JP6499656B2 - 鎖侵入に基づく増幅による核酸の検出 - Google Patents
鎖侵入に基づく増幅による核酸の検出 Download PDFInfo
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Description
本発明は、蛍光色素分子(fluorophore)と、クエンチャー(quencher)と、標的核酸配列に相補的な領域とを含むオリゴヌクレオチドプローブが検出のために使用される、1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質の存在下で試料中の標的核酸配列を検出するための方法に関する。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む。本発明は、この方法における使用に適したオリゴヌクレオチドプローブ、組成物及びキット、及び病原体(pathogen)の感染の診断のためのそれらの使用にも関する。
標的核酸配列の検出は、蛍光色素分子/クエンチャーのペアを含むDNAプローブを用いて行われている。かかるプローブは、標的核酸への結合状態でクエンチング(quenching)活性の変化を示し、標的の定量的検出を可能にする。プローブを使用して、リアルタイムにDNA増幅を測定することができ、検出すべき標的のための各プローブにおいて異なる蛍光色素分子/クエンチャーのペアを使用することにより、同じ反応において異なる標的が検出され得、それゆえ多重化(multiplexing)を可能にする。DNA増幅の検出のための以前のプローブシステムの例としては、標的結合状態でコンフォメーションの変化(conformational change)を示すハイブリダイゼーションプローブ(hybridisation probe)(米国特許第7241596号)、分子指標(molecular beacon)(米国特許第5925517号)、 Taqman chemistry (米国特許6214979号)、及びエンドヌクレアーゼで切断可能な(endonuclease-cleavable)プローブ (米国特許第7435561号及び米国特許出願第20050214809号)が挙げられる。上流プライマー、下流プライマー及び鎖侵入(strand invasion)系に依存する等温(isothermal)DNA増幅過程が、国際公開第2009/150467号に記載されている。
本発明は、1本鎖DNAに結合可能なタンパク質が存在する場合の検出アッセイにおけるDNAプローブの使用に関連する問題認識に一部基づいている。本発明者らは、DNAプローブが、1本鎖DNAへ結合可能なタンパク質の存在下では、特異的な、鋳型依存性(template-dependent)シグナルを提供することができず、鋳型の非存在下でさえ実際にはシグナルを発することを見出した。この問題は、1本鎖DNAへ結合可能なタンパク質との関連で、信頼できる鋳型依存性のDNA増幅の検出を提供し得る解決方法を研究することに本発明者らを導いた。本発明者らは、意外にも、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はペプチド核酸(Peptide Nucleic acid, PNA)ヌクレオチドを、蛍光色素分子及びクエンチャーで標識化されたオリゴヌクレオチドプローブの配列に組み込むことが、完全に対応するDNAプローブと比較して、1本鎖DNAへ結合可能なタンパク質による蛍光シグナルの混乱(disruption)に対する抵抗性をもたらすことを発見した。
配列番号1は、DNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号2は、DNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号3は、RNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号4は、RNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号5は、2’-O-メチルRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号6は、2’-O-メチルRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号7は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号8は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号9は、LNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号10は、PNAプローブの配列である。
配列番号11は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号12は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号13は、2’-フルオロRNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号14は、混合されたDNA/2’-フルオロRNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号15は、DNA鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号16は、DNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号17は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号18は、LNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号19は、混合されたDNA/2’-フルオロRNAプローブ/プライマーの配列である。
配列番号20は、人工DNA標的核酸配列のヌクレオチド配列である。
