JP6499656B2 - 鎖侵入に基づく増幅による核酸の検出 - Google Patents

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Description

本発明の分野
本発明は、蛍光色素分子(fluorophore)と、クエンチャー(quencher)と、標的核酸配列に相補的な領域とを含むオリゴヌクレオチドプローブが検出のために使用される、1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質の存在下で試料中の標的核酸配列を検出するための方法に関する。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む。本発明は、この方法における使用に適したオリゴヌクレオチドプローブ、組成物及びキット、及び病原体(pathogen)の感染の診断のためのそれらの使用にも関する。
本発明の背景
標的核酸配列の検出は、蛍光色素分子/クエンチャーのペアを含むDNAプローブを用いて行われている。かかるプローブは、標的核酸への結合状態でクエンチング(quenching)活性の変化を示し、標的の定量的検出を可能にする。プローブを使用して、リアルタイムにDNA増幅を測定することができ、検出すべき標的のための各プローブにおいて異なる蛍光色素分子/クエンチャーのペアを使用することにより、同じ反応において異なる標的が検出され得、それゆえ多重化(multiplexing)を可能にする。DNA増幅の検出のための以前のプローブシステムの例としては、標的結合状態でコンフォメーションの変化(conformational change)を示すハイブリダイゼーションプローブ(hybridisation probe)(米国特許第7241596号)、分子指標(molecular beacon)(米国特許第5925517号)、 Taqman chemistry (米国特許6214979号)、及びエンドヌクレアーゼで切断可能な(endonuclease-cleavable)プローブ (米国特許第7435561号及び米国特許出願第20050214809号)が挙げられる。上流プライマー、下流プライマー及び鎖侵入(strand invasion)系に依存する等温(isothermal)DNA増幅過程が、国際公開第2009/150467号に記載されている。
本発明の概要
本発明は、1本鎖DNAに結合可能なタンパク質が存在する場合の検出アッセイにおけるDNAプローブの使用に関連する問題認識に一部基づいている。本発明者らは、DNAプローブが、1本鎖DNAへ結合可能なタンパク質の存在下では、特異的な、鋳型依存性(template-dependent)シグナルを提供することができず、鋳型の非存在下でさえ実際にはシグナルを発することを見出した。この問題は、1本鎖DNAへ結合可能なタンパク質との関連で、信頼できる鋳型依存性のDNA増幅の検出を提供し得る解決方法を研究することに本発明者らを導いた。本発明者らは、意外にも、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はペプチド核酸(Peptide Nucleic acid, PNA)ヌクレオチドを、蛍光色素分子及びクエンチャーで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブの配列に組み込むことが、完全に対応するDNAプローブと比較して、1本鎖DNAへ結合可能なタンパク質による蛍光シグナルの混乱(disruption)に対する抵抗性をもたらすことを発見した。
本発明は、1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質の存在下で、試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、該方法が、蛍光色素分子と、クエンチャーと、前記標的核酸配列に相補的な領域とを含む少なくとも1のオリゴヌクレオチドプローブに前記試料を接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む、方法を提供する。
本発明は、蛍光色素分子と、クエンチャーと、標的核酸配列に相補的な領域とを含むオリゴヌクレオチドプローブであって、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドプローブを更に提供する。本発明は、組成物及びキットであって、本発明のオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ含む組成物及びキットを追加的に提供し、また、前記標的核酸配列に相補的な領域を含む鎖侵入オリゴヌクレオチド(strand invasion oligonucleotide)及び/又は1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質を提供する。本発明は、また、被験体における疾患の診断のための方法であって、被験体からの試料中の本発明の核酸配列を検出するための方法を実施して、前記疾患に関連する標的核酸配列を検出することを含む方法を提供する。
図1は、蛍光色素分子及びクエンチャーを含むプローブからのシグナルへの(A)リコンビナーゼ(UvsX)、(B) 1本鎖DNA結合タンパク質(gp32)、(C)鎖侵入に基づく増幅のための試薬混合物(reagent mixture)、D) E.coliリコンビナーゼRecA及びE) 1本鎖DNA結合タンパク質ET-SSBの効果を示す。(A)及び(B)についてのX軸:左から右-検査された各プローブについての4の条件(プローブのみ;相補的鋳型(complementary template)とプローブ;タンパク質(複数可)とプローブ;タンパク質(複数可)及び相補的鋳型とプローブ)。(C)についてのX軸:左から右-検査された各プローブについての2の条件(プローブ及び試薬組成物;プローブ、試薬組成物及び相補的鋳型)。(D)及び(E)についてのX軸):左から右-検査された各プローブについての2の条件(プローブのみ、タンパク質とプローブ)。検査されたプローブは、DNA 16 (配列番号1)、DNA 21 (配列番号2)、2’-O-メチルRNA 16 (配列番号 5)、2’-O-メチルRNA 21 (配列番号6)、2’-フルオロRNA 16 (配列番号7)、2’-フルオロRNA 21 (配列番号8)、LNA 12 (配列番号9)、PNA 14 (配列番号10)、RNA 16 (配列番号3)及びRNA 21 (配列番号4)であった。各図についてのY軸:蛍光(任意単位(arbitrary unit))。 図1は、蛍光色素分子及びクエンチャーを含むプローブからのシグナルへの(A)リコンビナーゼ(UvsX)、(B) 1本鎖DNA結合タンパク質(gp32)、(C)鎖侵入に基づく増幅のための試薬混合物(reagent mixture)、D) E.coliリコンビナーゼRecA及びE) 1本鎖DNA結合タンパク質ET-SSBの効果を示す。(A)及び(B)についてのX軸:左から右-検査された各プローブについての4の条件(プローブのみ;相補的鋳型(complementary template)とプローブ;タンパク質(複数可)とプローブ;タンパク質(複数可)及び相補的鋳型とプローブ)。(C)についてのX軸:左から右-検査された各プローブについての2の条件(プローブ及び試薬組成物;プローブ、試薬組成物及び相補的鋳型)。(D)及び(E)についてのX軸):左から右-検査された各プローブについての2の条件(プローブのみ、タンパク質とプローブ)。検査されたプローブは、DNA 16 (配列番号1)、DNA 21 (配列番号2)、2’-O-メチルRNA 16 (配列番号 5)、2’-O-メチルRNA 21 (配列番号6)、2’-フルオロRNA 16 (配列番号7)、2’-フルオロRNA 21 (配列番号8)、LNA 12 (配列番号9)、PNA 14 (配列番号10)、RNA 16 (配列番号3)及びRNA 21 (配列番号4)であった。各図についてのY軸:蛍光(任意単位(arbitrary unit))。 図1は、蛍光色素分子及びクエンチャーを含むプローブからのシグナルへの(A)リコンビナーゼ(UvsX)、(B) 1本鎖DNA結合タンパク質(gp32)、(C)鎖侵入に基づく増幅のための試薬混合物(reagent mixture)、D) E.coliリコンビナーゼRecA及びE) 1本鎖DNA結合タンパク質ET-SSBの効果を示す。(A)及び(B)についてのX軸:左から右-検査された各プローブについての4の条件(プローブのみ;相補的鋳型(complementary template)とプローブ;タンパク質(複数可)とプローブ;タンパク質(複数可)及び相補的鋳型とプローブ)。(C)についてのX軸:左から右-検査された各プローブについての2の条件(プローブ及び試薬組成物;プローブ、試薬組成物及び相補的鋳型)。(D)及び(E)についてのX軸):左から右-検査された各プローブについての2の条件(プローブのみ、タンパク質とプローブ)。検査されたプローブは、DNA 16 (配列番号1)、DNA 21 (配列番号2)、2’-O-メチルRNA 16 (配列番号 5)、2’-O-メチルRNA 21 (配列番号6)、2’-フルオロRNA 16 (配列番号7)、2’-フルオロRNA 21 (配列番号8)、LNA 12 (配列番号9)、PNA 14 (配列番号10)、RNA 16 (配列番号3)及びRNA 21 (配列番号4)であった。各図についてのY軸:蛍光(任意単位(arbitrary unit))。 図2は、鎖侵入に基づく増幅による標的DNAの増幅を示す。A)プライマー、プローブ、鎖侵入/中間体オリゴヌクレオチド(intermediate oligonucleotide, IO)及び標的DNAの構造。B)サイバーグリーン(SYBR Green)を使用することによって検出された増幅のリアルタイム測定。C) 2’-フルオロRNAプローブSB-2FLUORO (配列番号17)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。D) LNAプローブ(SB-LNA配列番号18)を用いて検出された増幅のリアルタイム測定。E)天然型(natural)DNAプローブ(SB-DNA配列番号16)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。B)〜E)では、NTC = 鋳型なしコントロール(no template control)であり、鋳型の希釈を示す。反応は、デュプリケートで行った。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。 図2は、鎖侵入に基づく増幅による標的DNAの増幅を示す。A)プライマー、プローブ、鎖侵入/中間体オリゴヌクレオチド(intermediate oligonucleotide, IO)及び標的DNAの構造。B)サイバーグリーン(SYBR Green)を使用することによって検出された増幅のリアルタイム測定。C) 2’-フルオロRNAプローブSB-2FLUORO (配列番号17)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。D) LNAプローブ(SB-LNA配列番号18)を用いて検出された増幅のリアルタイム測定。E)天然型(natural)DNAプローブ(SB-DNA配列番号16)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。B)〜E)では、NTC = 鋳型なしコントロール(no template control)であり、鋳型の希釈を示す。反応は、デュプリケートで行った。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。 図2は、鎖侵入に基づく増幅による標的DNAの増幅を示す。A)プライマー、プローブ、鎖侵入/中間体オリゴヌクレオチド(intermediate oligonucleotide, IO)及び標的DNAの構造。B)サイバーグリーン(SYBR Green)を使用することによって検出された増幅のリアルタイム測定。C) 2’-フルオロRNAプローブSB-2FLUORO (配列番号17)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。D) LNAプローブ(SB-LNA配列番号18)を用いて検出された増幅のリアルタイム測定。E)天然型(natural)DNAプローブ(SB-DNA配列番号16)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。B)〜E)では、NTC = 鋳型なしコントロール(no template control)であり、鋳型の希釈を示す。反応は、デュプリケートで行った。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。 図2は、鎖侵入に基づく増幅による標的DNAの増幅を示す。A)プライマー、プローブ、鎖侵入/中間体オリゴヌクレオチド(intermediate oligonucleotide, IO)及び標的DNAの構造。B)サイバーグリーン(SYBR Green)を使用することによって検出された増幅のリアルタイム測定。C) 2’-フルオロRNAプローブSB-2FLUORO (配列番号17)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。D) LNAプローブ(SB-LNA配列番号18)を用いて検出された増幅のリアルタイム測定。E)天然型(natural)DNAプローブ(SB-DNA配列番号16)を使用して検出された増幅のリアルタイム測定。B)〜E)では、NTC = 鋳型なしコントロール(no template control)であり、鋳型の希釈を示す。反応は、デュプリケートで行った。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。 図3は、多重の(multiple)DNA標的の検出を可能にする異なる蛍光色素分子及びクエンチャーで標識された2’-フルオロRNA塩基を有するプローブを用いた増幅のリアルタイム測定を示す。(A)クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)標的配列のためのCy5及びアイオワブラック(Iowa Black)で標識されたプローブ(SC-2FLURO、配列番号25)と、人工標的配列のためのROX及びBHQ2で標識されたプローブ(SB2-FLURO、配列番号17)とを用いることによる2のDNA標的の増幅及び検出。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。(B)サイバーグリーンIを用いた増幅後の標的の融解(Melt)分析。X軸:温度(セ氏度)。Y軸: -(d(蛍光)/d(温度)、任意単位)。(C)2’-フルオロRNAプローブを用いた増幅後の標的の融解分析。図3(B)についてのX及びY軸。 図3は、多重の(multiple)DNA標的の検出を可能にする異なる蛍光色素分子及びクエンチャーで標識された2’-フルオロRNA塩基を有するプローブを用いた増幅のリアルタイム測定を示す。(A)クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)標的配列のためのCy5及びアイオワブラック(Iowa Black)で標識されたプローブ(SC-2FLURO、配列番号25)と、人工標的配列のためのROX及びBHQ2で標識されたプローブ(SB2-FLURO、配列番号17)とを用いることによる2のDNA標的の増幅及び検出。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。(B)サイバーグリーンIを用いた増幅後の標的の融解(Melt)分析。X軸:温度(セ氏度)。Y軸: -(d(蛍光)/d(温度)、任意単位)。(C)2’-フルオロRNAプローブを用いた増幅後の標的の融解分析。図3(B)についてのX及びY軸。 図3は、多重の(multiple)DNA標的の検出を可能にする異なる蛍光色素分子及びクエンチャーで標識された2’-フルオロRNA塩基を有するプローブを用いた増幅のリアルタイム測定を示す。(A)クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)標的配列のためのCy5及びアイオワブラック(Iowa Black)で標識されたプローブ(SC-2FLURO、配列番号25)と、人工標的配列のためのROX及びBHQ2で標識されたプローブ(SB2-FLURO、配列番号17)とを用いることによる2のDNA標的の増幅及び検出。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。(B)サイバーグリーンIを用いた増幅後の標的の融解(Melt)分析。X軸:温度(セ氏度)。Y軸: -(d(蛍光)/d(温度)、任意単位)。(C)2’-フルオロRNAプローブを用いた増幅後の標的の融解分析。図3(B)についてのX及びY軸。 