CN115655848B - 一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒 - Google Patents
一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物化学和临床检验技术领域，提出了一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括：第一缓冲液，抗干扰剂，LDH，MDH，PEG6000，NADH，BSA，防腐剂；所述第一试剂的pH≥9.0；所述第二试剂包括：第二缓冲液，L‑天门冬氨酸，α‑酮戊二酸，防腐剂；所述第二试剂的pH≥5.5。通过上述技术方案，解决了现有技术中的测定谷草转氨酶试剂盒稳定性差、抗干扰能力差问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学和临床检验技术领域，具体的，涉及一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒。
背景技术
天门冬氨酸氨基转移酶(AST)也称为谷草转氨酶，主要存在于心肌细胞中，肝细胞次之。在心肌细胞内含量较多，当心肌梗死时，血清中AST活力增高，在发病后6-12h之内显著增高，在48h达到高峰，约在3-5天恢复正常。血清中AST也可来源于肝细胞，各种肝病可引起血清中AST的升高，中毒性肝炎还可更高。肌炎症、胸膜炎、肾炎等也可引起血清AST的轻度增高，还可能存在心肌细胞、肝细胞及骨骼肌损伤。临床上主要用于病毒性肝炎、阻塞性黄疸、心肌梗死的辅助诊断。
目前体外检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的方法主要有赖氏法、酶偶联比色法及连续监测法(速率法)。赖氏法的缺点是标本AST活性高时，草酰乙酸对AST显示的反馈抑制，使测定结果偏低；酶偶联比色法所用的氯化硝基四氮唑蓝(NBT)有毒，可能有致癌性，不满足绿色原则；连续监测法的优点是可以确定线性期并计算每分钟吸光度的变化(ΔA/min)，根据此值再准确地计算酶活性，可以利用全自动生化分析仪进行检测，酶和底物反应的特异性好，检测结果准确度高。以上三种方法相比较，采用连续监测法较佳。
CN107860729B公开了一种用于测定样本中谷草转氨酶的试剂盒，其试剂盒是双试剂，其中第一试剂包含TRIS，pH8.9、NADH、LDH、MDH、EDTA、TritonX-100、BSA、Proclin；第二试剂包含TRIS，pH6.5、L-天门冬氨酸、α-酮戊二酸，有效改善了NADH指示系统体外诊断试剂的热稳定性、机载稳定性、运输稳定性，可有效延长试剂盒的保存时间。但是第一试剂中的TRIS和第二试剂中TRIS所组成的缓冲液对，并没有在试剂盒的反应最佳pH值点，并且第一试剂的pH值无法保护NADH。
目前，市面上多采用双试剂的酶偶联的连续检测方法检测血清AST，由于试剂中酶和NADH的存在，在保存和使用中，以及在打开瓶盖上机操作时不稳定，为检测血清AST带来困难，而且存在稳定性能差、抗干扰能力弱等问题。因此，本领域亟需一种稳定性强、抗干扰能力强的谷草转氨酶检测试剂。
发明内容
本发明提出一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，解决了相关技术中的测定谷草转氨酶试剂盒稳定性差、抗干扰能力差问题。
本发明的技术方案如下：
一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，
所述第一试剂包括：第一缓冲液，抗干扰剂，LDH，MDH，PEG6000，NADH，BSA，防腐剂；
所述第一试剂的pH≥9.0；
所述第二试剂包括：第二缓冲液，L-天门冬氨酸，α-酮戊二酸，防腐剂；
所述第二试剂的pH≥5.5。
作为进一步的技术方案，所述第一试剂包括：第一缓冲液60~100mmol/L，抗干扰剂2mmol/L，LDH 4KU/L，MDH 1KU/L，PEG6000 0.1~5g/L，NADH 0.3mmol/L，BSA 1~3g/L，防腐剂0.5ml/L；
所述第一试剂的pH≥9.0；
所述第二试剂包括：第二缓冲液100~200mmol/L，L-天门冬氨酸 500mmol/L，α-酮戊二酸 36~76mmol/L，防腐剂0.8ml/L；
所述第二试剂的pH≥5.5。
作为进一步的技术方案，所述第一试剂包括：第一缓冲液100mmol/L，抗干扰剂2mmol/L，LDH 4KU/L，MDH 1KU/L，PEG6000 5g/L，NADH 0.3mmol/L，BSA 2g/L，防腐剂0.5ml/L；
所述第一试剂的pH=9.1；
所述第二试剂包括：第二缓冲液150mmol/L，L-天门冬氨酸 500mmol/L、α-酮戊二酸 70mmol/L、防腐剂 0.8ml/L；
所述第二试剂的pH＝5.5。
作为进一步的技术方案，所述第一缓冲液为Tris缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸缓冲液。
作为进一步的技术方案，所述抗干扰剂为EDTA。
作为进一步的技术方案，所述防腐剂为Proclin 950。
作为进一步的技术方案，所述第一试剂中PEG6000与BSA的质量比为5:2。
作为进一步的技术方案，还包括质控品和/或校准品。
本发明还提出了一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒的使用方法，将第一试剂和待测样品混合，孵育后，加入第二试剂混合均匀，测定吸光度。
