JPWO2018012606A1 - 反応促進剤 - Google Patents

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Abstract

ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物を提供する。式(I)により表される化合物を含むペルオキシダーゼ反応促進剤及びこれを用いた過酸化水素測定方法。

Description

本発明は、反応促進剤、例えばペルオキシダーゼの反応促進剤に関する。
ペルオキシダーゼは、種々の酵素測定法に広く利用されている。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP)(EC1.11.1.7）は酵素免疫測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay、ELISA）や各種の診断キット、診断薬、検出反応等に広く利用されている。しかしながら、HRPは主として天然の原料に依存しており、栽培したワサビ大根（Armoracia rusticana）を収穫し、抽出を行った後に精製される。こうしたことから、HRPの生産量は干ばつや温度変化など天候的要因によって左右されやすい。そのため、限られたHRP資源を効果的に活用することが望まれている。
この問題に対するアプローチとして、ペルオキシダーゼの生産量を安定させるべく、遺伝子組み換え技術を用いてペルオキシダーゼを産生する方法が挙げられる。例えば代表的なペルオキシダーゼであるC1aは、遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列が明らかになっている（非特許文献１）。C1a遺伝子を用いた組換え発現は大腸菌で試みられているが、その発現量は高いとは言えず、約0.11mg/L培地（非特許文献２）である。また、酵母での組換え発現量は約5.3mg/L（非特許文献３）との報告がある。しかしながら、この発現系ではHRPに糖鎖が付加されており、ELISAで使用する場合には抗体標識の際、糖鎖が抗体標識に影響を及ぼす可能性がある。そのため、組換え発現産物が天然の原料を置き換えるには至っていない。また、組換え発現の場合にも、依然としてペルオキシダーゼの消費量は大きく、ペルオキシダーゼの効果的な利用方法が望まれている。
特許文献１は、反応系におけるフェノチアジン誘導体色素を吸光度測定により検出する方法において、フェノチアジン誘導体の検出波長をシフトさせる化合物を記載している。
国際公開第２００８／０９３７２２号パンフレット
Eur. J. Biochem.,1988, vol. 173, pp. 681-687 Biotechnol. Prog.,1999, vol. 15, pp. 467-471 Protein. Engineering, 2000, vol. 13,pp.377-384
こうした問題に鑑み、本発明は、ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物、すなわちペルオキシダーゼ反応促進剤を提供する。さらに本発明はペルオキシダーゼ反応促進剤を含む組成物を提供する。さらに本発明はペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる過酸化水素測定方法を提供する。
上記問題を解決するために、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことにペルオキシダーゼの反応を促進させることのできる化合物を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の実施形態を包含する。
[１] ペルオキシダーゼ、及び、下記の式（I)で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、過酸化水素の測定方法、
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＯ−ＮＨ２、−Ｒ３、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
−Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
−Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[２] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは１に定義したとおりである、１に記載の方法。
[３] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１が、
からなる群より選択され、Ｒ２が、
からなる群より選択され、式中、Ｘは１に定義したとおりである、１又は２に記載の方法。
[４] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、１に記載の方法、
［式中、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
−Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
−Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[５] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、１に記載の方法、
［式中、
Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
[６] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、１に記載の方法、
［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｘ、及び
からなる群より選択され、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]。
[７] 式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS 1689-82-3）、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
からなる群より選択される化合物である、１〜６のいずれかに記載の方法。
[８] 式（I)により表される化合物を含む、ペルオキシダーゼ反応促進剤、
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＯ−ＮＨ２、−Ｒ３、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
−Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
−Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[９] 式（I)により表される化合物において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは８に定義したとおりである、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
