CN118103526A - 用于靶标检测的具有多种内部修饰的环状引物和loop-de-loop方法 - Google Patents
用于靶标检测的具有多种内部修饰的环状引物和loop-de-loop方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开内容提供了新的能够在封闭系统中以高特异性和灵敏度容易地检测靶核酸的扩增方法，其包含生物传感器对，该生物传感器对允许通过使用荧光/猝灭剂FRET技术检测环状引物的构象变化来确定靶序列的扩增。
Description
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年9月13日提交的美国临时专利申请No.63/243,625的优先权，其通过引用整体并入。
2.序列表
本申请包含具有XXX序列的序列表，该序列表已通过EFS-Web提交并且在此通过引用整体并入本文。在XXXX创建的所述ASCII拷贝被命名为49145WO_sequencelisting.txt，并且大小为XXX字节。
3.背景技术
迄今为止，使用核酸序列的互补性检测靶核酸的方法已经由传统的Southern杂交进行了多种改进或修改。特别地，多种体外核酸扩增方法，例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)、基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)和环介导的等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)的建立已使得能够检测到更少量的靶核酸。这些方法已用于样品中靶核酸的序列特异性检测和定量，以用于感染的医学诊断、突变体基因型的确定、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和点突变的检测，等等。核酸扩增方法由于其高特异性和灵敏度而已经是用于测试的金标准。
然而，目前的核酸扩增方法具有局限性，因为扩增反应和信号检测需要受控的环境和使用昂贵仪器的精确测量。因此，对于在即时(point-of-care)情况下的使用，这些方法通常成本过高。另外，所述方法未针对单个患者样品中多重靶标的检测进行优化。多重靶标的检测可通过以下来实现：单锅反应中的信号多重化(signal multiplexing)(荧光谱多重化、电化学检测器阵列)、将多个反应物理分离到独特的反应容器中、或其组合。然而，在CLIA豁免测试(CLIA waived test)的情况下，用户必需要求不超过三个简单步骤就使用单个患者样品同时查询一组核酸靶标。因此，对于CLIA豁免测试，将样品物理分离到离散室很快变得不可行，除非复杂的装置或一次性用品(disposable)自动地处理加工。利用荧光的谱多重化可降低靶向一组核酸靶标所需的独特反应的数目，但谱多重化LAMP反应需要在测定速度或信号强度方面做出巨大牺牲，这抑制了成功应用于POC测试的前景。
因此，需要开发新的能够容易地扩增和检测靶核酸，特别是多重靶标，并且在低成本下具有高灵敏度和特异性的方法。
4.发明内容
本公开内容提供了新的扩增方法，其能够在封闭系统中容易地检测靶核酸。该方法允许通过使用具有生物传感器对的环状引物(looped primer)以高特异性和灵敏度检测少量靶核酸。生物传感器对允许通过检测该环状引物的构象变化来确定靶序列的loop-de-loop(“LDL”)扩增，所述检测例如通过使用荧光/猝灭剂FRET技术进行。具体地，核酸扩增与环状引物中的第一夹序列(clamping sequence)和第二夹序列之间的相互作用竞争，导致产生信号的荧光/猝灭剂对分离并导致观察到的信号(例如荧光)的可测量的变化。
另外，使用具有多种生物传感器的多个环状引物能够在单个管中检测多重靶标。环状引物不仅可与环介导的等温扩增(LAMP)组合使用，而且可与任何其他利用链置换聚合酶的核酸扩增方法组合使用。
本申请人已表明，与先前已知的涉及抑制性荧光探针例如DARQ(通过释放猝灭来检测扩增)和OSD(一步置换)探针的方法相比，loop-de-loop扩增方法允许以更快的周转时间以改善的灵敏度和特异性对靶核酸分子进行序列特异性扩增。此外，与QUASR(未并入的扩增信号报道子的猝灭)不同，loop-de-loop扩增方法允许实时检测扩增信号。由于loop-de-loop方法即使使用粗制样品仍能提供强信号，因此该方法可通过低成本仪器进行。
本公开内容提供了两种类型的环状引物——NBM环状引物和BM环状引物——其可用于loop-de-loop(“LDL”)扩增方法。NBM环状引物和BM环状引物二者均包含荧光/猝灭剂对——第一(外部)传感器分子和第二(内部)传感器分子，其彼此足够接近以充分猝灭荧光信号，并在它们的相互作用发生变化时提供扩增信号。然而，NBM环状引物(图1)和BM环状引物(图23)包含相对于内部夹寡核苷酸位于不同位置的内部传感器分子和与靶序列互补的引物序列。NBM环状引物包含在内部夹寡核苷酸与引物序列之间的内部传感器分子，而BM环状引物包含在内部夹寡核苷酸的5’末端处的内部传感器分子。
因为NBM环状引物包含内部夹寡核苷酸与引物序列之间的内部传感器分子，因此一些内部传感器可以阻断或干扰链置换聚合酶如Bst 2.0 WarmStart(New EnglandBiolabs)朝向内部夹寡核苷酸的正向进展，如图27中所示。
与NBM环状引物不同，由于BM环状引物包含内部夹寡核苷酸的5’末端处的内部传感器分子，因此等温扩增测定中的链置换聚合酶可在到达内部传感器分子之前合成针对靶序列和内部夹寡核苷酸的连续互补序列(图23)。这允许靶序列和内部夹寡核苷酸的扩增，即使当内部传感器分子阻断链置换聚合酶的进行时也是如此。这允许使用多种内部传感器分子而不管它们的阻断作用如何。当多个环状引物一起用于同时检测多个靶标并且需要使用多种传感器分子时，这特别重要。
使用BM环状引物扩增产生的双链DNA分子倾向于具有比夹序列更高的解链温度，并因此开环构型更有利得多。这导致明亮的荧光，类似于用NBM环状引物获得的荧光。另外，BM环状引物的开放构型在宽的温度范围(包括在室温下)内是稳定的。该特征允许通过荧光确定终点，即使存在阻断性内部修饰时也是如此。
本公开内容还提供了使用NBM环状引物或BM环状引物用于扩增靶多核苷酸的方法。在一些实施方案中，NMB环状引物和BM环状引物在单个反应中一起使用。在一些实施方案中，NMB环状引物或BM环状引物在单个反应中单独使用。本公开内容还提供了用于该扩增方法的组合物。
因此，本发明提供了用于靶序列的loop-de-loop扩增(LdL)的BM环状引物。在一些实施方案中，环状引物从5’至3’包含：
第一传感器分子；
第一夹寡核苷酸；
第一间隔寡核苷酸；
第二传感器分子，
其中第一传感器分子和第二传感器分子是第一生物传感器对；
任选的第二间隔寡核苷酸；
第二夹寡核苷酸，
其中第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；以及
第一引物序列，其与靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸与第一夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中，第一间隔寡核苷酸或任选的第二间隔寡核苷酸在发夹结构中是单链的。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和第一引物序列重叠。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和第一引物序列不重叠。
在一些实施方案中，环状引物包含第二间隔寡核苷酸。
在一些实施方案中，第一间隔寡核苷酸和第二间隔寡核苷酸二者在发夹结构中均是单链的。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至30个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至15个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至10个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至9个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至8个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至7个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至6个核苷酸长。
在一些实施方案中，当第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸形成发夹结构时，第一传感器分子和任选的第二传感器分子相距9至在一些实施方案中，当第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸形成发夹结构时，第一传感器分子和任选的第二传感器分子相距10至/>
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少10个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少18个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少19个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少20个核苷酸长。
在一些实施方案中，第一生物传感器对是能量供体和接受体对。在一些实施方案中，第一生物传感器对是用于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)或生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energytransfer，BRET)的能量供体和接受体对。
在一些实施方案中，第一传感器分子是FRET荧光团并且第二传感器分子是FRET猝灭剂。在一些实施方案中，第一传感器分子是FRET猝灭剂并且第二传感器分子是FRET荧光团。在一些实施方案中，第一传感器分子是BRET能量供体并且第二传感器分子是BRET能量接受体。在一些实施方案中，第一传感器分子是BRET能量接受体并且第二传感器分子是BRET能量供体。
在一些实施方案中，第一传感器分子和第二传感器分子可形成产生可检测光信号的复合物。在一些实施方案中，当发夹结构形成时，第一传感器分子和第二传感器分子产生显著减弱的光信号。
在一些实施方案中，第二传感器分子与胸苷(thymidine，T)或脱氧胸苷(deoxythymidine，dT)连接。
在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于60℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于65℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于70℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于80℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)为70℃至80℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)为70℃至75℃。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为约72℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于60℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为60℃至65℃。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基，(ii)锁核酸，(iii)2’O-甲基RNA碱基，(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基，(v)硫代磷酸酯化RNA碱基，(vi)硫代磷酸酯化2'-O-甲基RNA碱基，或(vii)其组合。
在一些实施方案中，环状引物还包含在环状引物的5’末端处的第一另外的寡核苷酸。在一些实施方案中，环状引物还包含在第一传感器分子与第一夹寡核苷酸之间的第二另外的寡核苷酸。在一些实施方案中，第一另外的寡核苷酸或第二另外的寡核苷酸是条码序列。
在一些实施方案中，靶序列是病原体基因组特异性的。在一些实施方案中，靶序列是沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)特异性的。在一些实施方案中，靶序列来自orf8或cds2。在一些实施方案中，环状引物包含SEQ ID NO：15的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶序列是淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)特异性的。在一些实施方案中，靶序列来自porA或glnA。在一些实施方案中，环状引物包含SEQ ID NO：5或7的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶序列是病毒特异性的。在一些实施方案中，病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，靶序列是智人(Homo sapiens)特异性的。在一些实施方案中，靶序列是RNA序列。在一些实施方案中，靶序列是编码POP7b的RNA序列。在一些实施方案中，靶序列来自tbc1d3。在一些实施方案中，环状引物包含SEQ ID NO：22的寡核苷酸。
在一个方面中，本公开内容提供了用于靶序列的loop-de-loop扩增的引物混合物，其包含本文中所述的环状引物。在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)正向内引物(forward inner primer，FIP)、(ii)反向内引物(backward inner primer，BIP)、(iii)正向引物(forward primer，F3)和反向引物(backward primer，B3)，其中FIP、BIP、F3和B3与靶序列上的六个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)正向环引物(loop forward primer，LF)和(ii)反向环引物(loop backward primer，LB)，其中LF和LB与靶序列上的两个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，FIP、BIP、F3、B3、LF或LB与靶序列上的第一结合位点结合。
在一些实施方案中，FIP与第一结合位点结合，并且引物混合物中FIP与环状引物的量之比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。在一些实施方案中，BIP与第一结合位点结合，并且引物混合物中BIP与环状引物的量之比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。在一些实施方案中，LF与第一结合位点结合，并且引物混合物中LF与环状引物的量之比为1∶l、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。在一些实施方案中，LB与第一结合位点结合，并且引物混合物中LB与环状引物的量之比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。
在一些实施方案中，F3包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：3的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸，LF包含SEQ IDNO：6的寡核苷酸，或LB包含SEQ ID NO：8的寡核苷酸。在一些实施方案中，F3包含SEQ IDNO：1的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：3的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：6的寡核苷酸，并且LB包含SEQ ID NO：8的寡核苷酸。在一些实施方案中，F3包含SEQ ID NO：9的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：10的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：12的寡核苷酸，LF包含SEQ IDNO：13的寡核苷酸，或LB包含SEQ ID NO：14的寡核苷酸。在一些实施方案中，F3包含SEQ IDNO：9的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：10的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：12的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸，并且LB包含SEQ ID NO：14的寡核苷酸。在一些实施方案中，F3包含SEQ ID NO：16的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：17的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：18的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：19的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：20的寡核苷酸，或LB包含SEQ ID NO：21的寡核苷酸。在一些实施方案中，F3包含SEQ ID NO：16的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：17的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：18的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：19的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：20的寡核苷酸，并且LB包含SEQID NO：21的寡核苷酸。
