KR20180082401A - 성매개성 감염을 일으키는 다종의 병원체를 검출할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 프라이머 조성물과 이를 이용하여 성매개성 감염을 시각적으로 신속하게 진단하는 방법 - Google Patents

성매개성 감염을 일으키는 다종의 병원체를 검출할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 프라이머 조성물과 이를 이용하여 성매개성 감염을 시각적으로 신속하게 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성매개성 감염(sexually transmitted infection, STI)을 일으키는 병원체를 검출할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 프라이머 조성물과 이를 이용하여 시각적으로 신속하게 성매개성 감염을 진단하는방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 성매개성 감염 병원체 8종을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 및 이를 포함하는 조성물과 이를 이용하여 1시간 이내에 8종의 성매개성 감염여부를 시각적으로 판별할 수 있는 방법에 관한 것이다
본 발명에 따르면, 성매개성 감염 여부를 현장에서 육안으로 신속하게 판별하고 진단할 수 있어 성매개성 질환의 조기 진단 및 예방에 기여할 수 있으며, 그 치료 효과 및 관리를 극대화할 수 있다.

Description

성매개성 감염을 일으키는 다종의 병원체를 검출할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 프라이머 조성물과 이를 이용하여 성매개성 감염을 시각적으로 신속하게 진단하는 방법{Primers and the Composition for isothermal amplification reaction to detect the pathogens and Method for Rapid and Visual Diagnosis in sexually transmitted infections using thereof}
본 발명은 성매개성 감염(sexually transmitted infection, STI)을 일으키는 병원체를 검출할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 프라이머 조성물과 이를 이용하여 시각적으로 신속하게 성매개성 감염을 진단하는방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 성매개성 감염 병원체 8종을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 및 이를 포함하는 조성물과 이를 이용하여 1시간 이내에 8종의 성매개성 감염 여부를 시각적으로 판별할 수 있는 방법에 관한 것이다
인간의 성행위에 의한 감염병은 성행위의 은밀성과 병에 대한 혐오성이 결합되어 윤리적, 종교적 가치관과 배치되는 것이라는 막연한 인식으로 인해 지금까지 부끄러운 병, 감추어야 할 병으로 인식되어왔다. 이런 이유로 성매개병은 다른 병과는 달리 진단, 치료의 발전이 상대적으로 낙후된 상태였으며 급격한 산업화와 정보화로 인한 인간 대인간의 접촉 기회의 증가와 물질 풍요로 인한 쾌락추구 성향의 팽창으로 인해 성매개병의 종류가 다양화되었고 그 빈도는 꾸준히 증가하고 있다. 최근 들어 세균성 성매개병은 유병률이 감소하는 반면, 바이러스성 성매개병은 유병률이 의미있게 증가하고 있는 추세이다.
성매개 감염 (Sexually Transmitted Infection, STI)은 성적 접촉에 의해 감염자로부터 상대방에게 전염되는 것을 의미한다. 보다 자세하게는 명백한 증후를 갖고 있는 질환을 성 매개성질환(Sexually Transmitted Disease, STD)이라 하고, 증상 및 증후가 없는 무증상 감염까지 포함하는 개념을 성매개 감염 (Sexually Transmitted Infection, STI)으로 구분하였지만, 최근에는 STI로 통용되고 있다. STI는 전체 성인남녀의 약 50%가 평생에 한 번 이상 감염될 만큼 흔한 질병으로, 세계보건기구에 따르면 전세계적으로 치료 가능한 STI 환자는 매년 3억4천만 명 이상 새롭게 발생한다고 한다(J Microbiol., 45:453-459. 2007; WHO. Global Strategy for the prevention and control of sexually transmitted infections 2006-2015, 2007).
STI의 조기 진단과 치료가 이루어지지 않을 경우, 불임, 태아 사망, 자궁 외 임신, 항문생식기계통의 암, 미성숙 사망, 영유아 감염과 같은 합병증 또는 후유증을 초래할 수 있으며, 때론 치명적인 질환으로 생명에 위협을 줄 수 있다. STI는 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 STI의 진단 대상자인 유흥접객원 및 기타 STI 매개우려자 등에 대해 정기적인 STI 검진을 통한 감염자의 조기 발견과 치료로 STI 전파를 미연에 방지하는 것이 중요하다(Korean J UTII, 3:55-62, 2008).
