JPH08503371A

JPH08503371A - 酵素反応の強化

Info

Publication number: JPH08503371A
Application number: JP6512668A
Authority: JP
Inventors: シュナイダー，パレ; ビルケットアンデルセン，モルテン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-12-01
Filing date: 1993-12-01
Publication date: 1996-04-16
Also published as: FI952647A0; CA2150563A1; EP0677102A1; FI952647A; BR9307575A; WO1994012620A1; DK144192D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、酵素の活性化に関する。より特に、本発明は、ペルオキシダーゼ強化剤に関する。本発明は、ペルオキシダーゼ酵素及びペルオキシダーゼ強化剤の存在中過酸化水素の源により基質を酸化する方法にも関する。より特に、本発明は、溶液中の染料の漂白方法、その織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害する方法、リグニン含有増量の漂白、特に紙製造のためのパルプの漂白の方法、パルプ製造からの廃水の処理方法、並びにリグニン又はリグニン含有材料の酵素的重合及び／又は修飾の方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】酵素反応の強化技術分野本発明は、酵素の活性化に関する。より特に、本発明は、ペルオキシダーゼ強化剤に関する。本発明は、ペルオキシダーゼ酵素及びペルオキシダーゼ強化剤の存在中過酸化水素の源により基質を酸化する方法にも関する。より特に、本発明は、溶液中の染料の漂白方法、その織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害する方法、リグニン含有増量の漂白、特に紙製造のためのパルプの漂白の方法、パルプ製造からの廃水の処理方法、並びにリグニン又はリグニン含有材料の酵素的重合及び／又は修飾の方法に関する。背景技術ペルオキシダーゼ（E.C．1．11．1．7）は、過酸化水素による基質（電子又は水素供与体）の酸化を触媒する酵素である。このような酵素は、微生物、植物及び動物起源から公知であり、例えば、コプリナス・シネレウス（Corinus cinere us）からのペルオキシダーゼがある（例えば、EP 179，486参照）。それらは、典型的にはヘモタンパク質であり、すなわち、それらは、補欠分子団としてヘムを含む。過酸化水素又は過酸化水素前駆体と一緒のペルオキシダーゼの使用は、紙製造のためのパルプの漂白において、パルプ製造からの廃水の処理において、洗濯洗剤中での改良された漂白のために、洗濯の間の染料転移の阻害のために、並びにリグニン修飾のために、例えば、パーティクルボードの製造において、提案されてきた。 Boehringer Mannheimにより供給される化合物２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホネート）、ABTSは、発色性基質、且つ一般的なペルオキシダーゼ及びフェノール・オキシダーゼ検定剤である。これらの酵素は、それぞれ、過酸化水素及び２酸素（dioxygen）によるABTSの酸化を触媒し、緑っぽい青色を作り出し、この過程は光度計によりモニターされることができる。 ABTSは、ラッカーゼ酵素（ポリフェノール・オキシダーゼ、EC 1．10．3．2）により酸化されるとき安定なラジカル・カチオンを形成することが発見され、そして非フェノール性リグニン・モデル化合物の酸化のための酸化還元仲介物質として作用することが提案されている［Bourbonnais R，Paice MG； FEBS Lett（1 990）267 99-102］。 ABTSの存在中のラッカーゼ酵素によるクラフト・パルプの脱メチル化及び脱リグニン化についての研究は、ラッカーゼによる部分的脱メチル化の程度がABTSの存在中で増加されたことを示した［Bourbonnais R．and Paice M．G； Appl．Mi crobiol．Biotechnol.（1992）36 823-827］。特定の酸化性基質、例えば、金属イオン及びフェノール化合物、例えば、７- ヒドロキシクマリン（7HCm）、バニリン（VAN）、及びp-ヒドロキシベンゼンスルホネート（pHBS）が、漂白反応を強化することができる加速剤又は強化剤として記載されている（例えば、W0 92/18683、W0 92/18687、及びKato M and Shimi zu S ，Plant Cell Physiol．1985 26（7），pp．1291-1301 （特に表１参照）、又はSaunders B C，et al.，Peroxidase，London，1964，p．141 ffを参照こと。）。発明の要約本発明の目的は、ペルオキシダーゼ酵素の活性を強化するための剤を提供すること、そしてペルオキシダーゼ酵素の活性を強化する方法を提供することである。今般、驚くべきことに、ペルオキシダーゼの活性が本明細書中に記載するようなアジノ化合物の存在中で有意に増加することが発見された。