DD147368A1

DD147368A1 - Verfahren zur aktivitaetssteigerung von meerrettich-peroxidase

Info

Publication number: DD147368A1
Application number: DD21711879A
Authority: DD
Inventors: Baerbel Porstmann; Tomas Porstmann
Original assignee: Baerbel Porstmann; Tomas Porstmann
Priority date: 1979-11-23
Filing date: 1979-11-23
Publication date: 1981-04-01

Abstract

Verfahren zur Aktivitaetssteigerung von Meerrettich-Peroxidase dient der Erhoehung des Chromogenumsatzes. Das Verfahren findet Anwendung im Bereich der diagnostischen Medizin bei allen Nachweismethoden, bei denen Peroxidase in eine katalytische Reaktion eingeschaltet ist. Weitere Anwendungsbeispiele mit gleichen Methoden sind Chemie, Biochemie, Lebensmittelchemie, Biologie, Immunbiologie, Veterinaermedizin. Ziel der Erfindung ist, die untere Nachweisgrenze fuer Peroxidase zu senken, die analytische Empfindlichkeit dieser Reaktion zu erhoehen oder den Peroxidaseeinsatz bei gleicher Empfindlichkeit zu reduzieren. Die Aufgabe der Erfindung, den Substratumsatz zu steigern, indem die Denaturierung des Enzyms waehrend der Reaktion durch neutrale Detergenzien verzoegert wird, wird geloest durch Zugabe von Polyoxyaethylen-Sorbitolester oder durch Polyoxyaethylen-Octylphenol zur Substratloesung. Die Konzentration der Detergenzien betraegt vorzugsweise 1 ml (= 1,11 g/I) und die Reaktionstemperatur vorzugsweise 25 Grad C, wobei ferner der pH-Wert 5,0 und die Reaktionsdauer 60 bis 120 min betragen.

Description

118-1-

Verfahren· zur Aktivitätssteigerung von Meerrettich-Peroxidäse

Anwendungsgebiet dor Erfindunq

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivitätssteigerung von Peroxidase und ist überall dort anwendbar, wo eine durch Peroxidase katalysierte Substratreaktion vermessen wird«, Es kann somit Anwendung finden in der klinischen Biochemie_{ Biochemie _{ Nahrungsmittelchemie, Immunologie, Biologie, Pathologie, Pharmakologie auf den Gebieten Enzymologie, Histochemie und Enzymimmuntechniken_e

Peroxidase katalysiert folgende Reaktion:

D hat die Funktion des Protonendonators und wird im Reaktionsablauf oxidiert« Als Protonendonator setzt man üblicherweise Farbstoffe (Chroroogene) ein, die im oxidierten Zustand eine höhere Extinktion aufweisen (Farbentwicklung oder Farbvermehrung)«, Dabei entscheidet auch der Extinktionskoeffizient des oxidierten Farbstoffes über die Stärke der entstehenden Farbe und damit über die Empfindlichkeit« Zur Empfindlichkeitssteigerung wurden deshalb ständig neue Protonendonstoren entwickelt mit iramsr größeren Extinktionskoeffizienten irn oxidierten Zustand,, wie 4,4~Diaminodiphenyl (Benzidin), 2-Methoxyphenol (Guajakol), 3,3-Dimethoxybenzidin (oriho-Dianisidin), ortho-Phenylendiarain, 2,2-Azino-di-(3-athyl«.benzthiazolin-sulfonat(6)) (ABTS)* ' .'..-..'

Gleichzeitig als Alternative wurde versucht, die Reaktionsbedingungen zu optimieren, um dadurch den Substraturasatz zu erhöhen·

Als Aktivatoren für die Peroxidasereaktion wurden Ammonium-, Zyanidionen (FRIDOVICH, 0. : 3. Biol. Chemie 238, 3921 (1963)) sowie Manganionen (KLAPPER, M. H. und HACKETT, D. P.: 3. Biol· Chemie 238, 3736 (1963)) verwendet. Sie wirken aber nur bei hohen pH-Werten, wie pH 8 oder pH 9, weit außerhalb der optimalen Reaktionsbedingungen, die bei pH 5 liegen, aktivierend unter Verwendung von ortho-Dianisidin und ortho-Phenylendiamin. Bei Einsatz von Guajakol als Chromogen sind sie wirkungslos. Eine Aktivierung aer Peroxidasereaktion unter optimalen Reaktionsbedingungen ist bisher nicht bekannt.