図4は、プローブを切断する(cleaving)RNase H2の付加によって誘導された2’-フルオロRNAプローブのシグナル増進(signal enhancement)を示す。(A)二重標識プローブを、RNase H2試薬混合物の存在下又は非存在下において相補的なDNAとともにインキュベートした。X軸:左〜右 各検査されたプローブについての4の条件(試薬混合物とプローブ;相補的鋳型及び試薬混合物とプローブ;試薬混合物及びRNase H2とプローブ;相補的鋳型、試薬混合物及びRNase H2とプローブ。検査されたプローブは、LNA 12 (配列番号9)、PNA 14 (配列番号10)、SB-2’-O-メチルRNA 16 (配列番号32)、SB-DNA 16 (配列番号1)、及びSB-2’-フルオロRNA 16 (配列番号17)であった。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。(B) 2’-フルオロRNAプローブSC-2FLURO (配列番号24)を使用する、RNase H2の存在下又は非存在下におけるC. difficile標的配列の増幅のリアルタイム測定。X軸:時間(分)。Y軸:蛍光(任意単位)。 図4は、プローブを切断する(cleaving)RNase H2の付加によって誘導された2’-フルオロRNAプローブのシグナル増進(signal enhancement)を示す。(A)二重標識プローブを、RNase H2試薬混合物の存在下又は非存在下において相補的なDNAとともにインキュベートした。X軸:左〜右 各検査されたプローブについての4の条件(試薬混合物とプローブ;相補的鋳型及び試薬混合物とプローブ;試薬混合物及びRNase H2とプローブ;相補的鋳型、試薬混合物及びRNase H2とプローブ。検査されたプローブは、LNA 12 (配列番号9)、PNA 14 (配列番号10)、SB-2’-O-メチルRNA 16 (配列番号32)、SB-DNA 16 (配列番号1)、及びSB-2’-フルオロRNA 16 (配列番号17)であった。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。(B) 2’-フルオロRNAプローブSC-2FLURO (配列番号24)を使用する、RNase H2の存在下又は非存在下におけるC. difficile標的配列の増幅のリアルタイム測定。X軸:時間(分)。Y軸:蛍光(任意単位)。 図5は、105から10コピーまでのS. typhimuriumゲノムDNAの連続希釈(serial dilution)を用いるSalmonella typhimuriumの検出のための鎖侵入に基づく増幅アッセイの感度(sensitivity)を示す。2’-フルオロRNAプローブを使用する増幅のリアルタイム測定。使用されたプローブは、SM-2FLURO (配列番号30)であった。X軸:時間(分)。Y軸:蛍光(任意単位)。NTC = 鋳型なしコントロール、鋳型の希釈を示す。 図6は、(A) RNase H2の非存在下及び(B) RNase H2の存在下において2’-フルオロRNAプローブがプライマーに非依存的(independently)に標的を増幅も検出もしないことを示す。反応についての条件を各線(each trace)について示す。同種(cognate)リバースプライマー(配列番号12)もしくは偽(spurious)プライマー、SPU (配列番号33)の存在下又は非存在下のいずれかにおいて反応を行った。プローブSB-2FLURO (配列番号17)からのROX蛍光色素分子又はサイバーグリーンを検出することによって、増幅のリアルタイム測定を行った。X軸:時間(分)。Y軸:蛍光(任意単位)。 図7は、二重機能(dual function) 2’-フルオロRNAプライマー/プローブ及び天然型DNAプライマーを使用した鎖侵入に基づく増幅による標的DNAの増幅を示す。(A)フォワードプライマー、リバースプローブ-プライマー、鎖侵入/中間体オリゴヌクレオチド(IO)及び標的DNAの構造。B)サイバーグリーンを用いて検出された人工鋳型の増幅のリアルタイム測定。使用されたプライマーは、DNAプライマーSB-R20 (配列番号12)、2’-フルオロRNAプライマーSBFLURO1-RNA (配列番号13)及び2’フルオロRNA/DNAプライマーSBFLURO2-RNA (配列番号14)であった。C) SB-R20 (配列番号12)、又は内部蛍光色素分子(FAM)及び5’クエンチャーで標識された2’-フルオロRNAプローブ-プライマー(SB-2FLURO 2、配列番号19)を用いて検出された人工鋳型の増幅のリアルタイム測定。サイバーグリーンを用いて検出された、DNAプライマー(配列番号 12)を用いた増幅; FAMチャネル(channel)により検出された、2’-フルオロRNAプローブプライマー(配列番号19)を用いた増幅(サイバーグリーンを加えない)。NTC =鋳型なしコントロール、鋳型の希釈を示す。X軸:時間(分)。各図についてのY軸:蛍光(任意単位)。 図8は、相補的鋳型の非存在下における、DNA及びRNA塩基 (DNA/RNAもしくはDNA/2’-フルオロRNA又はDNA/2’-O-メチルRNA)を有する二重標識キメラプローブ(chimeric probe)からのシグナルへのリコンビナーゼUvsX及び1本鎖結合タンパク質T4-gp32の影響を示す。A) UvsXの効果。B) T4-gp32の効果。C)更なる一連のプローブを用いた追加的なUvsXアッセイ。D)更なる一連のプローブを用いた追加的なT4 gp32アッセイ。検査されたプローブは、DNA 21 (配列番号2)、DNA 16 + RNA5 (配列番号35)、DNA 10 + RNA 11 (配列番号36)、DNA5 + RNA16 (配列番号37)、RNA21 (配列番号4)、DNA16 + 2-フルオロRNA5 (配列番号38)、DNA10 + 2-フルオロRNA11 (配列番号39)、DNA 5 + 2-フルオロRNA 16 (配列番号40)、2-フルオロRNA21 (配列番号8)、DNA16 + 2-O-メチルRNA5 (配列番号41)、DNA10 + 2-O-メチルRNA11 (配列番号42)、DNA5 + 2-O-メチルRNA16 (配列番号43)、2-O-メチルRNA21 (配列番号6)、DNA20 + RNA1 (配列番号45)、DNA19 + RNA2 (配列番号46)、DNA18 + RNA3 (配列番号47)及びDNA17 + RNA4 (配列番号48)であった。Y軸:蛍光の倍増加(fold increase) (UvsX又はT4-gp32存在下における蛍光を、UvsX又はT4-gp32非存在下における蛍光で割った)、任意単位。 図8は、相補的鋳型の非存在下における、DNA及びRNA塩基 (DNA/RNAもしくはDNA/2’-フルオロRNA又はDNA/2’-O-メチルRNA)を有する二重標識キメラプローブ(chimeric probe)からのシグナルへのリコンビナーゼUvsX及び1本鎖結合タンパク質T4-gp32の影響を示す。A) UvsXの効果。B) T4-gp32の効果。C)更なる一連のプローブを用いた追加的なUvsXアッセイ。D)更なる一連のプローブを用いた追加的なT4 gp32アッセイ。検査されたプローブは、DNA 21 (配列番号2)、DNA 16 + RNA5 (配列番号35)、DNA 10 + RNA 11 (配列番号36)、DNA5 + RNA16 (配列番号37)、RNA21 (配列番号4)、DNA16 + 2-フルオロRNA5 (配列番号38)、DNA10 + 2-フルオロRNA11 (配列番号39)、DNA 5 + 2-フルオロRNA 16 (配列番号40)、2-フルオロRNA21 (配列番号8)、DNA16 + 2-O-メチルRNA5 (配列番号41)、DNA10 + 2-O-メチルRNA11 (配列番号42)、DNA5 + 2-O-メチルRNA16 (配列番号43)、2-O-メチルRNA21 (配列番号6)、DNA20 + RNA1 (配列番号45)、DNA19 + RNA2 (配列番号46)、DNA18 + RNA3 (配列番号47)及びDNA17 + RNA4 (配列番号48)であった。Y軸:蛍光の倍増加(fold increase) (UvsX又はT4-gp32存在下における蛍光を、UvsX又はT4-gp32非存在下における蛍光で割った)、任意単位。
配列の説明
配列番号1は、DNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号2は、DNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号3は、RNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号4は、RNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号5は、2’-O-メチルRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号6は、2’-O-メチルRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号7は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号8は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号9は、LNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号10は、PNAプローブの配列である。
配列番号11は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号12は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号13は、2’-フルオロRNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号14は、混合されたDNA/2’-フルオロRNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号15は、DNA鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号16は、DNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号17は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号18は、LNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号19は、混合されたDNA/2’-フルオロRNAプローブ/プライマーの配列である。
配列番号20は、人工DNA標的核酸配列のヌクレオチド配列である。
配列番号21は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号22は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号23は、DNA鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号24は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号25は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号26は、C. difficile ATCC BAA 1382の標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号27は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号28は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号29は、DNA鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号30は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号31は、S. typhimurium ATCC 14028の標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号32は、2’-O-メチルRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号33は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号34は、配列番号1〜8のプローブに対しての相補的な標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号35〜43は、キメラDNA/RNAのヌクレオチド配列、DNA/2’-フルオロRNA及びDNA/2’-O-メチルRNAプローブを示す。
配列番号44は、配列番号9及び10のプローブに対しての相補的な標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号45〜48は、キメラDNA/RNAプローブのヌクレオチド配列を示す。
本発明の詳細な説明
記載された方法の異なる適用が、当分野における具体的な必要性に調整され得ると理解される必要がある。本明細書中に使用された専門用語は、本発明の特定の実施例を説明する目的のみのためのものであり、限定されることを意図するものではないと理解される必要もある。加えて、本明細書及び添付のクレームに使用されるように、内容が明確に否定しない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」は、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「オリゴヌクレオチド」への言及は、2以上のかかるオリゴヌクレオチド、及び同様のものを含む。本明細書中において引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記のものであろうと又は下記のものであろうと、その全体が参照することによって本明細書により組み込まれる。
標的核酸配列の検出方法
試料
核酸が試料から取得又は誘導(derived)され得るという条件で、いかなる試料も標的核酸配列の検出のために使用され得る。試料は、例えば、環境試料、参照試料(reference sample)又は臨床試料であり得る。本発明の方法が標的核酸配列の検出により疾患の診断のために使用される場合には、試料は、一般に臨床試料、例えば、疾患にかかっている疑いのある、又は疾患にかかっている患者から取得された試料である。適切なタイプの臨床試料は、被験体に存在する、又は被験体に存在する疑いのある疾患又は感染症(infection)の個別の種類に従って変わる。試料は、唾液、痰(sputum)、血液、血漿(plasma)、血清、尿又はふん便(stool)試料であり得る。試料は、細胞又は組織試料であり得る。好ましい実施態様では、試料は、哺乳類の被験体等の動物の被験体から採取される。試料は、一般にヒト被験体から採取されるだろうが、本発明は、また、通例、家畜(domestic animal)、家畜類(livestock)、鳥及び魚にも適用される。例えば、本発明は、獣医の環境(veterinary setting)又は農業環境において適用され得る。本発明が、クロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)又はネズミチフス菌(Salmonella typhimurium, S. typhimurium)による感染症の感染を検出する実施態様では、試料は好ましくはふん便試料であり得る。ふん便試料は、消化管感染症にかかっている被験体から採取され得る。感染症は、下痢(diarrhoea)にかかっている患者において存在し得る。
試料は、DNA又はRNAであり得る核酸を含む。核酸が本発明による検出を可能にする適切な形態の試料に存在する場合、試料は、直接使用され得る。しかしながら、通常、核酸は、試料から誘導され、取得され、又は抽出(extract)される。検出方法における使用のために、核酸を含む試料を加工する方法、核酸を抽出する方法及び/又は核酸を精製する方法は、当分野において周知である。全核酸が単離され得、あるいはDNA及びRNAが別々に単離され得る。
通常、核酸が、オリゴヌクレオチドプローブ及び1本鎖DNA結合タンパク質並びに所望により更なる核酸成分と接触させるために都合の良い形でもたらされるように、試料が、適切な方法で加工される。核酸がDNAである場合、DNAは、通常、二本鎖の形でもたらされる。核酸がRNAである場合、通常、逆転写酵素(reverse transcriptase)又は逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ(polymerase)を用いて、cDNAに変換(convert)される。標的配列の濃度(concentration)を効率的に増大させるリボソームが細菌細胞(bacterial cell)に非常に多数存在するため、RNAは、細菌検出(bacterial detection)のために有用であり得る。リボソームRNA (rRNA)に加えて、他の形のRNA、例えば、トランスファーRNA (tRNA)、メッセンジャーRNA (mRNA)、低分子干渉RNA(small interfering RNA, siRNA)、核内低分子リボ核酸(small nuclear ribonucleic acid, snRNA)、マイクロRNA(microRNA, miRNA)が、また、原核生物及び真核生物の検出のために有用であり得る。