配列番号21は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号22は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号23は、DNA鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号24は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号25は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号26は、C. difficile ATCC BAA 1382の標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号27は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号28は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号29は、DNA鎖侵入オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号30は、2’-フルオロRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号31は、S. typhimurium ATCC 14028の標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号32は、2’-O-メチルRNAプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号33は、DNAプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号34は、配列番号1〜8のプローブに対しての相補的な標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号35〜43は、キメラDNA/RNAのヌクレオチド配列、DNA/2’-フルオロRNA及びDNA/2’-O-メチルRNAプローブを示す。
配列番号44は、配列番号9及び10のプローブに対しての相補的な標的DNAヌクレオチド配列である。
配列番号45〜48は、キメラDNA/RNAプローブのヌクレオチド配列を示す。
記載された方法の異なる適用が、当分野における具体的な必要性に調整され得ると理解される必要がある。本明細書中に使用された専門用語は、本発明の特定の実施例を説明する目的のみのためのものであり、限定されることを意図するものではないと理解される必要もある。加えて、本明細書及び添付のクレームに使用されるように、内容が明確に否定しない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」は、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「オリゴヌクレオチド」への言及は、2以上のかかるオリゴヌクレオチド、及び同様のものを含む。本明細書中において引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記のものであろうと又は下記のものであろうと、その全体が参照することによって本明細書により組み込まれる。
試料
核酸が試料から取得又は誘導(derived)され得るという条件で、いかなる試料も標的核酸配列の検出のために使用され得る。試料は、例えば、環境試料、参照試料(reference sample)又は臨床試料であり得る。本発明の方法が標的核酸配列の検出により疾患の診断のために使用される場合には、試料は、一般に臨床試料、例えば、疾患にかかっている疑いのある、又は疾患にかかっている患者から取得された試料である。適切なタイプの臨床試料は、被験体に存在する、又は被験体に存在する疑いのある疾患又は感染症(infection)の個別の種類に従って変わる。試料は、唾液、痰(sputum)、血液、血漿(plasma)、血清、尿又はふん便(stool)試料であり得る。試料は、細胞又は組織試料であり得る。好ましい実施態様では、試料は、哺乳類の被験体等の動物の被験体から採取される。試料は、一般にヒト被験体から採取されるだろうが、本発明は、また、通例、家畜(domestic animal)、家畜類(livestock)、鳥及び魚にも適用される。例えば、本発明は、獣医の環境(veterinary setting)又は農業環境において適用され得る。本発明が、クロストリジウム・ディフィシレ(C. difficile)又はネズミチフス菌(Salmonella typhimurium, S. typhimurium)による感染症の感染を検出する実施態様では、試料は好ましくはふん便試料であり得る。ふん便試料は、消化管感染症にかかっている被験体から採取され得る。感染症は、下痢(diarrhoea)にかかっている患者において存在し得る。
いかなる起源のいかなる標的核酸配列も検出され得る。標的核酸配列は、ヒト、哺乳類、細菌性又はウイルス性であり得る。標的核酸配列は、遺伝子又は染色体の領域であり得る。好ましくは、標的核酸配列は、遺伝子型(genotype)又は検出すべき有機体(organism) (病原体等)に特異的である。標的核酸配列は、特定の種のゲノムに特有であり得る。それゆえに、特定の種の検出のための標的核酸配列は、通常、近縁種のいかなるホモログ(homologous)核酸配列とも異なるだろう。通常、標的核酸配列は、近縁種のホモログ核酸配列とのいくつかのミスマッチ(mismatch)を含むだろう。標的核酸配列は、細菌の特定の株(strain)又は特定の血清型(serotype)、ウイルスの分離株(isolate)もしくはクレード(clade)に特異的な配列であり得る。標的核酸配列は、C. difficileという毒素産生菌(toxigenic strain)又はS. typhimuriumという菌株に特異的であり得る。
オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列、蛍光色素分子及びクエンチャーに相補的な領域を含む。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む。言い換えれば、オリゴヌクレオチドプローブに存在する少なくとも20%のヌクレオチドが、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、RNAヌクレオチド及び修飾RNAヌクレオチドの混合物等、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドの混合物を含み得る。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの配列は、DNAヌクレオチド及び少なくとも20%のRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド及び少なくとも20%の修飾RNAヌクレオチド、あるいはDNAヌクレオチド及び少なくとも20%のPNAヌクレオチドを含み得る。