Nach GALLATI, H.: 0. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15^ 699 (1977) und MAEHLY, A. C, in: Methods in Enzymology, New York, 1955, Bd. 2, 801, ist ein stabiler Komplex zwischen Enzym und Η₂0« ursächlich für die zunehmende Enzymdenaturierung während der Reaktion und führt dazu, daß in Abhängigkeit von der HpOp-Konzentration nach 30 bis 60 Minuten nur noch unbedeutende Substrat« mengen umgesetzt und entsprechend nur noch geringfügige Farbsteigerungen erzielt werden.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die untere Nachweisgrenze für Peroxidase zu senken und die analytische Empfindlichkeit der Methode zu steigern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Substratumsatz durch Peroxidase zu steigern, indem die Denaturierung des Enzymes während der Reaktion durch neutrale Detergenzien verzö-, gert wird. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, indem die Substratlösung mit neutralen Detergenzien (wie z. B. der Substratklasse Polyoxyäthylene als Sorbitolester oder Octylphenole) versetzt wird.

Dio Detergentien werden in flüssiger Form {mit der Dichte i_fli g/ml bei 20 ⁰C) der Substratlösung.in einem Konzentrationsbsrsich von 0,01 ml/1 bis 10 ml/1, vorzugsweise 1 ml/1 beigefügt (Abb_e I)* Dio Temperaturen bei der Umsetzung von Substratlösiing mit Detergenzien unter katalytischer Wirkung von Peroxidase betragen 4 ⁰C bis 40 ⁰C, vorzugsweise 25 ⁰C, Bei einer Reaktionszeit von 1 Stunde erwies sich, daß sich der Inaktivierungsschutz durch neutrale Detergenzien mit steigender Reaktionstemperatur vergrößert (Abb_e 2, 3)_e Die optimale Reaktionstemperatur der Peroxidase wird bei definierter Reaktionszeit und HpOg-Konzentration durch Detergenzien zu höheren Temperaturen hin verschoben (Abb, 4). Die Grenzen der Temperatursteigerung sind durch andere verfahrensspezifische Aspekte auf 40 C gesetzt« Die Aktivitätsdifferenz zwischen Substratlösung allein und mit Detergenzlenzusatz wird mit zunehmender Reaktionsdauer größer (Äbb_e 5). Dabei führt der durch Detergenzien bewirkte Inaktivierungsschutz zu einer linearen Beziehung zwischen Enzymkonzentration Und Enzymaktivität« Die optimal ermittelte Zeit für einen ausreichenden Extinktionszuwachs beträgt 2 h_e Die Aktivitätssteigerung ist unabhängig vom eingesetzten Chromogen, unterscheidet sich jedoch in ihrem Ausmaß bei όοη für jedes Chromogen optimal ermittelten Substratge« mischen· Neben freier Peroxidase ist auch an Proteine kovalent gebundene Peroxidase durch Detergenzien aktivierbar (z. B_e Peroxidase gekoppelt an Antikörper oder an Antigene)»

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1:

Jeweils 10 ng gereinigter Peroxidase (durch entsprechende Verdünnung eingestellt) mit Reinheitszahl 2,7, spezifische Aktivität 535 ΙΕ/mg werden in 50 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 gelöst und reagieren mit 1,45 ml Substratlösung A, die folgende Zusammensetzung aufweist (dient als Vergleichslö-'sung):

171 IS

0,60 ml Azetatpuffer 1 molar pH 5,0 0,60 ml H₂O₂ (66,0 mMol/1 aqua dest.) 0,50 ml o-Dianisidin (6 mg/0,5 ml Methanol) 58,80 ml H₂O

60,50 ral Gesamtvolumen

und 1,45 ml Substratlösung B, die sich wie folgt zusammensetzt;

0,60 ml Azetatpuffer 1 molar pH 5,0 0,60 ml H₂O₂ (66,0 mMo1/1 aqua dest.) 0,50 ml o-Dianisidin (6 mg/0,5 ml Methanol) 58,74 ml H₂O .

0,06 ml Polyoxyäthylen-Sorbitolester

60,50 ml Gesamtvolumen

Die Reaktionstemperatur betrug 20 C_# Die Extinktionsbestimmung erfolgte alle 30 Minuten nach Reaktionsstop mit 10 XjI einer 5n HCl am Spektralphotometer bei einer Wellenlänge Λ « 403 nm« Die Produktion von oxidiertem Chromogen durch Peroxidase beim Umsatz der Substratlösung mit Polyoxyäthylen-Sorbitolester (Lösung B) betrug nach 120 Minuten Reaktionszeit das 2,7fache der beim Umsatz des Substratgemisches ohne Detergenz (Lösung A). Die Extinktionsmessungen nach den verschiedenen Zeitintervallen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Ohne Detergenzienzusatz beträgt die Enzymaktivität, gemessen an der Extinktionsänderung pro Zeitintervall innerhalb der zweiten Stunde Reaktionszeit nur noch 11 % der Aktivität innerhalb der ersten 60 Minuten. Mit Detergenzienzusatz ist die Enzymaktivität innerhalb der ersten 60 Minuten l,9fach höher als ohne Detergenzienzusatz und sinkt innerhalb der zweiten Stunde lediglich auf 67 % des Einstundenwertes. Der Charakter. der Reaktionskinetik nähert sich unter den aufgeführten Reaktionsbedingungen durch den Detergenzienzusatz einer Reaktion 0, Ordnung (Abb. 5).