標的核酸配列
いかなる起源のいかなる標的核酸配列も検出され得る。標的核酸配列は、ヒト、哺乳類、細菌性又はウイルス性であり得る。標的核酸配列は、遺伝子又は染色体の領域であり得る。好ましくは、標的核酸配列は、遺伝子型(genotype)又は検出すべき有機体(organism) (病原体等)に特異的である。標的核酸配列は、特定の種のゲノムに特有であり得る。それゆえに、特定の種の検出のための標的核酸配列は、通常、近縁種のいかなるホモログ(homologous)核酸配列とも異なるだろう。通常、標的核酸配列は、近縁種のホモログ核酸配列とのいくつかのミスマッチ(mismatch)を含むだろう。標的核酸配列は、細菌の特定の株(strain)又は特定の血清型(serotype)、ウイルスの分離株(isolate)もしくはクレード(clade)に特異的な配列であり得る。標的核酸配列は、C. difficileという毒素産生菌(toxigenic strain)又はS. typhimuriumという菌株に特異的であり得る。
検出すべき標的核酸配列は、いかなるサイズでもあり得、いかなる配列をも有し得る。標的核酸配列は、オリゴヌクレオチドプローブに相補的な領域を含む。通常、標的核酸配列は、プローブによる検出と並行して増幅され、それゆえ、プライマーに相補的な更なる領域を含む。標的核酸配列(すなわち、単位複製配列(amplicon))が、等温状態(isothermal condition)下で鎖侵入に基づく増幅によって増幅される場合、適切な方法において標的の遺伝子型もしくは有機体の特異的な検出及び上流及び下流プライマー並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション(hybridisation)をもたらすために十分な長さを通常、有する。好ましくは、等温状態下での鎖侵入に基づくDNA増幅のための単位複製配列は、上流プライマーの5’結合部位から下流プライマーの5’結合部位まで測定された場合、少なくとも長さ45ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さ50、少なくとも長さ55又は少なくとも長さ60ヌクレオチドである。
毒素産生C. difficileの検出のための適切な標的核酸配列の例は、配列番号26である。S. typhimuriumの検出のための適切な標的配列の例は、配列番号31である。
1を超える標的核酸配列が、異なる標的核酸配列にそれぞれ特異的な2以上のオリゴヌクレオチドプローブを準備することにより、本発明の方法において検出され得る。通常、異なる標的核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドプローブが、異なる蛍光色素分子/クエンチャーのペアで標識され、それゆえ多重化を可能にするだろう。少なくとも2、3、4、5、10又はより多くの異なる標的配列が検出され得る。同一の有機体からの1を超える標的核酸配列が検出され得る。あるいは、少なくとも2、3、4、5、10又はより多くの異なる遺伝子型、有機体又は病原体に特異的な標的核酸配列が検出され得る。
オリゴヌクレオチドプローブ
オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列、蛍光色素分子及びクエンチャーに相補的な領域を含む。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む。言い換えれば、オリゴヌクレオチドプローブに存在する少なくとも20%のヌクレオチドが、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、RNAヌクレオチド及び修飾RNAヌクレオチドの混合物等、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドの混合物を含み得る。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの配列は、DNAヌクレオチド及び少なくとも20%のRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド及び少なくとも20%の修飾RNAヌクレオチド、あるいはDNAヌクレオチド及び少なくとも20%のPNAヌクレオチドを含み得る。
より好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む。
オリゴヌクレオチドプローブが長さ12〜25又は15〜25ヌクレオチドである場合、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも5の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチド、より好ましくは少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを通常含む。最大長20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブ(長さ10〜20又は12〜20ヌクレオチド等)が、少なくとも4の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチド、より好ましくは少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、又は少なくとも10の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを通常含む。長さ20〜25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも12、少なくとも15、又は少なくとも18の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含み得る。長さ8〜12ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも3、少なくとも4、又は少なくとも6の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含み得る。相補的鋳型配列の非存在下において、1本鎖DNAに結合可能なタンパク質の存在下でのプローブからの蛍光シグナルを妨げるための十分な、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブの配列が含む。
特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、もっぱら(天然型リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであり得る)リボヌクレオチドで構成され、あるいはもっぱらPNAヌクレオチドで構成される。プローブのヌクレオチド配列は、もっぱら天然型リボヌクレオチドで構成され、もっぱら修飾リボヌクレオチドで構成され、あるいは天然型及び修飾リボヌクレオチドの混合物で構成され得る。オリゴヌクレオチドプローブは、RNAヌクレオチド及びPNAヌクレオチド、あるいは修飾RNAヌクレオチド及びPNAヌクレオチドの混合された骨格(backbone)を有し得る。好ましい修飾リボヌクレオチドとしては、2’-フルオロリボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、及びLNA (ロックド核酸(locked nucleic acid))ヌクレオチド、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。修飾RNAヌクレオチドについての上記含有率(percentage content)又は最小数(minimum number)のうちのいずれかが、プローブにおける2’-フルオロリボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、又はLNAヌクレオチドの割合に具体的に適用され得る。あるいは、プローブはもっぱら、2’-フルオロリボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、又はLNAヌクレオチドで構成され得る。他の適切な修飾リボヌクレオチドは、2′-O-メトキシ-エチル及び他の2′-置換(substitution)を含む。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブが少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含むという条件で、該オリゴヌクレオチドプローブがデオキシリボヌクレオチド(deoxyribonucleotide)を更に含み得、該デオキシリボヌクレオチドが天然型デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドプローブが長さ25ヌクレオチド以下である場合、該オリゴヌクレオチドプローブは、通常20未満、より好ましくは18未満、15未満、12未満、又は10未満のデオキシリボヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、1〜5、1〜8、1〜10、又は1〜15のデオキシリボヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドプローブがデオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドを含む場合、これらは、リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの配列の5’及び/又は3’末端に存在し得る。オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、その5’末端及び/又は3’末端において1、2、3、4又は5の、デオキシリボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含み得る。あるいは、デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドの配列中に散在(interspersed)し得る。
オリゴヌクレオチドプローブは、通常、長さ約8〜約25ヌクレオチドである。プローブは、通常、少なくとも長さ8ヌクレオチド又は長さ30ヌクレオチド未満、より好ましくは長さ25ヌクレオチド未満である。プローブは、長さ少なくとも10、少なくとも12、又は少なくとも15ヌクレオチドであり得る。プローブは、長さ約10〜約20、約12〜約25、約15〜約25、又は約12〜約22ヌクレオチドであり得る。後述されるように、プローブの長さは、使用された条件下での標的配列の領域との特異的又は選択的ハイブリダイゼーションの必要性に従って選択され、標的配列の増幅のために使用されたプライマーの長さに基づいて選択され得る。
配列が、全ての細胞内及び外来のDNA又はRNA等の複合生体混合物(complex biological mixture)等の試料中の核酸に存在する場合に、特異的又は選択的ハイブリダイゼーションは、所与の条件下での特定のヌクレオチド配列のみに対するオリゴヌクレオチド(例えば、プローブ又はプライマー)の結合のことをいう。適切なハイブリダイゼーション条件は、当分野において既知である。例えば、Sambrook, Fritsche and Maniatis “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)を参照、該文献は、その全体として参照により本明細書に組み込まれる。適切なハイブリダイゼーション条件は、また、以下の実施例において提供される。当業者に既知であるように、適切なハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さ及びその塩基組成に応じて変わり得る。ハイブリダイゼーションは、通常、増幅と同じ温度において行われ、それゆえ、増幅方法に応じて適用可能であるポリメラーゼ及びリコンビナーゼ等の、増幅のために使用される酵素の活性プロフィール(activity profile)にも依存する。
プローブのヌクレオチド配列は、標的核酸配列の領域に部分的に又は完全に相補的であり得る。長さ25ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドプローブは、通常、標的核酸配列の領域に相補的な、長さ少なくとも10、長さ少なくとも15又は長さ少なくとも20ヌクレオチドの領域を含むだろう。オリゴヌクレオチドプローブは、相補的な領域の5’側又は3’側の長さ1、2、3、4、5、8又は10ヌクレオチドの隣接領域を更に含み得、該隣接領域は、標的核酸配列に相補的でない。オリゴヌクレオチドプローブは、相補的配列に隣接する5’及び3’末端に、標的核酸配列に相補的でない合計1、2、3、4、又は5、8又は10ヌクレオチドを含み得る。かかる隣接領域は、自己相補的(self-complementary)であり得、このことが、ヘアピン構造をもたらし得る。
特に標的配列に特異的な上流及び下流プライマーを用いて標的核酸配列が増幅される場合には、標的核酸配列の特異的な検出をまだ可能にしつつ、ミスマッチがオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸配列との間に存在し得る。特異的な増幅と組み合わせたプローブの結合が、標的配列を特異的に検出するだろう。オリゴヌクレオチドプローブの相補的領域と、標的核酸配列の対応する領域との間に1、2、3、4又は5のミスマッチがあり得る。プローブ配列におけるいかなるミスマッチ(複数)も、好ましくは、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも8又は少なくとも10ヌクレオチド離れている。
しかしながら、好ましくは、プローブが標的核酸配列の領域に完全に相補的である。
オリゴヌクレオチドプローブは、二次構造の領域を有し得、該二次構造のコンフォメーション(conformation)が、標的核酸配列への結合状態で変更される。それゆえに、オリゴヌクレオチドプローブは、プローブの5’及び3’末端において自己-相補的領域によって形成されたヘアピンステム(hairpin stem)と、標的配列に相補的な領域を含むループ(loop)領域とを含み得る。かかる実施態様では、蛍光が標的核酸配列の非存在下ではクエンチングされるように、蛍光色素分子及びクエンチャーが、ステム領域において互いにごく接近してプローブの5’及び3’末端に通常位置する。オリゴヌクレオチドプローブは、分子指標(molecular beacon)プローブであり得る。他の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブが、いかなる二次構造の領域も有さず、又は分子指標プローブでない。
オリゴヌクレオチドプローブは、プローブ及びプライマー作用の両方を有し得る。それゆえに、オリゴヌクレオチドプローブは、その標的核酸配列の増幅にお出発物質となる(priming)ことが可能であり得る。プライマーとして作用するオリゴヌクレオチドプローブは、もっぱらRNA、修飾RNA又はPNAで構成され得る。別の方法としては、プライマーとして作用するオリゴヌクレオチドプローブは、1〜5、1〜8、1〜10、又は1〜15デオキシリボヌクレオチドを含み得る。プライマーとして作用するオリゴヌクレオチドプローブは、その3’末端において少なくとも1のデオキシリボヌクレオチド、より好ましくは、その3’末端において少なくとも2、又は少なくとも3デオキシリボヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドプローブは、その標的核酸配列のための上流又は下流プライマーであり得る。プライマー作用を有するオリゴヌクレオチドプローブは、結合していない(free)3’末端を有し、プローブ配列の内部位置において蛍光色素分子及びクエンチャーのうちの一方又は両方を含むだろう。プライマー作用を有するオリゴヌクレオチドプローブは、5’末端において蛍光色素分子、及び内部位置においてクエンチャー、あるいは、3’末端においてクエンチャー及び内部位置において蛍光色素分子を有し得る。プライマーとしての本発明のオリゴヌクレオチドプローブの使用は、より詳細に後述されるとおりである。
