JP6703722B1 - L−グルタミンの測定方法、及びそのためのキット - Google Patents
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Abstract
Description
[1] L−グルタミン酸オキシダーゼを含む、 L−グルタミン測定のためのキットであって、検量線を作成するための標準物質としてL−グルタミン酸を含む 、キット。
[2] 1に記載のキットであって、L−グルタミン酸オキシダーゼを含む下記の反応液Iと、下記の反応液IIを含有する、キット:
(反応液I)L−グルタミン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを含み、
(反応液II)グルタミナーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む。
ただし、反応液I及びIIは、下記も満たす:
・いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含み、
・いずれか一方がペルオキシダーゼを含む。
[3] L−グルタミン酸が、溶液の形態である、1又は2に記載のキット。
[4] 反応液Iと反応液IIを予め混合した後にさらにL−グルタミン酸を混合するとの、検量線を作成するための指示を含む、1〜3のいずれか1項に記載のキット。
[5]カプラー化合物が、4−アミノアンチピリンである、1〜4のいずれか1項に記載の測定キット。
[6] 新トリンダー試薬が、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン・ナトリウム塩(TOOS)、又はN−エチル−N−スルホプロピルアニリン(ALPS)である、1〜5のいずれか1項に記載のキット。
[7] 反応液Iが、さらにアスコルビン酸オキシダーゼを含む、1〜6のいずれか1項に記載のキット。
[8] 下記(1)、(2)、及び(3)を含む、試料中のL−グルタミンを測定する方法:
(1)容器内で、試料中のL−グルタミン酸に、L−グルタミン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを作用させ、L−グルタミン酸を分解し、かつ所望により、試料中のアスコルビン酸又はエリソルビン酸に、アスコルビン酸オキシダーゼを作用させ、アスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解する工程;
(2)(1)に続いて同じ容器内で行われる工程であって、該カタラーゼに、カタラーゼ失活剤を作用させ、カタラーゼを失活させ、かつ試料中のL−グルタミンに、グルタミナーゼを作用させ、L−グルタミン酸を生成し、生成したL−グルタミン酸に、Lグルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、及び新トリンダー試薬を作用させ、色素を形成させる工程;及び
(3)L−グルタミン酸を含む標準液に、L−グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、及び新トリンダー試薬を作用させ、色素を形成させる工程。
[9](1)、(2)及び(3)の工程が、15〜35℃で行われる。8に記載の方法。
本発明により、L−グルタミン測定のキット製品全体を室温で長期間安定なものとできる。
(反応液I)L−グルタミン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを含む。
(反応液II)グルタミナーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む。
ただし、反応液I及びIIは、下記も満たす:
・いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含み、
・いずれか一方がペルオキシダーゼを含む。
本発明のキットは、L−グルタミンの測定のための標準物質として、L−グルタミン酸を含む。L−グルタミン酸は、好ましくは水に溶解した溶液の形態、すなわち標準液としてキットに含まれる。
本発明で用いられる反応液Iは、L−グルタミン酸オキシダーゼ及びカタラーゼを含有することができる。これらを含有させる液としては、各種緩衝液を利用することができる。緩衝液としては、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸、トリスアミノメタン、HEPES、MES、Bis−トリス、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、MOPS、BES、TES、DIPSO、TAPSO、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS及びこれらの塩などを利用することが可能である。
本発明で用いられる反応液IIは、L−グルタミナーゼ(単に、グルタミナーゼということもある。)及びカタラーゼ失活剤を含有することができる。上記酵素及びカタラーゼ失活剤を含有させる液としては、各種緩衝液を利用することができる。緩衝液の例としては、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸、トリスアミノメタン、HEPES、MES、Bis−トリス、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、MOPS、BES、TES、DIPSO、TAPSO、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS及びこれらの塩などを利用することが可能である。
本発明のキットが反応液I及びIIを含む場合、反応液I及びIIは、下記を満たす:
・いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含み、
・いずれか一方がペルオキシダーゼを含む。
本発明のL−グルタミン測定キットは、長期間安定に保存することが可能である。