作为进一步的技术方案，所述第一试剂与待测样品、第二试剂的体积比为4:0.3:1。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明提供了一种稳定性强、抗干扰能力强的用于测定谷草转氨酶的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。第一试剂包括：第一缓冲液，抗干扰剂，LDH，MDH，PEG6000，NADH，BSA，防腐剂；第二试剂包括：第二缓冲液，L-天门冬氨酸，α-酮戊二酸，防腐剂。
2、本发明一方面通过将NADH置于第一试剂中，使其在反应初期和样本孵育过程中消耗掉干扰物质，如血清中游离的α-酮酸、丙酮酸、草酰乙酸和一些能使NADH转变为NAD+的物质；另一方面通过添加一定量的PEG6000和防腐剂，使NADH更稳定不容易降解失效，进而提高了试剂盒的稳定性和抗干扰能力，使检测值准确度更高。
3、本发明通过将第一试剂的pH调节至9.0以上，第二试剂的pH调节至5.5以上，使NADH更利于保存，提高了试剂盒的稳定性和抗干扰能力。此外，第二试剂中的L-天门冬氨酸容易让NADH失效，本发明通过调节适当的pH更利于L-天门冬氨酸溶解，选择柠檬酸缓冲液使反应处于最佳的反应环境。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
以下对照组、实施例及对比例的试剂盒的制备方法如下：
S1、将PEG6000溶于水中，制备PEG6000溶液，备用；
S2、将800mL水与Tris、EDTA、PEG6000溶液混合，完全溶解后，使用4mol/L的盐酸调节pH，随后依次加入Proclin、BSA搅拌至溶解后，加入LDH、MDH、NADH溶解，定容至1L，混匀，即为第一试剂；
S3、将800mL水与柠檬酸、柠檬酸钠、L-天门冬氨酸、α-酮戊二酸、Proclin混合，完全溶解后，用4mol/L的盐酸调节pH，定容至1L，混匀，即为第二试剂。
对照组
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
第一试剂（R1）的pH为9.1；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为5.5。
实施例1
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 1g/L
第一试剂（R1）的pH为9.1；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为5.5。
实施例2
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 2g/L
第一试剂（R1）的pH为9.1；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为5.5。
实施例3
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 3g/L
第一试剂（R1）的pH为9.1；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为5.5。
实施例4
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 2g/L
Proclin300 0.5ml/L
第一试剂（R1）的pH为9.1；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为5.5。
实施例5
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 2g/L
Proclin950 0.5ml/L
第一试剂（R1）的pH为9.1；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为5.5。
实施例6
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 2g/L
Proclin950 0.5ml/L
第一试剂（R1）的pH为9.5；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为5.5。
实施例7
检测试剂盒，包括第一试剂（R1）和第二试剂（R2），具体如下：
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 2g/L
Proclin950 0.5ml/L
第一试剂（R1）的pH为9.1；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为6。
对比例1
与实施例5的区别仅在于将PEG6000替换为等量的TritonX-100。
对比例2
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 2mmol/L
LDH 4KU/L
MDH 1KU/L
NADH 0.3mmol/L
PEG6000 5g/L
BSA 2g/L
Proclin950 0.5mL/L
第一试剂（R1）的pH为8.9；
第二试剂（R2）：
柠檬酸缓冲液 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 500mmol/L
α-酮戊二酸 70mmol/L
Proclin300 0.8ml/L
第二试剂（R2）的pH为6.5。
对比例3
第一试剂（R1）：
Tris 100mmol/L
EDTA 5mmol/L
LDH 1.35KU/L
MDH 0.9KU/L
NADH 0.27mmol/L
TritonX-100 1g/L
BSA 2g/L
Proclin950 0.5mL/L
第一试剂（R1）的pH为8.9；
第二试剂（R2）：
Tris 150 mmol/L
L-天门冬氨酸 720mmol/L
α-酮戊二酸 36mmol/L
第二试剂（R2）的pH为6.5。
加速稳定性测试：
TBA-120FR全自动生化分析仪设置参数：