그러므로 STI 병원체를 조기에 검출하여 무증상의 감염자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 또한, STI는 질환별 다양한 병원체에 따른 약제 및 치료 경과가 서로 다르기 때문에 정확한 병원체의 유전자형 검출을 통해 적합한 항균제로 신속한 치료를 받아야 하며, 그에 따른 정확한 병원체 검출에 따른 항균제를 복용함으로써 항균제 오남용을 막을 수 있다.
그러므로 STI 병원체를 조기에 검출하여 무증상의 감염자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 또한, STI는 질환별 다양한 병원체에 따른 약제 및 치료 경과가 서로 다르기 때문에 병원체의 유전자검사법을 이용한 정확한 병원체의 진단을 통해 적합한 약제처방으로 신속한 치료를 받을 수 있을 뿐만 아니라, 감염 증세 및 임상소견의 최종진단 결정에 확신성을 유도하기에 약물 오남용을 막을 수 있다.
STI의 병원체 검출 방법으로 그람염색, 선택배지에 의한 배양동정법, 혈청학적 방법, 및 핵산증폭 방법(PCR,SDA, TMA 등)이 주를 이루고 있다. 그람염색 및 배양동정법은 검사과정이 번거롭고 복잡하며, 장시간이 소요되며 진단 민감도가 낮은 문제점이 있다. 효소면역검사법(enzyme immunoassay, EIA)과 면역형광검사법(immunofluorescence technique)은 배양동정법에 비해 더 신속하고 민감도와 특이도가 높은 것으로 보고되고 있으나, 고비용의 단점이 있다. 핵산증폭의 대표적인 방법인 PCR(multiplex PCR과 specific PCR)은 병원체 게놈의 유전자형(DNA 및 RNA 염기서열)을 분석하는 유전자 검사법으로, 하나의 반응기 내에서 한 번의 반응으로 검사가 가능한 대상 병원체 수 및 검사 가능 샘플 수에 제한이 있으며, 각 대상 병원체에 대한 정확한 유전자형 검출이 가능한 유전자와 염기서열 부위 선택이 어렵고, 이에 대한 최적의 PCR 조건 수립에 어려움이 있다(J Microbiol., 45:453-459. 2007; Can J Infect Dis Med Microbiol., 16:73-76, 2005; J Microbiol Methods.,62:245-256, 2005).
본 발명자들은, 등온증폭반응 구체적으로는 LAMP (loop-mediated isothermal amplification) 반응을 이용하여 성매개성 감염 병원체를 분자생물학적으로 1시간 이내에 시각적으로 진단할 수 있는 방법을 고안하였다. 이는 Bst DNA polymerase가 DNA가닥교체(strand displacement) 작용이 65℃에서 이루어지는데 이는 주형(template)을 이용한 아령 모양의 1차 주형을 합성시키는 상보적인 프라이머와 2차 프라이머로 동일 주형을 이용하여 재합성이 이루어진다. 상기 두 가지 프라이세트의 인식부위 사이에는 추가증폭용 프라이머로 구성되어 기존 PCR 방법과 비교하여 높은 특이성과 1시간 이내에 감염 여부를 확인할 수 있는 진단방법이다.
1. Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9. 2. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63 3. Goto M, Honda E, Ogura A, Nomoto A, Hanaki K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009 Mar;46(3):167-72
본 발명의 목적은 1시간 이내에 성매개성 감염의 병원체를 육안 판별로 진단하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은,
1) 상기 방법은 등온증폭법을 이용함으로써 설비를 요구하는 고가의 유전자증폭장치나 실시간 PCR장비를 대처하는데 있다.
2) 상기 방법은 성매개성 감염 병원체의 유무를 발색정도로 확인하여 감염여부를 판별함으로써 전기영동 장치나 형광값을 측정하는 실시간 PCR 등의 장비를 대처하여 현장에서 신속하게 시각적으로 감염 여부를 진단하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 성매개성 감염 병원체에 대한 등온증폭용 프라이머 세트 및 프라이머 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 프라이머 조성물에 병원체 DNA를 LAMP(loop-mediated isothermal amplification)반응을 이용하여 반응시켜 발색 여부를 확인함으로써 감염 여부를 진단하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명에 사용되는 Bst DNA polymerase는 DNA가닥교체(strand displacement) 작용이 65℃의 항온에서 6개의 프라이머가 관여하여 기하급수(exponential)적으로 이루어지며, 병원체 특이적인 뉴클레오타이드 합성이 이루어져 1시간 내에 목표 증폭산물을 얻을 수 있는 특징을 갖는다. 이는 한쌍의 프라이머가 관여된 기존 PCR법에서 요구되는 3단계 목표온도의 순환하는 방식보다 효율성이 높은 방법을 제공한다.