在一些实施方案中，引物混合物还包含第二环状引物，其中第二环状引物从5’至3’包含：
第三传感器分子；
第三夹寡核苷酸；
第三间隔寡核苷酸；
第四传感器分子，
其中第三传感器分子和第四传感器分子是第二生物传感器对，并且第二生物传感器对不同于第一生物传感器对；
任选的第四间隔寡核苷酸；
第四夹寡核苷酸，
其中第三夹寡核苷酸、第三间隔寡核苷酸、第四传感器分子、任选的第四间隔寡核苷酸和第四夹寡核苷酸可在低于第三夹寡核苷酸和第四夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；以及
第二引物序列，其与第二靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中，第三夹寡核苷酸与第四夹寡核苷酸互补。
在一些实施方案中，靶序列和第二靶序列是相同的。在一些实施方案中，靶序列和第二靶序列是不同的。
在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)第二正向内引物(second forwardinner primer，SFIP)、(ii)第二反向内引物(second backward inner primer，SBIP)、(iii)第二正向引物(second forward primer，SF3)和(iv)第二反向引物(secondbackward primer，SB3)，其中SFIP、SBIP、SF3和SB3与第二靶序列上的六个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)第二正向环引物(second loopforward primer，SLF)和(ii)第二反向环引物(second loop backward primer，SLB)，其中SLF和SLB与第二靶序列上的两个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物还包含第三环状引物，其中第三环状引物从5’至3’包含：
第五传感器分子；
第五夹寡核苷酸；
第五间隔寡核苷酸；
第六传感器分子，
其中第五传感器分子和第六传感器分子是第三生物传感器对，并且第三生物传感器对不同于第一生物传感器对和第二生物传感器对；
任选的第六间隔寡核苷酸；
第六夹寡核苷酸，
其中第五夹寡核苷酸、第五间隔寡核苷酸、第六传感器分子、任选的第六间隔寡核苷酸和第六夹寡核苷酸可在低于第五夹寡核苷酸和第六夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；以及
第三引物序列，其与第三靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中，第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中，靶序列、第二靶序列和第三靶序列是相同的。在一些实施方案中，靶序列、第二靶序列和第三靶序列是不同的。
在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)第三正向内引物(third forwardinner primer，TFIP)、(ii)第三反向内引物(third backward inner primer，TBIP)、(iii)第三正向引物(third forward primer，TF3)和(iv)第三反向引物(third backwardprimer，TB3)，其中TFIP、TBIP、TF3和TB3与第三靶序列上的六个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)第三正向环引物(third loop forwardprimer，TLF)和(ii)第三反向环引物(third loop backward primer，TLB)，其中TLF和TLB与第三靶序列上的两个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物还包含第四环状引物。在一些实施方案中，引物混合物还包含第五环状引物。
在另一个方面中，本公开内容提供了经干燥引物混合物，其是通过对本文中所述的环状引物或引物混合物进行冻干而获得的。
在一个方面中，本公开内容提供了用于靶序列的loop-de-loop扩增的试剂盒，其包含本文中所述的环状引物、引物混合物或经干燥引物混合物。
在一些实施方案中，聚合酶任选地是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含dNTP、MgSO4和缓冲剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含逆转录酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA酶抑制剂。
本公开内容还公开了检测样品中的靶序列的方法，其包括以下步骤：
提供样品；
将以下和聚合酶添加至该样品，从而产生反应混合物：(i)引物、(ii)引物混合物、或(iii)通过使经干燥引物混合物再水合而获得的重构引物混合物；以及
在50℃至85℃下孵育该反应混合物。
在一些实施方案中，孵育在50℃至70℃下进行。在一些实施方案中，孵育在60℃至65℃下进行。在一些实施方案中，孵育在62℃至65℃下进行。在一些实施方案中，聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶。
在一些实施方案中，所述方法还包括检测来自反应混合物的信号的步骤。
在一些实施方案中，信号是荧光信号。在一些实施方案中，检测步骤在孵育步骤期间进行。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品中存在或不存在靶序列的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括制备样品的在先步骤。在一些实施方案中，制备样品的步骤包括使RNA分子与逆转录酶相互作用，从而产生包含DNA分子的样品。
在一些实施方案中，制备样品的步骤还包括在与逆转录酶相互作用之前或期间对RNA分子进行预热。在一些实施方案中，反应混合物还包含RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA抑制剂。
在一些实施方案中，样品包含经纯化RNA、经纯化DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者鼻或鼻咽拭子。在一些实施方案中，样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定存在或不存在靶序列的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括确定存在或不存在第二靶序列或第三靶序列的步骤。
5.附图说明
图1示出了NBM环状引物的结构以及DNA扩增如何在使用NBM环状引物的loop-de-loop方法中进行。
图2A提供了来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)的LAMP测定结果，其用嵌入染料(SYTO)可视化。对于CT而言，扩增在至少5log的[DNA]内是快速的(＜30分钟)，并且对于NG而言，扩增在至少6log内是快速的(＜30分钟)。通过PROBIT分析，NG测定分析灵敏度(LOD50)为35cp/10μL反应物。
图2B提供了来自使用新的NBM环状引物的靶标扩增的读出。结果显示出对靶标的非常明亮的实时检测，其相对于SYTO染料具有增强的特异性并且具有最小的抑制作用。
图2C提供了用新的NBM环状引物检测淋病奈瑟菌。结果显示，所述方法具有可重复性，并产生了快速、稳健、高信噪比的扩增。探针消除了假阳性。
图3是实时荧光信号随时间变化的图，显示了使用Loop-de-Loop方法在50％替换下用经FAM标记的LF引物对沙眼衣原体的靶核酸的扩增。如右表所示测试阳性和阴性样品二者。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图4是实时荧光信号随时间变化的图，显示了使用Loop-de-Loop方法在50％替换下用经FAM标记的LF引物对淋病奈瑟菌的靶核酸的扩增。如右表所示测试阳性和阴性样品二者。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图5是实时荧光信号随时间变化的图，显示了使用Loop-de-Loop方法在50％替换下用经FAM标记的LF引物对智人的靶核酸的扩增。如右表所示测试阳性和阴性样品二者。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图6提供了包含有具有NBM环状引物的4个阳性(左)和4个阴性(右)反应物的管的图像。荧光用蓝色LED激发，照射(shine)以通过蓝色凝胶滤光片，并且发射用固定在照相手机上的琥珀色塑料滤光片进行可视化。
图7提供了包含通过在PCR管中进行冻干而制备的经干燥(冻干)混合物的管的图像，所述经干燥(冻干)混合物用于沙眼衣原体(顶部)、淋病奈瑟菌(中部)和智人(底部)的NBM环状引物测定。
图8提供了显示在使用图7的经干燥混合物的Loop-de-Loop反应中沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和智人的靶核酸的扩增的实时荧光信号，所述经干燥混合物在使用之前进行重构。结果显示出经干燥并随后重构的引物的维持的测定活性和灵敏度。
图9A(第一测试)和9B(第二测试)绘制了在多种温度下使用POP7b(智人(H.sapiens)RNA转录物)或ORF1ab(SARS-CoV-2基因组RNA)引物组从Loop-de-Loop LAMP反应获得结果所需的时间。
图10提供了靶向来自智人、沙眼衣原体(C.Trachomatis)和淋病奈瑟菌(N.Gonorrhoeae)的DNA或SARS-CoV-2的NBM环状引物的解链曲线。该NBM环状引物被设计为在高于反应温度65℃约10℃时解折叠(unfold)。该曲线表明loop-de-loop引物的茎环序列导致荧光信号。
图11提供了来自使用25％、50％或100％强度的NBM环状引物的loop-de-loop反应的实时荧光信号。在这种情况下，“强度”是指对于Loop-de-Loop方法，引物被环状形式替换的程度。数据显示，越强的引物倾向于提供越大的信号，以换取产生结果的时间放缓1至2分钟。100％强度的Loop-de-Loop引物使测定减慢，但不接近达到其他实时LAMP置换探针方法的程度。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图12提供了来自loop-de-loop反应物的相对荧光信号，所述loop-de-loop反应物包含0.4μM的NBM环状引物和2μM SYTO嵌入染料二者。2-通道荧光数据显示嵌入染料(SYTO)和loop-de-loop信号显现的时机相同。loop-de-loop与嵌入染料相比没有信号延迟，且loop-de-loop反应比SYTO提供更大的信号。
图13A和13B示出了来自使用NBM环状引物扩增沙眼衣原体的靶序列的实时荧光信号。图13A是来自新鲜混合的反应混合物的结果，并且图13B是来自经冷冻干燥反应混合物的结果。经冷冻干燥测定混合物稳定持续超过3个月，并提供了良好的读出。测定以14次重复运行，各自在该测定的LoD95(低阳性，20.7拷贝/μL)下的Ct E BOUR(一种沙眼衣原体菌株)，加2个无模板对照(no template control，NTC)。新鲜和经冷冻干燥的反应混合物之间在灵敏度(12/14，各自在LoD95下)或产生结果的平均时间(16分钟，T检验，P值＝0.66)方面没有变化。
图14A、14B和14C示出了来自使用NBM环状引物在单管反应(单锅)中SARS-CoV-2和人靶序列的loop-de-loop扩增的谱双重荧光信号。虚线信号来自SARS-CoV-2(FAM)，且实线信号来自人内部对照(Cy5)。使用了三种类型的样品-没有靶序列的对照样品(图14A)、粗制人鼻拭子(图14B)和与热灭活的SARS-CoV-2(具有基因组RNA靶序列的完整病毒)组合的粗制人鼻拭子(图14C)。数据显示出仅在靶序列存在时的特异性扩增信号。数据进一步表明了在单个反应容器中使用loop-de-loop方法时反应的谱多重化。
图15A示出了在多种浓度的POP7b引物下来自loop-de-loop扩增的实时荧光信号。随着POP7b引物浓度的降低，信号强度也降低(箭头)。在单个反应体积中使用超过一个引物组的多重化应用中，与其中100％的引物属于单个组的反应相比，任何给定引物组的浓度都降低。图15B绘制了在多种浓度的POP7b引物下产生结果的时间(分钟)。当引物浓度降至40％以下时，产生结果的时间受到影响，这对于许多应用(其中在单个管中对超过2个靶标进行多重化的优势超过临床的或基于市场的对速度的需求)来说是可以接受的。在反应中，10-4gBlock DNA用于21μL反应体积。
图16示出了在从冠状病毒阳性对象获得的未经处理的鼻拭子中来自SARS-CoV-2特异性的RNA靶序列(ORF1ab)、智人特异性的RNA靶序列(POP7b)、或这两种靶标特异性的靶序列、或均不是这两种靶标特异性的靶序列的loop-de-loop RT-LAMP扩增的实时荧光信号。将该鼻拭子直接洗脱到loop-de-loop RT-LAMP试剂中，并稀释至4个浓度到反应混合物中。1×拭子表示该测试配置中使用的样品的标准浓度，以每单位体积洗脱的拭子为单位。在这种情况下，SARS-CoV-2和人RNA引物组在单个管中被双重化(duplexed)。每个引物组均包含1个NBM环状引物，每个均标记有相同的荧光团和猝灭剂对(单荧光通道)。结果是检出SARS-CoV-2和人RNA二者的反应，其特征为双扩增信号。导致检出两个靶标的稀释液被标记为“双阳性”；导致检出任一靶标的稀释液被标记为“单阳性”；导致两个靶标都未检出的稀释液被标记为“双阴性”。该数据表明，对于这名冠状病毒阳性志愿者的拭子样品，实时Loop-de-Loop RT-LAMP测定的灵敏度是在反应中检测两个靶标所需的灵敏度的至少370倍。
图17示出了来自从阴性对象获得的鼻拭子中SARS-CoV-2特异性的靶序列的loop-de-loop扩增的实时荧光信号。
图18示出了来自SARS-CoV-2和人靶序列的多重化loop-de-loop扩增的荧光信号，并表明了loop-de-loop反应的特异性。使用经FAM标记引物针对loop-de-loop对SARS-CoV-2和人引物组二者进行修饰，因此双阳性对照显示2个扩增事件。RPPOS是呼吸系统病原体组阳性物质(Exact Diagnostics LLC)，包含来自22种非靶标呼吸系统病原体的遗传物质。PRNEG是不含核酸的RPPOS产品的背景基质对照。数据显示，检测SARS-CoV-2和人靶标的loop-de-loop RT-LAMP反应不会扩增脱靶核酸。
图19示出了来自含有高的沙眼衣原体(Ct)(每个反应10,000拷贝当量)和高的淋病奈瑟菌(Ng)(每个反应10,000拷贝当量)的样品的loop-de-loop扩增的荧光信号。
图20示出了来自含有高的沙眼衣原体(Ct)(每个反应10,000拷贝当量)和低的淋病奈瑟菌(Ng)的样品的loop-de-loop扩增的荧光信号。
图21示出了来自含有低的沙眼衣原体(Ct)和低的淋病奈瑟菌(Ng)的样品的loop-de-loop扩增的荧光信号。
图22示出了来自阴性对照-仅拭子对照(左侧两幅图)或仅缓冲液对照(右侧两幅图)的loop-de-loop扩增的荧光信号。
图23示出了BM环状引物的结构以及DNA扩增如何在使用BM环状引物的loop-de-loop方法中进行。
图24提供了来自使用包含用荧光素(FAM)标记的内部dT的NBM环状引物扩增的解链曲线。解链曲线示出了非扩增反应物的正斜率(-d(RFU)/dT＜0)，阳性扩增的负斜率。
图25提供了来自使用NBM环状引物人POP7b-LB-Cy5进行扩增的解链曲线。内部Cy5阻断了链置换聚合酶的正向进展，并因此是与NBM环状引物结构一起使用的阻断性内部修饰。
图26提供了来自使用具有内部Zen猝灭剂的NBM环状引物进行扩增的解链曲线。内部Zen猝灭剂阻断了链置换聚合酶的正向进展，并因此是与NBM环状引物结构一起使用的阻断性内部修饰。
图27示出了使用具有非阻断(顶部)或阻断(底部)修饰的NBM环状引物用链置换聚合酶进行的扩增。
图28A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-FAM荧光团和dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物。图28B提供了含有5’-FAM荧光团和dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物的解链曲线。