[１０] 式（I)により表される化合物において、Ｒ１が、
からなる群より選択され、Ｒ２が、
からなる群より選択され、式中、Ｘは８に定義したとおりである、８又は９に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
[１１] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
［式中、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
−Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
−Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[１２] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
［式中、
Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
[１３] 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｘ、及び
からなる群より選択され、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]。
[１４] 式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS1689-82-3）、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
からなる群より選択される化合物である、８〜１３のいずれかに記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
[１５] ペルオキシダーゼ及び８〜１４のいずれかに記載のペルオキシダーゼ反応促進剤を含む、過酸化水素測定用組成物。
[１６] ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、１５に記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-138640号の開示内容を包含する。
本発明の効果として、ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進することができる。これにより診断試薬や測定試薬へのペルオキシダーゼの処方量を、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤を添加しない場合と比較して、低減することができる。また同一のペルオキシダーゼの処方量であれば、酵素反応が促進されるため、測定の高感度化及び／又は反応時間短縮が可能となる。
希釈試料と第１試薬−Ａを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定した結果を示す。横軸は時間（分）であり、縦軸はＡ６９４／７５１である。また、Ａ６９４／７５１と、ΔＡ9ｍiｎ及びΔＡ10ｍiｎとの関係を示す。
ある実施形態において、本発明は、ペルオキシダーゼ反応促進剤を提供する。ここでペルオキシダーゼ反応促進剤とは、ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物をいう。ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進するとは、ペルオキシダーゼ反応促進剤が系に存在しない場合と比較して、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤が系に存在する場合、同一反応時間中により多くの過酸化水素が分解される、又は、より短時間で過酸化水素分解反応が完了する若しくはほぼ完了することをいう。
ペルオキシダーゼとしては任意の公知のものを使用しうる。ペルオキシダーゼは、過酸化水素と発色剤との酸化還元反応を触媒する。この反応により発色剤が発色する。ある実施形態において、反応が促進されるペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。ある実施形態において、反応が促進されるペルオキシダーゼは、ヘム依存性ペルオキシダーゼ、例えば動物ヘム依存性ペルオキシダーゼ、非ヘム依存性ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えばラクトペルオキシダーゼ、チオールペルオキシダーゼ、例えばグルタチオンペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、又はクロリドペルオキシダーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、Arthromyces ramosus由来ペルオキシダーゼ、Coprinus由来ペルオキシダーゼである。本発明の反応促進剤という場合、特に断らない限りこれはペルオキシダーゼ反応促進剤を意味する。
ある実施形態において、本発明は、ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、過酸化水素分解を利用した測定方法を提供する。ある実施形態において、本発明の測定方法は、過酸化水素を含む試料又は酵素反応等により過酸化水素が生成しうる試料にペルオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼ反応促進剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、発色剤を含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ反応促進剤を含む第１試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。発色剤を含む第２試薬は、単一の試薬でもよく、他の成分を含んでもよい。測定は定性的でも定量的でもよい。
別の実施形態では、本発明の測定方法は、ペルオキシダーゼ反応促進剤を含む第２試薬にペルオキシダーゼ、及び発色剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、並びに、過酸化水素を含む試料又は酵素反応等により過酸化水素が生成しうる試料を添加し加温する工程を含む。やはり試薬中の各成分は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
上記の第１試薬と第２試薬を一つの試薬として、単一工程にて添加することもできる。すなわち、別の実施形態において、本発明の測定方法は、過酸化水素を含み得る試料又は過酸化水素を生成しうる試料に、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ反応促進剤、及び発色剤を含む測定試薬を添加し加温する工程、並びに試薬の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ反応促進剤、及び発色剤を含む測定試薬は単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