본 발명에서는 발색시약으로 240uM hydroxy naphthol blue를 사용하며, hydroxy naphthol blue가 등온증폭반응에서 생성되는 Mg2+와 반응하여 보라색에서 파란색으로 변색되어 반응여부를 확인 할 수 있다. 발색시약으로는 Mg2+와 반응하여 변색 가능한 것이라면 hydroxy naphthol blue 외에도 다양한 발색시약이 사용될 수 있다.
본 발명에 의해, 성매개성 감염 병원체인 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 클라이미디아 트리코마티스(Chlamydia trachomatis), 마이코플라즈마 제니탈리움 호미니스(Mycoplasma genitalium), 가드네렐라 배지날리스(Gardenerella vaginalis), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 트리코모나스 배지날리스(Trichomonas vaginalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 중 적어도 하나 이상을 검출할 수 있으며, 유전자형 검출에 있어 정확성 및 신속성이 담보된 진단이 가능해 지며, 특히 1시간 내로 병원체 유무를 시각적으로 판별하여 감염 여부를 진단할 수 있게 된다.
이러한 본 발명의 등온증폭반응용 프라이머 세트는 다음의 프라이머 세트 1) 내지 8) 중 적어도 하나 이상이 선택된 것으로 이루어지는 것이 바람직하다.
1) 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어지는 칸디다 알비칸스(Candida albicans, CA) 증폭용 프라이머,
2) 서열번호 7 내지 서열번호 12로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis, CT) 증폭용 프라이머,
3) 서열번호 13 내지 서열번호 18로 이루어지는 가드네렐라 배지날리스(Gardenerella vaginalis, GV) 증폭용 프라이머,
4) 서열번호 19 내지 서열번호 24로 이루어지는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium, MG) 증폭용 프라이머,
5) 서열번호 25 내지 서열번호 30으로 이루어지는 마이코프라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis, MH) 증폭용 프라이머,
6) 서열번호 31 내지 서열번호 36으로 이루어지는 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae, NG) 증폭용 프라이머,
7) 서열번호 43 내지 서열번호 48으로 이루어지는 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum, UU) 증폭용 프라이머
또한, 본 발명의 등온증폭반응용 프라이머 조성물은, 제 1항의 등온증폭반응용 프라이머 세트와, dNTP, 반응버퍼, MgSO4, Bst DNA polymerase 및 발색시약을 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 발색시약은 하이드록시 나프톨 블루(hydroxy naphthol blue)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 성매개성 감염을 시각적으로 신속하게 진단하는 방법은, a) 제 2항의 프라이머 조성물에 성매개 감염 병원체의 표적 DNA를 제공하는 단계, b) 65℃에서 30분 내지 90분 반응시키는 단계, c) 발색 여부에 따라 병원체의 검출여부를 판별하는 단계를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다. 이때, 발색시약은 하이드록시 나프톨 블루(hydroxy naphthol blue)인 것이 바람직하다.
상기 성매개 감염 병원체는, 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum, UU), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae, NG), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis, CT), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium, MG), 가드네렐라 배지날리스(Gardenerella vaginalis, GV), 마이코프라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis, MH), 칸디다 알비칸스(Candida albicans, CA) 중 적어도 하나 이상이다.
본 발명은 본 발명은 성매개성 감염 병원체에 대한 등온증폭용 프라이머 세트 및 프라이머 조성물 및 상기 프라이머 조성물에 병원체 DNA를 등온증폭반응시켜 발색 여부를 확인함으로써 감염 여부를 진단하는 방법 및 이의 용도를 모두 포함한다.
본 발명에 따르면, 성매개성 감염 여부를 현장에서 육안으로 신속하게 판별하고 진단할 수 있어 성매개성 질환의 조기 진단 및 예방에 기여할 수 있으며, 그 치료 효과 및 관리를 극대화할 수 있다.
도 1 내지 도 8은 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 등온증폭반응 결과가 시각적으로 판별되는 것을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
[진단 대상]
본 발명은 성매개 감염 질환의 진단, 바람직하게는 성 매개 감염 질환 및 항생제의 내성을 동시에 진단하는 것에 관한 것이다.