图29A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-HEX荧光团和内部Onyx A(OQA)猝灭剂的NBM环状引物。图29B提供了含有5’-HEX荧光团和内部Onyx A(OQA)猝灭剂的NBM环状引物的解链曲线。
图30A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-VIC荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物。图30B提供了含有5'-VIC荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物的解链曲线。
图31A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-ABY荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物。图31B提供了含有5'-ABY荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物的解链曲线。
图32A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-QSY7猝灭剂和内部dT-TAMRA的NBM环状引物。图32B提供了含有5’-QSY7猝灭剂和内部dT-TAMRA的NBM环状引物的解链曲线。
图33A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-JUN荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物。图33B提供了含有5’-JUN荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的BM环状引物或NBM环状引物的解链曲线。
图34A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-QSY7猝灭剂和内部dT-FAM荧光团或者5’-FAM荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物。图34B提供了含有5’-QSY7猝灭剂和内部dT-FAM荧光团或者5'-FAM荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物的解链曲线。
图35A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-HEX荧光团和内部Onyx A(OQA)猝灭剂的NBM环状引物。图35B提供了含有5'-HEX荧光团和内部Onyx A(OQA)猝灭剂的NBM环状引物的解链曲线。
图36A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-VIC荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物。图36B提供了含有5’-VIC荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物的解链曲线。
图37A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-ABY荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物。图37B提供了含有5’-ABY荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物的解链曲线。
图38A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-JUN荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物。图38B提供了含有5’-JUN荧光团和内部dT-QSY7猝灭剂的NBM环状引物的解链曲线。
图39A提供了来自loop-de-loop反应的实时荧光信号，所述loop-de-loop反应使用含有5’-Yakima Yellow(YY)荧光团和内部Zen猝灭剂的NBM环状引物或BM环状引物。来自BM环状引物的信号比NBM环状引物的信号更亮，因为BM环状引物发夹在链置换聚合酶合成第二夹序列和任选的间隔序列的反向互补之后打开，导致图23中所示的构型。在NBM环状引物中，聚合酶被内部Zen猝灭剂阻断并且不能合成第二夹序列的反向互补，导致图27中所示的构型。图39B提供了含有5’-Yakima Yellow(YY)荧光团和内部Zen猝灭剂的NBM环状引物或BM环状引物的解链曲线。解链曲线表明，当第二传感器分子是阻断性修饰(如Zen)时，BM环状引物将在靶标存在的情况下产生稳定的开放引物构型，即使冷却至室温时也是如此。相反，NBM环状引物将保持冷却至室温时不发出荧光的稳定的发夹构型。
附图仅出于举例说明的目的描绘了本发明的多个实施方案。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到，在不背离本文中所述的本发明的原理的情况下，可以采用本文中所示结构和方法的替代实施方案。
6.具体实施方式
6.1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文中使用的，以下术语具有以下赋予它们的含义。
本文中使用的术语“生物传感器对”是指一对传感器分子，其可以在这两个传感器分子之间的某些物理相互作用之后产生可检测信号。例如，生物传感器对可以是供体分子和接受体分子对，其用于福斯特共振能量转移( resonance energy transfer)，例如荧光共振能量转移(FRET)。在这种情况下，可以通过从供体分子到接受体分子的距离依赖性能量转移来产生荧光信号。在另一些实施方案中，生物传感器对是用于生物发光共振能量转移(BRET)的传感器分子对。在这种情况下，可以通过从供体分子到接受体分子的距离依赖性能量转移来产生生物发光信号。本领域已知的其他生物传感器对也可用于本公开内容的多个实施方案中。
本文中使用的术语“loop-de-loop扩增”或“LdL扩增”是指使用可通过距离依赖性能量转移而产生荧光信号的环状引物来扩增靶核酸。
本文中使用的术语“环状引物”是指可用于本文中所述的LdL扩增的引物。环状引物包含生物传感器对，该生物传感器对可通过距离依赖性能量转移产生荧光信号。环状引物可以是BM环状引物或NBM环状引物。
本文中使用的术语“NBM环状引物”是指这样的环状引物，其从5’至3’包含：
第一传感器分子；
第一夹寡核苷酸；
间隔寡核苷酸；
第二夹寡核苷酸，
其中第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；
第二传感器分子，
其中第一传感器分子和第二传感器分子是第一生物传感器对；以及
第一引物序列，其与靶序列上的第一结合位点互补。
NBM环状引物是以与非阻断性修饰相容，但与阻断性修饰不太相容或不相容的形式。
当用NBM环状引物进行LdL扩增时，第二传感器分子可以阻断链置换聚合酶的正向进展。因此，虽然不是必需的，但使用不阻断聚合酶进展的传感器分子(例如，利用核苷酸碱基(例如，dT)作为化学连接主链的传感器)作为第二生物传感器是优选的。在一些实施方案中，NBM环状引物包含部分阻断链置换聚合酶的正向进展的传感器分子。在一些实施方案中，NBM环状引物包含不阻断链置换聚合酶的正向进展的传感器分子。
本文中使用的术语“BM环状引物”是指这样的环状引物，其从5’至3’包含：
第一传感器分子；
第一夹寡核苷酸；
第一间隔寡核苷酸；
第二传感器分子，
其中第一传感器分子和第二传感器分子是第一生物传感器对；
任选的第二间隔寡核苷酸；
第二夹寡核苷酸，
其中第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；以及第一引物序列，其与靶序列上的第一结合位点互补。
BM环状引物是以与阻断性和非阻断性修饰二者均相容的形式。因此，在一些实施方案中，BM环状引物包含阻断性修饰(例如，阻断聚合酶的进展的第二传感器分子)。在一些实施方案中，BM环状引物包含非阻断性修饰(例如，不阻断聚合酶的进展的第二传感器分子)。
本文中使用的术语“LOI)”是指检测限。例如，LOD95是检测限，第95个百分位。这是目标浓度，在该浓度下，在统计学上预期测定在95％时候检测到阳性结果。
6.2.其他解释性约定
本文中所列举的范围被理解为该范围内的所有值的简写，包括所列举的端点。例如，1至50的范围被理解为包括来自以下的任何数字、数字的组合、或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。
除非另有说明，否则提及具有一个或更多个立构中心的化合物意指其每个立体异构体以及立体异构体的所有组合。
6.3.环状引物
本公开内容提供了可用于本文中所述的LdL扩增的环状引物。环状引物包含可通过距离依赖性能量转移产生荧光信号生物传感器对。环状引物可以是BM环状引物或NBM环状引物。
NBM环状引物
在一个方面中，本发明提供了用于loop-de-loop扩增的NBM环状引物。NBM环状引物从5’至3’包含：
第一传感器分子；
第一夹寡核苷酸；
间隔寡核苷酸；
第二夹寡核苷酸，
其中第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；
第二传感器分子，
其中第一传感器分子和第二传感器分子是第一生物传感器对；以及
第一引物序列，其与靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸与第一夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸可以与第一夹寡核苷酸结合，但与第一夹寡核苷酸不完全互补。
第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸彼此互补，因此它们可以彼此结合。第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于60℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于65℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于70℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于80℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为70℃至80℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为72.5℃至77.5℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为约75℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于60℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为60℃至65℃。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)比使用链置换聚合酶的测定的延伸温度高10℃。在一些实施方案中，该解链温度低于、等于该测定的延伸温度或比其高任意量。
当Tm低于反应的延伸温度时，可以用终点检测(将反应冷却到接近或低于夹序列的Tm)代替实时检测，并且可以不存在反应抑制，即使在全强度下使用NBM环状引物(100％替换)时。
在Tm等于反应的延伸温度的情况下，实时检测仍然可行，但可存在较高的背景荧光，直至冷却反应以确定终点。
当Tm大于反应的延伸温度时，实时检测可以是主要的操作模式，并且将有最小的背景荧光。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸为3至10个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸为3至7个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸为6个核苷酸长。在一些典型的实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸具有相同的长度。
在一些实施方案中，间隔寡核苷酸为5至35个核苷酸长。在一些实施方案中，间隔寡核苷酸为10至20个核苷酸长。在一些实施方案中，间隔寡核苷酸为13至18个核苷酸长。在一些实施方案中，间隔寡核苷酸为13个核苷酸长。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸一起为15至35个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸一起为20至30个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸一起为23至28个核苷酸长。
环状引物可包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基，(ii)锁核酸，(iii)2’O-甲基RNA碱基，(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基，(v)硫代磷酸酯化RNA碱基，(vi)硫代磷酸酯化2’-O-甲基RNA碱基，或(vii)其组合。第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基，(ii)锁核酸，(iii)2’O-甲基RNA碱基，(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基，(v)硫代磷酸酯化RNA碱基，(vi)硫代磷酸酯化2'-O-甲基RNA碱基，或(vii)其组合。
在一些实施方案中，NBM环状引物还包含在环状引物的5’末端处的第一另外的寡核苷酸。在一些实施方案中，NBM环状引物还包含在第一传感器分子与第一夹寡核苷酸之间的第二另外的寡核苷酸。在一些实施方案中，第一另外的寡核苷酸或第二另外的寡核苷酸是条码序列。
在一些实施方案中，NBM环状引物还在环状引物的5’末端处包含另外的条码序列、探针序列或其他序列。另外的序列可包含核碱基或其修饰。
在一些实施方案中，靶序列是病原体基因组特异性的。在一些实施方案中，靶序列是沙眼衣原体特异性的。在一些实施方案中，靶序列来自orf8或cds2。具体地，靶结合位点可以具有SEQ ID NO：15的序列。
在一些实施方案中，靶序列是淋病奈瑟菌特异性的。在一些实施方案中，靶序列来自porA或glnA。具体地，靶结合位点可以具有SEQ ID NO：5或7的序列。
在一些实施方案中，靶序列是智人特异性的。在一些实施方案中，靶序列来自tbc1d3。具体地，靶结合位点可以具有SEQ ID NO：22的序列。
BM环状引物
在另一个方面中，本公开内容提供了BM环状引物。BM环状引物从5’至3’包含：
第一传感器分子；
第一夹寡核苷酸；
第一间隔寡核苷酸；
第二传感器分子，
其中第一传感器分子和第二传感器分子是第一生物传感器对；
任选的第二间隔寡核苷酸；
第二夹寡核苷酸，
其中第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任
选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；以及第一引物序列，其与靶序列上的第一结合位点互补。
NBM环状引物和BM环状引物包含相对于第二夹寡核苷酸位于不同位置处的第二传感器分子。
与NBM环状引物相比，BM环状引物包含距离更远的第一传感器分子和第二传感器分子(当它们形成发夹结构时)。然而，第一传感器分子和第二传感器分子仍然在物理上彼此足够接近以充分猝灭荧光信号。
因为第二传感器分子在第二夹寡核苷酸的5’末端上，所以等温扩增测定中的链置换聚合酶可在到达第二传感器分子之前合成针对靶序列和第二夹寡核苷酸的连续互补序列。所得双链DNA部分具有比夹序列更高的解链温度，并因此开环(非发夹)构型更有利得多。这导致明亮的荧光。另外，开放构型在宽的温度范围(包括在室温下)内是稳定的。该特征允许通过荧光确定终点，即使在等温扩增测定中存在阻断链置换聚合酶正向进展的第二传感器分子时。
开环构型可通过在第二传感器分子与第二夹寡核苷酸之间添加另外的碱基(即，任选的第二间隔寡核苷酸)进一步稳定。因此，在一些实施方案中，BM环状引物包含第二间隔寡核苷酸。在一些实施方案中，BM环状引物不包含第二间隔寡核苷酸。
在一些情况下，BM环状引物的特征在于猝灭效率(效率或福斯特共振能量转移)与平衡期间以开放构型存在的环状引物分子的比例之间的权衡，所述猝灭效率由传感器分子之间的物理距离确定。
在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸与第一夹寡核苷酸完全互补。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸与第一夹寡核苷酸部分互补。
在一些实施方案中，第一间隔寡核苷酸或任选的第二间隔寡核苷酸在发夹结构中是单链的。
在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和第一引物序列重叠。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和第一引物序列不重叠并且是单独的序列。