.-ι

'i

Beispiel 2: . .

Deweils 5 ng Peroxidase-IgG-Konjugat, hergestellt durch Glu~ taraldehydvernetzung nach der Zweischrittmethode, gelöst in 50 AiI phosphatgepufferter Kochsalzlösung reagierten mit .500 All Substratlösung A und Substratlösung B (siehe Beispiel l)_c Dia Extinktionsmeosung beider Ansätze erfolgte alle 30 Minuten nach Reakticnsstop mit lOxUl einer 5n HCl am Spektralphotometer bei einer Wellenlänge A = 403 nm.

Ohne Detergenzienzusatz beträgt die Enzymaktivität, gemessen an der Extinktionsänderung pro Zeitintervall innerhalb der zweiten Stunde nur noch 7 % der Aktivität innerhalb der ersten 60 Minuten, Mit Detergenzienzusatz ist die Enzymaktivität innerhalb der ersten 60 Minuten 3,2fach höher als ohne Detergentien» zusatz und sinkt innerhalb der zweiten Stunde lediglich auf 40 % des Einstundenwertes ab_e Die Extinktion der umgesetzten Substratlösung mit Detergenzienzusatz beträgt nach 120 Minuten Reaktionszeit das 4,2fache der Extinktion der umgesetzten Substratlösung ohne Detergenzienzusatz (Abb. 6)„

1 711

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 - Einfluß der Detergenzienkonzentration im Reaktionsgemisch auf die Aktivität gleicher Enzymkonzentration bei verschiedenen Reaktionszeiten (Reaktionstemperatur T = 25 ⁰C), K= Kontrolle ohne Detergenzien

Abb. 2 - Oxidation von Chromogen (o-Dianisidin) durch Meerrettich-Peroxidase (1 ng Peroxidase/Meßansatz) in Abhängigkeit von der Reaktionszeit bei verschiedenen Reaktionstemperaturen. Kein Zusatz von Detergenzien zum Reaktionsgemisch.

Abb. 3 - Oxidation von Chromogen (o-Dianisidin) durch Meerrettich-Peroxidase (1 ng Peroxidase/Meßansatz) in Abhängigkeit von der Reaktionszeit bei verschiedenen Reaktionstemperaturen. Zusatz von 0,1 ml Tween (121 zug) zu 100 ml Reaktionsgemisch.

Abb. 4 - Oxidation von Chromogen durch Meerrettich-Percxidase (1 ng Peroxidase/Meßansatz) in Abhängigkeit von der Reaktionstemperatur bei verschiedenen Reaktionszeiten.

ο ο Reaktionsgemisch ohne Zusatz von

Detergenzien

Φ'» Reaktionsgemisch mit Zusatz von

Polyoxyäthylen-Sorbitolester (0,1 ml/100 ml)

_ ^ _ __ __ ___ __ Verbindungslinie der Reaktions-

optima der Peroxidase in Reaktionsgeraischen ohne Detergenzien und mit Detergenzien

Abb„ 5 - Enzymkinetik gleicher HRP-Konzentrationen (1 ng Peroxidase/Meßansatz}

Reaktionsbedingungen; pH-Wort = 5,0

i-LOg-Konzentration = 0_#65 mftol/1

T = 25 ⁰C

o~~—=—ο Reaktionsgemisch mit Detergenzien

(1 ml Polyoxyäthylen-Sorbitolester/1 Reaktionsgemisch) .

₀——«-ο Reaktionsgemisch ohne Zusatz von Detergenzien

Abb« 6 - Enzymkinetik gleicher Konjugatkonzentrationen (5 ng Konjugat/Meßansatz) Reaktionsbedingungen: pH-Wert =5,0

= 0,65 mMol/1

T β 25 ⁰C

o Reaktionsgemisch mit Detergenzien ,(1 ml Polyoxyäthylen-Sorbitolester/l

Reaktionsgemisch) β Reaktionsgemisch ohne Zusatz von Deter-

aenzien \

Claims

·-*- ti 711 a Erfindungganspruch \ '

1« Verfahren zur Aktivitätaateigerung von Meerrettich-Peroxidase nach bekannten Verfahren, indem Peroxidase sowohl" in nicht gekoppelt er als auch in kovalent anProteine gekoppelter Form Chroraogene in Substratlösungen oxidiert, gekennzeichnet dadurch, daß neutrale Detergenzien (Dichte = 1,11 g/ml) in Konzentrationen von 0,01 ml/1 bis 10 ml/1, vorzugsweise 1 ml/1 dem Substratgemisch (Lösung) zugesetzt werden, wobei der Ρττ-Wert 5»0, die Reaktionstemperatur 25 ⁰C sowie die Reaktionsdauer 1 h bis 2 h beträgt.

2· Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß als neutrale Detergenzien Polyoxyäthylen-Sorbitolester oder Polyoxyäthylen-Octylphenol eingesetzt werden·

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