성매개 감염증은 과거에 임상증상과 병변이 생식기에 존재하는 상태를 나타내는 성병 (venereal disease, VD)이라는 용어로 사용돼 왔다. 그러나 이러한 VD라는 용어로는 성접촉에 의하여 전파되는 이들 질병의 특성을 제대로 표현하지 못하기 때문에, 이후에 성매개 질병(sexually transmitted disease, STD)으로서 명명하여 사용하였다. 그러나 질병(disease)이라는 용어는 감염 여부와 상관없이 병적 상태를 나타내는 단어이기 때문에, STD라는 용어의 사용으로는 이들 질병이 성접촉에 의하여 전파되는 병원체에 의한 감염증을 제대로 표현할 수 없다. 따라서 WHO에서는 이들 질병의 역학적 특성인 성접촉에 의하여 전파되며, 임상증상이나 병변의 유무에 관계없이 병원체의 전파에 의한 감염증이라는 사실을 표현할 수 있는 용어로서 성접촉에 의하여 전파되는 감염증 또는 성매개 감염증(sexually transmitted infection, STI)으로 부를 것을 권장하고 있다.
STI는 30개 이상의 병원체에 의한 감염 질환으로서, 원인에 따라 바이러스, 세균 감염, 원충 감염 및 곰팡이균 감염 등으로 나눌 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
바이러스는 DNA 또는 RNA 동물 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. DNA 바이러스는 파포바바이러스 (예를 들어, 유두종 바이러스), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스), 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순 포진 바이러스) 및 폭스바이러스 (예를 들어,두창 바이러스)와 같은 바이러스류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 박테리아(세균)는 그람(gram) 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 항산성(acid-fast) 박테리아 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 기생생물은 기생충 (예를 들어, 유충류), 특히 선충류 (회충류, 예를 들어 편충, 구충, 요충, 회충, 사상충 등), 촌총류 (예를 들어, 촌충)를 비롯한 (이에 제한되지 않음) 기생충을 포함한다.
본 발명은 성매개 감염 질환에 관한 아래 8종의 병원체를 판별하고 진단할 수 있다.
우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum, UU)
나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae, NG)
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis, CT)
마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium, MG)
가드네렐라 배지날리스(Gardenerella vaginalis, GV)
마이코프라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis, MH)
트리코모나스 배지날리스(Trichomonas vaginalis, TV)
칸디다 알비칸스(Candida albicans, CA)
또한, 본 발명은 바람직하게는 상기 성매개 감염 질환의 진단과 동시에 항생제 내성에 관한 진단을 동시에 하는 것을 포함한다.
임상의들이 성매개 감염 질환의 진단 및 치료에 있어 경험에 의한(empirical) 항생제 처방을 선호함으로써 항생제 내성 병원체들의 발생 및 전파율이 급격히 증가하고 있다. 이는 바이러스성과 세균성 증상이 서로 비슷하여 쉽게 감별진단 할 수 없는 때가 많다. 병원체는 배양조건이 어려울 뿐만 아니라, 배양 후 병원체의 염색을 통한 해석에 오류를 범할 수 있다. 또한 명확한 결과를 위해서는 추가 확진검사가 요구되기 때문에 신속한 치료를 요구하는 환자의 처방은 경험적인 치료를 할 수 밖에 없다는 문제가 존재한다.
그러므로, 성매개 감염질환의 진단 및 치료에 있어서, 항생제 내성의 문제 해결이 필요한 실정이다.
특히 임균 및 클라마이디아 등 중요 STI균의 경우, 항생제 남용에 따라 베타 락탐계 항생제 내성, 테트라사이클린계 내성이 흔히 나타난다. 이는 곧 치료 실패와 합병증, 감염 확산, 경제적 손실로 나타나서, 임상 진료에서 큰 문제가 되고 있다. 따라서 이러한 항생제 내성을 정확하고 신속하게 분석하여, 적절한 항생제를 선택할 수 있는 것이 중요하다.
그러므로, 본 발명의 방법은 성매개 감염 질환의 진단과 동시에 항생제 내성 유전자를 함께 분석하여 STI의 치료에 가장 널리 사용되는 항생제에 대한 내성을 미리 정확하게 파악하여 치료 방침 결정과 치유에 도움을 줄 수 있다.