在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至30个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至15个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至10个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至9个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至8个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至7个核苷酸长。在一些实施方案中，第二夹寡核苷酸和任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至6个核苷酸长。
在一些实施方案中，当第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸形成发夹结构时，第一传感器分子和第二传感器分子相距小于在一些实施方案中，当第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸形成发夹结构时，第一传感器分子和第二传感器分子相距9至/>在一些实施方案中，当第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸形成发夹结构时，第一传感器分子和第二传感器分子相距10至/>在一些实施方案中，当第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸形成发夹结构时，第一传感器分子和第二传感器分子相距20至/>在一些实施方案中，当第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、第二传感器分子、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸形成发夹结构时，第一传感器分子和第二传感器分子相距25至/>
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少10个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少11个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少12个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少13、14或15个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少16、17或18个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少19个核苷酸长。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第一间隔寡核苷酸一起为至少20个核苷酸长。
在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于60℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于65℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于70℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)高于80℃。
在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)为60℃至80℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)为70℃至80℃。在一些实施方案中，发夹结构的解链温度(Tm)为70℃至75℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为约72℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为60℃至65℃。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于60℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于70℃。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于80℃。
在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基，(ii)锁核酸，(iii)2’O-甲基RNA碱基，(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基，(v)硫代磷酸酯化RNA碱基，(vi)硫代磷酸酯化2'-O-甲基RNA碱基，或(vii)其组合。在一些实施方案中，第一夹寡核苷酸、第一间隔寡核苷酸、任选的第二间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸包含选自以下的一种或更多种：(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基，(ii)锁核酸，(iii)2’O-甲基RNA碱基，(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基，(v)硫代磷酸酯化RNA碱基，(vi)硫代磷酸酯化2'-O-甲基RNA碱基，和(vii)其组合。
在一些实施方案中，BM环状引物还包含在环状引物的5’末端处的第一另外的寡核苷酸。
在一些实施方案中，BM环状引物还包含在第一传感器分子与第一夹寡核苷酸之间的第二另外的寡核苷酸。在一些实施方案中，第一另外的寡核苷酸或第二另外的寡核苷酸是条码序列。
在一些实施方案中，靶序列是病原体基因组特异性的。在一些实施方案中，靶序列是病毒特异性的。在一些实施方案中，病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，靶序列是智人特异性的。在一些实施方案中，靶序列是RNA序列。在一些实施方案中，BM环状引物包含SEQ ID NO：25的寡核苷酸。在一些实施方案中，BM环状引物包含SEQ ID NO：26的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶序列是编码POP7b的RNA序列。在一些实施方案中，靶序列来自tbc1d3。
传感器分子
本领域已知的多种生物传感器可并入本文中所述的NBM或BM环状引物中。例如，可使用在极为接近或处于足够距离内时改变颜色或产生可检测信号的分子对(例如基于发光蛋白的NanoLuc、Nanobit、NonoBRET技术)。
在一些实施方案中，第一生物传感器对是能量供体和接受体对。在一些实施方案中，第一生物传感器对是用于福斯特共振能量转移的能量供体和接受体对。在一些实施方案中，第一生物传感器对是用于荧光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)的能量供体和接受体对。在一些实施方案中，第一传感器分子是FRET荧光团并且第二传感器分子是FRET猝灭剂。在一些实施方案中，第一传感器分子是FRET猝灭剂并且第二传感器分子是FRET荧光团。在一些实施方案中，第一传感分子是BRET能量供体并且第二传感分子是BRET能量接受体。在一些实施方案中，第一传感分子是BRET能量接受体并且第二传感分子是BRET能量供体。
在一些实施方案中，FRET猝灭剂是5IABkFQ，其可从Integrated DNAtechnologies以商品名5’IowaFQ获得。5’Iowa/>FQ是FRET猝灭剂，其具有范围为420nm至620nm的宽吸收谱，在531nm处具有峰值吸光度。这种猝灭剂可与在绿色到粉红色的谱范围内发射的荧光素和其他荧光染料一起使用。在一些实施方案中，猝灭剂是任一种Black Hole/>(可从Biosearch Technologies获得)、任一种Iowa猝灭剂(可从Integrated DNA technologies获得)、/>猝灭剂(可从Integrated DNA Technologies获得)、任一种/>猝灭剂(可从Millipore-Sigma获得)，或任一种/>猝灭剂(可从ATTO-TEC GmbH获得)。
在一些实施方案中，FRET荧光团是i6-FAMK(FAM(荧光素)叠氮化物)，其可从Integrated DNA technologies以Int 6-FAM(叠氮化物)的名称获得。这种形式的FAM可使用点击化学与寡核苷酸连接。这种修饰的内部版本可通过dT碱基与寡核苷酸连接。可在修饰位置处添加dT核苷酸。或者，为了避免添加额外的核苷酸，可用所需的修饰替代序列中现有的T核苷酸。在一些实施方案中，荧光团是Cy3、Cy5、TAMRA或Yakima(可从Integrated DNA Technologies获得)。
在一个实施方案中，环状引物包含内部猝灭剂(例如或Onyx/>)和5’荧光团(例如Yakima/>或HEX)。
在一些实施方案中，第一传感器分子和第二传感器分子可形成产生可检测光信号的复合物。在一些实施方案中，当发夹结构形成时，第一传感器分子和第二传感器分子产生显著减弱的光信号。
在NBM环状引物的多个实施方案中，发夹结构中第一传感器分子与第二传感器分子之间的距离为0。在一些实施方案中，第一传感器分子与第二传感器分子之间的猝灭可由于“接触猝灭”而发生。
在BM环状引物的多个实施方案中，发夹结构中第一传感器分子与第二传感器分子之间的距离大于0。在一些实施方案中，第一传感器分子与第二传感器分子之间的距离彼此相距太远而不能确保接触猝灭。在一些实施方案中，福斯特共振能量转移(FRET)可以是用于猝灭的主要方法。在一些实施方案中，该距离在5埃至200埃的范围内，优选在10埃至100埃的范围内。在一些实施方案中，第一传感器分子与第二传感器分子之间3至30个碱基的距离提供了猝灭作用。
在一些实施方案中，第二传感器分子与胸腺嘧啶(thymine，T)连接。在一些实施方案中，第二传感器分子与胸苷连接。第二个传感器分子与脱氧胸苷连接。
在一些实施方案中，第二传感器分子与除胸腺嘧啶(T)之外的位点连接。在一些实施方案中，第二传感器分子与除胸苷之外的位点连接。在一些实施方案中，第二传感器分子与除脱氧胸苷之外的位点连接。
在一些实施方案中，基于制造效率和商业可获得性来选择第一传感器和第二传感器分子。在一些实施方案中，基于第二传感器对链置换聚合酶的阻断来选择第二传感器。因此，第二传感器的选择可根据链置换聚合酶而变化。
例如，在制造过程期间，内部猝灭剂可优选作为第二传感器分子。内部猝灭剂通常由大多数寡核苷酸制造商提供，并且可添加至合成而无需任何合成后反应。相反，添加至寡核苷酸内部dT(或另一种碱基，但不太常见)的大多数荧光团需要进行合成后修饰。如果荧光团作为阻断性修饰插入内部，则必须将猝灭剂添加至寡核苷酸的5’末端。制造商很少提供5’猝灭剂修饰。由于这些原因，内部猝灭剂可优选作为第二传感器分子。这绝不是方法的要求，而是商业考虑。
在一些实施方案中，第二传感器分子可阻断链置换聚合酶。在一些实施方案中，第二传感器分子不阻断链置换聚合酶。例如，一些传感器分子(例如，来自Thermo Fisher的QSY7)与dT碱基预缀合并且不阻断。优选使用非阻断性传感器分子用于NBM环状引物，但不是必需的。对于BM环状引物，阻断性或非阻断性传感器分子都可用作第二传感器分子。在一些实施方案中，BM环状引物包含阻断性传感器分子。在一些实施方案中，BM环状引物包含非阻断性传感器分子。
在一些实施方案中，使用5’荧光团的亚酰胺键联(例如，荧光素型荧光团如YakimaYellow或HEX的亚磷酰胺)产生环状引物，其在自动化寡核苷酸合成期间高效地产生。
在一些实施方案中，第二传感器分子是与胸腺嘧啶连接的TAMRA(非阻断性的)。
在一些实施方案中，环状引物包含5’亚酰胺荧光团例如HEX、Yakima Yellow以及具有可阻断链置换聚合酶的第二传感器分子的TAMRA。
6.4.用于Loop-de-Loop扩增的引物混合物
在另一方面中，本发明提供了用于Loop-de-Loop扩增的引物混合物。引物混合物包含本文中提供的环状引物。引物混合物可包含NBM环状引物、BM环状引物或二者。
在一些实施方案中，引物混合物包含一种环状引物。在一些实施方案中，引物混合物包含两种或更多种环状引物。
当其含有两种或更多种环状引物时，混合物中的引物可与单个靶序列或多个靶序列结合。在一些实施方案中，设计多个环状引物以检测来自多种来源的靶序列。例如，混合物可包含设计用于检测来自多种病原体的靶序列的多个环状引物。在一些实施方案中，混合物包含设计用于检测来自单一病原体的多个靶序列的多个环状引物。
在一些实施方案中，混合物中的所有环状引物都是BM环状引物。在一些实施方案中，混合物中的所有环状引物都是NBM环状引物。在一些实施方案中，混合物包含一个或更多个NBM环状引物以及一个或更多个BM环状引物。
引物混合物还可包含用于扩增反应的另外的引物。例如，引物混合物还可包含(i)正向内引物(FIP)，(ii)反向内引物(BIP)，(iii)正向引物(F3)和反向引物(B3)，其中FIP、BIP、F3和B3与靶序列上的六个不同的结合位点结合。在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB)，其中LF和LB与靶序列上的两个不同的结合位点结合。在一些实施方案中，另外的引物之一(例如FIP、BIP、F3、B3、LF或LB)与第一结合位点(即靶序列上与环状引物相同的结合位点)结合。
在一些实施方案中，引物混合物包含一个引物组。在一些实施方案中，引物组包含本文中提供的用于loop-de-loop扩增的环状引物(BM环状引物或NBM环状引物)、(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和(iv)反向引物(B3)。在一些实施方案中，引物组还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB)。
在一些实施方案中，引物组包含本文中提供的用于loop-de-loop扩增的环状引物和选自以下的三个引物：(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和(iv)反向引物(B3)。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、BIP、F3和B3。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、F3和B3。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、BIP和B3。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、BIP和F3。
在一些实施方案中，引物组包含本文中提供的用于loop-de-loop扩增的环状引物和选自以下的五个引物：(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)、(iv)反向引物(B3)、(v)正向环引物(LF)和(vi)反向环引物(LB)。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、BIP、F3、B3、LF和LB。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、F3、B3、LF和LB。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、BIP、B3、LF和LB。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、BIP、F3、LF和LB。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、BIP、F3、B3和LF。在一些实施方案中，引物组包含环状引物、FIP、BIP、F3、B3和LB。
在一些实施方案中，引物混合物包含两个引物组。在一些实施方案中，引物混合物包含三个引物组。在一些实施方案中，引物混合物包含四个或五个引物组。
在一些实施方案中，每个引物组用于扩增独特的靶序列。在一些实施方案中，引物混合物包含用于扩增同一靶序列的两个或更多个引物组。在一些实施方案中，引物混合物包含与同一靶序列上同一结合位点结合的两个或更多个环状引物。
环状引物可与另外的引物以针对扩增反应优化的任何比率混合。在一些实施方案中，FIP与第一结合位点结合，并且引物混合物中FIP与环状引物的量之比为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。在一些实施方案中，BIP与第一结合位点结合，并且引物混合物中BIP与环状引物的量之比为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。在一些实施方案中，LF与第一结合位点结合，并且引物混合物中LF与环状引物的量之比为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。在一些实施方案中，LB与第一结合位点结合，并且引物混合物中LB与环状引物的量之比为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。