ある実施形態において、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いることができる。この場合、本発明の測定方法は、HRPの基質となる過酸化水素を生成するための工程をさらに有しうる。過酸化水素生成は、任意の公知の反応により行うことができる。例えばHbA1cに直接作用しうるヘモグロビンA1ｃオキシダーゼ（A1cOX）を、HbA1cを含む試料に添加すると、HbA1cが酸化され、過酸化水素が生じる。
HRPは溶液中に遊離していてもよく、固相に固定化されたものでもよい。HRPは、単独でもよく、別の化合物やタンパク質、例えば酵素や抗体に連結されたものでもよい。
試料溶液に添加する本発明の反応促進剤の終濃度は特に限定されず、例えば、０．０１〜２００ｍＭ、０．０２〜１５０ｍＭ、０．０３〜１００ｍＭ、０．０４〜８０ｍＭ、０．０５〜６０ｍＭ、０．０６〜５０ｍＭ、０．０８〜４０ｍＭ、０．１ｍＭ〜３０ｍＭ、０．１５〜２０ｍＭ、０．２〜１０ｍＭ、０．３〜５ｍＭ、０．４〜３ｍＭ、例えば０．０５〜１０ｍＭの範囲であり得る。例えば試料溶液中に生成しうる過酸化水素の濃度が０〜０．００５ｍＭの場合、添加する本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤の終濃度は、例えば、０．０１〜２０ｍＭ、例えば０．０２〜１０ｍＭとすることができる。試料溶液に添加する本発明の反応促進剤の終濃度は特に限定されず、例えば０．００１〜５％（ｗ／ｖ）、０．００３〜３％（ｗ／ｖ）、０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、０．０２〜０．３％（ｗ／ｖ）、０．０３〜０．１％（ｗ／ｖ）であり得る。なお、反応促進剤と他の酵素や試薬との添加順序は制限されず、同時でも逐次添加でもよい。
ある実施形態において合計反応時間は、６０分以下、３０分以下、２０分以下、好ましくは１５分以下、好ましくは１０分程度とすることができる。例えば、上記の第1試薬添加後の加温を３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分、例えば５分程度とすることができ、上記の第2試薬添加後の加温を３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分、例えば５分程度とすることができる。また、試料に含まれる又は試料中に生成すると推定される過酸化水素の濃度範囲に対して、ペルオキシダーゼによる反応が完了するか又はほぼ完了するよう、測定試薬の各成分の濃度を調節することができる。反応が完了するとは、試料に含まれる過酸化水素、又は当該試料から潜在的に生成されうる過酸化水素の１００％が反応したことをいう。反応がほぼ完了するとは、試料に含まれる過酸化水素、又は当該試料から潜在的に生成されうる過酸化水素の例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上が反応したことをいう。
吸光度測定における測定波長は、発色剤に応じて選択することができる。吸光度の測定波長は、例えば340〜900nm、590〜900nm、600〜751nm、610〜730nmでありうる。ある実施形態において、２つの測定波長A1及びA2で測定を行い、その差（A1-A2又はA1／2と表記することがある）を取得することもできる。２つの測定波長A1及びA2は、590〜900nmの範囲の任意の２つの波長とすることができる。例えばA1を色素の吸光波長とし、A2をバックグラウンド波長とし、その差（A1-A2）を算出し得る。吸光度の測定波長は、フェノチアジン誘導体色素を用いる場合、590〜730nm、例えば610〜710nmでありうる。バックグラウンド波長は、フェノチアジン誘導体色素を用いる場合、当該フェノチアジン誘導体色素の吸収がほとんどない領域、例えば710nmより高く900nm以下である範囲から選択することができる。例えばA1＝A694とし、A2＝A751とし、これらからA694-A751を算出してもよい。吸収波長をA1＝A654としてもよい。吸光度測定は自動分析装置を用いて行ってもよい。
発色剤は、特に限定されないが、過酸化水素存在下でのペルオキシダーゼの触媒反応により吸光度が変化する化合物が好ましい。発色剤としては、４−アミノアンチピリンや、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（Ｎ-エチル-Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−ｍ−トルイジンナトリウム）、ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３、７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノシアジン）、ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４、４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４−アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ−６４、ＤＡ−６７は４−アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。さらに発色剤として、メチレンブルー、１０−（アセチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−（フェニルカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−ヘキサメチル−アミノ）−フェノチアジン、１０−（（３−（メチルカルボキシアミノ）−４−メチル−フェニル）−アミノ）−フェノチアジン、１０−（（３−（メチルカルボキシアミノメチル）−フェニル）−メチルアミノ）−フェノチアジン、１０−（１−ナフタレンアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチル）−フェノチアジン、１０−（フェニルアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチルアミノ）−フェノチアジン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、トルイジンブルーＯ、１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、メチレングリーン若しくはその塩、又はそのロイコ体等が挙げられるがこれに限らない。発色剤は、反応溶液における終濃度が、０.００１〜１０ｍＭ、例えば０.００５〜２ｍＭとなるよう添加しうる。
測定反応に用いるペルオキシダーゼとしては任意の公知のものを使用しうる。ある実施形態において、ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。ある実施形態において、ペルオキシダーゼは、ヘム依存性ペルオキシダーゼ、例えば動物ヘム依存性ペルオキシダーゼ、非ヘム依存性ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えばラクトペルオキシダーゼ（LPO）、チオールペルオキシダーゼ、例えばグルタチオンペルオキシダーゼ（GluP）、甲状腺ペルオキシダーゼ（TPO）、バナジウムブロモペルオキシダーゼ（VBrPO）、又はクロリドペルオキシダーゼ（ClPO)である。これらは公知のものや市販のものを利用しうる。
