEHD)委托的测试试点的一部分。所有餐厅员工都同意参与COVID-19的测试项目，并被告知样本将被用于研究。Prenetics有限公司被香港政府授权以测试餐厅员工(https://www.info.gov.hk/gia/ general/202007/17/P2020071700975.htm)。
RT-qPCR
简而言之，对于患者样本，口腔-鼻咽拭子储存在通用转移培养基(COPANDiagnostic，USA)或0.9％盐水中，并使用QIAsymphony系统(Qiagen Co.，UK)提取。将200μL样本溶液与430μL OBL缓冲液混合，并进入提取阶段。将RNA洗脱到60μLAVE缓冲液中，并且使用转子基因Q(Qiagen Co.,UK)将10μL洗脱液进行RT-qPCR扩增。使用经英格兰公共卫生部(PHE，UK)验证的RNA聚合酶基因靶标和靶向E和S基因的Altona RealStar SARS-CoV-2的RT-PCR试剂盒建立RT-qPCR反应。
对于餐厅员工，从527名参与者采集喉咙深处唾液，并用PBS以1:1的比例稀释。将200μL稀释的DTS添加到MagMAX病毒/病原体核酸分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)的结合缓冲液中，并且根据制造商的方案进行病毒RNA提取，除了在60μL无RNase的水中而不是在洗脱缓冲液中洗脱RNA外。在Kingfisher Flex自动化系统(Thermo FisherScientific)中完成整个分离过程。根据美国CDC 2019-新型冠状病毒(2019-nCoV)实时RT-PCR诊断面板使用说明书(Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use)进行用于检测SARS CoV-2的提取的RNA的RT-PCR。RT-PCR靶向SARS-CoV-2基因和人类RNaseP基因的N1、N2。简而言之，将5μL提取的RNA或对照、1.5μL组合的引物/探针混合物(IDT,US)、5μL 4X TaqMan Fast病毒1步主混合物(Thermo Fisher Scientific)和8.5μL不含RNase的水混合(总体积为20μL)并装载到实时PCR系统(Applied Biosciences ViiA7，Thermo Fisher Scientific)。使用QuartStudio实时PCR软件(Thermo FisherScientific)分析数据。
RT-LAMP
根据制造方案(Oxsed RaViD直接SARS-CoV-2试验)进行用于检测SARS CoV-2的RT-LAMP。对于湿反应混合物，将5μL洗脱的RNA样本带入含有O117_Q的反应中用于RT-LAMP测定。对于干反应，将5μL提取的RNA与20μL无RNase的水混合，以复原冻干的RT-LAMP主混合物。将反应在65℃孵育30分钟，并记录颜色。
分析稳定性、灵敏度和特异性
评估了含有O117_N或O117_Q的湿反应混合物的稳定性。添加5μL的40拷贝/μL的合成的RNA对照2作为阳性对照，添加5μL的0.2μg/μL的人类基因组cDNA作为阴性对照。人类基因组cDNA是从提取自人类骨髓来源的MSC系(Lonza，UK)的全RNA逆转录的。如前所述实施RNA提取(Brinkhof et al.2018和2006)，并使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen,Manchester,UK)实施逆转录。按照制造商的说明，包括基因组DNA清除步骤，将0.5-1μg的全RNA转化为cDNA。最终cDNA样本在不含RNAse/DNAse的水中稀释至0.2μg/L，并在-20℃储存，直至用作RT-LAMP测定的阴性对照。如上所述进行反应，并在0、30和60分钟评估颜色改变。
为了获得分析灵敏度的估算值，使用三个全长SARS-CoV-2转录物评估了LAMP测定的50％终点。19/304使用病毒RNA微型试剂盒(Qiagen Co.,UK)进行提取，并在AVE缓冲液中洗脱。从重悬于450μL不含RNAse的水中的50μL阴性喉拭子中，取20μL溶液用5μL RNA在AVE缓冲液中的系列稀释液进行加标。将25μL溶液添加到含有O117_N或O117_Q引物的干燥试剂盒中，并进行平行试验，重复五次。如上所述进行LAMP测定，通过颜色改变进行评估，并通过在用Sybr-Safe(Thermo Fisher Scientific)染色的2％琼脂糖凝胶上LAMP产物的UV-Vis进行确认。使用Reed-Muench方法计算50％终点(Reed et al.1938)。
评估了针对其它人类感染性冠状病毒的SARS-CoV-2RNA的LAMP测定的特异性。从对于OC43、HKU1、NL63和229E阳性的生物库呼吸系统样本中提取RNA(之前按照Gaunt等人(2010)所述，使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen Co.,UK)根据制造商的说明收集并处理匹配的样本)。将来自重悬于450μL不含RNAse的水中的50μL阴性喉拭子的20μL溶液，用5μL的RNA洗脱液进行加标。将25μL添加到含有O117_N或O117_Q引物的干燥试剂盒中，并进行平行试验。将LAMP测定在65℃一式两份进行40分钟，并通过颜色改变进行评估。
定量检测方法
评估了将RT-LAMP反应的定性颜色改变输出转换成定量输出的三种方法。使用Fluorostar Omega酶标仪(BMG Labtech,UK)读取阴性和阳性样本的吸收光谱，并使用430/560nm的比率评估反应结果。也使用嵌入荧光染料SYTO 9实施LAMP产物的检测，荧光染料的终浓度为3μM(Thermo Fisher Scientific)，一旦30分钟RT-LAMP反应完成，就将其添加到反应混合物中。分别在485nm和500nm处通过Fluorostar Omega酶标仪(BMG Labtech,UK)实施激发和发射。可替代地，将5μL反应产物装入Qubit dsDNA BR测定试剂盒(Invitrogen,UK)。根据制造商的说明实施测定，并使用Qubit 2.0荧光计读数。吸光度和SYTO 9定量测定的阳性结果的截断值被确定为阴性对照的3倍标准偏差以上。对于Qubit，使用阴性样本和阴性对照计算3倍标准偏差。