在一些实施方案中，引物混合物被设计用于检测淋病奈瑟菌特异性的靶序列。在一些实施方案中，F3包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：3的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：6的寡核苷酸，或LB包含SEQ ID NO：8的寡核苷酸。在一个实施方案中，F3包含SEQ ID NO：1的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：2的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：3的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：4的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：6的寡核苷酸，并且LB包含SEQ ID NO：8的寡核苷酸。在一些实施方案中，环状引物是SEQ ID NO：5或7的寡核苷酸。
在一些实施方案中，引物混合物被设计用于检测沙眼衣原体特异性的靶序列。在一些实施方案中，F3包含SEQ ID NO：9的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：10的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：12的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸，或LB包含SEQ ID NO：14的寡核苷酸。在一个实施方案中，F3包含SEQ ID NO：9的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：10的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：11的寡核苷酸，BIP包含SEQID NO：12的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：13的寡核苷酸，并且LB包含SEQ ID NO：14的寡核苷酸。在一些实施方案中，环状引物是SEQ ID NO：15的寡核苷酸。
在一些实施方案中，引物混合物被设计用于检测智人特异性的靶序列。在一些实施方案中，F3包含SEQ ID NO：16的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：17的寡核苷酸，FIP包含SEQID NO：18的寡核苷酸，BIP包含SEQ ID NO：19的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：20的寡核苷酸，或LB包含SEQ ID NO：21的寡核苷酸。在一个实施方案中，F3包含SEQ ID NO：16的寡核苷酸，B3包含SEQ ID NO：17的寡核苷酸，FIP包含SEQ ID NO：18的寡核苷酸，BIP包含SEQ IDNO：19的寡核苷酸，LF包含SEQ ID NO：20的寡核苷酸，并且LB包含SEQ ID NO：21的寡核苷酸。在一些实施方案中，环状引物是SEQ ID NO：22的寡核苷酸。
在一些实施方案中，引物混合物被设计用于检测病毒特异性的靶序列。在一些实施方案中，病毒是SARS-CoV-2。
在一些实施方案中，本文中提供的引物混合物还被组合用于检测多个靶序列。在一些实施方案中，多个靶序列是不同生物体特异性的。例如，多个靶序列是不同病原体特异性的。在一些实施方案中，多个靶序列是单一生物体特异性的。
因此，在一些实施方案中，引物混合物还包含第二环状引物。
第二环状引物可以是NBM环状引物，其包含：
第三传感器分子；
第三夹寡核苷酸；
第三间隔寡核苷酸；
第四夹寡核苷酸，
其中第三夹寡核苷酸、第三间隔寡核苷酸和第四夹寡核苷酸可在低于第三夹寡核苷酸和第四夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；
第四传感器分子，
其中第三传感器分子和第四传感器分子是第二生物传感器对，并且第二生物传感器对不同于第一生物传感器对；以及
第二引物序列，其与第二靶序列上的第一结合位点互补。
第二环状引物可以是BM环状引物，其包含：
第三传感器分子；
第三夹寡核苷酸；
第三间隔寡核苷酸；
第四传感器分子，
其中第三传感器分子和第四传感器分子是第二生物传感器对，并且第二生物传感器对不同于第一生物传感器对；
任选的第四间隔寡核苷酸；
第四夹寡核苷酸，
其中第三夹寡核苷酸、第三间隔寡核苷酸、第四传感器分子、任选的第四间隔寡核苷酸和第四夹寡核苷酸可在低于第三夹寡核苷酸和第四夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；以及
第二引物序列，其与第二靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中，第三夹寡核苷酸与第四夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中，第三夹寡核苷酸可与第四夹寡核苷酸结合但与第四夹寡核苷酸不完全互补。
在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)第二正向内引物(SFIP)，(ii)第二反向内引物(SBIP)，(iii)第二正向引物(SF3)和第二反向引物(SB3)，其中SFIP、SBIP、SF3和SB3与第二靶序列上的六个不同的结合位点结合。在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)第二正向环引物(SLF)和(ii)第二反向环引物(SLB)，其中SLF和SLB与第二靶序列上的两个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物还包含第三环状引物。
在一些实施方案中，第三环状引物是NBM环状引物，其包含：
第五传感器分子；
第五夹寡核苷酸；
第五间隔寡核苷酸；
第六夹寡核苷酸，
其中第五夹寡核苷酸、第五间隔寡核苷酸和第六夹寡核苷酸可在低于第五夹寡核苷酸和第六夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；
第六传感器分子，
其中第五传感器分子和第六传感器分子是第三生物传感器对，并且第三生物传感器对不同于第一生物传感器对和第二生物传感器对；以及
第二引物序列，其与第三靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中，第三环状引物是BM环状引物，其包含：
第五传感器分子；
第五夹寡核苷酸；
第五间隔寡核苷酸；
第六传感器分子，
其中第五传感器分子和第六传感器分子是第三生物传感器对，并且第三生物传感器对不同于第一生物传感器对或第二生物传感器对；
任选的第六间隔寡核苷酸；
第六夹寡核苷酸，
其中第五夹寡核苷酸、第五间隔寡核苷酸、第六传感器分子、任选的第六间隔寡核苷酸和第六夹寡核苷酸可在低于第五夹寡核苷酸和第六夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；以及
第三引物序列，其与第三靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中，第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中，第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸结合，但第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸不完全互补。
在一些实施方案中，引物混合物还包含(i)第三正向内引物(TFIP)、(ii)第三反向内引物(TBIP)、(iii)第三正向引物(TF3)和第三反向引物(TB3)，其中TFIP、TBIP、TF3和TB3与第三靶序列上的六个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物包含(i)第三正向环引物(TLF)和(ii)第三反向环引物(TLB)，其中TLF和TLB与第三靶序列上的两个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中，引物混合物包含两个、三个、四个、五个或六个环状引物。当引物混合物包含两个或更多个环状引物时，每个环状引物可包含独特的生物传感器对，各自提供用于检测的独特信号。在一些实施方案中，每个生物传感器对提供用于检测的独特视觉信号(例如，独特的颜色)。在一些实施方案中，每个生物传感器对包含独特的染料分子。
在一些实施方案中，引物混合物中的两个或更多个环状引物包含相同的生物传感器对。在一些实施方案中，引物混合物中的两个或更多个环状引物用FAM标记。在一些实施方案中，引物混合物中两个不同的环状引物用FAM标记。
在一些实施方案中，本文中提供的引物混合物是冻干的。经干燥的引物混合物可包含本文中所述的任何环引物或引物混合物。在一些实施方案中，包含两个或更多个环状引物的引物混合物被冻干。在一些实施方案中，引物混合物是冻干珠的形式。
6.5.用于Loop-de-Loop扩增的试剂盒
在另一个方面中，提供了用于loop-de-loop扩增的试剂盒。该试剂盒可包含本文中提供的任何环状引物或引物混合物。
在一些实施方案中，试剂盒包含一个引物组。在一些实施方案中，引物组包含本文中提供的用于loop-de-loop扩增的环状引物、(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和反向引物(B3)。在一些实施方案中，引物组还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB)。
在一些实施方案中，试剂盒包含两个引物组。在一些实施方案中，试剂盒包含三个引物组。在一些实施方案中，试剂盒包含四个或五个引物组。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有在单个容器中的多个引物组。在一些实施方案中，试剂盒包含多个引物组，其中每个引物组单独包含在单独的容器中。
在一些实施方案中，试剂盒还包含聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是链置换DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是Bst 2.0DNA聚合酶(可从NEB获得)。在一些实施方案中，试剂盒包含两种或更多种聚合酶。
在一些实施方案中，试剂盒还包含其他反应酶，例如逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶是RTx逆转录酶(可从NEB获得)。在一些实施方案中，试剂盒还包含RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于扩增反应的试剂。在一些实施方案中，试剂包含dNTP、MgSO4和缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲液包含表面活性剂。在一些实施方案中，缓冲液包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的吐温-20。在一些实施方案中，试剂包含海藻糖。在一些实施方案中，试剂包含蔗糖。在一些实施方案中，试剂包含用于稳定化的聚合物。可根据聚合酶选择和优化扩增试剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含混合物，所述混合物包含dNTP、MgSO4、缓冲液、用于loop-de-loop扩增的一个或更多个引物组、和聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒包含混合物，所述混合物包含dNTP、用于loop-de-loop扩增的一个或更多个引物组、聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中，混合物是液体形式。在一些实施方案中，混合物是干燥形式。在一些实施方案中，混合物被配制成冻干粉、珠或丸粒。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于扩增反应的装置。在一些实施方案中，试剂盒包含用于环状引物介导的等温扩增的装置。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于运行扩增反应的反应管。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于在扩增反应之前过滤或纯化样品的组分。
在一些实施方案中，试剂盒用于诊断感染性疾病。在一些实施方案中，试剂盒用于诊断病原体感染，例如沙眼衣原体和淋病奈瑟菌。在一些实施方案中，试剂盒用于确定单核苷酸多态性(SNP)和点突变。在一些实施方案中，试剂盒用于确定突变基因型。在一些实施方案中，试剂盒用于确定与药物抗性表型相关的突变基因型。例如，可检测药物抗性标志物，例如头孢曲松(ceftriaxone)/头孢克肟(cefixime)抗性标志物、喹诺酮(quinolone)(环丙沙星(ciprofloxacin))抗性标志物、大环内酯类抗性标志物(阿奇霉素(azithromycin))。
6.6.Loop-de-Loop扩增方法
在另一个方面中，提供了loop-de-loop扩增方法。所述方法可包括以下步骤：
提供样品；
将(i)引物、引物混合物或通过将本文中提供的经干燥引物混合物再水合而获得的重构引物混合物和(ii)聚合酶添加至样品，从而产生反应混合物；以及
在50℃至85℃下孵育该反应混合物。
反应温度可根据聚合酶和靶序列进行调整。在一些实施方案中，孵育在50℃至70℃下进行。在一些实施方案中，孵育在55℃至70℃下进行。在一些实施方案中，孵育在60℃至65℃下进行。在一些实施方案中，孵育在62℃至65℃下进行。在一些实施方案中，孵育在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃下进行。
在一些实施方案中，所述方法还包括检测来自反应混合物的信号的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括检测荧光信号的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括检测颜色或浊度变化的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括检测非视觉信号的步骤。在一些实施方案中，所述检测步骤在孵育步骤期间进行。在一些实施方案中，所述检测步骤在完成孵育步骤之后进行。在一些实施方案中，实时检测信号。在一些实施方案中，实时记录信号并在完成孵育步骤之后进行分析。
在一些实施方案中，所述方法还包括制备用于loop-de-loop扩增的样品的步骤。在一些实施方案中，制备样品的步骤包括使RNA分子与逆转录酶相互作用，从而产生包含DNA分子的样品。在一些实施方案中，制备样品的步骤还包括在与逆转录酶相互作用之前将包含RNA分子的样品或反应混合物预热。
在一些实施方案中，用于loop-de-loop扩增的样品包含经纯化的多核苷酸分子。在一些实施方案中，样品包含经纯化的RNA、经纯化的DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者鼻或鼻咽拭子。在一些实施方案中，样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。在一些实施方案中，用于loop-de-loop扩增的样品是粗制样品。在一些实施方案中，用于loop-de-loop扩增的样品是经纯化的样品。
在一些实施方案中，检测多于一种类型的信号。在一些实施方案中，检测多个荧光或其他视觉信号。在一些实施方案中，检测多个信号以确定多个靶序列的存在或不存在。在一些实施方案中，检测多个信号以确认单个靶序列的存在或不存在。在一些实施方案中，检测多个信号以向所述方法提供另外的灵敏度和特异性。
对于靶序列的扩增，可使用本领域已知的多种扩增方法。
在一些典型的实施方案中，环介导的等温扩增(“LAMP”)被用于靶核酸的loop-de-loop扩增。LAMP是依赖于称为聚合酶的酶的链置换活性的等温DNA扩增方法，所述酶以碱基特异性方式将核苷酸碱基添加至正延伸的DNA或RNA链以形成具有互补序列的双链核酸。在等温扩增方法中，链置换聚合酶，例如来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)细菌的链置换聚合酶(Bst聚合酶及其变体)，当其使互补链聚合时置换双链DNA的一条链，并因此不需要热循环。
LAMP方法可使用4种不同的引物(F3、B3、正向内引物或FIP，以及反向内引物或BIP)，所述引物被专门设计用于识别靶DNA序列的6个不同区域。可添加2个另外的“环”引物以提高反应速度。反应混合物中的引物浓度可以变化，但通常对于FIP和BIP引物设置为1.6μM，对于正向和反向环引物(LF、LB)设置为0.8μM，以及对于F3和B3引物设置为0.2μM。在LAMP方法的一些实施方案中，可使用5种引物(仅使用2种可能的LAMP引物中的1种)。使用链置换反应在恒温(约65℃)下进行LAMP反应。通过在恒温下孵育样品、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、缓冲液和底物，可在一个步骤中完成靶标的扩增和检测。用于LAMP的典型混合物组成包含以下试剂：20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1％吐温20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst聚合酶、上述浓度的引物、以及水，在20℃下将pH调节至8.8。反应体积通常为5μL至50μL。反应温度针对所使用的特定酶和引物进行优化，并且反应进行5至60分钟。LAMP具有高灵敏度、特异性和有效性。
LAMP依赖于识别6个靶位点的至少4种引物(例如F3、B3、FIP和BIP)以扩增特定的DNA或RNA靶标(RNA靶标首先需要逆转录成DNA)。如果包含环引物(例如LF和LB)，则靶核酸中的总共8个独特位点被6个引物识别。在本文中提供的多个实施方案中，总共8个独特位点中的一个可被本文中所述的环状引物识别。如果样品中存在靶标，则可发生扩增反应，并提供大量的DNA。