オリゴヌクレオチドプローブは、いかなる蛍光色素分子及びいかなるクエンチャーでも標識され得る。蛍光色素分子及びクエンチャーは、クエンチャーの吸収スペクトル(absorption spectrum)が、蛍光色素分子の発光スペクトルに重なるように選択されるだろう。標的鋳型とのハイブリダイゼーション状態では、蛍光色素分子がクエンチング効果の減少に起因するシグナルの増大を引き起こすように、蛍光色素分子及びクエンチャーが、更に選択され、プローブに配置されるだろう。
クエンチャーは、非蛍光性であり得、例えば非蛍光性の発色団(chromophore)であり得る。クエンチャーは、ダーククエンチャー(dark quencher)であり得る。別の方法として、蛍光色素分子又はクエンチャーの蛍光を特異的に測定する場合に、いずれかのシグナルの変化が標的鋳型へのハイブリダイゼーションについて伝達し得るように、クエンチャーが、蛍光色素分子と異なる発光スペクトルで蛍光を発し得る。特にプローブのポリメラーゼ依存性伸長が望ましくない実施態様では、蛍光色素分子及びクエンチャーが、好ましくはプローブの5’及び3’末端に配置される。蛍光色素分子は、プローブの5’末端に配置され、クエンチャーは、3’末端に配置され得る。別の方法として、クエンチャーが、プローブの5’末端に位置し、及び蛍光色素分子が3’末端に位置し得る。蛍光色素分子及び/又はクエンチャーは、プローブの5’又は3’末端から10ヌクレオチド以下離れている等、プローブ内の内部位置にも配置され得る。例えば、長さ25ヌクレオチド未満のプローブでは、蛍光色素分子又はクエンチャーは、プローブの5’又は3’末端から1〜3、1〜5、1〜8又は1〜10ヌクレオチド離れて位置し得る。好ましくは、蛍光色素分子及びクエンチャーのうちの1のみが内部位置にあり、そのペアの他方の要素が5’又は3’末端にある。
蛍光色素分子及びクエンチャーは、通常、プローブ長に応じて、プローブ配列において少なくとも8のヌクレオチド離れて、より好ましくは少なくとも10、又は少なくとも12のヌクレオチド離れて位置している。プローブが長さ15〜25ヌクレオチドである場合、蛍光色素分子及びクエンチャーは、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15又は少なくとも20ヌクレオチド離れてい得る。蛍光色素分子及びクエンチャーは、5’及び3’末端に位置し得、それゆえプローブにおいて可能な最大距離、離れて位置し得る。プローブを、(オープン構造(open conformation)又は線形構造(linear conformation)の)標的核酸配列にハイブリダイゼーションさせる場合には、クエンチャーによる蛍光色素分子のクエンチングが減少し、標的核酸配列の存在を検出可能なシグナルを引き起こすように、蛍光色素分子とクエンチャーとの距離が選択されるだろう。蛍光色素分子及びクエンチャーの間の適切な距離は、実験的に最適化され得る。
蛍光色素分子は、いかなる蛍光成分(fluorescent moiety)でもあり得、通常は蛍光性有機色素である。クエンチャーは、蛍光色素分子の蛍光をクエンチングするいかなる成分でもあり得、通常、有機色素等の発色性分子(chromogenic molecule)である。当業者は、その通常の技術常識に基づいてオリゴヌクレオチドプローブのための適切な蛍光色素分子-クエンチャーのペアを選択することが可能である。適切な組み合わせは、例えば、以下の参考文献: Marras SE: Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes. Edited by Didenko V, vol. 335: Humana Press; 2006: 3-16, 及びDidenko VV: DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques 2001, 31(5):1106-1116, 1118, 1120-1101において考察される。
適切な蛍光色素分子としては、限定されるものでないが、フルオレセイン(fluorescein)及び、カルボキシフルオレセイン(6-FAM、 5-FAM、 dT FAM等のFAM)、VIC、ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(HEX)等のフルオレセイン誘導体、並びにJOE、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)、クマリン並びに3-フェニル-7-イソシアナートクマリン等のクマリン誘導体、ルシファーイエロー(Lucifer yellow)、NED、テキサスレッド(Texas red)、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、5カルボキシローダミン、N-(p-2-ベンゾオキサゾリル)フェニル)マレイミド、CY5等のシアニン色素、ローダミン色素、キサンテン色素、ナフチルアミン(naphthlyamine)、アクリジン、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、及びピレンが挙げられる。適切なクエンチャーとしては、限定されるものではないが、DABSYL、4'-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-マレイミド(DABMI)、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、ブラックホールクエンチャー1(Black Hole Quencher 1)、ブラックホールクエンチャー2、ダーククエンチャー1、ダーククエンチャー2、アイオワブラックRQ(Iowa Black RQ)、アイオワブラックFQが挙げられる。
好ましい蛍光色素分子/クエンチャーの組み合わせとしては:
- TAMRA及びブラックホールクエンチャー2;
- ROX及びブラックホールクエンチャー2;
- ROX及びDABCYL;
- FAM(dT-FAM等)及びアイオワブラックFQ;
- FAM (dT-FAM等)及びDABCYL;
- ROX及びアイオワブラックFQ;
- CY5及びアイオワブラックRQ
が挙げられる。
蛍光色素分子及びクエンチャーは、通常、プローブに共有結合的に接続される。蛍光色素分子及びクエンチャーが、任意の適切なリンカーにより、プローブの配列に存在する1以上のヌクレオチドへ接続され得る。当業者は、その通常の技術常識に基づいて任意の適切なリンカーを選択することができる。適切なリンカーは、例えば、Agrawal S (ed.): Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties: Humana Press; 1993において考察される。
本明細書中で提供される特定のオリゴヌクレオチドプローブは、毒素産生 C .difficile及びS. typhimuriumにおける核酸標的配列に相補的である。かかるプローブの好ましい例は、毒素産生C. difficileのための配列番号24及び25並びに S. typhimuriumのための配列番号30である。本発明は、また、配列番号3〜10、17〜19、32、35〜43及び48のプローブ及びプローブ-プライマーを提供する。
配列番号3〜10、17〜19、24、25、30、32、35〜43及び48のバリアント(Variant)は、本発明の一部としても提供される。3〜10、17〜19、24、25、30、32、35〜43及び48のバリアントとしては、元のプローブのヌクレオチド配列に対し、対応するヌクレオチド配列を有するが、別の蛍光色素分子及び/又はクエンチャーを含むプローブが挙げられる。上記バリアントは、本明細書中に記載された蛍光色素分子及びクエンチャーからのいかなる適切な蛍光色素分子-クエンチャーのペアも含み得る。
配列番号3〜10、17〜19、24、25、30、32、35〜43及び48のバリアントは、天然型のリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド又はPNAヌクレオチドのうちの異なるパターンで構成される元のプローブの配列に対応するヌクレオチド配列も有し得る。例えば、配列番号24、25及び30の元のプローブは、2’-フルオロリボヌクレオチドで構成される。それらのバリアントのヌクレオチド配列は、天然型リボヌクレオチドを含み得、又はもっぱら天然型リボヌクレオチドで構成され得る。それらの追加的なバリアントは、2’-フルオロリボヌクレオチドの代わりに別の修飾リボヌクレオチドを含み得、又は天然型及び修飾リボヌクレオチドの混合物を含み得る。好ましい別の修飾リボヌクレオチドとしては、2’-O-メチルリボヌクレオチド、及びLNA (ロックド核酸)ヌクレオチドが挙げられる。従って、例えば、配列番号24、25及び30のバリアントは、2’-フルオロリボヌクレオチド及び1〜8、1〜5もしくは1〜3の天然型リボヌクレオチド、あるいは2’-フルオロリボヌクレオチド及び1〜8、1〜5もしくは1〜3の2’-O-メチルリボヌクレオチドで構成され得る。配列番号24、25及び30のバリアントは、少なくとも20%の対応するLNAもしくはPNAヌクレオチドを含み得、またはもっぱら対応するLNA及びPNAヌクレオチドで構成され得る。
バリアントプローブは、また、配列番号3〜10、17〜19、24、25、30、32及び35〜43の配列において対応するリボヌクレオチド又はPNAヌクレオチドの代わりに、1〜10、1〜5又は1〜3の、デオキシリボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドを含むキメラプローブであり得る。本発明は、また、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む配列番号16のDNAプローブのバリアントを提供する。
配列番号3〜10、17〜19、24、25、30、32、35〜43及び48のバリアントは、また、対応する元のプローブ配列の少なくとも8の連続的なヌクレオチドに部分的又は完全に相補的な領域を含む長さ25ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり得る。好ましくは、かかるバリアントは、対応する元のプローブ配列の少なくとも9、少なくとも10、少なくとも12又は少なくとも14の連続的なヌクレオチドに部分的又は完全に相補的な領域を含むだろう。上記バリアントは、元のプローブ配列の対応する領域(それゆえに標的配列)に対して1、2、3、4又は5ミスマッチ(置換(substitution))を有する領域を含み得、それゆえにそれに部分的に相補的である。従って、例えば、バリアントは、元のプローブ配列の少なくとも12ヌクレオチドの対応する領域に対して1、2、又は3のミスマッチを有する少なくとも長さ12ヌクレオチドの領域を含み得る。いかなるミスマッチも、好ましくは少なくとも4、少なくとも5、又は少なくとも8ヌクレオチド離れている。
配列番号3〜10、17〜19、24、25、30及び32のバリアントは、また、対応する元のプローブ配列の配列に対する少なくとも70%の配列同一性(sequence identity)、好ましくは少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有する長さ25ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドであり得る。
上記バリアントプローブは、元のプローブに部分的に又は完全に相補的な領域に対し、5’及び/又は3’の隣接領域を含み得る。5’及び/又は3’の隣接領域は、標的核酸配列に非相補的な配列、あるいは標的ヌクレオチド配列において元のプローブの結合領域に隣接する領域に相補的な配列を含み得る。例えば、配列番号24、25及び30のバリアントでは、5’隣接領域が、長さ1〜10、又は1〜5ヌクレオチドの配列を含み得、該配列が、配列番号26又は配列番号31の関連する標的核酸配列におけるプローブの結合領域の5’側にある1〜10又は1〜5のヌクレオチドに対して相補的である。
シグナルの検出
プローブからのシグナルの検出は、蛍光検出用の任意の適切な手段によって行われ得る。プローブは、いかなる事前のDNA増幅を行うことなく、標的核酸配列を検出するために使用され得る。より典型的には、プローブは、標的核酸配列の増幅後又は増幅中、標的核酸配列を検出するために使用される。好ましくは、プローブからのシグナルは、標的核酸配列の増幅と並行してリアルタイムに測定される。
単一の標的配列のための1のプローブの単一のシグナルが検出され得る。別の方法として、異なる標的配列を検出するプローブであって、異なる蛍光波長でそれぞれシグナルして多重検出をもたらすプローブが使用され得る。3、4、5、6、8、10又はより多い等の2以上の異なるプローブが、単一の反応においていくつかの異なる標的配列の多重検出のために使用され得る。
サイバーグリーン及びチアゾールオレンジ(thiazole orange)等の、増幅されたDNAにインターカレート(intercalate)する色素も、オリゴヌクレオチドプローブ(複数可)と並行して使用されてDNAの増幅を検出し得る。
同一又は別の標的配列のためのDNAオリゴヌクレオチドプローブも、オリゴヌクレオチドプローブ(複数可)と並行して使用され得る。
本発明は、また、プローブからのシグナルを増進するための手段を提供する。標的核酸配列の検出が行われる予定の試料を、RNase H2等のRNase H 酵素と接触させ得る。好ましいRNase H2酵素は、Thermococcus gammatolerans RNase H2である。本発明者らによって示されるように、RNase H酵素は、プローブからのシグナルを増進することができる。RNase H酵素は、標的核酸配列へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション状態で形成された二本鎖を切断して、これによりクエンチングの減少をもたらすと考えられている。
より一般的には、試料を、オリゴヌクレオチドプローブ/標的核酸配列の二本鎖を特異的に分解することができるいかなるヌクレアーゼとも接触させ得る。
標的核酸配列の増幅
本発明の方法が標的核酸配列の増幅を含む場合、DNA増幅のいかなる適切な方法も使用され得る。通常、DNA増幅は、等温状態下で実行され得る。DNA増幅方法は、鎖侵入に基づく増幅、ローリングサークル増幅(rolling-circle amplification, RCA)、鎖置換増幅(strand displacement amplification, SDA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(recombinase polymerase amplification, RPA)を含み得る。鎖侵入に基づく増幅(SIBA)が好ましい。上記増幅方法は、通常、1本鎖DNAを結合可能なタンパク質が存在することを必要とし、ひいては本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、かかる方法において増幅の検出を好都合に可能にする。
本発明は、それゆえに、かかる標的核酸配列の増幅を促進する条件下で本発明のオリゴヌクレオチドプローブとかかる試料を接触させることを含む、1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質の存在下において試料中の標的核酸配列の増幅を検出するための方法を提供する。
かかる条件は、典型的には、1以上のプライマー及びDNAポリメラーゼ酵素が存在することを含む。当業者は、使用される予定のDNAポリメラーゼのタイプに応じて、特定の標的配列のための適切なプライマーを選択することができるだろう。DNAポリメラーゼ酵素が、RCA酵素 (phi29等)である場合、ランダムプライマー又は標的核酸配列を増幅する1種類のプライマーが使用され得る。より典型的には、増幅条件は、標的核酸配列のための上流プライマー及び下流プライマーが存在することを含むだろう。
上述のように、オリゴヌクレオチドプローブは、プライマー作用を提供し得、それゆえ増幅条件は、下流プライマー及び別個の上流プライマーとして作用する(かつ所望により他の下流プライマー(複数可)として作用しない)オリゴヌクレオチドプローブが存在することを含み得、あるいは、上流プライマー及び別個の下流 プライマーとして作用する(かつ所望により他の上流プライマー(複数可)として作用しない)オリゴヌクレオチドプローブが存在することを含み得る。
SIBAが使用される場合、条件は、通常、鎖侵入オリゴヌクレオチドが存在することを更に含む。SIBA増幅のための好ましいプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドの主要点が、より詳しく後述される。
標的核酸配列の増幅のための適切な条件は、当分野において知られるポリメラーゼ酵素活性をもたらすために使用されるいかなる条件も更に含む。条件は、通常、全4のdNTP、dATP、dTTP、dCTP及びdGTP又はその類似体、適切な緩衝剤/pH (buffering agents/pH)及び酵素の性能あるいは安定性のために必要な他の因子が存在することを含む。条件は、界面活性剤(detergent)及び安定剤(stabilising agent)が存在することを含み得る。使用される温度は、通常、等温、すなわち、増幅過程の間ずっと一定である。使用される温度は、通常、ポリメラーゼ酵素及び他の酵素成分の性質によって決まり、プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドに必要なハイブリダイゼーション温度も反映する。