西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、以下の反応を触媒する。
ドナー化合物＋H2O2→酸化型ドナー化合物＋2H2O
ドナー化合物は電子供与体ともいい、フェノール、グアイヤコール、ピロガロール系化合物等が挙げられる。HRPにはアイソザイムが存在するが、本明細書でHRPというとき、これは主要アイソザイムであるペルオキシダーゼC1aを指す。HRPは４つの分子内Ｓ−Ｓ結合を有する。またHRPは構造形成にカルシウムイオンが必須である。さらにHRPは酵素活性にヘム補因子を必要とする。
過酸化水素分解反応は緩衝溶液中で行うことができる。過酸化水素生成反応も行う場合は、当該生成反応と同じ緩衝溶液を過酸化水素分解反応に使用しうる。反応溶液のｐＨは特に限定されないが、例えば３〜１１、４〜１０、５〜９、例えば６〜８でありうる。反応温度は、例えば、１０〜４５℃、１０〜４０℃、１０〜３８℃、２０〜３７℃、例えば２５〜３７℃でありうる。反応時間は、０．１〜６０分、０．１〜３０分、０．１〜２０分、０．〜１５分、０．１〜１０分、例えば０．１〜５分であり得る。
ペルオキシダーゼは、試料溶液中に含まれる過酸化水素、又は過酸化水素を生成しうる基質の量にもよるが、例えば終濃度が０.０１〜３００ＫＵ/Ｌ、０.０１〜１００ＫＵ/Ｌ、０.０１〜５０Ｕ/ｍＬ、０.１〜２０Ｕ/ｍＬ、０．２〜１０Ｕ／ｍＬ、０.５〜５０ＫＵ／Ｌ、例えば０.５〜１０Ｕ／ｍＬとなるよう試料に添加することができる。ペルオキシダーゼの活性「Ｕ」は、次の反応条件下で、20秒間に1mgのプルプロガリン(purpurogallin)を生成する酵素(POD)量を1 プルプロガリン単位と定義する。
試薬：
A. 5%(W/V)ピロガロール水溶液
B. 0.147M H2O2水溶液(30%(W/V)H2O2溶液1.67mlを蒸留水で希釈して100mlとする)
C. 0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0 (反応混液及び酵素希釈用)
D. 2.0N H2SO4溶液
酵素溶液：酵素標品を予め氷冷した0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0で溶解し、同緩衝液で3.0〜6.0 プルプロガリン U/Pに希釈して氷冷保存する
手順：
１ 試験管(32φ×200mm)に下記反応混液を調製し、20℃で約５分間予備加温する
14.0ml 蒸留水
2.0ml ピロガロール水溶液(A)
1.0ml H2O2水溶液(B)
2.0ml リン酸緩衝液(C)
２ 酵素溶液1.0mlを加え、反応を開始する
３ 20℃で正確に20秒間反応させた後、H2SO4溶液(D)1.0mlを加えて反応を停止させる。反応停止後の混液から生成したプルプロガリンをエーテル15mlで抽出する。この操作を5回繰り返し、抽出液を合わせ、更にエーテルを加えて全量を100mlにする。この液について420nmにおける吸光度を測定する(ODtest)。
４ 盲検は反応混液１を20℃で20秒間放置後、H2SO4溶液(D)1.0mlを加えて混和し、次いで酵素溶液1.0mlを加えて調製する。この液につき上記同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する(OD blank)。
計算式は次のとおりである：
U/ml＝ΔOD(OD test-OD blank)×希釈倍率／（0.117×1ml）
＝ΔOD×8.547×希釈倍率
U/mg ＝ U/ml×1/C
0.117: 1mg% プルプロガリンエーテル溶液の420nmにおける吸光度
C : 溶解時の酵素濃度(c mg/ml)
1プルプロガリン単位は13.5国際単位(o-ジアニシジンを基質とし、25℃の反応条件下)に相当する。
吸光度測定には、任意の公知の分光光度計や検出機器を使用しうる。反応溶液の吸光度は発色した発色剤の量を示し、ここから試料中の過酸化水素濃度を決定しうる。また、過酸化水素を生成する反応と共役させた場合は、当該過酸化水素を生成するための基質の濃度を決定しうる。濃度が既知の過酸化水素を含む標準物質についての吸光度を測定し、濃度と吸光度の関係をプロットして検量線を作成しうる。次いで、濃度未知の過酸化水素、又は過酸化水素を生成するための基質を含む試料について吸光度を測定し、前記検量線から過酸化水素、又は過酸化水素を生成するための基質の濃度を決定しうる。
ある実施形態において、本発明は、ペルオキシダーゼ反応促進剤を含む、過酸化水素測定用組成物を提供する。この組成物は場合により、過酸化水素を生成しうる酵素、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、安定化剤、発色剤、界面活性剤等を含み得る。また本発明の組成物に、過酸化水素以外の化合物を測定するためのさらなる酵素や試薬を追加してもよい。
緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、ＨｂＡ１ｃ変性剤等として、界面活性剤（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、１−ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ−１００、ブリッジ３５、ブリッジ５８、ツイーン８０、コール酸塩、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、トレハロースＣ８、トレハロースＣ１０、トレハロースＣ１２、トレハロースＣ１４、トレハロースＣ１６、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０、ヘキサデシルピリジニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ノニルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、へキシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ−システイン等）、亜硝酸塩、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は以下の式（I)により表される化合物を含む。
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＯ−ＮＨ２、−Ｒ３、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
−Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
−Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
６員単環は場合により１、２、３、４若しくは５つの置換基により置換されていてもよく、１０員縮合環は場合により１、２、３、４、５、６若しくは７つの置換基により置換されていてもよい。
芳香族の単環の炭素環としてはベンゼン環が挙げられる。芳香族の炭素環と炭素環との縮合環としてはナフタレン環が挙げられる。