本文中所述的新的loop-de-loop方法可应用于除LAMP之外的其他等温扩增方法。已经创建了许多等温扩增方法以解决聚合酶链式反应(PCR)的温度循环依赖性。虽然这些方法可变化很大，但其都有一些共同的特征。例如，因为DNA链不热变性，所以所有等温方法都依赖于替代方法来实现引物结合和开始扩增反应。一旦反应开始，聚合酶还必须将仍退火成目标序列的链置换。等温方法通常使用DNA聚合酶的链置换活性用于分离双链体DNA。具有这种能力的聚合酶包括Klenow片段(3’-5’exo-)、用于中等温度(25℃至40℃)反应的phi29、和Bsu大片段，以及用于更高温度(50℃至65℃)反应的Bst DNA聚合酶的大片段。为了检测RNA种类，添加了与反应温度相容的逆转录酶以保持扩增的等温性质。除了分离dsDNA的链置换机制之外，等温方法还可需要酶或引物设计来避免初始的起始变性要求。
如上所讨论的，环介导的等温扩增(LAMP)使用识别靶DNA的6至8个不同区域的4至6个引物。链置换DNA聚合酶起始合成，并且2个引物形成环结构以促进随后的几轮扩增。LAMP快速、灵敏并且扩增如此广泛以致LAMP非常适合于现场诊断。loop-de-loop引物可用于单个或任何组合或者内和/或环引物。
链置换扩增(SDA)依赖于链置换DNA聚合酶(通常是Bst DNA聚合酶、大片段或Klenow片段(3’-5'exo-))，在由链限制的限制性内切核酸酶或切口酶在包含在引物中的位点处产生的切口处起始。SDA需要1个正向引物和1个反向引物，以及1个碰撞正向引物和1个碰撞反向引物。每个聚合酶置换步骤可再生切口位点，导致指数扩增。SDA通常用于临床诊断。现有的荧光监测技术能够实现SDA(Nadeau et al.，Real-Time，Sequence-specificdetection of nucleic acids during strand displacement amplification，276m 2177-187(1999))，但依赖于限制性内切核酸酶的作用来产生荧光。正向或反向SDA引物均可适用于loop-de-loop方法，所述方法不要求切割位点位于荧光团和猝灭剂对之间。切割位点可存在于loop-de-loop引物的夹序列旁边，朝向引物的3’末端，使得在互补链上通过聚合酶使引物的5’末端完全延伸、随后通过限制性内切核酸酶切割引物之后产生荧光。
解旋酶依赖性扩增(helicase-dependent amplification，HDA)利用解旋酶的双链DNA解旋活性来分离链，使得通过链置换DNA聚合酶实现引物退火和延伸。与PCR类似，该系统只需要两个引物，1个正向引物和1个反向引物。HDA已用于数种诊断装置和经FDA批准的测试。HDA中的任何引物均可适合用于loop-de-loop方法，以实时地产生反应的实时、闭管监测。在HDA中，解旋酶可打开可通过单链结合蛋白稳定的loop-de-loop引物的环结构，并随后通过DNA聚合酶变成双链荧光扩增子。
切口酶扩增反应(nicking enzyme amplification reaction，NEAR)采用链置换DNA聚合酶在由切口酶产生的切口处起始，由靶序列快速产生许多短的核酸。该过程非常快速和灵敏，使得能够在数分钟内检测小靶标量。NEAR通常用于临床和生物安全应用中的病原体检测。用于NEAR的正向或反向引物可使用loop-de-loop方法通过链置换DNA聚合酶使环延伸来产生实时荧光。
6.7.使用方法
本文中提供的loop-de-loop扩增方法可用于检测来自多种来源的靶序列。例如，其可用于检测病毒基因组、细菌基因组、古核生物基因组、植物基因组、动物基因组、原生生物基因组、原核生物基因组或真核生物基因组特异性的靶序列。在一些实施方案中，所述方法用于检测RNA(例如，正义RNA、反义RNA)或DNA。在一些实施方案中，所述方法用于检测合成产生的靶序列。
在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于检测病原体特异性的DNA。在一些实施方案中，病原体是病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫。在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于检测与STD相关的病原体。在一些实施方案中，病原体是沙眼衣原体。在一些实施方案中，病原体是淋病奈瑟菌。在一些实施方案中，病原体是SARS-CoV-2。
在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于诊断感染。在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于确定突变基因型。在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于确定与药物抗性表型相关的突变基因型。例如，可检测药物抗性标志物，例如头孢曲松/头孢克肟抗性标志物、喹诺酮(环丙沙星)抗性标志物、大环内酯类抗性标志物(阿奇霉素)。
在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于确定单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于确定突变。
在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于检测单个靶标。在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于检测多于一个的靶标。在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于检测2、3、4或5个靶标。
在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于分析或表征样品。在一些实施方案中，loop-de-loop方法用于鉴定样品的来源。例如，loop-de-loop方法用于鉴定人样品。
本文中所述的loop-de-loop方法可用于分析多种样品。在一些实施方案中，分析血液、尿液、精液、组织或唾液样品。在一些实施方案中，从动物或人患者收集样品。在一些实施方案中，分析经纯化的样品。在一些实施方案中，分析粗制样品。在一些实施方案中，样品包含经纯化的RNA、经纯化的DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者中鼻甲或鼻咽拭子。在一些实施方案中，样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。
6.8.实施例
以下实施例通过举例说明而非限制的方式提供。
6.8.1实施例1：使用嵌入染料(SYTO)的针对沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的LAMP测定
制备LAMP反应混合物以单独检测沙眼衣原体基因组DNA和淋病奈瑟菌基因组DNA。反应以10μL的体积制备并且包含以下试剂：20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCI、8mMMgSO4、0.1％吐温20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst 2.0/>聚合酶、引物(SEQ ID1至4、6、8至14)(具有1.6μM的FIP和BIP，0.8μM的LF和LB，0.2μM的F3和B3)、2.5μM SYTO 85嵌入染料、以及水，在20℃下将pH调节至8.8。将靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍。将靶DNA或无DNA缓冲液(对于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物。反应温度为65℃，并通过SYTO 85荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图2A中所示出的数据描绘了通过嵌入染料监测的来自沙眼衣原体(绿色)和淋病奈瑟菌(蓝色)的LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间的代表性曲线，对于每个基因组DNA靶标的3个水平是——高(储备浓度)、低(储备DNA的10-5稀释，对于Ct；储备DNA的10-6稀释，对于Ng)以及无模板对照(无DNA(NTC))。
6.8.2.实施例2：通过loop-de-loop扩增进行的沙眼衣原体检测
制备loop-de-loop LAMP反应混合物以检测沙眼衣原体基因组DNA。反应以10μL体积制备并且包含以下试剂：20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1％吐温20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst 2.0/>聚合酶、引物(SEQ ID 9至15)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、以及水，在20℃下将pH调节至8.8。将定量的靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH 8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍或2倍(用于更精细的分辨率)。将靶DNA稀释液或无DNA缓冲液(用于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物，并在数个对数浓度的范围下，每个浓度多至20次重复被用于查看测定灵敏度。反应温度为65℃，并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图3中所示出的数据描绘了来自针对沙眼衣原体的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-Loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。然后基于测定的终点确定通过PROBIT分析估计测定灵敏度(检测限，50％和95％概率)。
6.8.3.实施例3：通过loop-de-loop扩增的淋病奈瑟菌检测
制备loop-de-loop LAMP反应混合物以检测淋病奈瑟菌基因组DNA。反应以10μL体积制备并且包含以下试剂：20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1％吐温20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst 2.0/>聚合酶、引物(SEQ ID 1至4、6至8)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、以及水，在20℃下将pH调节至8.8。将定量的靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH 8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍或2倍(用于更精细的分辨率)。将靶DNA稀释液或无DNA缓冲液(用于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物，并在数个对数浓度的范围下，每个浓度多至20次重复被用于查看测定灵敏度。反应温度为65℃，并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图2B至2C中所示出的数据描绘了来自针对淋病奈瑟菌的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loopLAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间的代表性曲线。图2B比较了来自loop-de-loop测定的信号与如图2A中所示没有用loop-de-loop引物而用SYTO 85染料进行的LAMP测定的信号。在阳性扩增的情况下，loop-de-loop测定提供了大得多的信号。在图2C中，证明了loop-de-loop测定的再现性，以及可忽略的背景荧光和无模板对照中的降低的后期的、伪扩增产物。图4中所示出的数据描绘了来自针对淋病奈瑟菌的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。然后基于测定的终点确定通过PROBIT分析从连续稀释测试结果估计测定灵敏度(检测限，50％和95％概率)。
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6.8.4.实施例4：通过loop-de-loop扩增的智人检测
制备loop-de-loop LAMP反应混合物以检测智人基因组DNA。反应以10μL体积制备并且包含以下试剂：20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1％吐温20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst 2.0/>聚合酶、引物(SEQ ID 16至22)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、以及水，在20℃下将pH调节至8.8。将定量的靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH 8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍或2倍(用于更精细的分辨率)。将靶DNA稀释液或无DNA缓冲液(用于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物，并在数个对数浓度的范围下，每个浓度多至20次重复被用于查看测定灵敏度。反应温度为65℃，并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图3中所示出的数据描绘了来自针对智人的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。然后基于测定的终点确定通过PROBIT分析估计测定灵敏度(检测限，50％和95％概率)。
6.8.5.实施例5：用于loop-de-loop扩增的经干燥引物混合物
用5步冷冻干燥方案使用内部冻干测试进行冷冻干燥试剂的配制。被设计用于检测淋病奈瑟菌的loop-de-loop LAMP反应混合物以每管25μL体积进行制备并等分到每个管中。冻干混合物包含以下试剂：1.4mM dNTP、作为无甘油制剂的0.32U/μL Bst 2.0聚合酶、引物(SEQ ID 1至4、6至8)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、5％海藻糖、以及水(每个反应补至25μL)。去除管盖以用于冻干。将管条放置在加热的搁板冻干机单元(制药和生物技术行业的标准设备构件)的金属搁板上。冻干机被程序设定为以5个步骤运行。步骤1：打开冷凝器，关闭真空，使搁板和试剂冷却至41°F，30分钟。打开冷凝器，关闭真空，使搁板和试剂冷却至23F，30分钟。步骤3：打开冷凝器，关闭真空，使搁板和试剂冷却至-23F，2小时。步骤4：打开冷凝器，打开真空，使搁板和试剂保持在-23F下，10小时。步骤5：打开冷凝器，打开真空，使搁板和试剂加热至77F，5小时。一旦该过程完成，将管移出并盖上盖子，得到图7中所示的产物。在多种环境条件下孵育一段时间之后，测试冷冻-干燥测定的活性。图8示出了再水合反应的代表性实时loop-de-loop LAMP测定活性。再水合方案包括向经干燥的试剂添加24μL再水合缓冲液、以及1μL的淋病奈瑟菌靶基因组DNA。再水合缓冲液由以下构成：20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1％吐温/>20、以及水，在20℃下将pH调节至8.8。将缓冲液添加至管，然后将管重新密封并直接放入实时qPCR仪中而无需涡旋或混合。反应温度为65℃，并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图8中所示出的数据描绘了来自针对淋病奈瑟菌的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。发现冻干的loop-de-loop测定速度、灵敏度和特异性与新鲜配制测定速度、灵敏度和特异性没有区别。此外，荧光强度不受干燥和再水合的影响，表明loop-de-loop方法可为病原体检测提供储存稳定的体外诊断试剂盒。/>
6.8.6.实施例6：用于loop-de-loop扩增的温度
如上所述制备loop-de-loop LAMP反应混合物，一种包含ORF 1ab引物组，并且另一种包含POP7b引物组。ORF1ab引物组对具有单链正义RNA基因组的SARS-CoV-2病毒具有特异性。POP7b引物组对不是天然作为DNA模板存在的人RNA靶标具有特异性；因此，该引物组可用作样品中人RNA的特异性指示物。在两种情况下，loop-de-loop均被用于修饰用于LAMP的6个组成引物之一，以产生第七环状引物。环状引物利用荧光团和猝灭剂对产生可观察信号。对于本实验，将中等高浓度的合成双链DNA模板(其正义链上包含与用于每个引物组的RNA靶标相对应的序列)用作LAMP反应温度优化的靶标，以使由于逆转录步骤引起的变异或在稀释靶标的情况下遇到的随机噪声最小化。将靶DNA稀释液添加至384孔板内的混合物。将其在范围为55℃至70℃的多种温度下孵育，并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。该实验针对重叠的温度范围进行了两次(第一测试和第二测试)，并且数据在图9A和9B中示出。所述图描绘了获得用于检测的足够信号所需的时间。结果表明，引物组在宽的温度范围内均有活性。例如，对于POP7b和ORF1ab引物组二者，约57℃至70℃是可接受的范围。在60℃至68℃实现了最佳性能。