- TAMRA及びブラックホールクエンチャー2;
- ROX及びブラックホールクエンチャー2;
- ROX及びDABCYL;
- FAM(dT-FAM等)及びアイオワブラックFQ;
- FAM (dT-FAM等)及びDABCYL;
- ROX及びアイオワブラックFQ;
- CY5及びアイオワブラックRQ
が挙げられる。
プローブからのシグナルの検出は、蛍光検出用の任意の適切な手段によって行われ得る。プローブは、いかなる事前のDNA増幅を行うことなく、標的核酸配列を検出するために使用され得る。より典型的には、プローブは、標的核酸配列の増幅後又は増幅中、標的核酸配列を検出するために使用される。好ましくは、プローブからのシグナルは、標的核酸配列の増幅と並行してリアルタイムに測定される。
本発明の方法が標的核酸配列の増幅を含む場合、DNA増幅のいかなる適切な方法も使用され得る。通常、DNA増幅は、等温状態下で実行され得る。DNA増幅方法は、鎖侵入に基づく増幅、ローリングサークル増幅(rolling-circle amplification, RCA)、鎖置換増幅(strand displacement amplification, SDA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(recombinase polymerase amplification, RPA)を含み得る。鎖侵入に基づく増幅(SIBA)が好ましい。上記増幅方法は、通常、1本鎖DNAを結合可能なタンパク質が存在することを必要とし、ひいては本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、かかる方法において増幅の検出を好都合に可能にする。
標的核酸配列の増幅のための好ましい方法、SIBAの主要点は、後述される。本発明は、1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質の存在下において試料中の標的核酸配列の増幅を検出するための方法を提供し、該方法は、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、前記試料を、本発明の少なくとも1のオリゴヌクレオチドプローブ、少なくとも1の上流プライマー、少なくとも1の下流プライマー、及び少なくとも1の鎖侵入オリゴヌクレオチドと接触させることを含む。上述のように、オリゴヌクレオチドプローブは、それ自体が上流プライマー又は下流プライマーとして作用し得、又は別の方法としては別個の上流及び下流プライマーが、オリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて提供される。それぞれの、前記プライマー、前記プローブ及び前記鎖侵入オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸配列に相補的な領域を含む。鎖侵入オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖にして、それぞれの、前記プライマー及び前記プローブの結合を可能にする。
適切な上流及び下流プライマーは、目的の標的核酸配列に基づいて、かつ、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖にして上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にする鎖侵入オリゴヌクレオチドの結合部位を考慮して、選択される。上流及び下流プライマーは、標的に対し部分的又は完全に相補的な配列及び所望により5’及び/又は3’の隣接非相補的配列を含む。別の方法として、上流及び下流プライマーは、標的に対して部分的又は完全に相補的な配列で完全に構成され得る。標的に対して相補的なプライマー配列の長さは、標的核酸配列への特異的なハイブリダイゼーションをもたらすのに十分である。相補的な配列の長さは、通常少なくとも10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15、少なくとも16、 又は少なくとも17ヌクレオチドである。相補的な配列の長さは、10〜25、15〜25、10〜30又は15〜30ヌクレオチドであり得る。
目的の標的核酸配列に基づいて、かつ、上流及び下流プライマーの結合部位と、関連性のある領域において標的核酸配列を1本鎖の状態にして上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にする鎖侵入オリゴヌクレオチドの必要性とを考慮して、適切な鎖侵入オリゴヌクレオチドが選択される。
本発明は、標的ヌクレオチド配列の検出のための上流及び下流プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ並びに鎖侵入オリゴヌクレオチドの特定の組み合わせを提供する。それゆえ、本発明は、少なくとも1の1本鎖DNA結合タンパク質の存在下で試料中の毒素産生C. difficileの標的核酸配列を検出するための方法を提供し、該方法は、前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、上述の配列番号24もしくは25のオリゴヌクレオチドプローブ又はそれらのいずれかのバリアント、上述の配列番号21の上流プライマー又はそのバリアント、上述の配列番号22の下流プライマー又はそのバリアント、並びに上述の配列番号23の鎖侵入オリゴヌクレオチド又はその修飾された誘導体もしくはそのバリアントと前記試料を接触させることを含む。かかる方法は、配列番号26の標的核酸配列を検出することを含み得る。
核酸
本発明は、蛍光色素分子、クエンチャー及び標的核酸配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドプローブを、それ自体を製品として更に提供する。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドプローブ製品は、本発明の方法において使用するための、上述されたいかなるオリゴヌクレオチドプローブでもあり得る。本発明は、上述のように、配列番号3〜10、13、14、24、25もしくは30のオリゴヌクレオチドプローブ又はそのいずれかのバリアントも具体的に提供する。