−Ｃ１−６アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル（n-プロピル、イソプロピル）、ブチル（n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル）、ペンチル（n-ペンチル、tert-ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、3-ペンチル）、ヘキシル（n-ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキシル）基が挙げられる。
−Ｃ2−６アルケニルとしては、エテニル基（ビニル基）、１-プロペニル基、２-プロペニル基（アリル基）、１-ブテニル基、２-ブテニル基、３-ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などが挙げられる。
−Ｃ2−６アルキニルとしては、エチニル基、１-プロピニル基、２-プロピニル基、１-ブチニル基、２-ブチニル基、３-ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などが挙げられる。
−Ｏ−Ｃ１−６アルキルは、Ｃ１−６アルコキシ基ともいい、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基などの直鎖状又は分岐鎖状アルコキシ基が挙げられる。
ある実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環（ベンゼン環）である。ある実施形態において、Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環であり、Ｒ２は１０員の炭素環の縮合環（ナフタレン環）である。
ある実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、
からなる群より選択される基である。式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは上記に定義したとおりである。
ある実施形態において、Ｒ１は、
からなる群より選択され、Ｒ２は、
からなる群より選択され、式中、Ｘは上記に定義したとおりである。
ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を含む：
［式中、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
−Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
−Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を含む：
［式中、
Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を含む：
［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｘ、及び
からなる群より選択され、
Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]。
ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS 1689-82-3）、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下のAlizarin Yellow GG（CAS584-42-9）、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下のChrome Yellow（CAS6054-97-3）、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下のDirect Yellow 44（CAS8005-52-5）、
以下の式により表される化合物、
［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下の2-ヒドロキシ-1-(2-ヒドロキシ-4-スルホ-1-ナフチルアゾ)-3-ナフトエ酸（CAS 3737-95-9）、
からなる群より選択される化合物である。
本発明の反応促進剤からは、以下の式により表される化合物(Tartrazine、CAS 1934-21-0)は除かれる：
上記の式IV〜式VIIIの化合物は市販されているものやそれらの塩を使用しうる。他の式I〜IIIの化合物は慣用の手法を用いて合成するか、又は市販されているものを使用しうる。
化合物がペルオキシダーゼによる過酸化水素分解反応を促進するか否かは、系に候補化合物を添加した場合の反応の進行と、添加しなかった場合の反応の進行とを比較することにより評価することができる。
（過酸化水素測定方法の例）
本発明の過酸化水素測定試薬及び測定方法について例示する。ただし本発明はこれ限定されない。
過酸化水素及び色素は市販のものを使用しうる。ペルオキシダーゼは、天然の原料から精製してもよく、又は市販品を使用してもよい。
以下の過酸化水素測定用試薬を調製する。
濃度既知の過酸化水素試料
０〜０．０００３％（ｗ／ｖ） 過酸化水素
第１試薬−Ａ（ペルオキシダーゼ、ロイコ色素を含む溶液）
３０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
０．２％（ｗ／ｖ） ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．０６７Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ １０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ−６７、和光純薬工業製）
Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して、次に示す手順に沿ってＨｂＡ１ｃを測定する。イオン交換水８μｌを、９６μｌの第１試薬−Ａに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの濃度既知の過酸化水素試料を添加して過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。イオン交換水と第１試薬−Ａを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、それらの差であるＡ６９４／７５１を求める。横軸に過酸化水素の濃度を、縦軸にイオン交換水と第１試薬を混合してから１０分後のＡ６９４／７５１をプロットし、過酸化水素濃度とＡ６９４／７５１の相関性を表す検量線を作成する。
次に、濃度既知の過酸化水素試料の代わりに、濃度未知の過酸化水素試料を用いて、上記と同様の測定を行う。イオン交換水と第１試薬−Ａを混合してから１０分後のＡ６９４／７５１と、上記で作成した検量線を用いて、試料の過酸化水素濃度を決定する。
以下の実施例において本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。特に断らない場合、試薬は市販品を用いた。
［実施例１］ペルオキシダーゼによる過酸化水素検出反応が完遂した場合における吸光度の測定