従って、本発明の第一態様において、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素の活性を強化するための剤であって、以下の一般式： A=N-N=B ｛式中、同一又は異なるものであってもよいAとBが、独立して、図１中に表される置換基の中のいずれかを表し；置換基中、同一又は異なるものであってもよい記号X及びYが、独立して、炭素、非置換又は置換基R⁵により置換さることができる窒素、硫黄、酸素、セレニウム又はテルル（tellurium）を表し；そして置換基中、同一又は異なるものであってもよい置換基R¹、R²、R³、及び R⁴が、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、C₁-C₅アルキル基であってそのアルキル基がさらに飽和又は不飽和であってもよいもの、又はアミノ基であってそのアミノ酸基がさらに非置換又は置換基R⁵により１又は２回置換さることができるもの、を表し；ここで、置換基R⁵が、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、C₁-C₅アルキル基、又はアミノ基を表す。｝により記載される剤を提供する。本発明の第二態様においては、本発明は、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素により基質を酸化する方法を提供する。特定の態様においては、本発明は、織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害する方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりその洗浄液を処理することを含んで成る方法を提供する。特定の態様においては、本発明は、織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害することができる洗剤添加物であって、ペルオキシダーゼ活性を示す酵素、過酸化水素の源及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤を含んで成る洗剤添加物を提供する。さらに特定の態様においては、本発明は、織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害することができる洗剤組成物であって、ペルオキシダーゼ活性を示す酵素、過酸化水素の源、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤を含んで成る洗剤組成物を提供する。他の態様においては、本発明は、リグニン含有材料の漂白、特に紙製造のためのパルプの漂白の方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりそのリグニン又はリグニン含有材料を処理することを含んで成る方法を提供する。さらなる態様においては、本発明は、リグニン又はリグニン含有材料の酵素的重合及び／又は修飾方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりそのリグニン又はリグニン含有材料を処理することを含んで成る方法を提供する。そしてさらなる態様においては、本発明は、廃水、例えば、化学又は医薬産業からの廃水の処理方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりその廃水を処理することを含んで成る方法を提供する。図面の簡単な説明本発明をさらに添付図面を参照して説明する、ここで：図１は、本発明に係る一般式（I）の置換基（II）、（III）、（IV）、及び（ V）を示し；図２は、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼによるメチル・オレンジの漂白に適用された本発明の係るペルオキシダーゼ強化剤（ABTS）とpHBSとの比較を示し（1：pHBS、20μMH₂O₂；2：pHBS、200μMH₂O₂；3 ：ABTS、20μMH₂O₂；4：ABTS、200μMH₂O₂）；図３は、本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤（ABTS）の変動濃度の存在中のコプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼによるメチル・オレンジの加速された漂白を示し（1：0μM ABTS; 2：1μM ABTS; 3：5μM AB TS；及び4：10μM ABTS)；図４は、pH10.5におけるダイレクト・ブルー１（DB1）の漂白の間の初期漂白速度の比較を示し（□ABTS、1nMペルオキシダーゼ；◆VAN、100nMペルオキシダーゼ；■7HCm、100nMペルオキシダーゼ；▲pHBS、100nMペルオキシダーゼ）；そして図５は、pH8.8（及びpH10.5）におけるDB1の漂白の間の初期漂白速度の比較を示す（□ABTS pH8.8；◆VAN pH8.8；■7HCm pH8.8；◇ABTS pH10.5；及び▲pHBS pH8.8）。発明の詳細な説明ペルオキシダーゼ強化剤本発明は、ペルオキシダーゼ酵素の活性を強化するための公知の化学化合物の使用に関する。従って、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素の効果を強化することができる剤を提供する。