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを含む組成物及び剤形も提供する。組成物は、例えば、溶液剤、凍結乾燥品(lyophilisate)、懸濁液、あるいは油性又は水性媒体(aqueous vehicle)中の乳濁液(emulsion)であり得る。組成物は、上流プライマー、下流プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドから選択された1以上のオリゴヌクレオチド成分を更に含み得る。組成物は、DNAポリメラーゼ、1本鎖DNAに結合可能なタンパク質、リコンビナーゼ及びリコンビナーゼアクセサリータンパク質から選択される1以上のタンパク質を更に含み得る。組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブ、加えて、(i)標的核酸配列に相補的な領域を含む鎖侵入オリゴヌクレオチド及び/又は(ii)1本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のタンパク質を含む。組成物の、プローブ、プライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチド成分は、標的核酸配列の検出のためにそれぞれ設計される。
本発明は、本発明の少なくとも1のオリゴヌクレオチドプローブを含むキットを更に提供する。キットは、所望により、本発明の方法における使用のための使用説明書を更に含む。キットは、増幅されたDNAの検出のための手段を含み得る。キットは、上流プライマー及び/又は下流プライマーを含み得る。キットは、鎖侵入オリゴヌクレオチドを含み得る。それぞれの前記オリゴヌクレオチドが、混合物として、又は別個の容器でキットにおいて提供され得る。
本発明の方法は、標的核酸配列が検出されることが望ましいいかなる応用においても使用され得る。
本発明は、医療機関において特に有益である。本発明の検出方法は、臨床サンプルが標的核酸配列を含むか否かの決定を可能にする高度に特異的な検査を提供する。本方法は、様々な疾患状況(disease settings)に適用され得る。本発明は、被験体の疾患の診断方法を提供し、該診断方法は、かかる被験体からの試料中の本発明の標的核酸配列の検出方法を実施して、かかる疾患に関連する標的核酸配列を検出することを含む。
より広い態様において、本発明は、試料中のS. typhimuriumを検出する方法を提供し、該方法は、配列番号31を含む標的核酸配列の増幅を促進する条件下で、少なくとも1の上流プライマー、少なくとも1の下流プライマー及び少なくとも1の鎖侵入オリゴヌクレオチドとかかる試料を接触させることを含み、それぞれの前記プライマー及び前記鎖侵入オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸配列に相補的な領域を含み、前記鎖侵入オリゴヌクレオチドは、前記上流プライマー及び下流プライマーの結合を可能にするように、標的核酸配列の少なくとも一部を一本鎖の状態にする。
以下の実施例は、本発明を説明する。
蛍光色素分子及びクエンチャーを含む1本鎖オリゴヌクレオチドプローブによって生成されるシグナルへの、1本鎖DNAに結合可能なタンパク質の影響を研究した。オリゴヌクレオチドプローブは、天然型DNAもしくはRNA、又は、2’-フルオロRNA、2’-O-メチルRNA、PNA、もしくはLNA等の修飾された核酸で構成される。LNA及びPNAプローブの長さは、他のプローブ(長さ16〜21塩基)と比較して、それぞれ12及び14塩基であった。より短いLNA及びPNAプローブが、そのより高い融解温度に起因して使用された。親和性アッセイにおけるオリゴヌクレオチドプローブの濃度は、800 nMであったPNAを除き、100 nMであった。
蛍光色素分子及びクエンチャーで標識された天然型DNA (配列番号16)、2’-フルオロRNA (配列番号17)及びLNA (配列番号18)で構成された3のプローブを検査した。フォワードプライマー(配列番号11)、リバースプライマー(配列番号12)、プローブ、鎖侵入オリゴヌクレオチド(配列番号15)、及び標的核酸配列(配列番号20)の構造を図2aにまとめた。プローブは、リバースプライマー(配列番号12)の下流領域に部分的に重複するように設計され、それゆえ、標的鋳型において、リバースプライマーと同じ領域と結合する。
Cy5及びアイオワブラック(配列番号25)、又は、ROX及びBHQ2 (配列番号17)、のいずれかで標識された2’-フルオロRNAプローブを、実施例1に記載された鎖侵入増幅反応条件下でいっせいに混合した(incorporated)。C. difficile標的配列(配列番号26)及び人工標的配列(配列番号20)の増幅を並行して検出した。
実施例1に記載された鎖侵入DNA増幅反応条件下で、天然型DNA、修飾RNA、LNA及びPNAプローブを、10μg/mlのThermococcus gammatolerans RNase H2を用いて又は用いずに、その相補的標的鋳型の存在下又は非存在下でインキュベートした。先の実験において示されたように、(天然型DNAを含むプローブを除いて)全てのプローブが、それらの標的配列が存在する場合に、シグナルの増加を引き起こした(図4a)。しかしながら、RNase H2が存在する反応条件では、RNA-プローブ及び標的DNAの二本鎖からのRNA塩基の切断に起因して、2’-フルオロRNAプローブ(配列番号17)についてのシグナルの更なる増加を検出した。他のプローブDNA (配列番号16)、PNA (配列番号10)、LNA (配列番号9)及び2’-O-メチルRNA (配列番号32)は、RNase H2によって切断されなかった。
2’-フルオロRNAプローブ(配列番号30)を用いて、低コピーの標的DNAを検出した。実施例1に記載された鎖侵入に基づく増幅反応条件下で、2’-フルオロRNAプローブを、S. typhimurium標的遺伝子の検出のためのアッセイに利用した。増幅のために使用されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び鎖侵入オリゴヌクレオチドは、それぞれ配列番号27、配列番号28及び配列番号29であった。