示例性的引物和开关寡核苷酸序列
SEQ ID NO:1＝GGTTTTCAAGCC
SEQ ID NO:2＝GGTTTTCAAGCCAGATTCATTATGGATGTCACAATTCAGAAGTAGGA
SEQ ID NO:3＝TCTTCGTAAGGGTGGTCGCAGCACACTTGTTATGGCAAC
SEQ ID NO:4＝CCCCAAAATGCTGTTGTT
SEQ ID NO:5＝TAGCACGTGGAACCCAAT
SEQ ID NO:6＝TCGGCAAGACTATGCTCAGG
SEQ ID NO:7＝TTGCCTTTGGAGGCTGTGT
SEQ ID NO:8＝GGCTTGAAAACC
SEQ ID NO:9＝TCTTTCACACGTGGTGTT
SEQ ID NO:10＝GTACCAAAAATCCAGCCTC
SEQ ID NO:11＝CATGGAACCAAGTAACATTGGAAAACCTGACAAAGTTTTCAGATCC
SEQ ID NO:12＝CTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGACTTCTCAGTGGAAGCA
SEQ ID NO:13＝GAAAGGTAAGAACAAGTCCTGAGT
SEQ ID NO:14＝CTGTCCTACCATTTAATGATGGTGT
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序列表
<110> 牛津大学创新有限公司
<120> 开关寡核苷酸
<130> N419851WO
<150> GB2012480.6
<151> 2020-08-11
<160> 14
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 1
ggttttcaag cc 12
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 2
ggttttcaag ccagattcat tatggatgtc acaattcaga agtagga 47
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 3
tcttcgtaag ggtggtcgca gcacacttgt tatggcaac 39
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 4
ccccaaaatg ctgttgtt 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 5
tagcacgtgg aacccaat 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 6
tcggcaagac tatgctcagg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 7
ttgcctttgg aggctgtgt 19
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 开关寡核苷酸
<400> 8
ggcttgaaaa cc 12
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 9
tctttcacac gtggtgtt 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 10
gtaccaaaaa tccagcctc 19
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 11
catggaacca agtaacattg gaaaacctga caaagttttc agatcc 46
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 12
ctctgggacc aatggtacta agaggacttc tcagtggaag ca 42
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 13
gaaaggtaag aacaagtcct gagt 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 14
ctgtcctacc atttaatgat ggtgt 25

Claims (21)

1.一种用于扩增DNA的片段的方法的寡核苷酸引物组，所述引物组包含正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)和开关寡核苷酸，其中，所述开关寡核苷酸包含与所述正向引物或所述反向引物中的一个的片段互补的核苷酸序列，其中，所述开关寡核苷酸适于在低于用于DNA扩增的温度范围的温度下与所述互补引物退火结合，并且其中，当所述互补引物结合至所述开关寡核苷酸时，所述开关寡核苷酸阻止所述互补引物的扩增。
2.一种在使用环介导等温扩增(LAMP)或逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测靶DNA或RNA序列时减少假阳性的方法，其中，所述方法包括在LAMP或RT-LAMP反应中包括开关寡核苷酸，其中，所述开关寡核苷酸包含与用于扩增的正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)或反向外引物(B3)的片段互补的核苷酸序列，其中，所述开关寡核苷酸适于在低于用于扩增的温度范围的温度下与所述互补引物退火结合，并且其中，当所述互补引物结合至所述开关寡核苷酸时，所述开关寡核苷酸阻止所述互补引物的扩增。