本剤は、以下の一般式： A=N-N=B ｛式中、同一又は異なるものであってもよい記号AとBが、独立して、図１中に表される置換基（II）、（III）、（IV）、及び（V）の中のいずれかを表し；置換基中、同一又は異なるものであってもよい記号X及びYが、独立して、炭素、非置換又は置換基R⁵により置換さることができる窒素、硫黄、酸素、セレニウム又はテルルを表し；そして置換基中、同一又は異なるものであってもよい置換基R¹、R²、R³、及び R⁴が、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、C₁-C₅アルキル基であってそのアルキル基がさらに飽和又は不飽和、直鎖状又は分枝状であってもよいもの、又はアミノ基であってそのアミノ酸基がさらに非置換又は置換基R⁵により１又は２回置換さることができるもの、を表し；ここで、置換基R⁵が、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、C₁-C₅アルキル基、又はアミノ基を表す。｝により記載されるアジノ化合物である。本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤は、遊離形態又は付加塩の形態にあることができる。好ましい態様においては、同一又は異なるものであってもよい置換基R¹、R²、 R³、及びR⁴は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルキル基、又はスルホ基を表す。好ましくは、そのハロゲンは、フルオロ、クロロ、又はブロモである。好ましくは、そのC₁-C₃アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、又はイソプロピルである。好ましい態様においては、その置換基R⁵は、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃ アルコキシ基、C₁-C₃アルキル基、又はアミノ基を表す。最も好ましい態様においては、本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤は、２, ２'-アジノ-ビス(３-エチル-ベンゾチアゾリン-６-スルホネート）である。この化合物は、ABTSと略され、発色性基質、且つ一般的なペルオキシダーゼ及びフェノール・オキシダーゼ検定剤である。その上、公知の且つ先に記載した強化剤と比べて、ABTSが高くアルカリ性の条件、すなわち、pH９以上において、ペルオキシダーゼ強化剤として働くことができることが証明された。この特徴は、レンジpH７-13、特にレンジpH８-12、好ましくはレンジpH９-11内での性能について意図される、例えば、洗剤組成物中でA BTSが働くことを可能にする。ペルオキシダーゼの存在中での酸化方法他の態様においては、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素の存在中過酸化水素の源により基質を酸化する方法であって、以下の一般式： A=N-N=B ｛式中、同一又は異なるものであってもよい記号AとBが、独立して、図１中に表される置換基（II）、（III）、（IV）、及び（V）の中のいずれかを表し；置換基中、同一又は異なるものであってもよい記号X及びYが、独立して、炭素、非置換又は置換基R⁵により置換さることができる窒素、硫黄、酸素、セレニウム又はテルルを表し；そして置換基中、同一又は異なるものであってもよい置換基R¹、R²、R⁵、及び R⁴が、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、C₁-C₅アルキル基であってそのアルキル基がさらに飽和又は不飽和であってもよいもの、又はアミノ基であってそのアミノ酸基がさらに非置換又は置換基R⁵により１又は２回置換さることができるもの、を表し；ここで、置換基R⁵が、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、C₁-C₅アルキル基、又はアミノ基を表す。｝により表されるペルオキシダーゼ強化剤の存在を特徴とする方法を提供する。本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤は、遊離形態又は付加塩の形態にあることができる。好ましい態様においては、同一又は異なるものであってもよい置換基R¹、R²、 R³、及びR⁴は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルキル基、又はスルホ基を表す。好ましくは、そのハロゲンは、フルオロ、クロロ、又はブロモである。好ましくは、そのC₁-C₃アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、又はイソプロピルである。好ましい態様においては、その置換基R⁵は、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃ アルコキシ基、C₁-C₃アルキル基、又はアミノ基を表す。さらに好ましい態様においては、本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤は、２ ,２'-アジノ-ビス(３-エチル-ベンゾチアゾリン-６-スルホネート）（ABTS）である。本発明に係る方法において使用される酵素は、酵素分類EC 1．11．1．7に含まれるいずれかのペルオキシダーゼ酵素であることができる。