上述されたRNAプローブは、リバースプライマーの下流領域と重複するように設計されており、それゆえ標的配列に結合するためのリバースプライマーと競合し得た。配列番号17のプローブは、DNA増幅の出発物質となる(priming)ための基質としての機能を果たすことが可能であるか否かを、実施例2に記載された人工的な系を用いて研究した。図6aは、プローブが、その3’-末端に接続されたクエンチャーの存在に起因して、プライマーとしての作用を果たさなかったことを示す。標的配列の増幅は、相補的リバースプライマー(配列番号12)の存在下でのみ起こった。プローブが同種のリバースプライマーを用いずに単独で使用された場合、又は同種でない又は偽のリバースプライマー、SPU R-プライマー(配列番号33)とともに使用された場合、増幅は起こらなかった。更に、リバースプライマーがない試料では、RNase H2の存在下で増幅がみられなかった(図6b)。このことは、プローブが、増幅中において不活性であり、標的単位複製配列の結合にのみ関与することを示唆した。
2’-フルオロRNAを含むオリゴヌクレオチドは、プローブ及びプライマーの両方としての作用を果たし得るか否かを、実施例2に記載された人工的な系を用いて研究した(図7a)。配列番号12のリバースプライマーにおける一部又は全ての天然DNAヌクレオチドを、2’-フルオロRNAで置き換えて、配列番号13及び14のオリゴヌクレオチドを作製した。これらの2’-フルオロRNAプライマーは、天然型DNAリバースプライマーと同じくらい良好な効率で人工標的DNAを増幅することが可能であった(図7b)。数個の天然型DNA塩基を3′末端に保持する2’-フルオロRNAプライマー(配列番号14)は、より若干効率的であった。
天然型DNAプローブの配列を修飾して一部にRNA又は修飾RNA塩基を組み込むことにより、DNA結合タンパク質に対する抵抗性をもたらす能力を研究した。二重標識プローブ、UvsX及びT4-gp32の濃度は、実施例1において使用されたものと同一であった。
Claims (13)
- 一本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼアクセサリータンパク質若しくはリコンビナーゼコファクタータンパク質の存在下で、試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、該方法が、蛍光色素分子と、クエンチャーと、前記標的核酸配列に相補的な領域とを含む少なくとも1の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブに前記試料を接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含む、方法。
- 前記標的核酸配列の増幅を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅が、等温条件下で前記標的核酸配列の増幅を促進する条件下で行われる、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1の上流プライマー及び少なくとも1の下流プライマーであって、前記標的核酸配列に相補的な領域をそれぞれ含む該上流プライマー及び該下流プライマーと、前記試料を接触させることを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列に相補的な領域を含む鎖侵入オリゴヌクレオチドと、前記試料を接触させることを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸配列の増幅の出発物質となることが可能であり、かつ、前記少なくとも1の上流又は下流プライマーとして作用する、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼは、UvsX又はRecAから選択され、あるいは前記リコンビナーゼアクセサリータンパク質が、UvsY又はgp32から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブに存在する前記修飾RNAヌクレオチドが、少なくとも1の、2’-フルオロリボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド又はLNAリボヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料をRNase Hと接触させることを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号24、25又は30の配列あるいはそのいずれかのバリアントを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含むキットであって、該オリゴヌクレオチドプローブが、蛍光色素分子と、クエンチャーと、標的核酸配列に相補的な領域とを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブの配列が、少なくとも20%の、RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド及び/又はPNAヌクレオチドを含み、かつ加えて、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記配列が、
(i)前記標的核酸配列に相補的な領域を含む鎖侵入オリゴヌクレオチド;及び
(ii) 一本鎖DNAに結合可能な少なくとも1のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼアクセサリータンパク質若しくはリコンビナーゼコファクタータンパク質
を含む、キット。 - (i)前記キットが、前記標的核酸配列に相補的な領域を含む上流及び/又は下流プライマーを更に含み、又は(ii)前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸配列の増幅の出発物質となることが可能であり、かつ、前記上流プライマー又は前記下流プライマーとして作用する、請求項11に記載のキット。
- 被験体からの試料において請求項1〜12のいずれか1項に規定された方法を実行して、疾患と関連している標的核酸配列を検出することを含む、被験体における前記疾患の診断を補助する方法。
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