使用されるポリメラーゼは、通常、鎖置換活性を有する。用語「鎖置換(strand displacement)」は、所望によりアクセサリータンパク質とともに、DNA合成中に二本鎖DNAの領域に遭遇(encounter)した時に相補鎖を置き換える(displace)DNAポリメラーゼの能力を記述するために、本明細書中において使用される。適切なDNAポリメラーゼとしては、E. coli、B. subtilis、又はB. stearothermophilusのpolI、及びその機能的断片もしくはそのバリアント、並びにT4及びT7 DNAポリメラーゼ及びその機能的断片もしくはそのバリアントが挙げられる。好ましいポリメラーゼは、Bsu DNAポリメラーゼ又はその機能的断片もしくはそのバリアントである。
増幅条件は、1本鎖DNAを結合可能なタンパク質が存在することを含む。1本鎖DNAを結合可能なタンパク質は、相補的鋳型の非存在下で蛍光色素分子及びクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブからの蛍光シグナルを変化させ、かつ、1本鎖DNAに結合することができるいかなるタンパク質でもあり得る。タンパク質は、1本鎖結合タンパク質(SSB)あるいは、1本鎖DNAを結合可能であり、かつ、別の機能活性も有するいかなるタンパク質でもあり得る。1本鎖DNAを結合可能なタンパク質は、リコンビナーゼ又はリコンビナーゼアクセサリータンパク質もしくはコファクター(cofactor)であり得る。1本鎖タンパク質(single-stranded protein)を結合可能なタンパク質は、中等温度好性(mesophilic)又は好熱性(thermophilic)であり得る。
増幅条件は、好ましくはリコンビナーゼが存在することを含む。いかなるリコンビナーゼ系も本発明の方法において使用され得る。リコンビナーゼ系は、原核生物又は真核生物起源であり得、細菌、酵母、ファージ、又は哺乳類のものであり得る。リコンビナーゼは、5’〜3’又は3’〜5(;)方向において一本鎖オリゴヌクレオチドへ重合させ得る。リコンビナーゼは、T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、アシネトバクターファージ(Acinetobacter phage)133、アエロモナスファージ(Aeromonas phage)65、シアノファージ(cyanophage)P-SSM2、シアノファージPSSM4、シアノファージS-PM2、Rbl4、Rb32、アエロモナスファージ25、ビブリオファージ(Vibrio phage) nt-1、phi-1、Rbl6、Rb43、ファージ31、ファージ44RR2.8t、Rb49、ファージRb3、又はファージLZ2等のミオウイルス科ファージ(myoviridae phage)に由来し得る。好ましい実施態様では、T4リコンビナーゼUvsX (受入番号: P04529)又はその機能的バリアントもしくは断片が使用される。真核生物のRad系又はE. coliのrecA-Reco系又は他の原核細胞系も使用され得る。リコンビナーゼは、E. coliのRecAであり得る。
条件は、1本鎖結合タンパク質(例えば、T4 gp32、受入番号P03695)及びリコンビナーゼ負荷剤(recombinase loading agent)(例えばUvsY、受入番号NP_049799.2)等のリコンビナーゼアクセサリータンパク質が存在することを更に含み得る。好ましい実施態様では、条件は、T4 gp32、UvsX及びUvsYタンパク質が存在することを含む。リコンビナーゼ(UvsX等)、及び使用した場合にはリコンビナーゼ負荷剤(UvsY等)及び1本鎖DNA結合タンパク質(gp32等)は、それぞれ、同一又は異なるミオウイルス科ファージ起源からの天然タンパク質、ハイブリッドタンパク質又は変異タンパク質であり得る。天然タンパク質は、タンパク質の野生型又は自然変異体(natural variant)であり得る。
1本鎖DNAを結合可能なタンパク質は、別の方法として、DNA増幅方法において1本鎖結合活性をもたらすために使用されるいかなるタンパク質であってもよい。増幅方法は、PCRであり得る。1本鎖DNAを結合可能なタンパク質は、ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs)から入手可能な超耐熱性1本鎖DNA結合タンパク質(ET-SSB)であり得る。
条件は、例えばプロリン、DMSO、又はDNAへのリコンビナーゼの負荷(loading)を増進することが知られている密集剤(crowding agent)等の、DNA相互作用を調節するために使用される化合物等、リコンビナーゼの効率性を増進するために使用される他の因子を更に含み得る(Lavery P. et al. J. Biol. Chem. 1992, 267, (13), 9307-9314)。
条件は、また、ATP再生系が存在することを含み得る。様々なATP 再生系が当業者に知られており、糖分解酵素(glycolytic enzyme)を含む。ATP再生系の適切な構成要素としては、クレアチンリン酸(phosphocreatine)、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、ピロホスファターゼ、スクロース及びスクロースホスホリラーゼのうちの1以上を挙げることができる。条件は、ATPが存在することを更に含み得る。
マグネシウムイオン、DTT又は他の還元剤、塩、BSA/PEGあるいは他の密集剤等の追加的な構成要素も含まれ得る。
上述された様々な構成要素が、異なる濃度において提供されてDNA増幅をもたらし得る。当業者が、実際には、様々な構成要素の適切な作用濃度(working concentrations)を選択し得る。オリゴヌクレオチドプローブが上流又は下流プライマーの配列と重複する場合、プライマー及びプローブの結合間においてみられるいかなる競合も、より低濃度のプローブ、又は、リバースプライマーより3′末端からの長さが短いプローブ等の重複領域を減少させたプローブ、のいずれかを用いることによって最小化し得る。
鎖侵入に基づく増幅(SIBA)
標的核酸配列の増幅のための好ましい方法、SIBAの主要点は、後述される。本発明は、1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質の存在下において試料中の標的核酸配列の増幅を検出するための方法を提供し、該方法は、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、前記試料を、本発明の少なくとも1のオリゴヌクレオチドプローブ、少なくとも1の上流プライマー、少なくとも1の下流プライマー、及び少なくとも1の鎖侵入オリゴヌクレオチドと接触させることを含む。上述のように、オリゴヌクレオチドプローブは、それ自体が上流プライマー又は下流プライマーとして作用し得、又は別の方法としては別個の上流及び下流プライマーが、オリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて提供される。それぞれの、前記プライマー、前記プローブ及び前記鎖侵入オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸配列に相補的な領域を含む。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖にして、それぞれの、前記プライマー及び前記プローブの結合を可能にする。
SIBAのためのプライマー
適切な上流及び下流プライマーは、目的の標的核酸配列に基づいて、かつ、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖にして上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にする鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位を考慮して、選択される。上流及び下流プライマーは、標的に対し部分的又は完全に相補的な配列及び所望により5’及び/又は3’の隣接非相補的配列を含む。別の方法として、上流及び下流プライマーは、標的に対して部分的又は完全に相補的な配列で完全に構成され得る。標的に対して相補的なプライマー配列の長さは、標的核酸配列への特異的なハイブリダイゼーションをもたらすのに十分である。相補的な配列の長さは、通常少なくとも10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15、少なくとも16、 又は少なくとも17ヌクレオチドである。相補的な配列の長さは、10〜25、15〜25、10〜30又は15〜30ヌクレオチドであり得る。
上述の配列長は、標的核酸配列に部分的又は完全に相補的であり得るプライマーの一部に言及するものであると理解される必要がある。増幅を成し遂げるための上流及び下流プライマー並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドの組み合わせられた使用に特に留意して、標的配列の特異的な増幅及び検出をまだ可能にしつつ、ミスマッチが、特定位置においてプライマーと標的配列との間に存在し得る。プライマーの相補的な領域及び標的配列の対応する領域の間には、1、2、3、4又は5のミスマッチがあり得る。
通常、上流及び下流プライマーは、全体で長さ30ヌクレオチド未満、より好ましくは長さ15〜25、又は15〜23ヌクレオチド等の長さ25ヌクレオチド未満であるだろう。リコンビナーゼが鎖侵入のために使用される場合、長さ30ヌクレオチド未満のプライマーを使用することが特に好ましい。かかるプライマーは、リコンビナーゼのための基質(substrate)として作用することはできない。
上流(又はフォワード)プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチドの5’結合部位の近位位置又は該5’結合部位と重複する位置において2本鎖標的核酸配列のうちの1本鎖の5’領域に結合する。下流(又はリバース)プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチドの3’結合部位の近位位置又は該3’結合部位と重複する位置において2本鎖標的核酸配列のうちの上流プライマーと反対側の鎖の5’領域に結合する。上流及び下流プライマーの5’結合部位は、2本鎖標的配列において通常少なくとも45ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50、少なくとも55又は少なくとも60ヌクレオチド離れている。
上流及び/又は下流プライマーは、鎖侵入オリゴヌクレオチドの配列との配列の重複領域を有し得る。配列の重複領域は、通常長さ1〜8ヌクレオチドであり、長さ少なくとも5又は少なくとも6ヌクレオチドであり得る。下流プライマーは、また、鎖侵入オリゴヌクレオチドの配列との長さ1〜8ヌクレオチドの配列の重複領域を有し得る。別の方法として、代わりに標的配列における、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位に近位の位置にプライマーが結合し、上流及び/又は下流プライマー並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドの間には、配列の重複はなくてもよい。
プライマーが、鎖侵入オリゴヌクレオチドの近位で結合する場合、鎖侵入オリゴヌクレオチドの関連する結合部位及びプライマーの5’末端の間は、通常、25ヌクレオチド以下、より好ましくは20ヌクレオチド以下、15ヌクレオチド以下、又は10ヌクレオチド以下である。このことは、プライマーが、鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合によって生み出された1本鎖領域に確実にハイブリダイゼーションできるようにする。
好ましくは、各プライマーが、特定の遺伝子型等の特定の標的核酸配列、あるいは特定の有機体又は特定の病原体等の特定の標的に存在する核酸配列の特異的な検出を可能にするように設計される。それゆえに、各プライマーは、通常、標的のみに見出される相補的配列に特異的又は選択的にハイブリダイゼーションする。しかしながら、各プライマーは、第2のプライマー、鎖侵入オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて使用された場合に、標的核酸配列の特異的検出が得られるという条件で、他の種において見出された配列等の他の配列ともハイブリダイゼーションさせられ得る。
毒素産生C. difficile及びS. typhimuriumにおける標的ヌクレオチド配列の増幅のための適切な上流及び下流プライマーの具体的な例が、本明細書中において提供される。本発明は、毒素産生C. difficileの標的核酸配列(配列番号26等)の増幅のための配列番号21及び22又はそのバリアントのプライマーと、S. typhimuriumの標的核酸配列(配列番号31等)の増幅のための配列番号27及び28又はそのバリアントのプライマーとを提供する。
配列番号21、22、27及び28のバリアントは、配列番号21、22、27及び28の対応する元のプライマー配列の少なくとも10の連続するヌクレオチドに部分的に又は完全に相補的な領域を含む最大長30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり得る。好ましくは、かかるバリアントは、配列番号21、22、27及び28の対応する元のプライマー配列の少なくとも11、12、13、14又は15の連続するヌクレオチドに部分的又は完全に相補的な領域を含むだろう。元のプライマー配列は、最大長21ヌクレオチド(例えば、配列番号21)等、長さ16ヌクレオチドより長く、バリアントは、それに応じて、その16、17、18、19又は20の連続するヌクレオチドに部分的又は完全に相補的な領域を含み得る。
上記バリアントは、元のプライマー配列(ひいては標的配列)の対応する領域に関して1、2、3、4、又は5のミスマッチ(置換)を有し、かつ、それゆえにそれに部分的に相補的である領域を含み得る。従って、例えば、バリアントは、少なくとも長さ10ヌクレオチドの領域を含み得、該領域は、対応する元のプライマー配列の少なくとも10の連続するヌクレオチドの対応する領域に対し、1又は2のミスマッチ等の1、2、又は3のミスマッチを有する。バリアントは、少なくとも長さ13、14又は15ヌクレオチドの領域を含み得、該領域は、対応する元のプライマー配列における同等の長さの対応する領域に対し、1〜3のミスマッチ等、1、2、3、4又は5のミスマッチを有する。バリアントプライマー配列におけるいかなるミスマッチも、少なくとも2、少なくとも4、少なくとも5、又は少なくとも10ヌクレオチド離れてい得る。
別の方法として、バリアントは、長さ少なくとも10、11、12、13、14又は15ヌクレオチドの領域を含み得、該領域は、元のプライマー配列と完全に相補的である。
配列番号21、22、27及び28のバリアントは、また、最大長30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり得、該オリゴヌクレオチドは、対応する元のプライマー配列に対して少なくとも70%の配列の同一性を有し、好ましくは少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列の同一性を有する。
加えて、バリアントプライマーは、元のプライマー配列に部分的又は完全に相補的な領域に対し、5’及び/又は3’の隣接ヌクレオチド配列(複数可)を含み得る。5’及び/又は3’の隣接配列(複数可)は、標的核酸配列に非相補的であり得、あるいは標的核酸配列において元のプライマーの結合領域の5’及び/又は3’側の5〜10ヌクレオチド等の、標的核酸配列における元のプライマーの結合領域に隣接する領域に対し、配列が相補的であり得る。
SIBAのための鎖侵入オリゴヌクレオチド
目的の標的核酸配列に基づいて、かつ、上流及び下流プライマーの結合部位と、関連性のある領域において標的核酸配列を1本鎖の状態にして上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にする鎖侵入オリゴヌクレオチドの必要性とを考慮して、適切な鎖侵入オリゴヌクレオチドが選択される。
鎖侵入オリゴヌクレオチドは、標的及び所望により追加的な隣接非-相補的配列(複数可)に相補的な配列を含む。標的に相補的な配列の長さは、当業者によって実験的に決定され得、所望により等温状態下で、標的核酸配列の効率的な鎖侵入をもたらすのに十分である。相補的配列は、RNA-DNAの相補的塩基対合及び修飾ヌクレオチドを含み得る。通常、相補的配列の長さは、少なくとも25又は少なくとも27ヌクレオチドであり、通常、最小32、少なくとも33又は少なくとも35ヌクレオチド等の少なくとも30ヌクレオチドであり、より好ましくは長さ少なくとも36、37、38、39又は40ヌクレオチド又はより長い。相補的配列長は、長さ30〜50、32〜50、35〜50、40〜50、35〜48、35〜46、38〜45又は40〜45ヌクレオチドであり得る。