6.8.7.实施例7：多重化loop-de-loop反应以检测经纯化的靶标和粗制样品中的靶标二者
图14A、14B和14C分别示出了来自用ORF1ab和POP7b LdL引物组对SARS-CoV-2和人靶序列进行loop-de-loop扩增的两个荧光信号。示出了来自SARS-CoV-2ORF1ab(FAM)和POP7b人内部对照(Cy5)的信号。使用了三种类型的样品——无任何靶序列的对照样品(无模板对照)(图14A)、人鼻拭子(图14B)以及与热灭活病毒形式的SARS-CoV-2靶序列组合的人鼻拭子(图14C)。人鼻拭子由志愿者自行收集，并且直接添加至反应而无需样品处理或核酸提取。通过扭转数秒钟将拭子洗脱到反应混合物中。将SARS-CoV-2靶序列作为加入到SARS-CoV-2阳性反应中的完整热灭活病毒(ATCC VR-1986HK)引入到反应中。ORF1ab LdL-FAM和POP7b LdL-Cy5引物组在复制反应体积中以1∶1的比例双重化。相对于未经标记的引物类似物，两个引物组均以1∶3的比例使用LdL引物(25％强度)。反应包含逆转录酶、链置换聚合酶和RNA酶抑制剂。使用实时PCR仪(Bio-Rad)在55.6摄氏度下孵育反应2.5分钟，并随后在63.5摄氏度下孵育反应60分钟，同时记录FAM和Cy5的荧光测量值。正如所预期的，在60分钟内无模板对照重复显示没有loop-de-loop荧光信号。包含COVID-19阴性鼻拭子样品的反应显示出放大的POP7b信号，如通过Cy5荧光增加证明的，然而ORF1ab信号保持平稳(阴性)。加入热灭活病毒的样品在单个反应容器中显示出两个RNA靶标的谱双重检测。结果表明，loop-de-loop RT-LAMP允许SARS-CoV-2和人靶标的单管谱多重化。
用ORF1ab LdL引物组对SARS-CoV-2进行的多重化loop-de-loop测试与PCR测试一样灵敏，并且不需要提取，因为用粗制样品的反应提供了如下表中所提供的良好结果。POP7b LdL引物组被用作内部对照。将完整的热灭活SARS-CoV-2病毒(ATCC VR-1986HK)的连续稀释液添加至双重化loop-de-loop反应，并监测实时信号显现。用于测定的检测限估计为LoD95＝400cp/拭子＝2.7×103cp/mL，针对测试试剂盒的具体格式。
| 拷贝数/反应或拷贝数/拭子 | 阳性/共计 |
| 512 | 2/2 |
| 372 | 7/8 |
| 256 | 1/2 |
| 128 | 0/2 |
在单个管中还测试了三重化loop-de-loop反应。其显示出三个靶标的特异性扩增，保持了快速的获得结果的时间。使用用FAM荧光团标记的2个loop-de-loop引物组检测SARS-CoV-2病毒RNA的2个单独靶标。用Cy5标记的人内部对照loop-de-loop引物组检测第三RNA靶标。内部Cy5荧光团与5’IowaRQ猝灭剂配对。反应包含粗制鼻拭子洗脱液，并加入有热灭活的SARS-CoV-2。
还测试了另外的环状引物用于POP7b人内部对照的loop-de-loop引物组。在一种情况下，内部TAMRA荧光团(第二传感器分子)与5’IowaFQ猝灭剂(第一传感器分子)配对。在另一种情况下，5’Yakima/>(Epoch Biosciences)(第一传感器分子)与内部ZenTM(Integrated DNA Technologies)猝灭剂(第二传感器分子)配对。对于YakimaYellow和Zen构型，产生并测试了环状引物的三种变体。在第一变体中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸完美互补并且各自都为6个碱基长。间隔寡核苷酸为13个碱基长。在第二变体中，第一夹寡核苷酸的特征在于在其5’末端具有另外的碱基，使得第一夹寡核苷酸为7个碱基长并且第二夹寡核苷酸为6个碱基长。第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸之间有6个互补碱基。间隔寡核苷酸为13个碱基长。在第三变体中，第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸二者都为7个碱基长并且序列完全互补。间隔寡核苷酸为10个碱基长。
这些另外的环状引物被用于LAMP反应。所述反应提供了靶序列的特异性扩增信号。
6.8.8.实施例8：通过loop-de-loop扩增对人样品中SARS-CoV-2的检测
制备了loop-de-loop LAMP反应混合物以检测来自未经处理的人唾液中的SARS-CoV-2。在PCR管中通过在pH缓冲盐溶液中用10％vol/vol的人唾液混合物将冻干酶、dNTP和寡核苷酸引物混合物再水合制备反应。冻干的引物混合物包含用于SARS-CoV-2的引物组和人内部对照RNA序列。一旦用唾液样品再水合，将反应在预热温度下孵育限定的一段时间以促进病毒裂解、RNA酶抑制和逆转录，并随后在更高的反应温度下孵育以用于LAMP DNA扩增。使用定制仪器收集温度控制和实时荧光数据。
将热灭活的SARS-CoV-2添加至从匿名供体收集的新鲜唾液的合并物中。制备在唾液中的3倍连续稀释液。使用loop-de-loop扩增方法测试20个样品。通过移动app、眼或实时曲线检查的读出总结如下。结果显示，LoD为约2,500cp/mL。
自收集的鼻拭子获自志愿者对象，并通过扭转10次直接添加至反应混合物。图16示出了来自获自有症状的志愿者的鼻拭子的扩增结果，所述志愿者后来通过PCR测试被证实对COVID呈阳性。还提供了来自阳性/阴性对照样品的结果。结果显示，样品(1×拭子)的浓度是在loop-de-loop测定的情况下检出阳性样品所需的365倍高。由于假定LoD为约2,500cp/mL，因此估计特定样品包含约9.1×105cp/mL的SARS-CoV-2病毒RNA。
图17示出了来自获自阴性志愿者的鼻拭子的扩增结果。患者通过loop-de-loop反应和PCR测试二者均检出为阴性。
将用于检测SARS-CoV-2的反应混合物与用于检测人基因组序列的引物以1∶1的比例多重化。多重化扩增结果在图18中提供。结果显示出对两个靶序列的特异性和灵敏性检测而无交叉反应。
6.8.9.实施例9：通过loop-de-loop扩增对人样品中沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的检测
使用30秒、1Hz扭转法(Panpradist et al.，2016)将三个阴道拭子(BD BBLCulture Swabs，购自Lee Biosolutions，MO的聚氨酯泡沫尖端拭子，来源于独特的个体供体)洗脱到1,294μL再水合缓冲液(每个拭子431μL)中。在拭子失去一些液体之后，获得了1095μL的合并的阴道拭子洗脱液。流体回收率为85％。将该拭子洗脱液移液至包含用于Loop-de-Loop LAMP的冻干反应混合物的注射模制原型一次性用品中(一份用于Ct，一份用于Ng，以及一份用于人工过程控制)。
每个反应用以下再水合：
●18μL的拭子洗脱液(将拭子旋转入再水合缓冲液中)；
●1μL的混悬于再水合缓冲液中的全Ct病原体
●1μL的混悬于再水合缓冲液中的全Ng病原体
Ct和Ng病原体样品位于一次性用品的每个反应室中。因此，例如，Ct测定的任务是在Ng和人靶标同时存在以及拭子样品中存在的任何细菌环境的情况下检出Ct。
扩增结果在图19至22中提供。图19示出了来自包含高Ct(每次反应10,000拷贝当量)和高Ng(每次反应10,000拷贝当量)的样品的荧光信号。图22示出了来自阴性对照——仅拭子对照(左侧两幅图)或仅缓冲液对照(右侧两幅图)的信号。在仅拭子对照中，没有Ct或Ng扩增，但人基因组序列按预期扩增。在仅缓冲液对照中，没有Ct或Ng扩增。在一个仅缓冲液反应(测试20)中较晚检出智人扩增，可能是由于伪扩增导致延迟信号。
这些结果表明，该测定灵敏地以约100个拷贝/反应检出Ct和以约＞1,000个拷贝/反应检出Ng。
6.8.10.实施例10：NBM环状引物中内部传感器的阻断作用
测试了包含不同内部传感器分子的NBM环状引物其对链置换聚合酶扩增的阻断作用。
包含利用核苷酸碱基(例如dT)作为传感器分子(荧光或猝灭剂)化学连接的骨架的内部修饰的NBM环状引物没有阻断聚合酶。图24示出了来自使用包含用荧光素(FAM)标记的内部dT的NBM环状引物扩增的解链曲线。如所预期的，解链曲线对于非扩增反应物显示出正斜率(-d(RFU)/dT＜0)，并且对于阳性扩增子显示出负斜率。
另一方面，包含不利用核苷酸碱基(例如dT)作为化学连接的骨架的内部修饰的NMB环状引物阻断了聚合酶。可能是聚合酶本身需要DNA碱基的磷酸骨架才能移动。例如，如图25中所提供的，内部Cy5结构中断这种情况。图25提供了人POP7b-LB-Cy5的解链曲线。该探针的Tm开始时非常高，并且当扩增发生时Tm没有大的变化。因此，在65℃时几乎没有信号产生。解链曲线仅显示出正导数，这表明Cy5阻断了延伸。
类似地，具有内部Zen猝灭剂(IDT)的环状引物(例如，POP7bLB-LdL-YY-1和2)也阻断了酶的进展，如图26中所提供的。
发夹的Tm从70℃变化至63℃，因此有一些实时荧光增益。然而，由于在反应温度下并非100％的发夹均处于开放构型，因此荧光比FAM更微弱(约25％)。解链曲线表明内部Zen猝灭剂阻断了Bst聚合酶对互补链的延伸。
这些结果表明NBM环状引物的使用受到限制，因为许多内部传感器分子均可以阻断延伸。除了FAM或TAMRA(IDT)之外，作为dT修饰而提供的内部修饰不是很多。
有一些方法使用点击化学将Cy3、Cy5和其他荧光团与核苷酸碱基(dT)连接，从而使其进入内部修饰。点击化学是高效的，但这仍然需要寡核苷酸制造商的非标准试剂和合成后修饰。
当环状引物的反向互补物的合成在第二夹序列3’末端处的内部传感器位点处停止时，LAMP和RT-LAMP反应中的实时扩增信号可能不存在或相对较弱，并且环状引物的发夹结构的解链温度可能更低。这些延伸阻断环状引物可能有问题，因为：1)它们产生微弱的荧光信号，2)荧光强烈依赖于温度，3)荧光的终点测量不能区分阳性和阴性结果。
6.8.11.实施例11：使用BM和NBM环状引物进行的Loop-de-Loop扩增
测试了靶向POP7b或CoV-11并包含多个内部修饰的BM和NBM环状引物。其在LAMP反应中在靶核苷酸存在(+)或不存在(-)的情况下的实时扩增信号提供于图28A、29A、30A、3lA、32A、33A、34A、35A、36A、37A和38A中，以及其在不同温度下的解链曲线提供于图28B、29B、30B、3lB、32B、33B、34B、35B、36B、37B和38B中。靶向POP-7b或CoV-11的测试的环状引物总结于下表中。
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图28A至38B表明多种内部猝灭剂(例如，Onyx(Millipore Sigma)、dT-TAMRA荧光团、QSY7猝灭剂(Thermo Fisher Scientific))可用于NBM引物中以进行Loop-de-Loop扩增。具体地，用POP7b LB或CoV-11 LB(这二者均具有5’HEX和poly-AT间隔区)证明了Onyx猝灭剂(内部OQA猝灭剂)的NBM相容性；用具有5’QSY7猝灭剂、poly-AT间隔区和内部dT-TAMRA的POP7b LB证明了dT-TAMRA荧光团的NBM相容性；并使用5’FAM、VIC、ABY和JUN用POP7b LB或CoV-11LB证明了QSY7猝灭剂的NBM相容性。
图28A至38B还表明BM环状引物与实际上不阻断聚合的多种内部猝灭剂相容。例如，具有内部QSY7的POP7b LB与5’FAM、5’VIC、5’ABY或5’JUN组合的实时扩增曲线表明，生物传感器对在BM环状引物中提供了期望的扩增反应并且在NBM环状引物中也提供了期望的扩增反应。(图28A、30A、31A、33A)。因此，由于已经证明BM环状引物与阻断聚合的内部生物传感器一起发挥作用，因此BM环状引物与阻断或允许聚合的内部生物传感器相容。
BM环状引物与内部生物传感器相容，无论其阻断作用如何。具有阻断性修饰的BM环状引物和具有非阻断性修饰的BM环状引物二者都可用于扩增靶序列。
另一方面，某些NBM环状引物与需要使用无阻断作用的内部生物传感器的阻断性修饰(例如，具有高阻断作用的生物传感器)不相容。例如，使用NBM环状引物SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24作为环状引物的POP7b引物组靶向POP7的扩增反应表现出来自内部Zen猝灭剂的阻断作用，导致来自5'-Yakima Yellow的微弱荧光信号产生以及阳性样品在室温下终点荧光的消失。相比之下，使用BM环状引物SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26作为环状引物的POP7b引物组靶向POP7的扩增反应表现出来自5'-Yakima Yellow的强荧光信号产生，尽管具有来自内部Zen猝灭剂的阻断作用。此外，使用具有阻断性内部修饰(Zen猝灭剂)的BM环状引物保留了阳性样品在室温下的终点荧光。另外，使用5’-HEX代替5’-Yakima Yellow作为第一传感分子提供了与BM环状引物序列SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28相当的结果，其中第二传感分子也是阻断性内部Zen猝灭剂。
低于夹序列Tm的阴性反应的解链曲线表明NBM环状引物的背景/基线荧光通常比BM环状引物的背景/基线荧光更低。这可能是因为NBM环状引物中的接触猝灭比BM环状引物中的FRET猝灭更有效。此外，阳性反应的实时扩增曲线表明NBM环状引物的终点荧光(在rxn温度(rxn temp)下)通常比BM环状引物的终点荧光更高。这可能是因为NBM环状引物中荧光/猝灭剂对之间的间隔更大。
在某些条件中，BM环状引物提供了比相当的NBM环状引物更好的扩增信号。在室温下的最大差异信号(pos减去neg)由具有poly-T间隔区的BM环状引物产生。
LdL夹序列的解链温度(Tm)影响反应速度和实时扩增曲线中的背景/基线荧光。对于BM环状引物，特别是对于具有poly-T间隔区的那些BM环状引物，Tm比预测的更低。
具有5’-VIC和内部dT-QSY7的环状引物(5’-VIC-1)显著比其他“5’荧光团标记的引物更慢，尽管与其他荧光团修饰相比，Tm仅略有提高(1-2C)。因此，5’VIC和dT-QSY7的组合不如其他组合优选。
7.序列
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8.通过引用并入
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件在此出于所有目的通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独地指出出于所有目的通过引用并入。
9.等同方案
本公开内容尤其提供了大麻素组合物和随从组合物。本公开内容还提供了通过施用大麻素和随从组合物来治疗神经退行性疾病的方法。尽管已经说明和描述了多个具体实施方案，但上述说明书不是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行多种改变。对于本领域技术人员而言，许多变化在阅读本说明书之后将变得明显。
Claims (106)
1.用于靶序列的loop-de-loop扩增(LdL)的环状引物，其从5’至3’包含：
第一传感器分子；
第一夹寡核苷酸；
第一间隔寡核苷酸；
第二传感器分子，
其中所述第一传感器分子和所述第二传感器分子是第一生物传感器对；
任选的第二间隔寡核苷酸；
第二夹寡核苷酸，
其中所述第一夹寡核苷酸、所述第一间隔寡核苷酸、所述第二传感器分子、所述任选的第二间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸能够在低于所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；
以及
第一引物序列，其与所述靶序列上的第一结合位点互补。
2.权利要求1所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸与所述第一夹寡核苷酸互补。
3.权利要求1或2所述的环状引物，其中所述第一间隔寡核苷酸或所述任选的第二间隔寡核苷酸在所述发夹结构中是单链的。
4.权利要求1至3中任一项所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述第一引物序列重叠。
5.权利要求1至3中任一项所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述第一引物序列不重叠。
6.权利要求1至5中任一项所述的环状引物，其包含所述第二间隔寡核苷酸。
7.权利要求6所述的环状引物，其中所述第一间隔寡核苷酸和所述第二间隔寡核苷酸二者在所述发夹结构中均是单链的。
8.权利要求1至7中任一项所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至30个核苷酸长。
9.权利要求8所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至15个核苷酸长。
10.权利要求9所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至10个核苷酸长。