本発明では、L−グルタミンを測定するため、まず試料に反応液Iを添加する。試料中に内在性のL−グルタミン酸が存在する場合、当該工程によりこれを除去する。当該反応条件は、使用する酵素の至適pH、至適温度にしたがって設定すればよいが、おおむね、pH6.0〜8.0、温度15〜30℃の条件下で、5〜20分ほど実施することができる。
(実験方法)
L-グルタミン標準液(100mg/L)とL-グルタミン酸標準液(100mg/L)を調製した日を
0タイムとし、37℃に1週間〜10週間保管して、継時的にそれぞれL-グルタミンとL-グルタミン酸の濃度を、前掲特許文献1(特許第6049795号)及び特許文献2(特許第6218894号)に記載のL-グルタミン測定キットとL-グルタミン酸測定キットで発色して吸光度を測定した。0タイムの吸光度を100%として、継時的に測定した吸光度を%表示でグラフ化した。
L-グルタミン溶液は不安定であることが知られているが、図1に示すように、本実験でもL-グルタミン標準液(100mg/L)の吸光度は37℃、1週間で約10%減少し、4週間で約20%、10週間で約40%減少した。
(実験方法)
L-グルタミン測定キット(GN)(前掲特許文献1)のA液及びB液を調製した。その4日後に、正確に各々200mg/Lになるように調製したL-グルタミン溶液とL-グルタミン酸溶を調製した。さらにその5日後に、先に調製した200mg/Lの液を用いて、各々200mg〜12.5mg/Lの濃度の標準液を調製した。A液及びB液の組成を下表に示した。なお、以下の実験では、特に記載した場合を除き、L-グルタミン測定キットというときは本実験で用いたキットと同じものを指す。
(1)0.05mlの各濃度のGNのL-グルタミン標準液を6本の試験管に採り、そこへ30秒間隔でGN-A液0.5mlを加える。
(2)10分後、各試験管へ30秒間隔でGN-B液を加える。
(3)最初の試験管にGN-B液を加えてから10分経過したら、30秒おきにOD555nmを測定する
(1)GN-A液0.5mlとGN-B液0.5mlを試験管に採りよく混ぜる。
(2)そこへ0.05mlの各濃度のGNの L-グルタミン標準液を、30秒毎に加える。
(3)最初の試験管にL-グルタミン標準液を加えてから10分経過したら、30秒おきにOD555nmを測定する。
(1)GN-A液0.5mlとGN-B液0.5mlを試験管に採りよく混ぜる。
(2)そこへ0.05mlの各濃度のL-グルタミン酸標準液を、30秒毎に加える。
(3)最初の試験管にL-グルタミン酸標準液を加えてから10分経過したら、30秒おきにOD555nmを測定する。
冷凍保存していたトマトの抽出液(20gのトマトを200mlの水でミキサーし、コーヒーフィルターで濾過した濾液を試料とした。)10試料と、冷蔵保存してある日本酒(原液を試料とした)10試料を、L-グルタミン測定キット(前掲特許文献1)を用いて測定した。検量線は、L-グルタミン標準液による2-1、及びL-グルタミン酸による2-3を用いた。
結果を各々の表に示した。
L-グルタミン測定キット(GN)の構成で、L-グルタミン酸標準溶液を使用する場合、B液添加後、A液添加までの時間の影響がどの程度あるかを確認した。
L-グルタミン酸標準溶液(100mg/L)に、L-グルタミン測定キットのB液を添加後、直
ちにA液を添加する(0分)か、又はB液添加後2分〜20分後にA液を添加して、A液を添加してから10分間発色反応を行った後の吸光度を測定した。すなわち、B液添加後にA液添加までの時間を空けるとどうなるかを検討した。
(2)0.5mlのGN-B液を1分毎に加えていき、GN-B液添加後、0分、2分、4分〜20分の間をあけて、GN-A液を加える。
(3)最初の試験管にGN-A液を加えてから10分経過したら、それぞれの間隔でOD555nmを測定する。
OD555nmの測定値を下表と図4に示した。
L-グルタミン酸溶液(6.7mM / 0.1Mリン酸バッファー pH6.0)0.54 mLに、L-グルタミン測定キットに使用されているグルタミナーゼ(10 U/mL)を0.06 mL加えて30℃でインキュベーションし、GABA測定キット((株)エンザイム・センサ、特許文献3参照)を用いてGABAの生成を555 nmの吸光度で測定した。
特許文献2:特開2017−12169号公報(特許第6218894号)
特許文献3:特許第6585244号公報
非特許文献1:Biochem. Biophys.Res. Commun., 448, 361-364 (2014)
Claims (5)
- 下記の反応液Iと、下記の反応液IIを含有する、L−グルタミン測定のためのキットであって、L−グルタミン定量用の検量線を作成するための標準物質としてL−グルタミン酸を含み、反応液Iと反応液IIを予め混合した後にさらにL−グルタミン酸を混合するとの、検量線を作成するための指示を含む、キット:
(反応液I)L−グルタミン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを含み、
(反応液II)グルタミナーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む。
ただし、反応液I及びIIは、下記も満たす:
・いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含み、
・いずれか一方がペルオキシダーゼを含む。 - L−グルタミン酸が、溶液の形態である、請求項1に記載のキット。
- カプラー化合物が、4−アミノアンチピリンである、請求項1又は2に記載の測定キット。
- 新トリンダー試薬が、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン・ナトリウム塩(TOOS)、又はN−エチル−N−スルホプロピルアニリン(ALPS)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のキット。
- 反応液Iが、さらにアスコルビン酸オキシダーゼを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキット。
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