微生物、植物及び動物起源からのこのような酵素が、公知である。好ましくは、本発明に係る方法において使用される酵素は、植物（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）又は微生物、例えば、菌又はバクテリアにより生産されることができる。さらなる態様においては、このペルオキシダーゼは、コプリナス（Coprinus）、例えば、コプリナス・シネレウス（C．cinereu s ）又はコプリナス・マクロリザス（C．macrorhizus）から、又はバチルス（Bac illus）、例えば、バチルス・プミラス（B．pumilus）から得られ、特にPCT/DK9 0/00260に記載のペルオキシダーゼである。さらの本ペルオキシダーゼは、上記ペルオキシダーゼをエンコードしているDN A配列並びにそのペルオキシダーゼをエンコードしているDNA配列の発現を可能にする機能をエンコードしているDNA配列を担持している組換え体DNAベクターにより形質転換された宿主細胞を、培養基中そのペルオキシダーゼの発現を許容する条件下で培養し、そしてその培養物からそのペルオキシダーゼを回収することを含んで成る方法により生産可能であるものである。特に、組換えにより生産されたペルオキシダーゼは、コプリナス（Coprinus）種、特にWO 92/16634に記載されたコプリナス・マクロリザス（C．macrorhizus ）又はコプリナス・シネレウス（C．cinereus）から得られるペルオキシダーゼである。本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤は、0.01〜100μMの、より好ましくは0. 1〜50μMの、最も好ましくは１〜10μMの濃度において存在することができる。過酸化水素の源は、過酸化水素又は過酸化水素前駆体、例えば、ペルカーボネート又はペルボレート、又は過酸化水素生成酵素系、例えば、オキシダーゼ及びそのオキシダーゼのための基質であることができる。過酸化水素は、本工程の開始又は間に、例えば、0.001-5mM、好ましくは0.01-1mMの量において添加されることができる。コプリナス（Coprinus）ペルオキシダーゼを使用するとき、0.01-0.25mM H₂O₂ が好ましく、そしてバチルス・プミラス（B．pumilus）ペルオキシダーゼを使用するとき、0.1-１mM H₂O₂が好ましい。工業的適用ペルオキシダーゼ酵素の存在中過酸化水素源による基質の酸化の本発明に係る方法は、様々な工業的用途が在る。好ましい態様においては、本発明に係る方法は、溶液中での染料の漂白のための用途が在る。他の態様においては、本発明に係る方法は、染料転移阻害のための、例えば、染色された繊維（例えば、WO 92/18587参照）又は洗濯（例えば、WO 91/05839参照）のための用途が在る。従って、特定の態様においては、本発明は、織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害する方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりその洗浄液を処理することを含んで成る方法を提供する。その繊維染料は、合成染料、例えば、アゾ染料、又は天然若しくは天然と同一の染料であることができる。第三の態様においては、紙製造のためのパルプの漂白における用途が在る。紙パルプの漂白における過酸化水素又は過酸化水素前駆体と一緒のペルオキシダーゼの使用は、例えは、SE 88/0673及びUS4,690,895中に記載されている。従って、本発明は、リグニン含有材料の漂白、特に紙製造のためのパルプの漂白のための方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりそのリグニン又はリグニン含有材料を処理することを含んで成る方法を提供する。第四の態様においては、本発明は、リグニン修飾、例えば、パーティクルボード製造における用途が在る。木複合材、例えば、繊維ボード及びパーティクルボードの製造のためのバインダーは、ペルオキシダーゼ処理されたリグニンから作られることができる(US 4,432,921参照）。従って、本発明は、リグニン又はリグニン含有材料の酵素的重合及び／又は修飾方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりそのリグニン又はリグニン含有材料を処理することを含んで成る方法を提供する。第五の態様においては、本発明は、廃水、例えば、化学又は医薬産業からの、染料製造からの、繊維産業からの、又はパルプ製造からの廃水の処理において用途が在る（例えば、US 4,623,465、又はJP-A 2-31887参照）。より特定の態様においては、本発明は、染料製造からの、繊維産業からの、又はパルプ製造からの廃水の処理方法であって、過酸化水素の源の存在中、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりその廃水を処理することを含んで成る方法を提供する。洗剤組成物本発明に従って、本ペルオキシーダーゼ強化剤は、洗剤組成物の成分として添加されることができる。特定の態様においては、本発明は、織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害することができる洗剤添加物であって、ペルオキシダーゼ活性を示す酵素、過酸化水素の源及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤を含んで成る洗剤添加物を提供する。