上記配列長は、標的核酸配列に対し部分的又は完全に相補的であり得る鎖侵入オリゴヌクレオチドの一部に言及するものであるということを理解する必要がある。増幅を達成するための上流及び下流プライマー並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドの組み合わせられた使用を特に考慮して、ミスマッチが、標的配列の特異的な増幅及び検出をまだ可能にしつつ、鎖侵入オリゴヌクレオチド及び標的配列の間において特定位置に存在し得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドの相補的領域及び標的配列の対応する領域の間には、相補的配列の全長に応じて、1、2、3、4、5、6、7、又は8のミスマッチがあり得る。
鎖侵入オリゴヌクレオチドの相補的配列は、上流及び下流プライマーのための結合領域の間にある(かつ通常それらのうちの1以上と重複する)標的配列の一部にハイブリダイゼーションする。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、上流及び/又は下流プライマーとの、長さ少なくとも5又は少なくとも6ヌクレオチドの領域等の、1〜8ヌクレオチドの重複領域を有し得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドの相補的配列の5’部分は、通常、融解(melt)すべき2本鎖標的ヌクレオチド配列(単位複製配列)の5’境界から25ヌクレオチド以下、より好ましくは20ヌクレオチド以下の範囲内において結合する。
鎖侵入オリゴヌクレオチドは、所望により、相補的配列領域に隣接する標的に対する非相補的配列領域(複数可)を更に含む。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、いかなるヌクレオチド配列でもあり得る非相補的5’領域を含み得る。5’非相補的領域は、典型的には長さ少なくとも3ヌクレオチド、より典型的には長さ少なくとも6、少なくとも8、好ましくは少なくとも10、少なくとも12又は少なくとも14ヌクレオチドである。5’非相補的領域は、リコンビナーゼの結合を補助し得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、通常、長さ1〜3ヌクレオチドの3’非相補的領域を含み得、該領域は、invdT等の、ポリメラーゼ伸長(polymerase extension)を妨害するヌクレオチドを含む。
リコンビナーゼが、鎖侵入オリゴヌクレオチドとともに使用される場合、該オリゴヌクレオチドは、通常少なくとも長さ30ヌクレオチドである。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、好ましくは長さ少なくとも35、少なくとも40又は少なくとも45ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50であり、長さ少なくとも55ヌクレオチド以上でもあり得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、長さ40〜70、45〜70、45〜70、50〜70、55〜70、45〜65、50〜65、50〜60又は55〜65ヌクレオチドであり得る。
通常、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、DNA増幅のための基質としての役割を果たすことができないといった伸長不可能な3’末端を有し、標的配列は、その結果、特異的な上流及び下流プライマーを更に結合した状態においてのみ増幅される。このことは、非特異的増幅産物の形成を防ぐ。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、3’末端から10〜15又は10〜20ヌクレオチドにおいてといった、その3’領域において、1、2、3、4、5、6、7、8又はそれ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、3’末端ヌクレオチドの3’修飾を含み得、ジデオキシヌクレオチドであり、又は3’アミノ-アリル基、3’炭素スペーサー(carbon spacer)、3’ホスフェート(phosphate)、3’ビオチン、3’シアリル、又は3’チオールを含み得る。3’ヌクレオチドは、3’-3’結合(linkage)によって逆方向に組み込まれた(incorpolated)ヌクレオチドであり得る。代替的に又は追加的に、鎖侵入オリゴヌクレオチドの3’領域は、PNA (ペプチド核酸)ヌクレオチド、LNA (ロックド核酸)、2’-5’結合DNAもしくは2’-O-メチルRNA、又はその組み合わせ等の、DNAポリメラーゼのための基質能力(substrate capability)が不十分なヌクレオチドを含み得る。
鎖侵入オリゴヌクレオチドが完全にPNAからなるPNAオリゴマー(oligomer)である場合、かかるオリゴヌクレオチドは、リコンビナーゼ酵素の非存在下で二本鎖DNAを不安定化して侵入し得る。従って、PNAオリゴヌクレオチドが使用される場合、リコンビナーゼ酵素の存在なしで本発明の方法が行われ得る。
毒素産生C. difficile及びS. typhimuriumにおける標的ヌクレオチド配列のための適切な鎖侵入オリゴヌクレオチドの具体的な例が、本明細書中において提供される。本発明は、毒素産生C. difficileの標的核酸配列(配列番号26等)の増幅のための配列番号23の鎖侵入オリゴヌクレオチド又はその修飾された誘導体(derivative)もしくはそのバリアントと、S. typhimuriumの標的核酸配列(配列番号31等)の増幅のための配列番号29の鎖侵入オリゴヌクレオチド又はその修飾された誘導体もしくはそのバリアントとを提供する。
上述のように、本発明に使用された鎖侵入オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ基質(polymerase substrate)としてのその使用を妨害するために、その3’領域に1以上の修飾されたオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。従って、配列番号23又は29の修飾された誘導体は、その3’領域において、通常3’末端から10〜15又は10〜20ヌクレオチドにおいて、1、2、3、4、5、6、7、8又はより多い修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾は、上述のもののいずれかから選択され得る。修飾された誘導体は、配列番号23又は29に対応する配列のPNAオリゴマーであり得る。
配列番号23及び29のバリアントは、通常、長さ30ヌクレオチドより多い、より好ましくは少なくとも35、少なくとも40、又は少なくとも45ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、配列番号23又は29に存在する対応する元の標的の相補的配列の少なくとも30の連続するヌクレオチドに対して、部分的又は完全に相補的な領域を含む。好ましくは、かかるバリアントは、配列番号23又は29に存在する標的の相補的配列の少なくとも32、35、37、40、42又は45の連続するヌクレオチドに部分的又は完全に相補的な領域を含むだろう。
上記バリアントは、配列番号23又は29 (ひいては標的配列)の元の鎖侵入オリゴヌクレオチドの対応する標的の相補的領域に関して、1、2、3、4、5、6、7又は8のミスマッチ(置換)を有し、かつ、それゆえにそれに対して部分的に相補的な領域を含み得る。従って、例えば、バリアントは、長さ少なくとも30ヌクレオチドの領域を含み得、該領域は、対応する元の鎖侵入オリゴヌクレオチドの少なくとも40の連続するヌクレオチドの対応する領域に対して、1〜4又は1〜3等の1、2、3、又は4のミスマッチを有する。バリアントは、長さ少なくとも35、40、42、又は45ヌクレオチドの領域を含み得、該領域は、対応する元の鎖侵入オリゴヌクレオチドにおける同等の長さの対応する領域に対して、1〜5、又は1〜3等、1、2、3、4、5又は6のミスマッチを有する。バリアント鎖侵入オリゴヌクレオチド配列におけるいかなるミスマッチも、少なくとも2、少なくとも4、少なくとも5、又は少なくとも10ヌクレオチド離れてい得る。
別の方法として、バリアントは、長さ少なくとも32、35、37、40、42又は45ヌクレオチドの領域を含み得、該領域は、元の鎖侵入オリゴヌクレオチドの標的の相補的領域(target-cmplementary region)と完全に相補的である。
配列番号23及び29のバリアントは、長さ30ヌクレオチドより長いオリゴヌクレオチドでもあり得、該オリゴヌクレオチドは、対応する元の鎖侵入オリゴヌクレオチドの標的の相補的配列に対し、少なくとも70%の配列の同一性、好ましくは少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有する標的の相補的領域を含む。
バリアントの鎖侵入オリゴヌクレオチドは、元の鎖侵入オリゴヌクレオチド配列に部分的又は完全に相補的な領域の5’側及び/又は3’側の隣接ヌクレオチド配列(複数可)を含み得る。5’側及び/又は3’側の隣接配列(複数可)は、標的核酸配列に対して非相補的であり得、又は標的核酸配列において元の鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合領域の5’側及び/又は3’側の5〜10又は5〜15ヌクレオチド等、標的核酸配列における元の鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合領域に隣接する領域に対して配列が相補的であり得る。
バリアントの鎖侵入オリゴヌクレオチドの残りの配列は、通常、標的配列に関連性がなく、元の鎖侵入オリゴヌクレオチドにも通常関連性がない。
バリアントの鎖侵入オリゴヌクレオチドは、3’末端から10〜15又は10〜20ヌクレオチドであり得る2、3、4、5、6、7、8又はより多くの修飾ヌクレオチド等、その3’領域において1以上の修飾オリゴヌクレオチドを更に含む。修飾は、上述のもののいずれかから選択され得る。
標的ヌクレオチド配列の検出
本発明は、標的ヌクレオチド配列の検出のための上流及び下流プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドの特定の組み合わせを提供する。それゆえ、本発明は、少なくとも1の1本鎖DNA結合タンパク質の存在下で試料中の毒素産生C. difficileの標的核酸配列を検出するための方法を提供し、該方法は、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、上述の配列番号24もしくは25のオリゴヌクレオチドプローブ又はそれらのいずれかのバリアント、上述の配列番号21の上流プライマー又はそのバリアント、上述の配列番号22の下流プライマー又はそのバリアント、並びに上述の配列番号23の鎖侵入オリゴヌクレオチド又はその修飾された誘導体もしくはそのバリアントと前記試料を接触させることを含む。かかる方法は、配列番号26の標的核酸配列を検出することを含み得る。
本発明は、少なくとも1の1本鎖DNA結合タンパク質の存在下で、試料中のS. typhimuriumの標的核酸配列を検出するための方法を更に提供し、該方法は、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、上述の配列番号30のオリゴヌクレオチドプローブ又はそのバリアント、上述の配列番号27の上流プライマー又はそのバリアント、上述の配列番号28の下流プライマー又はそのバリアント、並びに上述の配列番号29の少なくとも1の鎖侵入オリゴヌクレオチド又はその修飾された誘導体もしくはそのバリアントと、前記試料を接触させることを含む。かかる方法は、配列番号31の標的核酸配列を検出することを含み得る。
本発明は、少なくとも1の1本鎖DNA結合タンパク質の存在下で、試料中の配列番号20の標的核酸配列を検出する方法を更に提供し、該方法は、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、上述の配列番号13もしくは14のオリゴヌクレオチドプローブまたはそのバリアント、配列番号11の上流プライマー又はそのバリアント、配列番号12の下流プライマー又はそのバリアント、及び配列番号15の少なくとも1の鎖侵入オリゴヌクレオチド、その修飾された誘導体又はそのバリアントに前記試料を接触させることを含む。配列番号11及び12のバリアントは、配列番号21、22、27及び28のバリアントについての上述された同じ基準に従って選択され得る。配列番号15のバリアント及び修飾された誘導体は、配列番号23及び29のバリアントについて上述された同じ基準に従って選択され得る。
本発明は、少なくとも1の1本鎖DNA結合タンパク質の存在下で、試料中の配列番号34の標的核酸配列を検出する方法も提供し、該方法は、配列番号3〜10のいずれか1のオリゴヌクレオチドプローブ又はそのバリアントと前記試料を接触させることを含む。
本発明の製品
核酸
本発明は、蛍光色素分子、クエンチャー及び標的核酸配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを、それ自体を製品として更に提供する。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドプローブ製品は、本発明の方法において使用するための、上述されたいかなるオリゴヌクレオチドプローブでもあり得る。本発明は、上述のように、配列番号3〜10、13、14、24、25もしくは30のオリゴヌクレオチドプローブ又はそのいずれかのバリアントも具体的に提供する。
組成物
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを含む組成物及び剤形も提供する。組成物は、例えば、溶液剤、凍結乾燥品(lyophilisate)、懸濁液、あるいは油性又は水性媒体(aqueous vehicle)中の乳濁液(emulsion)であり得る。組成物は、上流プライマー、下流プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドから選択された1以上のオリゴヌクレオチド成分を更に含み得る。組成物は、DNAポリメラーゼ、1本鎖DNAに結合可能なタンパク質、リコンビナーゼ及びリコンビナーゼアクセサリータンパク質から選択される1以上のタンパク質を更に含み得る。組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブ、加えて、(i)標的核酸配列に相補的な領域を含む鎖侵入オリゴヌクレオチド及び/又は(ii)1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質を含む。組成物の、プローブ、プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチド成分は、標的核酸配列の検出のためにそれぞれ設計される。
組成物は、(i)配列番号21の上流プライマーもしくはそのバリアント、(ii)配列番号22の下流プライマーもしくはそのバリアント及び/又は(iii)配列番号23の鎖侵入オリゴヌクレオチドもしくはそのバリアントと組み合わせて、配列番号24又は25のオリゴヌクレオチドプローブあるいはそのバリアントを含み得る。追加的に又は代替的に、組成物は、(i)配列番号27の上流プライマーもしくはそのバリアント、(ii)配列番号28の下流プライマーもしくはそのバリアント及び/又は(iii)配列番号29の鎖侵入オリゴヌクレオチドもしくはそのバリアントと組み合わせて、配列番号30のオリゴヌクレオチドプローブもしくはそのバリアントを含み得る。追加的に又は代替的に、組成物は、(i)配列番号11の上流プライマーもしくはそのバリアント、(ii)配列番号12の下流プライマーもしくはそのバリアント及び/又は(iii)配列番号15の鎖侵入オリゴヌクレオチドもしくはそのバリアントと組み合わせて、配列番号17〜19及び32のいずれか1のオリゴヌクレオチドプローブ又はそのバリアントを含み得る。
キット
本発明は、本発明の少なくとも1のオリゴヌクレオチドプローブを含むキットを更に提供する。キットは、所望により、本発明の方法における使用のための使用説明書を更に含む。キットは、増幅されたDNAの検出のための手段を含み得る。キットは、上流プライマー及び/又は下流プライマーを含み得る。キットは、鎖侵入オリゴヌクレオチドを含み得る。それぞれの前記オリゴヌクレオチドが、混合物として、又は別個の容器でキットにおいて提供され得る。