본 발명은 성매개 감염 발생 초기에 감염증 병원체를 감별하여 정확한 원인을 규명함으로써 경험에 의한 항생제 처방을 지양할 수 있고 더 나아가 감염 병원체가 항생제 내성을 보유하고 있는지 여부까지 판별함으로써 특이적인 항생제 선택을 통해 항생제 내성율 감소에 기여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 성매개 감염질환의 정확한 원인을 규명함으로써 경험에 의한(empirical) 항생제 처방을 지양함과 동시에 감염 병원체의 항생제 내성 유무까지 판별함으로써 병원체에 효과적인 항생제 선택을 통해 항생제 내성율을 감소시킬수 있는 분석방법, 진단 키트 그리고 칩을 제공한다.
[등온증폭반응]
본 발명은 등온증폭반응 구체적으로는 LAMP (loop-mediated isothermal amplification) 반응을 이용하여 성매개성 감염 병원체를 분자생물학적으로 1시간 이내에 시각적으로 판별하고 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다.
이하에서는 등온증폭법에 대해 간략히 설명한다.
표준 PCR의 경우 고가의 cycler 장비와 반응시 오염의 우려, 여러 온도를 거치는 번거로움 등의 제한이 있다. 그래서 이러한 문제를 해결하기 위해, 등온 PCR 방법이 고안되었으며, 특이적 기능을 가지는 폴리머라제(polymerase)의 발견으로 현실화 되고 있으며, 다음과 같은 방법들이 이용되고 있다.
- LAMP (Loop-mediated isothermal amplification): LAMP 방법은 단순하고 빠른 등온 증폭 방법으로 strand displacement DNA synthesis 기능을 가지는 Bst DNA polymerase 를 이용한 방법이다. 두 쌍의 특이적 primer를 이용하여 loop을 형성한 후 계속적으로 증폭시키는 방법이다. 고가의 장비없이 특정 DNA를 one-step으로 증폭할 수 있어, 기초 과학뿐만 아니라 여러 임상적 샘플에서 진단 및 검출 방법으로 이용되고 있다.
- NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification): Isothermal transcription-based amplification 방법이다. 즉 RNA나 DNA로부터 RNA를 합성하는 등온 PCR 방법의 하나이다. 이 방법은 reverse transcriptase, RNase H, T7 DNA dependent RNA polymerase의 세 가지 효소를 이용하여, RNA를 증폭하는 방법이다. 임상적으로 RT-PCR 방법보다 더 효과적으로 genomic DNA가 섞인 샘플에서 RNA를 증폭할 수 있는 방법이다.
- MDA (Multiple displacement amplification): MDA 방법은 strand displacement DNA synthesis 기능을 가지는 bacteriophage phi29 DNA polymerase를 이용하는 등온 증폭 방법으로서, modified 된 random primer를 사용하여 전체 게놈을 높은 fidelity를 유지하며 증폭할 수 있는 방법이다. 매우 적은 양의 (1-10 copies) 인간 게놈을 약 20-30 mg 까지 증폭 시킬 수 있는 유용한 방법으로 임상적 샘플이나 희귀 샘플을 이용한 실험에 매우 유용한 방법이다.
- RCA (Rolling circle amplification): RCA 방법은 대표적인 등온 증폭 방법으로 일정 온도에서 circular 형태의 DNA를 증폭할 수 있는 방법이다. Bacteriophage phi29 DNA polymerase를 이용하며, polymerase가 circular 형태의 DNA에 결합된 primer를 시작으로 합성이 일어나며, 계속해서 DNA를 따라 증폭이 일어나는 방법으로 다른 등온 방법에 비해 최적화 조건이 거의 필요 없는 방법이다. 증폭 산물은 target DNA에 붙어 있는 형태로 나오기 때문에, 세포나 조직에서의 분석에서 특이적 signal을 필요로 하는 실험에 유용할 수 있는 방법이다.
이하에서는 실시예 및 도면을 이용하여 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 성매개성 감염 병원체에 대한 증폭용 프라이머를 이용하여 LAMP(loop-mediated isothermal amplification)반응을 이용하여 발색정도를 반응 후 즉시 분석 및 진단하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명에 사용되는 Bst DNA polymerase는 DNA가닥교체(strand displacement) 작용이 65℃의 항온에서 6개의 프라이머가 관여하여 기하급수(exponential)적으로 이루어지며, 병원체 특이적인 뉴클레오타이드 합성이 이루어져 1시간 내에 목표 증폭산물을 얻을 수 있는 특징을 갖는다. 이는 한쌍의 프라이머가 관여된 기존 PCR법에서 요구되는 3단계 목표온도의 순환하는 방식보다 효율성이 높은 방법을 제공한다.