この洗剤添加物は、さらに、洗剤中で慣用に使用される１以上の他の酵素、例えば、ブロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、又はセルラーゼを含んで成ることができる。好ましくは、この洗剤添加物は、粒状物、好ましくは非発塵性粒状物、液体、特に安定化液体、スラリーの形態で、又は保護された形態で、提供される。他の特定の態様においては、本発明は、織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害することができる洗剤組成物であって、ペルオキシダーゼ活性を示す酵素、過酸化水素の源、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤を含んで成る洗剤組成物を提供する。本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤は、ペルオキシダーゼ酵素、過酸化水素の源、及び本発明に係るペルオキシダーゼ強化剤を含んで成る、ペルオキシダーゼ系の一部として、その洗剤中に含まれることができる。このペルオキシダーゼ系は、非発塵性粒状物、液体、特に安定化液体の形態又は保護された形態における洗剤組成物中に含まれることができる。非発塵性粒状物は、例えば、US 4,106,991及び4,661,452（両方Nov o Industri A/Sへ付与されたもの）中に開示されているように、製造されることができ、そして場合により、本分野において公知の方法によりコートされることができる。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、ポリオール、例えば、プロピレン・グリコール、糖若しくは糖アルコール、乳酸又は硼酸の添加により安定化されることができる。他の酵素安定化剤も本分野においてよく知られている。このペルオキシダーゼ系の保護形態は、EP 238,216中に開示された方法に従って調製されることができる。本発明に係る洗剤組成物は、いずれかの便利な形態で、例えば、粉末、粒状物又は液体として存在することができる。液体洗剤は、水性、典型的には90％までの水及び0-20％の有機溶媒であることができる。この洗剤組成物は、アニオン性、非イオン性、カチオン性、両性の又はこれらのタイプの混合物である界面活性剤を含んで成る。この洗剤は、普通には、0-50 ％のアニオン性界面活性剤、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（LA S）、アルファオレフィンスルホネート（AOS）、硫酸アルキル（AS）、アルコール・エーテル・スルフェート（AES）又は石鹸を含むであろう。それは、0-40％非イオン性界面活性剤、例えば、ノニル・フェノール・エトキシレート又はアルコール・エトキシレートを含むこともできる。さらに、それは、（例えば、WO 9 2/06154中に記載されているような）ポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤を含むこともできる。（水性洗剤溶液中で測定される）pHは、普通には中性又はアルカリ性、例えば、7-11であろう。この洗剤は、1-40％の洗剤ビルダー、例えば、ゼオライト、ホスフェート、ホスホネート、クエン酸塩、NTA、EDTA又はDTPA、アルケニル琥珀酸無水物、又はシリケートを含むことができ、又はそれは、ビルドされない（すなわち、本質的に洗剤ビルダーを含まない）ことができる。それは、他の慣用の洗剤成分、例えば、織物コンディショナー、泡ブースター、漂白剤、例えば、過硼酸塩、ペルカーボネート、テトラアセチル・エチレン・ジアミン（ TAED）、又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）、抗-腐食剤、土壌懸濁剤、金属イオン封鎖剤、抗-土壌再デポジション剤、酵素のための安定化剤、泡抑制剤、染料、殺バクテリア剤、光学的ブライトナー又は芳香剤を含むこともできる。この洗剤組成物は、さらに、洗剤中に慣用に使用される１以上の他の酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、及びセルラーゼを含んで成ることができる。本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態は： a）ホスフェート・ビルダー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、シリケート、使用における所望のpHに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩を含む洗剤粉末として配合された洗剤組成物、 b）ゼオライト・ビルダー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル又は等価なポリマー、シリケート、使用における所望のpHに調整するためのアルカリ、及び中性無機塩を含む洗剤粉末として配合された洗剤組成物、 c）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、湿潤剤、有機酸、アルカリを含んで成る水性洗剤液体であって７〜10.5の間の値に調整された使用におけるpHをもつものとして配合された洗剤組成物、 