キット又は組成物は、所望により、DNAポリメラーゼ、リコンビナーゼ、及びリコンビナーゼアクセサリータンパク質の1以上を含む。好ましくは、DNAポリメラーゼは、Bsuポリメラーゼである。好ましくは、リコンビナーゼは、所望によりリコンビナーゼアクセサリータンパク質UvsY及びgp32と組み合わせた、バクテリオファージT4 UvsXである。キット又は組成物は、上述のように、dNTPs、適切な緩衝液、並びに本発明の方法におけるDNA増幅のために必要な他の因子を更に含み得る。
キットは、本発明の方法及び組成物に関連して、上述のオリゴヌクレオチドプローブ、上流プライマー、下流プライマー及び/又は鎖侵入オリゴヌクレオチドのいかなる組み合わせも含み得る。
標的核酸配列の検出のための適用
本発明の方法は、標的核酸配列が検出されることが望ましいいかなる応用においても使用され得る。
診断方法
本発明は、医療機関において特に有益である。本発明の検出方法は、臨床サンプルが標的核酸配列を含むか否かの決定を可能にする高度に特異的な検査を提供する。本方法は、様々な疾患状況(disease settings)に適用され得る。本発明は、被験体の疾患の診断方法を提供し、該診断方法は、かかる被験体からの試料中の本発明の標的核酸配列の検出方法を実施して、かかる疾患に関連する標的核酸配列を検出することを含む。
かかる方法は、かかる病原体からの標的核酸配列の検出を含む、被験体における病原体の感染の診断のためのものであり得る。病原体が存在するか否かの決定は、患者に存在し、又は存在する疑いのあるいかなる疾患又は疾病と関連するものでもあり得る。かかる疾患としては、病原体の存在によって引き起こされたもの、病原体の存在と関係しているもの、病原体の存在によって悪化したものが挙げられる。それゆえに、患者は、病原体の存在を示す症状をみせ得、上述の方法によって病原体の有無を決定するために、試料が患者から取得され得る。
いかなる病原体も検出され得る。病原体は、ウイルス又は細菌(bacterium)又は寄生生物(parasite)であり得る。病原体は、限定されるものではないが、真菌(fungi)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、インフルエンザウイルス(A、B及びC型)、ポリオウイルス、RSVウイルス(RSV virus)、ライノウイルス(Rhinovirus)、ロタウイルス(Rotavirus)、A型肝炎ウイルス(Hepatitis A virus)、ノーウォークウイルス群(Norwalk Virus Group)、エンテロウイルス(Enterovirus)、アストロウイルス(Astrovirus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、パラインフルエンザウイルス(Parainfluenza virus)、ムンプスウイルス(Mumps virus)、水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella-Zoster virus)、サイトメガロウイルス(Cytomegalovirus)、エプスタイン-バーウイルス(Epstein-Barr virus)、アデノウイルス(Adenoviruses)、風疹ウイルス(Rubella virus)、ヒトT細胞リンパ腫I型ウイルス(Human T-cell Lymphoma type I virus, HTLV-I)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、マールブルグ(Marburg)及びエボラ(Ebola)を含むウイルス;ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、クラミジア(Chlamydia)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、シゲラ(Shigella)、サルモネラ菌(Salmonella)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、シュードモナス菌(Pseudomonas)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルセラ菌(Brucella)、野兎病菌(Franciscella tularensis)、ヘリコバクター・ピロリ菌(Helicobacter pylori)、レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、ペスト菌(Yersinia pestis)、連鎖球菌(Streptococcus) (A及びB型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、髄膜炎菌(Meningococcus)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza) (b型)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、カンピロバクター菌(Campylobacteriosis)、カタラリス菌(Moraxella catarrhalis)、ドノバン症(Donovanosis)、及び放線菌(Actinomycosis)を含む細菌;カンジダ(Candidiasis)及びアスペルギルス(Aspergillosis)を含む真菌病原体(fungal pathogen);条虫(Taenia)、吸虫(Fluke)、回虫(Roundworm)、アメーバ(Amoebiasis)、ランブルべん毛虫(Giardiasis)、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)、住血吸虫(Schistosoma)、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、トリコモナス(Trichomoniasis)及び旋毛虫(Trichinosis)を含む寄生性病原体(parasitic pathogen)、等の病原体であり得る。
対象の特定の病原体は、毒素産生C. difficile及びS. typhimuriumを含み、これらの病原体の感染の診断のために適した方法及びオリゴヌクレオチドの組み合わせは、上述の通りである。
本発明の特に好ましい実施態様は、消化管感染症、特に下痢の症状を有する患者に存在する毒素産生C. difficileの確認である。
本発明は、それゆえ、毒素産生C. difficile及びS. Typhimuriumによって引き起こされる下痢等の胃腸疾患のための診断方法を提供する。診断方法は、抗生物質耐性マーカ及び病原体マーカを検出することを更に含み得る。方法は、所与の患者のための最適な治療処置を可能にすることから、方法は、胃腸疾患の患者管理の劇的な改善をもたらす。それによって、検査は、入院の長さ、再入院の頻度を減少させ、費用を減少させるだろう。
診断方法は、患者の試料由来の核酸に基づいて便利に行われ得、胃腸疾患が、毒素産生C.difficile又はS. typhimuriumの感染に起因するか否かの指標を臨床医にもたらし得る。診断方法は、例えば、C. difficileの毒型(toxinotype)及び病原性、及び該C. difficileが抗生物質に抵抗性であるか否かについての指標を提供し得る。検査の結果に応じて、医療処置がその後、例えば抗生物質の使用によって最適化され得る。
ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)の検出
より広い態様において、本発明は、試料中のS. typhimuriumを検出する方法を提供し、該方法は、配列番号31を含む標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、少なくとも1の上流プライマー、少なくとも1の下流プライマー及び少なくとも1の鎖侵入オリゴヌクレオチドとかかる試料を接触させることを含み、それぞれの前記プライマー及び前記鎖侵入オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸配列に相補的な領域を含み、前記鎖侵入オリゴヌクレオチドは、前記上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にするように、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖の状態にする。
好ましくは、該方法は、蛍光色素分子、クエンチャー及び前記標的核酸配列に相補的な領域を含む少なくとも1のオリゴヌクレオチドプローブと、前記試料を接触させることを更に含む。通常、該オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含み、それゆえに、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、上述の通りである。通常、Salmonella typhimuriumを検出するための該方法は、1本鎖DNAを結合可能な少なくとも1のタンパク質の存在下で実施される。通常、1本鎖DNAを結合可能な該タンパク質は、リコンビナーゼである。
好ましくは、上流プライマーは、配列番号27の配列又はそのバリアントを含み、下流プライマーは、配列番号28の配列又はそのバリアントを含み、鎖侵入オリゴヌクレオチドは、配列番号29の配列又はそのバリアントを含む。
以下の実施例は、本発明を説明する。
実施例1 - 1本鎖DNA結合タンパク質についての異なるオリゴヌクレオチドの親和性
蛍光色素分子及びクエンチャーを含む1本鎖オリゴヌクレオチドプローブによって生成されるシグナルへの、1本鎖DNAに結合可能なタンパク質の影響を研究した。オリゴヌクレオチドプローブは、天然型DNAもしくはRNA、又は、2’-フルオロRNA、2’-O-メチルRNA、PNA、もしくはLNA等の修飾された核酸で構成される。LNA及びPNAプローブの長さは、他のプローブ(長さ16〜21塩基)と比較して、それぞれ12及び14塩基であった。より短いLNA及びPNAプローブが、そのより高い融解温度に起因して使用された。親和性アッセイにおけるオリゴヌクレオチドプローブの濃度は、800 nMであったPNAを除き、100 nMであった。
20 mMトリス-酢酸(Tris-acetate)pH 8.0、10 mM酢酸マグネシウム、2 mM ATP、60 mMトリス-クリアチンリン酸及び0.025 U/μlクレアチンキナーゼを含む緩衝液中の、200nM相補的鋳型(配列番号1〜8のプローブに対し配列番号34、あるいは配列番号9又は10のプローブに対し配列番号44)及び5μM UvsXの存在下又は非存在下でオリゴヌクレオチドプローブをインキュベートした。セ氏40℃で20分インキュベートした後、蛍光を測定した。
全オリゴヌクレオチドプローブの、それらの相補的鋳型とのインキュベーションは、相補的鋳型の非存在下で生成されたシグナルと比較して、蛍光シグナルの増加を引き起こした(図1a)。しかしながら、図1aに示すように、相補的鋳型の非存在下でのバクテリオファージT4 UvsXの存在は、天然型DNAオリゴヌクレオチドプローブ(配列番号1及び2)を用いた蛍光シグナルの有意な増加も引き起こした。この観察結果の考えられる説明は、UvsXがDNAプローブの二次構造を不安定化し、プローブとクエンチャーとの距離の増加、及び相補的鋳型の非存在下でさえ、プローブシグナルの増加を引き起こすというものである。UvsXを含む反応におけるDNA増幅を測定する場合に、プローブのこの非特異的活性化は、不良なシグナル対バックグラウンド比を引き起こすと予期されるだろう。
対照的に、同一の配列を有するが、RNA(配列番号3及び4)又は修飾RNA(配列番号5、6、7、8)あるいはLNA(配列番号9)又はPNA (配列番号10)で構成されたオリゴヌクレオチドプローブは、UvsXの存在下でクエンチングされたままであり、有意なシグナルの増加は、相補的鋳型の存在下でのみ起こった。
UvsXとともに使用された同じオリゴヌクレオチドプローブからのシグナルへの、1本鎖結合タンパク質、バクテリオファージT4 gp32 (New England Biolabs)の効果も解明した。UvsXとともに使用されたオリゴヌクレオチドプローブと同様の濃度のオリゴヌクレオチドプローブを、20 mMトリス-酢酸pH 7.9、50 mM酢酸カリウム、10 mM酢酸マグネシウム及び1 mM DTTを含む緩衝液中の、0.25 mg/mlのgp32及び200 nM相補的鋳型((配列番号1〜8を有するプローブに対する配列番号34あるいは配列番号9又は10を有するプローブに対する配列番号44)の存在下又は非存在下でインキュベートした。
図1bに示すように、gp32の存在は、相補的鋳型の非存在下でDNAプローブ(配列番号1及び2)のシグナルの有意な増加を再度もたらした。また、gp32が存在する場合に、相補的鋳型の存在下又は非存在下で、DNAプローブから生成されたシグナル間に有意な違いはみられなかった。従って、二重標識された天然型DNAプローブは、T4 gp32を含む反応における標的検出に不適当である。
対照的に、RNA (配列番号3及び4)又は修飾RNA (配列番号5、6、7、8)、LNA (配列番号9)及びPNA (配列番号10)プローブは、T4 gp32の存在下で蛍光の有意な増加をほとんど又は全く示さなかった。
増幅のための1本鎖結合タンパク質及びリコンビナーゼの両方を利用する等温の鎖侵入に基づく増幅方法において用いられる試薬条件で、オリゴヌクレオチドプローブも検査した。反応液中の試薬成分は、10 mMトリス-酢酸pH 8.0、10 mM酢酸マグネシウム、5% DMSO、5% PEG 1000、4 mM DTT、0.5 mM EDTA、0.1 mg/ml BSA、150 mMスクロース、2 mM ATP、200 μM DNTP’s、1:100,000サイバーグリーンI、60 mMトリス-クレアチンリン酸であった。反応液中のタンパク質は、250 ng/μlのgp32, 5 μM UvsX、0.0625 U/μl BSU、0.0125 U/μlスクロースホスホリラーゼ及び0.025 U/μlクレアチンキナーゼ(Sigma-Aldrich St. Louis, MO, U.S.A)であった。プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドの濃度は、200nMであった。使用されたプローブの濃度は、別途提示する場合を除き、200 nMであった。
全ての反応液を、標的DNA又は酢酸マグネシウムなしで調製した。反応をその後、酢酸マグネシウム中に調製された適量の標的DNAを加えること、又は酢酸マグネシウム単独で用いることのいずれかにより開始させた。反応において生成された蛍光シグナルのリアルタイム検出を、96ウェルプレートにおいて40℃で行った。
DNAプローブ(配列番号1及び2)との(プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドがない)前記試薬組成物のインキュベーション状態では、相補的鋳型の存在下又は非存在下において生成されたシグナルに違いはなかった(図1c)。それゆえに、プローブを含む天然型DNAは、1本鎖結合タンパク質及び/又はリコンビナーゼが用いられるDNA増幅反応における使用のために望ましくない。対照的に、RNA (配列番号3及び4)又は修飾RNA (配列番号5、6、7、8)、LNA (配列番号9)及びPNA (配列番号10)プローブは、相補的鋳型が存在する場合にのみシグナルの増加を起こすことが示された。それゆえに、RNA、修飾RNA、LNA及びPNAプローブが、1本鎖結合タンパク質及び/又はリコンビナーゼが用いられるDNA増幅反応に適している。
オリゴヌクレオチドプローブからのシグナルへの、Escherichia coliリコンビナーゼ、RecA (New England Biolabs)の効果も解明した(図1d)。図1a及び1bにおいて使用されたオリゴヌクレオチドプローブと同様の濃度のオリゴヌクレオチドプローブを、70 mMトリス-HCl pH 7.6、10 mM MgCl2、5 mM DTT及び10mM ATPを含む緩衝液中の100 μg/mlのRecAの存在下又は非存在下でインキュベートした。RecAの存在も、プローブ(図1d、DNA21 [配列番号2])を含む天然型DNAのシグナルの増加をもたらした。しかしながら、増加は、T4 UvsXを用いてみられたものほど高くなかった。とはいえ、T4 UvsXを用いてみられたように、RNA (RNA21 配列番号4)、2’-フルオロRNA (2-フルオロRNA21、配列番号 8)、2’-O-メチルRNA(2-O-メチルRNA21、配列番号6)、LNA (配列番号9)もしくはPNA (配列番号10)を含むプローブとのRecAのインキュベーションは、有意なシグナルの増加をもたらさなかった。