11.权利要求10所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至9个核苷酸长。
12.权利要求11所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至8个核苷酸长。
13.权利要求12所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至7个核苷酸长。
14.权利要求13所述的环状引物，其中所述第二夹寡核苷酸和所述任选的第二间隔寡核苷酸一起为3至6个核苷酸长。
15.权利要求1至14中任一项所述的环状引物，其中当所述第一夹寡核苷酸、所述第一间隔寡核苷酸、所述第二传感器分子、所述任选的第二间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸形成所述发夹结构时，所述第一传感器分子和任选的第二传感器分子相距9至
16.权利要求15所述的环状引物，其中当所述第一夹寡核苷酸、所述第一间隔寡核苷酸、所述第二传感器分子、所述任选的第二间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸形成所述发夹结构时，所述第一传感器分子和所述任选的第二传感器分子相距10至
17.权利要求1至16中任一项所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸和所述第一间隔寡核苷酸一起为至少10个核苷酸长。
18.权利要求17所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸和所述第一间隔寡核苷酸一起为至少18个核苷酸长。
19.权利要求18所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸和所述第一间隔寡核苷酸一起为至少19个核苷酸长。
20.权利要求19所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸和所述第一间隔寡核苷酸一起为至少20个核苷酸长。
21.权利要求1或20所述的环状引物，其中所述第一生物传感器对是能量供体和接受体对。
22.权利要求21所述的环状引物，其中所述第一生物传感器对是用于荧光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)的能量供体和接受体对。
23.权利要求21所述的环状引物，其中所述第一传感器分子是FRET荧光团并且所述第二传感器分子是FRET猝灭剂。
24.权利要求21所述的环状引物，其中所述第一传感器分子是FRET猝灭剂并且所述第二传感器分子是FRET荧光团。
25.权利要求21所述的环状引物，其中所述第一传感器分子是BRET能量供体并且所述第二传感器分子是BRET能量接受体。
26.权利要求21所述的环状引物，其中所述第一传感器分子是BRET能量接受体并且所述第二传感器分子是BRET能量供体。
27.权利要求1至26中任一项所述的环状引物，其中所述第一传感器分子和所述第二传感器分子能够形成产生可检测光信号的复合物。
28.权利要求1至26中任一项所述的环状引物，其中当所述发夹结构形成时，所述第一传感器分子和所述第二传感器分子产生显著减弱的光信号。
29.权利要求1至27中任一项所述的环状引物，其中所述第二传感器分子与胸苷(T)或脱氧胸苷(dT)连接。
30.权利要求1至29中任一项所述的环状引物，其中所述发夹结构的解链温度(Tm)高于60℃。
31.权利要求30所述的环状引物，其中所述发夹结构的解链温度(Tm)高于65℃。
32.权利要求31所述的环状引物，其中所述发夹结构的解链温度(Tm)高于70℃。
33.权利要求32所述的环状引物，其中所述发夹结构的解链温度(Tm)高于80℃。
34.权利要求32所述的环状引物，其中所述发夹结构的解链温度(Tm)为70℃至80℃。
35.权利要求34所述的环状引物，其中所述发夹结构的解链温度(Tm)为70℃至75℃。
36.权利要求35所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为约72℃。
37.权利要求1至29中任一项所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于60℃。
38.权利要求1至29中任一项所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为60℃至65℃。
39.权利要求1至38中任一项所述的环状引物，其中所述第一夹寡核苷酸、所述第一间隔寡核苷酸、所述任选的第二间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基，(ii)锁核酸，(iii)2’O-甲基RNA碱基，(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基，(v)硫代磷酸酯化RNA碱基，(vi)硫代磷酸酯化2’-O-甲基RNA碱基，或(vii)其组合。
40.权利要求1至39中任一项所述的环状引物，其还包含在所述环状引物的5’末端处的第一另外的寡核苷酸。
41.权利要求1至40中任一项所述的环状引物，其还包含在所述第一传感器分子与所述第一夹寡核苷酸之间的第二另外的寡核苷酸。
42.权利要求40或41所述的环状引物，其中所述第一另外的寡核苷酸或所述第二另外的寡核苷酸是条码序列。
43.权利要求1至42中任一项所述的环状引物，其中所述靶序列是病原体基因组特异性的。
44.权利要求43所述的环状引物，其中所述靶序列是沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)特异性的。
45.权利要求44所述的环状引物，其中所述靶序列来自orf8或cds2。
46.权利要求43所述的环状引物，其中所述靶序列是淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)特异性的。
47.权利要求43所述的环状引物，其中所述靶序列来自porA或glnA。
48.权利要求43所述的环状引物，其中所述靶序列是病毒特异性的。
49.权利要求48所述的环状引物，其中所述病毒是SARS-CoV-2。
50.权利要求1至42中任一项所述的环状引物，其中所述靶序列是智人(Homo sapiens)特异性的。
51.权利要求50所述的环状引物，其中所述靶序列是RNA序列。
52.权利要求50所述的环状引物，其中所述靶序列是编码POP7b的RNA序列。
53.权利要求50所述的环状引物，其中所述靶序列来自tbcld3。
54.用于靶序列的loop-de-loop扩增的引物混合物，其包含权利要求1至53中任一项所述的环状引物。
55.权利要求54所述的引物混合物，其还包含(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和反向引物(B3)，其中所述FIP、所述BIP、所述F3和所述B3与所述靶序列上的六个不同的结合位点结合。
56.权利要求54所述的引物混合物，其还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB)，其中所述LF和所述LB与所述靶序列上的两个不同的结合位点结合。
57.权利要求55至56中任一项所述的引物混合物，其中所述FIP、所述BIP、所述F3、所述B3、所述LF或所述LB与所述靶序列上的所述第一结合位点结合。
58.权利要求55所述的引物混合物，其中所述FIP与所述第一结合位点结合，并且所述引物混合物中所述FIP与所述环状引物的量之比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。
59.权利要求55所述的引物混合物，其中所述BIP与所述第一结合位点结合，并且所述引物混合物中所述BIP与所述环状引物的量之比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。
60.权利要求55所述的引物混合物，其中所述LF与所述第一结合位点结合，并且所述引物混合物中所述LF与所述环状引物的量之比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。
61.权利要求55所述的引物混合物，其中所述LB与所述第一结合位点结合，并且所述引物混合物中所述LB与所述环状引物的量之比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1或9∶1。
62.权利要求55至61中任一项所述的引物混合物，其中所述F3包含SEQ ID NO∶1的寡核苷酸，所述B3包含SEQ ID NO∶2的寡核苷酸，所述FIP包含SEQ ID NO∶3的寡核苷酸，所述BIP包含SEQ ID NO∶4的寡核苷酸，所述LF包含SEQ ID NO∶6的寡核苷酸，或者所述LB包含SEQID NO∶8的寡核苷酸。
63.权利要求55至61中任一项所述的引物混合物，其中所述F3包含SEQ ID NO∶1的寡核苷酸，所述B3包含SEQ ID NO∶2的寡核苷酸，所述FIP包含SEQ ID NO∶3的寡核苷酸，所述BIP包含SEQ ID NO∶4的寡核苷酸，所述LF包含SEQ ID NO∶6的寡核苷酸，并且所述LB包含SEQID NO∶8的寡核苷酸。
64.权利要求55至61中任一项所述的引物混合物，其中所述F3包含SEQ ID NO∶9的寡核苷酸，所述B3包含SEQ ID NO∶10的寡核苷酸，所述FIP包含SEQ ID NO∶11的寡核苷酸，所述BIP包含SEQ ID NO∶12的寡核苷酸，所述LF包含SEQ ID NO∶13的寡核苷酸，或者所述LB包含SEQ ID NO∶14的寡核苷酸。
65.权利要求55至61中任一项所述的引物混合物，其中所述F3包含SEQ ID NO∶9的寡核苷酸，所述B3包含SEQ ID NO∶10的寡核苷酸，所述FIP包含SEQ ID NO∶11的寡核苷酸，所述BIP包含SEQ ID NO∶12的寡核苷酸，所述LF包含SEQ ID NO∶13的寡核苷酸，并且所述LB包含SEQ ID NO∶14的寡核苷酸。
66.权利要求55至61中任一项所述的引物混合物，其中所述F3包含SEQ ID NO∶16的寡核苷酸，所述B3包含SEQ ID NO∶17的寡核苷酸，所述FIP包含SEQ ID NO∶18的寡核苷酸，所述BIP包含SEQ ID NO∶19的寡核苷酸，所述LF包含SEQ ID NO∶20的寡核苷酸，或者所述LB包含SEQ ID NO∶21的寡核苷酸。
67.权利要求55至61中任一项所述的引物混合物，其中所述F3包含SEQ ID NO∶16的寡核苷酸，所述B3包含SEQ ID NO∶17的寡核苷酸，所述FIP包含SEQ ID NO∶18的寡核苷酸，所述BIP包含SEQ ID NO∶19的寡核苷酸，所述LF包含SEQ ID NO∶20的寡核苷酸，并且所述LB包含SEQ ID NO∶21的寡核苷酸。
68.权利要求54至67中任一项所述的引物混合物，其还包含第二环状引物，其中所述第二环状引物从5’至3’包含：
第三传感器分子；
第三夹寡核苷酸；
第三间隔寡核苷酸；
第四传感器分子，
其中所述第三传感器分子和所述第四传感器分子是第二生物传感器对，并且所述第二生物传感器对不同于所述第一生物传感器对；
任选的第四间隔寡核苷酸；
第四夹寡核苷酸，
其中所述第三夹寡核苷酸、所述第三间隔寡核苷酸、所述第四传感器分子、所述任选的第四间隔寡核苷酸和所述第四夹寡核苷酸能够在低于所述第三夹寡核苷酸和所述第四夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；
以及
第二引物序列，其与第二靶序列上的第一结合位点互补。
69.权利要求68所述的引物混合物，其中所述第三夹寡核苷酸与所述第四夹寡核苷酸互补。
70.权利要求68或69所述的引物混合物，其中所述靶序列和所述第二靶序列是相同的。
71.权利要求68或69所述的引物混合物，其中所述靶序列和所述第二靶序列是不同的。
72.权利要求68至71中任一项所述的引物混合物，其还包含(i)第二正向内引物(SFIP)、(ii)第二反向内引物(SBIP)、(iii)第二正向引物(SF3)和(iv)第二反向引物(SB3)，其中所述SFIP、所述SBIP、所述SF3和所述SB3与所述第二靶序列上的六个不同的结合位点结合。
73.权利要求68至69中任一项所述的引物混合物，其还包含(i)第二正向环引物(SLF)和(ii)第二反向环引物(SLB)，其中所述SLF和所述SLB与所述第二靶序列上的两个不同的结合位点结合。
74.权利要求54至73中任一项所述的引物混合物，其还包含第三环状引物，其中所述第三环状引物从5’至3’包含：
第五传感器分子；
第五夹寡核苷酸；
第五间隔寡核苷酸；
第六传感器分子，
其中所述第五传感器分子和所述第六传感器分子是第三生物传感器对，并且所述第三生物传感器对不同于所述第一生物传感器对和所述第二生物传感器对；
任选的第六间隔寡核苷酸；
第六夹寡核苷酸，
其中所述第五夹寡核苷酸、所述第五间隔寡核苷酸、所述第六传感器分子、所述任选的第六间隔寡核苷酸和所述第六夹寡核苷酸能够在低于所述第五夹寡核苷酸和所述第六夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构；
以及
第三引物序列，其与第三靶序列上的第一结合位点互补。
75.权利要求74所述的引物混合物，其中所述第五夹寡核苷酸与所述第六夹寡核苷酸互补。
76.权利要求74或75所述的引物混合物，其中所述靶序列、所述第二靶序列和所述第三靶序列是相同的。
77.权利要求74或75所述的引物混合物，其中所述靶序列、所述第二靶序列和所述第三靶序列是不同的。
78.权利要求74至77中任一项所述的引物混合物，其还包含(i)第三正向内引物(TFIP)、(ii)第三反向内引物(TBIP)、(iii)第三正向引物(TF3)和(iv)第三反向引物(TB3)，其中所述TFIP、所述TBIP、所述TF3和所述TB3与所述第三靶序列上的六个不同的结合位点结合。
79.权利要求74至78中任一项所述的引物混合物，其还包含(i)第三正向环引物(TLF)和(ii)第三反向环引物(TLB)，其中所述TLF和所述TLB与所述第三靶序列上的两个不同的结合位点结合。
80.权利要求74至79中任一项所述的引物混合物，其还包含第四环状引物。
81.权利要求80所述的引物混合物，其还包含第五环状引物。
82.经干燥引物混合物，其是通过对权利要求1至53中任一项所述的环状引物或者权利要求54至81中任一项所述的引物混合物进行冻干而获得的。
83.用于靶序列的loop-de-loop扩增的试剂盒，其包含：
权利要求1至53中任一项所述的环状引物、权利要求54至81中任一项所述的引物混合物、或者权利要求80所述的经干燥引物混合物。
84.权利要求83所述的试剂盒，其还包含聚合酶，其中所述聚合酶任选地是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)聚合酶。
85.权利要求83至84中任一项所述的试剂盒，其还包含dNTP、MgSO4和缓冲剂。
86.权利要求83至85中任一项所述的试剂盒，其还包含逆转录酶。
87.权利要求83至86中任一项所述的试剂盒，其还包含RNA酶抑制剂。
88.权利要求87所述的试剂盒，其中所述RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA酶抑制剂。
89.检测样品中的靶序列的方法，其包括以下步骤：
提供样品；
将以下和聚合酶添加至所述样品，从而产生反应混合物：(i)权利要求1至53中任一项所述的引物、(ii)权利要求54至81中任一项所述的引物混合物、或者(iii)通过使权利要求82所述的经干燥引物混合物再水合而获得的重构引物混合物；以及
在50℃至85℃下孵育所述反应混合物。
90.权利要求89所述的方法，其中所述孵育在50℃至70℃下进行。
91.权利要求90所述的方法，其中所述孵育在60℃至65℃下进行。
92.权利要求91所述的方法，其中所述孵育在62℃至65℃下进行。
93.权利要求89至90中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶。
94.权利要求89至93中任一项所述的方法，其还包括检测来自所述反应混合物的信号的步骤。
95.权利要求94所述的方法，其中所述信号是荧光信号。
96.权利要求94至95中任一项所述的方法，其中检测步骤在孵育步骤期间进行。
97.权利要求89至96中任一项所述的方法，其还包括确定所述样品中存在或不存在所述靶序列的步骤。
98.权利要求89至97中任一项所述的方法，其还包括制备所述样品的在先步骤。
99.权利要求98所述的方法，其中制备所述样品的步骤包括使RNA分子与逆转录酶相互作用，从而产生包含DNA分子的样品。
100.权利要求99所述的方法，其中制备所述样品的步骤还包括在与所述逆转录酶相互作用之前或期间对所述RNA分子进行预热。
101.权利要求89至100中任一项所述的方法，其中所述反应混合物还包含RNA酶抑制剂。
102.权利要求101所述的方法，其中所述RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA抑制剂。
103.权利要求89至102中任一项所述的方法，其中所述样品包含经纯化RNA、经纯化DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者鼻或鼻咽拭子。
104.权利要求89至102中任一项所述的方法，其中所述样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。
105.权利要求89至104中任一项所述的方法，其还包括确定存在或不存在所述靶序列的步骤。
106.权利要求105所述的方法，其还包括确定存在或不存在所述第二靶序列或所述第三靶序列的步骤。
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