d）本質的に直鎖状アルコキシル化第一アルコール、ホスフェート・ビルダー、アルカリから成る液体非イオン性界面活性剤を含んで成る非水性洗剤液体であって７〜10.5の間の値に調整された使用におけるpHをもつものとして配合された洗剤組成物、 e）アニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤、ホスフェート・ビルダー、ナトリウム・シリケートを含み、並びにほとんど又は実質的に全く中性無機塩を含まない、少なくとも600g/lのバルク密度をもつ粒状物の形態における洗剤粉末として配合された洗剤組成物、 f）アニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤、ゼオライト・ビルダー、ナトリウム・シリケートを含み、並びにほとんど又は実質的に全く中性無機塩を含まない、少なくとも600 g/lのバルク密度をもつ粒状物の形態における洗剤粉末として配合された洗剤組成物、 g）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル・ポリマー、脂肪酸石鹸、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、粘度粒子、及びナトリウム・シリケートを含む洗剤粉末として配合された洗剤組成物、 h）5-65重量％の界面活性剤、0-50重量％のビルダー及び0-30重量％の電解質を含んで成る液体コンパクト洗剤、を含む。以下の実施例は、本発明をさらに説明し、そしてそれは、いかなる方法によるかを問わず請求されるものとして本発明の範囲を限定するものと意図されない。実施例１メチル・オレンジの漂白２,２'-アジノ-ビス(３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルフホネート）（ABTS 、Boehringer Mannheimにより供給されたもの）又はパラ-ヒドロキシベンゼン・スルホネート（pHBS、Sigmaにより供給されたもの）の存在中、WO 92/16634に従って得られた組換えにより生産されたコプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼ（rCiP）、及び過酸化水素により触媒されるメチル・オレンジ（Merck）の加速された漂白を図２中に示す。以下の条件を使用した： 10 nM rCiP 25 μM メチル・オレンジ（Methyl Orange） 50 μM ABTS又はパラ-ヒドロキシベンゼン・スルホネート 20 及び200μM過酸化水素 50 mM Britton & Robinsonバッファー、pH8.8 30℃サーモスタット。試薬を１cmキュベット内で混合し、そして漂白を過酸化水素の添加により開始した。漂白をこの染料の吸収ピークである465nmにおいて分光光度計により検出した。漂白を10分間のスパンにわたる時間に関して追跡した。実施例２メチル・オレンジの漂白２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルフホネート）（ABT S、Boehringer Mannheimにより供給されたもの）の変化濃度の存在中、WO 92/l6 634に従って得られた組換えにより生産されたコプリナス・シネレウス（Coprinu s cinereus ）ペルオキシダーゼ（rCiP）、及び過酸化水素により触媒されるメチル・オレンジ（Merck）の加速された漂白を図３中に示す。以下の条件を使用した： 10 nM rCiP 25μMメチル・オレンジ（Methyl Orange） 0、1、5及び10μM ABTS 200μM過酸化水素 50mM Britton & Robinsonバッファー、pH8.8 30℃サーモスタット。この漂白の混合、開始及び検出は実施例１中に記載したものと同じである。実施例３ダイレクト・ブルー１の漂白加速剤としてABTSを使用した、WO 92/16634に従って得られた組換えにより生産されたコプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼ（rCi P）によるダイレクト・ブルー１（DirectBlue１（DB1））の初期漂白を、これまで公知の加速剤の中で最良のもの：７-ヒドロキシクマリン（7HCm）、バニリン（VAN）、及びp-ヒドロキシベンゼン・スルホネート（pHBS）と比較した。以下の条件を使用した：１nM rCiP 又は100nM rCiP（pH10.5における）それぞれ、0、10、25、50、又は75μMの加速剤 50mM Britton & Robinsonバッファー、それぞれ、pH8.8又は10.5 20μM過酸化水素。試薬を１cmキュベット内で混合し、そしてその漂白を過酸化水素の添加により開始した。漂白をその染料の吸収ピークである610nm において分光光度計により検出した。漂白を10分間続け、そして漂白速度（-Δm Abs/分）を吸収における初期（線形）減少から測定した。 pH10.5において、加速剤として100nm rCiP及びABTSを使用した漂白は、そのキュベットが分光光度計内に置かれることができる前に漂白が既に完了している程速かった。この理由は、pH10.5におけるrCiPの投与量がABTSとの組み合わせにおいて使用されるとき１nMまで減少されたからであり、但し、100nM rCiP付近の投与量が、吸収における有意な減少を観察するために（これまで公知な）すべての他の加速剤のために必要であった。