これらのオリゴヌクレオチドプローブへの、超耐熱性(Extreme Thermostable)1本鎖DNA結合タンパク質、ET-SSB (New England Biolabs)の効果を、加えて解明した(図1e)。50℃を超える温度で使用された場合に活性が失われるT4-gp32と異なり、ET-SSBは、95℃においてその活性をまだ保っている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はDNA塩基配列決定(sequencing)等の高温で行われる反応において1本鎖結合タンパク質が必要である場合、ET-SSBは、それゆえ適切な選択である。図1a及び1bにおいて使用されたオリゴヌクレオチドプローブと同様の濃度のオリゴヌクレオチドプローブを、20 mMトリス-酢酸pH 7.9、50 mM酢酸カリウム、10 mM酢酸マグネシウム及び1 mM DTTを含む緩衝液中の50 μg/mlのET-SSBの存在下又は非存在下でインキュベートした。ET-SSBの存在は、プローブ(図1e、DNA21 配列番号2)を含む天然型DNAのシグナルの有意な増加ももたらした。もっぱら天然型DNAを含む二重標識プローブは、それゆえET-SSBを含む反応には不適当である。対照的に、RNA (RNA21、配列番号4)、2’-フルオロRNA (2-フルオロRNA21、配列番号8)、2’-O-メチルRNA (2-O-メチルRNA21、配列番号6)、LNA (配列番号9)又はPNA (配列番号10)を含むプローブは、ET-SSBに対してより抵抗性であった。これらの修飾されたプローブは、それゆえ、ET-SSBのような1本鎖結合タンパク質の存在下で行われる反応により適している。
実施例2 -異なるオリゴヌクレオチドプローブを用いる、鎖侵入に基づく増幅(SIBA(商標))の検出
蛍光色素分子及びクエンチャーで標識された天然型DNA (配列番号16)、2’-フルオロRNA (配列番号17)及びLNA (配列番号18)で構成された3のプローブを検査した。フォワードプライマー(配列番号11)、リバースプライマー(配列番号12)、プローブ、鎖侵入オリゴヌクレオチド(配列番号15)、及び標的核酸配列(配列番号20)の構造を図2aにまとめた。プローブは、リバースプライマー(配列番号12)の下流領域に部分的に重複するように設計され、それゆえ、標的鋳型において、リバースプライマーと同じ領域と結合する。
実施例1に記載されたように、鎖侵入に基づく増幅反応においてプローブ、プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドを用いて、人工標的DNA (配列番号20)をリアルタイムに増幅及び検出した。サイバーグリーンI色素を用いて検出された反応において示されるように、標的DNAの増幅は、標的DNAを含む反応においてのみ得られ、その間、鋳型なしコントロール(NTC)は、増幅を引き起こさなかった(図2b)。配列番号17及び18のそれぞれ2’-フルオロRNA又はLNAプローブが使用された場合、鋳型依存性の増幅の特異的検出もみられた(図2c及び2d)。リバースプライマー及びプローブの間の競合(competition)の結果として、2’-フルオロRNA又はLNAを含むプローブを使用して検出された試料において増幅の開始のわずかな遅れがみられた。この競合は、プローブの濃度を低減させることによって更に最小化され得る。
対照的に、DNAプローブ(配列番号16)は、標的鋳型の存在下において増幅を検出することができなかった(図2e)。このことは、反応における1本鎖結合タンパク質の存在が、単位複製配列の非存在下でさえ、プローブシグナルの劇的な増加をもたらすという事実に起因する。それゆえ、DNAプローブは、試薬プロトコルにDNA結合タンパク質を含む方法における使用には不適当であることが分かった。
実施例3 - RNAオリゴヌクレオチドプローブを用いるSIBAの多重検出
Cy5及びアイオワブラック(配列番号25)、又は、ROX及びBHQ2 (配列番号17)、のいずれかで標識された2’-フルオロRNAプローブを、実施例1に記載された鎖侵入増幅反応条件下でいっせいに混合した(incorporated)。C. difficile標的配列(配列番号26)及び人工標的配列(配列番号20)の増幅を並行して検出した。
C. difficile遺伝子からの標的配列の増幅のために使用されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号21、配列番号22及び配列番号23であった。人工標的の増幅のために使用されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号11、配列番号12及び配列番号15であった。反応を、10,000及び107コピーの、それぞれC. difficileゲノムDNA及び人工標的DNAを用いて行った。図3aは、DNA標的の増幅のリアルタイム測定を、2’-フルオロRNA塩基を含むプローブを用いることによっていっせいに達成したことを示す。Cy5及びアイオワブラックで標識された2’-フルオロRNAプローブ(配列番号25)を、使用して、C. difficileからの標的配列を検出し、一方、ROX及びBHQ2 (配列番号17)を用いて、人工標的配列を検出した。サイバーグリーンI (図3b)又は2’-フルオロRNAプローブ(図3c)のいずれかを用いる融解分析(Melt analysis)は、両方の反応が特異的であり、かつ同じ反応管において起こることを更に確認した。2’-フルオロRNAプローブは反応において加水分解されないため、該プローブは、サイバーグリーンのかわりに、融解分析のためのツールとしても役立ち得る。
実施例4 - シグナル生成を促進するためのRNAプローブのRNase H切断
実施例1に記載された鎖侵入DNA増幅反応条件下で、天然型DNA、修飾RNA、LNA及びPNAプローブを、10μg/mlのThermococcus gammatolerans RNase H2を用いて又は用いずに、その相補的標的鋳型の存在下又は非存在下でインキュベートした。先の実験において示されたように、(天然型DNAを含むプローブを除いて)全てのプローブが、それらの標的配列が存在する場合に、シグナルの増加を引き起こした(図4a)。しかしながら、RNase H2が存在する反応条件では、RNA-プローブ及び標的DNAの二本鎖からのRNA塩基の切断に起因して、2’-フルオロRNAプローブ(配列番号17)についてのシグナルの更なる増加を検出した。他のプローブDNA (配列番号16)、PNA (配列番号10)、LNA (配列番号9)及び2’-O-メチルRNA (配列番号32)は、RNase H2によって切断されなかった。
配列番号24の2’-フルオロRNAプローブも使用して、上記反応条件下でのRNase H2の存在下又は非存在下におけるC. difficileからの標的配列の増幅を検出した。図4bは、RNase H2がプローブからのシグナルの生成に必要ではなかったことを示す。しかしながら、RNase H2の存在は、シグナルを更に増進した。
実施例5 -鎖侵入に基づく増幅及びRNAオリゴヌクレオチドプローブによるSalmonella typhimuriumの検出
2’-フルオロRNAプローブ(配列番号30)を用いて、低コピーの標的DNAを検出した。実施例1に記載された鎖侵入に基づく増幅反応条件下で、2’-フルオロRNAプローブを、S. typhimurium標的遺伝子の検出のためのアッセイに利用した。増幅のために使用されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号27、配列番号28及び配列番号29であった。
検査の感受性を、105〜10コピーのS. typhimuriumゲノムDNAの連続希釈を用いて評価した。プローブは、最小10コピーのゲノムDNAサンプルを検出することができた(図5)。鋳型なしコントロール(NTC)は、検出可能なシグナルを生成せず、2’-フルオロRNAプローブが高度に特異的であることが確認された。
実施例6 - 3’末端に接続されたクエンチャーを有するRNAオリゴヌクレオチドプローブは、ポリメラーゼによる伸長のための基質として作用しない
上述されたRNAプローブは、リバースプライマーの下流領域と重複するように設計されており、それゆえ標的配列に結合するためのリバースプライマーと競合し得た。配列番号17のプローブは、DNA増幅の出発物質となる(priming)ための基質としての機能を果たすことが可能であるか否かを、実施例2に記載された人工的な系を用いて研究した。図6aは、プローブが、その3’-末端に接続されたクエンチャーの存在に起因して、プライマーとしての作用を果たさなかったことを示す。標的配列の増幅は、相補的リバースプライマー(配列番号12)の存在下でのみ起こった。プローブが同種のリバースプライマーを用いずに単独で使用された場合、又は同種でない又は偽のリバースプライマー、SPU R-プライマー(配列番号33)とともに使用された場合、増幅は起こらなかった。更に、リバースプライマーがない試料では、RNase H2の存在下で増幅がみられなかった(図6b)。このことは、プローブが、増幅中において不活性であり、標的単位複製配列の結合にのみ関与することを示唆した。
実施例7 -二重プライマー/プローブ作用を有するRNAオリゴヌクレオチド
2’-フルオロRNAを含むオリゴヌクレオチドは、プローブ及びプライマーの両方としての作用を果たし得るか否かを、実施例2に記載された人工的な系を用いて研究した(図7a)。配列番号12のリバースプライマーにおける一部又は全ての天然DNAヌクレオチドを、2’-フルオロRNAで置き換えて、配列番号13及び14のオリゴヌクレオチドを作製した。これらの2’-フルオロRNAプライマーは、天然型DNAリバースプライマーと同じくらい良好な効率で人工標的DNAを増幅することが可能であった(図7b)。数個の天然型DNA塩基を3′末端に保持する2’-フルオロRNAプライマー(配列番号14)は、より若干効率的であった。
そこで、3′-末端が標的配列を自由に伸長できる限り、蛍光色素分子及びクエンチャーを2’-フルオロRNAプライマーに加えて、プローブ作用をもたらし得ると推論された。かかる構造が、DNA結合タンパク質による、プローブシグナルへの干渉にまだ抵抗性であり、それゆえ増幅の特異的な検出をまだ可能とするだろうと更に仮定した。2’-フルオロRNAプライマーを、内部蛍光色素分子及び5′クエンチャーで標識した(配列番号19)。図7cは、鎖侵入に基づく増幅反応において、配列番号19が、人工標的DNA (配列番号20)を増幅及び検出することができたことを示す。
実施例8 - DNA結合タンパク質のためのキメラDNA-RNA二重標識プローブの親和性
天然型DNAプローブの配列を修飾して一部にRNA又は修飾RNA塩基を組み込むことにより、DNA結合タンパク質に対する抵抗性をもたらす能力を研究した。二重標識プローブ、UvsX及びT4-gp32の濃度は、実施例1において使用されたものと同一であった。
図8は、DNAとRNAとの混合物(配列番号35、36、37)、又はDNAと2’-フルオロRNAとの混合物(配列番号38、39、40)、又はDNAと2’-O-メチルRNAとの混合物(配列番号41、42、43)の塩基を含む二重標識プローブがDNA結合タンパク質UvsX及びT4-gp32に対する抵抗性も示したことを示す。UvsX又はT4-gp32の付加の結果としての蛍光の倍増加(fold increase)として結果を示す。抵抗性の度合いは、二重標識プローブに存在するRNA塩基の量に主に依存した。プローブに存在するRNA塩基の量が増加するにつれて、二重標識プローブの、DNA結合タンパク質に対する抵抗性が増加した。
異なる比率の、DNA-RNA、DNA-2’-フルオロRNA及び2’-O-メチルRNAを含む21塩基の二重標識プローブとともに、UvsXをインキュベートした(図8a)。全ての事例において、5の、RNA又は2’-フルオロRNA又は2’-O-メチルRNA塩基及び15のDNA塩基を含む21塩基の二重標識プローブは、DNA塩基のみを含む21塩基の二重標識プローブよりも、UvsXに対して抵抗性であった。同様の実験を、T4-バクテリオファージgp32 (1本鎖結合タンパク質)を用いて行った(図8b)。DNA結合タンパク質に対する抵抗性は、この場合もやはり、二重標識プローブにおけるRNA塩基の存在量に主に依存した。5の、RNA又は2’-フルオロRNA又は2’-O-メチルRNA塩基並びに15のDNA塩基を含む、21塩基の二重標識プローブは、T4-gp32に対して抵抗性を示すのに十分であった。それゆえに、キメラDNA-RNA又はDNA-2’-フルオロ-RNA又はDNA-2’-O-メチルRNA二重標識プローブは、DNA結合タンパク質を含む反応における使用にも適している。
キメラプローブに含まれているRNA塩基数と、1本鎖DNAを結合可能なタンパク質によるプローブシグナルの混乱に対する抵抗性との関係を、更に研究した。図8cは、異なるDNA-RNA割当量(ration)を有する追加的な一連の21塩基の二重標識プローブを用いたUvsXのインキュベーション結果を示す。図8dは、同じ一連のプローブ及びgp32とのインキュベーションによる結果を示す。アッセイを、実施例1に記載されたように実施した。DNAプローブにおける少なくとも約20%の塩基をRNA塩基と置き換えた場合、プローブシグナルへの干渉の一貫した減少がみられることが分かった(例えばプローブDNA 17 + RNA 4参照)。

Claims (13)

  1. 一本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼアクセサリータンパク質若しくはリコンビナーゼコファクタータンパク質の存在下で、試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、該方法が、蛍光色素分子と、クエンチャーと、前記標的核酸配列に相補的な領域とを含む少なくとも1の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブに前記試料を接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む、方法。
  2. 前記標的核酸配列の増幅を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記増幅が、等温条件下で前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で行われる、請求項2に記載の方法。
  4. 少なくとも1の上流プライマー及び少なくとも1の下流プライマーであって、前記標的核酸配列に相補的な領域をそれぞれ含む該上流プライマー及び該下流プライマーと、前記試料を接触させることを含む、請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記標的核酸配列に相補的な領域を含む鎖侵入オリゴヌクレオチドと、前記試料を接触させることを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸配列の増幅の出発物質となることが可能であり、かつ、前記少なくとも1の上流又は下流プライマーとして作用する、請求項4又は5に記載の方法。
  7. 前記リコンビナーゼは、UvsX又はRecAから選択され、あるいは前記リコンビナーゼアクセサリータンパク質が、UvsY又はgp32から選択される、請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記オリゴヌクレオチドプローブに存在する前記修飾RNAヌクレオチドが、少なくとも1の、2’-フルオロリボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド又はLNAリボヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記試料をRNase Hと接触させることを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号24、25又は30の配列あるいはそのいずれかのバリアントを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含むキットであって、該オリゴヌクレオチドプローブが、蛍光色素分子と、クエンチャーと、標的核酸配列に相補的な領域とを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含み、かつ加えて、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記配列が、
    (i)前記標的核酸配列に相補的な領域を含む鎖侵入オリゴヌクレオチド;及び
    (ii) 一本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼアクセサリータンパク質若しくはリコンビナーゼコファクタータンパク質
    を含む、キット。
  12. (i)前記キットが、前記標的核酸配列に相補的な領域を含む上流及び/又は下流プライマーを更に含み、又は(ii)前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸配列の増幅の出発物質となることが可能であり、かつ、前記上流プライマー又は前記下流プライマーとして作用する、請求項11に記載のキット。
  13. 被験体からの試料において請求項1〜12のいずれか1項に規定された方法を実行して、疾患と関連している標的核酸配列を検出することを含む、被験体における前記疾患の診断を補助する方法。
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