本実施例では、過剰量のペルオキシダーゼを用いて、過酸化水素検出反応が完遂した場合の吸光度変化量を決定する。
以下の組成を有する過酸化水素測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して過酸化水素の測定を実施した。
（試料）
１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
０．０００１２％（ｗ／ｖ） 過酸化水素
（第１試薬−Ａ）
３０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
０．２％（ｗ／ｖ） ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．０６７Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ １０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ−６７、和光純薬工業製）
（第２試薬）
０．４８％（ｗ／ｖ） 表１における比較例２の化合物（和光純薬工業）、本発明の化合物のいずれか一つ（いずれも東京化成工業）、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水
第２試薬８μｌを、９６μｌの第１試薬−Ａに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの試料を添加して過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。第２試薬と第１試薬−Ａを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、第２試薬と第１試薬−Ａを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、第２試薬と第１試薬−Ａを混合してから４．８分後は、試料を添加する直前を表す。第２試薬と第１試薬−Ａを混合してから９分後、１０分後のΔＡ（ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎ）を表１に示す。また、一例として、比較例１における、Ａ６９４／７５１、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎの関係性を図１に示す。
表１に示した通り、本発明の化合物及び比較例について、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎに差は見られない。つまり、希釈試料と第１試薬−Ｂを混合してから１０分後には、過酸化水素の定量反応は完遂していることが分かる。そこで、各比較例、及び本発明におけるΔＡ１０ｍｉｎを、それぞれの条件において過酸化水素定量反応が１００％進行した時のΔＡ（ΔＡ１００％）と定義した。
［実施例２］本発明の化合物による、ペルオキシダーゼによる過酸化水素検出反応促進効果の確認
次に本実施例では、少量のペルオキシダーゼを用いて、本発明の化合物による、過酸化水素検出反応の促進の度合いを決定した。
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して過酸化水素の測定を実施した。
（試料）
１００ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
０．０００１２％（ｗ／ｖ） 過酸化水素
（第１試薬−Ｂ）
３０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ６．５
０．２％（ｗ／ｖ） ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．０１３Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ １０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ−６７、和光純薬工業製）
（第２試薬）
０．４８％（ｗ／ｖ） 表２における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水
第２試薬８μｌを、９６μｌの第１試薬−Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの試料を添加して過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。第２試薬と第１試薬−Ｂを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、第２試薬と第１試薬−Ｂを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、第２試薬と第１試薬−Ｂを混合してから４．８分後は、試料を添加する直前を表す。
次に、本実施例で算出されたΔＡを実施例１で定義したΔＡ１００％で割り、過酸化水素検出反応の進行度を算出した。第２試薬と第１試薬−Ｂを混合してから７．５分後及び１０分後（換言すると、それぞれ試料を添加してから２．５分及び５分後）の過酸化水素検出反応の進行度を表２に示す。
表２に示した通り、Tartrazine、Alizarin Yellow GG、Chrome Yellow、Direct Yellow44、4-(フェニルアゾ)フェノール、及び2-ヒドロキシ-1-(2-ヒドロキシ-4-スルホ-1-ナフチルアゾ)-3-ナフトエ酸は、ペルオキシダーゼを用いた過酸化水素検出反応を促進した。
本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤を用いることにより、過酸化水素測定試薬に処方するペルオキシダーゼの量を低減することができる。また、同量のペルオキシダーゼを用いた場合の測定感度を向上させることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. ペルオキシダーゼ、及び、下記の式（I)で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、過酸化水素の測定方法、
    ［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    前記の置換基は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＯ−ＮＨ２、−Ｒ３、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
    Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    Ｚは、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
    −Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    −Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  2. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
    からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは請求項１に定義したとおりである、請求項１に記載の方法。
  3. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１が、
    からなる群より選択され、Ｒ２が、
    からなる群より選択され、式中、Ｘは請求項１に定義したとおりである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    ［式中、
    Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    −Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    −Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  5. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    ［式中、
    Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
  6. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    ［式中、
    Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
    前記の置換基は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｘ、及び
    からなる群より選択され、
    Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]。
  7. 式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS1689-82-3）、
    以下の式により表される化合物、
    ［式中、Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    からなる群より選択される化合物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 式（I)により表される化合物を含む、ペルオキシダーゼ反応促進剤、
    ［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    前記の置換基は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＯ−ＮＨ２、−Ｒ３、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
    Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    Ｚは、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
    −Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    −Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  9. 式（I)により表される化合物において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
    からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは請求項８に定義したとおりである、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
  10. 式（I)により表される化合物において、Ｒ１が、
    からなる群より選択され、Ｒ２が、
    からなる群より選択され、式中、Ｘは請求項８に定義したとおりである、請求項８又は９に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
  11. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
    ［式中、
    Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    −Ｒ３は、−Ｈ又は−ＮＨＣＯ−ＮＨ−Ｒ５−Ｎ＝Ｎ−Ｒ６であるか、或いは、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    −Ｒ５及び−Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ａｔ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、＝Ｏ、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  12. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
    ［式中、
    Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＳＯ３Ｘ、−ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
  13. 式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
    ［式中、
    Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
    前記の置換基は、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｘ、及び
    からなる群より選択され、
    Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]。
  14. 式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS1689-82-3）、
    以下の式により表される化合物、
    ［式中、Ｘは、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物
    ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、−Ｌｉからなる群より選択される]、
    からなる群より選択される化合物である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
  15. ペルオキシダーゼ及び請求項８〜１４のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤を含む、過酸化水素測定用組成物。
  16. ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１５に記載の組成物。
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