１分間当たりの初期漂白の結果を加速剤濃度の関数として図４及び５中に例示する。実施例４ABTSによる強化された染料転移阻害洗浄試験を、ペルオキシダーゼに基く染料転移阻害に対するABTSの効果を調査するためにTerg-o-tometer内で行った。比較のために、確立された強化剤pHBSをもテストした。綺麗な白色のトレーサー・テスト片（綿、Testfabrics，Inc.，USAからのStyl e#400；漂白されているが、蛍光増白されていないもの）を、アゾ染料Acid Red 151（C.I．26900；例えば、Aldrich Chemical Co.から入手可能なもの）により染色されたナイロン・テスト片と一緒に洗浄した。参照テスト片を、同一綿布から切断し、そして染色された織物の非存在中で洗浄した。所定のTerg-o-tometer ポット内の染料転移を、上記トレーサ一片の間のハンター色差（Hunter color d ifference）：として測定し、ここで、ポット及び上記の参照片、ハンターL、a、及びb値をDat acolor Elrephometer 2000上の非フィルター昼光源により得られた軽減データから評価した。この洗浄試験のための洗剤溶液を、漂白及び光学的増白剤を全く含まない商業的に入手可能な欧州の高pHパワー洗剤4.5g/lを使用して調製した。使用した水は、1:2の比で脱鉱物水と混合された水道水であり；その混合物は、約1.1mM Ca²⁺ に等しい硬度をもっていた。詳細な実験条件は以下のものであった：洗浄経過時間： 15分間 Terg-o-tometer攪拌： 70回転／分温度： 35℃ pH：ペルオキシダーゼ系の添加に先立ってNaOHにより10.5に調整された繊維負荷：１リッターの洗浄液当たりAcid R ed 151により染色された約6gナイロン及び1g白色綿過酸化物源：すべての場合に、50μM H₂O₂ がペルオキシダーゼと共に存在したペルオキシダーゼ：５nMにおける、WO 92/16634に従って得られた、組換えにより生産されたCoprinus cinereusペルオキシダーゼ。洗浄後、上記テスト片を冷水道水中で十分に濯ぎ、そして暗所において一夜乾燥させ、その後、軽減の測定を行った。上記２つの強化剤の各濃度による処理が以下の結果をもたらした：白色洗浄織物に関するハンターΔE 1μM ABTS 34.9 5μM ABTS 32.3 20μM ABTS 23.7 1μM pHBS 34.8 5μM pHBS 34.5 20μM pHBS 30.8 ハンターΔEの≧２単位の差異は統計的に有意であった。両方の場合において、１μM強化剤によるペルオキシダーゼ系は、有意な染料転移阻害を提供しなかった（ペルオキシダーゼ系によらない参照はここでは含まれない）。しかしながら、見て分かるように、ABTS系は、既に５μMの強化剤において効果をもち、一方、pHBS系はもたず；そして20μMの強化剤においては、A BTS系は、pHBS系よりもかなり大きな効果をもつ。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年２月１４日【補正内容】【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】

Claims

【特許請求の範囲】１．ペルオキシダーゼ酵素の活性を強化するための剤であって、以下の一般式（ I）： A=N-N=B ｛式中、同一又は異なるものであってもよい記号AとBが、独立して、図１中に表される置換基（II）、（III）、（IV）、及び（V）の中のいすれかを表し；置換基中、同一又は異なるものであってもよい記号X及びYが、独立して、炭素、非置換又は置換基R⁵により置換さることができる窒素、硫黄、酸素、セレニウム又はテルルを表し；そして置換基中、同一又は異なるものであってもよい置換基R¹、R²、R³、及び R⁴が、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、C₁-C₅アルキル基であってそのアルキル基がさらに飽和又は不飽和であってもよいもの、又はアミノ基であってそのアミノ酸基がさらに非置換又は置換基R⁵により１又は２回置換さることができるもの、を表し；ここで、置換基R⁵が、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、C₁-C₅アルキル基、又はアミノ基を表す。｝により特徴付けされる剤。２．２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホネート）である、請求項１に記載の剤。３．過酸化水素の源の存在中ペルオキシダーゼ酵素により基質を酸化する方法であって、以下の一般式： A=N-N=B ｛式中、同一又は異なるものであってもよいAとBが、独立して、図１中に表される置換基（II）、（III）、（IV）、及び（V）の中のいずれかを表し，置換基中、同一又は異なるものであってもよい記号X及びYが、独立して、炭素、非置換又は置換基R⁵により置換さることかできる窒素、硫黄、酸素、セレニウム又はテルルを表し；そして置換基中、同一又は異なるものであってもよい置換基R¹、R²、R³、及び R⁴が、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシ基、スルホ基、ニトロ基、C₁-C₅アルキル基であってそのアルキル基がさらに飽和又は不飽和であってもよいもの、又はアミノ基であってそのアミノ酸基がさらに非置換又は置換基Ｒ⁵により１又は２回置換さることができるもの、を表し；ここで、置換基R⁵が、ハロゲン、ヒドロキシ基、C₁-C₃アルコキシ基、C₁-C₅アルキル基、又はアミノ基を表す。