分析方法：速率法； 反应方向：负；
主波长：340nm； 副波长：405nm；
温度：37℃； 样本量：15μL；
第一试剂（R1）：200μL； 第二试剂（R2）：50μL；
延迟时间：90s； 测量时间：1~3min。
（1）试剂空白吸光度（37℃加速7天，观察NADH下降程度，反应试剂盒的稳定性），结果记录在表1中：
表1 空白吸光度
（2）线性高值样本测定值（37℃加速7天，观察高值样本测定情况，反应试剂盒的线性稳定，高值样本的浓度在667U/L），结果记录在表2中：
表2 线性高值
（3）机载试剂稳定性测试：测定朗道质控品（28天2~8℃仪器试剂仓，看质控测定情况，反应试剂盒的开瓶稳定性），结果记录在表3中：
表3 机载稳定性
（4）长期稳定性（在2~8℃冷库存储一年，观察试剂空白吸光度变化以及朗道质控测定值，观察试剂实际情况保存效果），结果记录在表4中：
HN1530-1399UN 靶值：38U/L（30-46）
HE1532-1080UE 靶值：142U/L（114-170）
表4 长期稳定性
（5）抗干扰能力测试
干扰评价：用超纯水梯度稀释干扰物质，并将各浓度的干扰物质按照1:9的比例分别添加到空白对照血清(即不含有干扰物质的正常人混合血清)中，各干扰物质浓度如表5~16所示。用实施例5及对比例1~3提供的试剂盒分别测定空白血清和加入不同浓度干扰物质的血清的检测结果，每份血清样本测定3次取均值，并计算均值与空白对照血清测量值的偏差，即为干扰度。
干扰度=（该浓度下的均值-空白对照的均值）/空白对照的均值*100％
若干扰度的绝对值小于10％，记作抗干扰，否则记作不抗干扰。其中干扰药物包括羟苯磺酸钙、抗坏血酸和血红蛋白。
表5 实施例5试剂盒的血红蛋白干扰试验
表6 对比例1试剂盒的血红蛋白干扰试验
表7 对比例2试剂盒的血红蛋白干扰试验
表8 对比例3试剂盒的血红蛋白干扰试验
表9 实施例5试剂盒的抗坏血酸干扰试验
表10 对比例1试剂盒的抗坏血酸干扰试验
表11 对比例2试剂盒的抗坏血酸干扰试验
表12 对比例3试剂盒的抗坏血酸干扰试验
表13 实施例5试剂盒的羟苯磺酸钙干扰试验
表14 对比例1试剂盒的羟苯磺酸钙干扰试验
表15 对比例2试剂盒的羟苯磺酸钙干扰试验
表16 对比例3试剂盒的羟苯磺酸钙干扰试验
综上所述，本发明实施例1~7所提供的检测试剂盒具有良好的抗干扰性和稳定性，且具有很好的灵敏性，有效克服了现有技术中存在的缺点，具有高度产业利用价值。
对比例1与实施例5的区别仅在于将第一试剂（R1）中的PEG6000替换为等量的TritonX-100，对比例1提供的试剂盒的稳定性、抗干扰能力不如实施例5，因此，使用PEG6000可以使NADH更稳定不容易降解失效，使试剂盒的稳定性和抗干扰能力更强。
对比例2与实施例5的区别仅在于第一试剂（R1）与第二试剂（R2）的pH不同，对比例2提供的试剂盒的稳定性和抗干扰能力不如实施例5。因此本发明将第一试剂的pH调节至9.0以上，第二试剂的pH调节至5.5以上，使NADH更利于保存，使试剂盒稳定性和抗干扰能力更强。
对比例3提供的试剂盒的稳定性和抗干扰性不如实施例5，因此本发明提供的测定谷草转氨酶的试剂盒稳定性强、抗干扰能力强。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其特征在于，所述第一试剂包括：第一缓冲液60~100mmol/L，抗干扰剂2mmol/L，LDH 4KU/L，MDH 1KU/L，PEG6000 0.1~5g/L，NADH 0.3mmol/L，BSA 1~3g/L，防腐剂 0.5ml/L；
所述第一试剂的pH≥9.0；
所述第二试剂包括：第二缓冲液100~200mmol/L，L-天门冬氨酸 500mmol/L，α-酮戊二酸 36~76mmol/L，防腐剂0.8ml/L；
所述第二试剂的pH≥5.5。
2. 根据权利要求1所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，其特征在于，所述第一试剂包括：第一缓冲液100mmol/L，抗干扰剂2mmol/L，LDH 4KU/L，MDH 1KU/L，PEG60005g/L，NADH 0.3mmol/L，BSA 2g/L，防腐剂 0.5ml/L；
所述第一试剂的pH=9.1；
所述第二试剂包括：第二缓冲液150mmol/L，L-天门冬氨酸 500mmol/L、α-酮戊二酸70mmol/L、防腐剂 0.8ml/L；
所述第二试剂的pH＝5.5。
3.根据权利要求1所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液为Tris缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，其特征在于，所述抗干扰剂为EDTA。
5. 根据权利要求1所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为Proclin 950。
6.根据权利要求1所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中PEG6000与BSA的质量比为5:2。
7.根据权利要求1所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒，其特征在于，还包括质控品和/或校准品。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒的使用方法，其特征在于，将第一试剂和待测样品混合，孵育后，加入第二试剂混合均匀，测定吸光度。
9.根据权利要求8所述的一种稳定型的谷草转氨酶测定试剂盒的使用方法，其特征在于，所述第一试剂与待测样品、第二试剂的体积比为4:0.3:1。
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