본 발명에서는 발색시약으로 240uM hydroxy naphthol blue를 사용하며, hydroxy naphthol blue가 등온증폭반응에서 생성되는 Mg2+와 반응하여 보라색에서 파란색으로 변색되어 반응여부를 확인 할 수 있다. 발색시약으로는 Mg2+와 반응하여 변색 가능한 것이라면 hydroxy naphthol blue 외에도 다양한 발색시약이 사용될 수 있다.
본 발명에 의해, 성매개성 감염 병원체인 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 클라이미디아 트리코마티스(Chlamydia trachomatis), 마이코플라즈마 제니탈리움 (Mycoplasma genitalium), 가드네렐라 배지날리스(Gardenerella vaginalis), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 트리코모나스 배지날리스(Trichomonas vaginalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 유전자형 검출에 있어 정확성 및 신속성이 담보된 진단이 가능해 지며, 특히 1시간 내로 병원체 유무를 시각적으로 판별하여 감염 여부를 진단할 수 있게 된다.
[프라이머 디자인]
본 발명에서는 성매개성 감염 병원체를 LAMP(loop-mediated isothermal amplificatin)법을 이용하여 검출하기 위해 다음과 같이 서열번호 1 내지 서열번호 48의 프라이머(primer)를 디자인하였다.
세트 번호 프라이머
이름 		서열정보 (5'--> 3')
세트 1
(CA)		 서열번호 1 CA_LF CTGTGCCGTTGTTTAATGCAC
서열번호 2 CA_LB TAAACTGGATTGACCGTTTTGTGC
서열번호 3 CA_F3 AACTTGTCTATAATGTTGTCTGT
서열번호 4 CA_B3 CCCTTTTCGATAAACTCTTGAA
서열번호 5 CA_FIP GTGTTGGGTTATCTTCCGTGCATTTTCCTTTATGTTTTTGTTGATGAGC
서열번호 6 CA_BIP CTGCCATAATTTAGTCCCCGTTCTTTTGCAAAAATGAAATGAAGAAGCA
세트 2
(CT)		 서열번호 7 CT_LF TCGCCCGCACGTTCTCT
서열번호 8 CT_LB TCTTCGTTGACCGATGTACTCT
서열번호 9 CT_F3 GGGGTTATCTTAAAAGGGATTG
서열번호 10 CT_B3 CCGTCAGACAGAAAAGAGG
서열번호 11 CT_FIP CCGGAAAAATGGTGGGGTTAATTTTCAGCTTGTAGTCCTGCTTG
서열번호 12 CT_BIP AGCGAGTTACGAAGACAAAACCTTTTACTTATCCTCAGAAGTTTATGCA
세트 3
(GV)		 서열번호 13 GV_LF TATCGCAGCCCGTCACGTC
서열번호 14 GV_LB AGACCCGGCCACTGTTATG
서열번호 15 GV_F3 GTAAGGGCGTATGGTGGATG
서열번호 16 GV_B3 TTTCACTTCCCTGCGTACC
서열번호 17 GV_FIP CAAAGCCCACTCGGCAGCTCTTTTTTGGTAGACAGGACCGATGA
서열번호 18 GV_BIP ATCCGAGGATTTCCGAATGGGGTTTTCCCCACAAAAACTGTGGTGA
세트 4
(MG)		 서열번호 19 MG_LF CTAGCAGCTTTTCTTGAAAGCATGA
서열번호 20 MG_LB TTAGCGAGTGAACTATAGCCAAGG
서열번호 21 MG_F3 TCGAGTGAACGAGTGATC
서열번호 22 MG_B3 TTCTTCACTGCGGCTTAC
서열번호 23 MG_FIP GTTCGTTCTCGGTACTGGTTACAGTTTTAGTAGCGAAGGTGGCAAT
서열번호 24 MG_BIP GTAGTCAAGGAGAGGATCCTAAGGTTTTCCTTCTCGCTAACTTACGG
세트 5
(MH)		 서열번호 25 MH_LF GCACGGCCATTACAGCCAA