3.一种环介导等温扩增(LAMP)或逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求1所述的所述引物组与模板DNA或RNA、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶和任选的逆转录酶在溶液中混合；并且
(b)将混合物加热至所述DNA聚合酶的工作温度。
4.根据权利要求1所述的引物组或权利要求2或权利要求3所述的方法，其中，所述开关寡核苷酸适于阻止在所述开关寡核苷酸的3’端的延伸。
5.根据权利要求4所述的引物组或所述方法，其中，所述开关寡核苷酸包含暗淬灭剂部分，任选地其中，所述引物中的一个或多个包含荧光团。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的引物组或方法，其中，所述开关寡核苷酸与正向环引物或反向环引物互补。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的引物组或方法，其中，所述引物组还包含正向环引物(LF)和/或反向环引物(LB)。
8.一种用于扩增DNA片段的试剂盒，其中，所述试剂盒包含根据权利要求1和4至7中任一项所述的引物组。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其还包含：
(i)DNA聚合酶；
(ii)逆转录酶；
(iii)pH指示剂和/或比色指示剂；
(iv)荧光团；
(v)脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)；
(vi)缓冲液组分；和/或
(vii)使用说明书。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中，将所述引物和任选的一种或多种所述试剂盒的附加组分干燥，并且任选地组合成试剂混合物。
11.根据权利要求1和4至7中任一项所述的引物组或根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒在检测或扩增靶DNA或RNA序列的方法中的用途。
12.根据权利要求1和4至7中任一项所述的引物组、根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒或根据权利要求11所述的用途，其中，所述方法包括：逆转录RNA以产生cDNA，并且扩增逆转录的cDNA。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的引物组、方法、试剂盒或用途，其中，所述开关寡核苷酸过量于所述互补引物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的引物组、方法、试剂盒或用途，其中，所述方法用于检测样本中病原体的多核苷酸。
15.根据权利要求14所述的引物组、方法、试剂盒或用途，其中，所述病原体是冠状病毒科。
16.根据权利要求16所述的引物组、方法、试剂盒或用途，其中，所述冠状病毒科是SARS-CoV-2。
17.根据权利要求15或16所述的引物组、方法、试剂盒或用途，其中，所述互补引物包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50％序列同一性的变体，和/或，其中，所述开关寡核苷酸包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少50％序列同一性的变体。
18.根据权利要求17所述的引物组、方法、试剂盒或用途，其中，所述引物组还包含：反向内引物(BIP)，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少50％序列同一性的变体；正向外引物(F3)，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少50％序列同一性的变体；反向外引物(B3)，其包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ IDNO:5具有至少50％序列同一性的变体；正向环引物(LF)，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少50％序列同一性的变体；和/或，反向环引物(BF)，其包含SEQ IDNO:7的核苷酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少50％序列同一性的变体。
19.根据权利要求18所述的引物组、方法、试剂盒或用途，其中，所述引物组包含具有SEQ ID NO:9至14的核苷酸序列的另外六个引物。
20.一种用于检测SARS-CoV-2或用于诊断受试者的SARS-CoV-2感染或Covid-19的试剂盒，所述试剂盒包含：具有SEQ ID NO:2至8的核苷酸序列的一组6个引物和开关寡核苷酸或具有SEQ ID NO:2至14的核苷酸序列的一组12个引物和开关寡核苷酸，DNA聚合酶，逆转录酶，比色pH指示剂，脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，以及任选的缓冲液，任选地其中，所述试剂盒包含真空干燥的试剂混合物。
21.一种检测样本中的SARS-CoV-2或诊断受试者的SARS-CoV-2感染或Covid-19的方法，所述方法包括：
(i)获得样本，或从受试者获得生物样本；
(ii)逆转录以从所述样本中的RNA产生cDNA；
(iii)使用具有SEQ ID NO:2至8的核苷酸序列的一组6个引物和开关寡核苷酸或具有SEQ ID NO:2至14的核苷酸序列的一组12个引物和开关寡核苷酸来扩增逆转录的cDNA；
(iv)检测扩增的DNA；并且
确定SARS-CoV-2的存在或诊断受试者的SARS-CoV-2感染或COVID-19。
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