｝により表されるペルオキシダーゼ強化剤の存在を特徴とする方法。４．ペルオキシダーゼ強化剤が、２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホネート）である、請求項３に記載の方法。５．ペルオキシダーゼ強化剤が、方法の開始において又は間において添加される、請求項３又は４のいずれかに記載の方法。６．ペルオキシダーゼ強化剤の量が、0.01〜100μM、より好ましくは0.1〜50μM 、最も好ましくは1〜10μMのレンジ内にある、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。７．過酸化水素の源が、過酸化水素又は過酸化水素前駆体、例えば、ペルカーボネート又は過硼酸塩、又は過酸化水素生成酵素系、例えば、オキシダーゼ及びその基質である、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。８．ペルオキシダーゼ酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼあるいはコプリナス（Coprinus）、例えば、コプリナス・シネレウス（C．cinereus）又はコプリナス・マクロリザス（C．macrorhizus）から、又はバチルス（Bacillus ）、例えば、バチルス・プミラス（B．pumilus）から得られるペルオキシダーゼである、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。９．溶液中の染料の漂白に適用される、請求項３〜８のいずれかに記載の方法。１０．織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害することに適用される請求項３-８のいずれかに記載の方法であって、過酸化水素の源の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりその洗浄液を処理することを含んで成り、請求項１又は２のいずれかに記載のペルオキシダーゼ強化剤の存在を特徴とする方法。１１．織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害することができる洗剤添加物であって、ペルオキシダーゼ活性を示す酵素、過酸化水素の源及び請求項１又は２のいずれかに記載のペルオキシダーゼ強化剤を含んで成る洗剤添加物。１２．ペルオキシダーゼ強化剤が、２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホネート）である、請求項11に記載の洗剤添加物。１３．粒状物、好ましくは非発塵性粒状物、液体、特に安定化液体、スラリーの形態で、又は保護された形態で、提供される、請求項11 又は12のいずれかに記載の洗剤添加物。１４．織物が洗浄液中で一緒に洗浄されるとき、染色された織物から他の織物への繊維染料の転移を阻害することができる洗剤組成物であって、ペルオキシダーゼ活性を示す酵素、過酸化水素の源、及び請求項１又は２のいずれかに記載のペルオキシダーゼ強化剤を含んで成る洗剤組成物。１５．ペルオキシダーゼ強化剤が、２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホネート）である、請求項14に記載の洗剤組成物。１６．１以上の他の酵素、特に、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、及び／又はオキシダーゼ、あるいはその混合物をさらに含んで成る、請求項14又は15のいずれかに記載の洗剤組成物。１７．リグニン含有材料の漂白、特に紙製造のためのパルプの漂白のために適用される請求項３〜８のいずれかに記載の方法であって、過酸化水素の源の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりそのリグニン又はリグニン含有材料を処理することを含んで成り、請求項１又は２のいずれかに記載のペルオキシダーゼ強化剤の存在を特徴とする方法。１８．リグニン又はリグニン含有材料の酵素的重合及び／又は修飾に適用される請求項３〜８のいずれかに記載の方法であって、過酸化水素の源の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりそのリグニン又はリグニン含有材料を処理することを含んで成り、請求項１又は２のいずれかに記載のペルオキシダーゼ強化剤の存在を特徴とする方法。１９．廃水、例えば、化学又は医薬産業からの廃水の処理において適用される請求項３〜８のいずれかに記載の方法であって、過酸化水素の源の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりその廃水を処理することを含んで成り、請求項１又は２のいずれかに記載のペルオキシダーゼ強化剤の存在を特徴とする方法。２０．染料製造からの、繊維産業からの、又はパルプ製造からの廃水の処理のための請求項19に記載の方法であって、過酸化水素の源の存在中、ペルオキシダーゼ酵素によりその廃水を処理することを含んで成り、請求項１又は２のいずれかに記載のペルオキシダーゼ強化剤の存在を特徴とする方法。