서열번호 26 MH_LB TGGCTTTTAACCATTGGGTCAG
서열번호 27 MH_F3 AATAAGAGCCACTGCCCA
서열번호 28 MH_B3 GCTCTCTTGATCAATTTCTTGA
서열번호 29 MH_FIP GCATTTATGGTGCCCAGGACTTTTTCGCTACGGACTTAAAATCCG
서열번호 30 MH_BIP GCCCTTAGCTCAGCAGGTAGTTTTAATGGTACGCCCTAGAGG
세트 6
(NG)		 서열번호 31 NG_LF ACCGGCTTTTACGCCACT
서열번호 32 NG_LB AAAGTGCACGGATCTACTAACCC
서열번호 33 NG_F3 GGTCGACATGGTGCTACT
서열번호 34 NG_B3 AGTATGCAACTTAGACAAACC
서열번호 35 NG_FIP AGCATCAAAAACCAAACGCATAGTTTTCAGCCTGCTAAAGAGGGT
서열번호 36 NG_BIP ATGGGCATTCATAATATTTCCGCCTTTTTCTAATGTTGCACGTACGATA
세트 7
(TV)		 서열번호 37 TV_LF GGTTGACAACACCAACTGTGAA
서열번호 38 TV_LB AAAGCAGTGCATGTTCTGGG
서열번호 39 TV_F3 GCCATCGTCAAGAACCTTGT
서열번호 40 TV_B3 AGCTTGATAGCCTGCTTGTT
서열번호 41 TV_FIP TGCCGAGTGGAAGAGCTGTTTCTTTTCTCAGATTCCAAAGGACCGC
서열번호 42 TV_BIP TCGATCACCTTCCAGAAGGCACTTTTGCACCGACTGTACCATCAG
세트 8
(UU)		 서열번호 43 UU_LF TCCTGTTGCCCCTCAGTC
서열번호 44 UU_LB ACGAAGCAGGATTTGTTGAACA
서열번호 45 UU_F3 TCCAATCTTTGAACAAATCGT
서열번호 46 UU_B3 CCTTCTGTATGGTAAGCGT
서열번호 47 UU_FIP CAGTTTTTTCAGCAACTGTTAATGCTTTTTTGTGGTCTTAAGATTCACGAA
서열번호 48 UU_BIP GCTGTTGCTATCCATACAGATACATTTTGGATTGTACGTCCTTTCATTG
[실시예]이하, 상기 방법을 수행하기 위한 본 발명의 일 실시예를 구체적으로 설명한다.
상기에서 디자인된 프라이머로 제작된 프라이머세트를 성매개감염 병원체를 검출하는데 사용가능한지를 확인하기 위하여, 증폭 및 발색반응용 조성물을 제조하였다.
반응 혼합물은 총 25ul로 1ul의 병원체 DNA, 0.8mM Betaine, 8mM MgSO4, 1.5mM each dNTP, 1X 반응버퍼(20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 10mM KCL, 0.1% Trostion X-100), 240uM Hydroxy naphthol blue, 8U Bst DNA polymerase (New England Biolabs)와 각 병원체에 해당하는 5pmole F3와 B3, 40pmole FIP와 BIP, 20pmole LF와 BF의 프라이머와 증류수 1.15ul로 반응튜브에 첨가하였다.
제조된 조성물은 65℃ 반응용기에서 1 시간 반응하였다. 반응된 튜브는 육안관찰 및 발광상자를 이용하여 일반 디지털카메라로 촬영하여 발색정도의 변화를 확인할 수 있었다. 또한 10ul를 2% agarose gel에서 전기영동하여 증폭된 양상을 확인하였고, 이는 육안으로 판별된 발색된 정도와 일치하는 것을 관찰하였다.
도 1 내지 도 8은 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 등온증폭반응 결과가 시각적으로 판별되는 것을 나타낸 것이다.
각 도면의 lane 1 내지 6 은 108, 107, 106, 105, 104 copies 및 주형이 없이 증류수 만을 첨가한 것을 나타내며, lane M은 DNA size marekr를 나타낸다. 각 도면의 좌상은 PCR 반응물의 자연광원 하에서 확인된 결과이고, 좌하는 좌상의 이미지를 반전한 이미지이다.
도 1은 lane 1 내지 4 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, 반전 이미지에서 lane 6의 무반응 튜브와 보라색을 나타냄을 확인할 수 있었다. lane 5에서는 각각 중간 정도의 색감을 확인할 수 있었는데, 이는 전기영동의 결과에서 lane 5가 다른 반응물에 비해 적은 증폭정도를 나타내는 것으로 판별되었다.
도 2는 lane 1 내지 5 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, lane 6은 보라색으로 나타냄을 확인할 수 있었다. 반전이미지에서도 lane 1 내지 5와 lane 6은 뚜렷이 구분되는 반전된 색깔을 나타내었다. 이는 전기영동의 결과와 같이 반응의 유무에 따른 반응정도와 일치함을 확인하였다.
도 3은 lane 1 내지 5 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, lane 6은 보라색으로 나타냄을 확인할 수 있었다. 반전이미지에서도 lane 1 내지 5와 lane 6은 뚜렷이 구분되는 반전된 색깔을 나타내었다. 이는 전기영동의 결과와 같이 반응의 유무에 따른 반응정도와 일치함을 확인하였다.
도 4는 lane 1 내지 5 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, lane 6은 보라색으로 나타냄을 확인할 수 있었다. 반전이미지에서도 lane 1 내지 5와 lane 6은 뚜렷이 구분되는 반전된 색깔을 나타내었다. 이는 전기영동의 결과와 같이 반응의 유무에 따른 반응정도와 일치함을 확인하였다.
도 5는 lane 1 내지 5 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, lane 6은 보라색으로 나타냄을 확인할 수 있었다. 반전이미지에서도 lane 1 내지 5와 lane 6은 뚜렷이 구분되는 반전된 색깔을 나타내었다. 이는 전기영동의 결과와 같이 반응의 유무에 따른 반응정도와 일치함을 확인하였다.
도 6은 lane 1 내지 4 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, lane 5 내지 6 은 보라색으로 나타냄을 확인할 수 있었다. 반전이미지에서도 lane 1 내지 4 와 lane 5 내지 6은 뚜렷이 구분되는 반전된 색깔을 나타내었다. 이는 전기영동의 결과와 같이 반응의 유무에 따른 반응정도와 일치함을 확인하였다.
도 7은 lane 1 내지 4 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, lane 5 내지 6 은 보라색으로 나타냄을 확인할 수 있었다. 반전이미지에서도 lane 1 내지 4 와 lane 5 내지 6은 뚜렷이 구분되는 반전된 색깔을 나타내었다. 이는 전기영동의 결과와 같이 반응의 유무에 따른 반응정도와 일치함을 확인하였다.
도 8은 lane 1 내지 3 까지 자연광 이미지에서 반응물이 파란색으로 나타났고, lane 4 내지 6 은 보라색으로 나타냄을 확인할 수 있었다. 반전이미지에서도 lane 1 내지 3 와 lane 4 내지 6은 뚜렷이 구분되는 반전된 색깔을 나타내었다. 이는 전기영동의 결과와 같이 반응의 유무에 따른 반응정도와 일치함을 확인하였다. 다만, lane 4는 증폭정도가 약하기에 발색반응에 발생정도에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
이상과 같이 도면과 명세서에서 최적 실시 예가 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미 한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위하여 사용된 것은 아니다. 그러므로 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (1)

1) 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어지는 칸디다 알비칸스(Candida albicans (CA)) 증폭용 프라이머,
2) 서열번호 7 내지 서열번호 12로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis (CT)) 증폭용 프라이머,
3) 서열번호 13 내지 서열번호 18로 이루어지는 가드네렐라 배지날리스(Gardenerella vaginalis (GV)) 증폭용 프라이머,
4) 서열번호 19 내지 서열번호 24로 이루어지는 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium (MG)) 증폭용 프라이머,
5) 서열번호 25 내지 서열번호 30으로 이루어지는 마이코프라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis (MH)) 증폭용 프라이머,
6) 서열번호 31 내지 서열번호 36으로 이루어지는 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae (NG)) 증폭용 프라이머,
7) 서열번호 43 내지 서열번호 48으로 이루어지는 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum (UU)) 증폭용 프라이머,
상기 1) 내지 7) 중 적어도 하나 이상이 선택된 등온증폭반응용 프라이머 세트, 및
dNTP, 반응버퍼 그리고 Bst DNA polymerase를 포함하여 이루어지는 등온증폭반응용 프라이머 조성물.
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