DE3342977A1

DE3342977A1 - Verfahren zur diagnostischen bestimmung von wasserstoffperoxid und wasserstoffperoxid bildenden substrat/enzymmischungen

Info

Publication number: DE3342977A1
Application number: DE19833342977
Authority: DE
Inventors: Barbara Dr. 6220 Rüdesheim Schöbel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-11-28
Filing date: 1983-11-28
Publication date: 1985-06-05

Description

Verfahren zur diagnostischen Bestimmung von Wasser-
stoffperoxid und Wasserstoffperoxid bildenden Substrat/Enzymmischungen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Wasserstoffperoxid bildenden Substrat/Enzymmischungen, dadurch gekennzeichnet, daß Cytochrom- und Peroxidase-haltige Stoffgemische verwendet und als Fertigreagenzien zu diagnostischen Zwecken angewendet werden.
In der medizinischen Diagnostik spielt die Messung von Substanzen wie Cholesterin, Cholin, Glucose, Harnsäure, Triglyceride und von Enzymreaktionen, die derartige Substanzen bilden, eine große Rolle. Die Bestimmung kann durch entsprechende Oxidasen mit Hilfe des gebildeten Wasserstoffperoxids spezifisch und quantitativ in der biologischen Probe wie Blut, Serum, Plasma, Harn erfolgen. Hierbei wird das durch die Oxidation der Substanz gebildete Wasserstoffperoxid mit Hilfe einer Peroxidase auf ein Chromogen übertragen. Als Chromogen kann prinzipiell jeder Stoff dienen, der im oxidierten Zustand ein anderes Absorptionsspektrum als im reduzierten zeigt.
In den bekannten diagnostischen Stoffgemischen werden als chromogene Stoffe zum Beispiel NADH ("UV-Test"), Jodidlösungen oder 4-Aminophenazon plus ein Phenol (Trinder) verwendet. Als Peroxidase werden die Enzyme POD (EC 1.11.1.7) oder LPO (EC 1.11.1.8) eingesetzt. Beide sind im Hinblick auf das zu oxidierende Substrat (hier Chromogen) recht unspezifisch, man kann somit sehr unterschiedliche chromogene Stoffe benutzen. Die Unspezifität dieser Peroxidasen kann aber auch dazu führen, daß ein Teil des gebildeten Wasserstoffperoxids nicht auf das zugesetzte Chromogen, sondern auf reduzierende Begleitsubstanzen in der biologischen Probe übertragen wird. In diesem Fall sind die gefundenen Werte zu gering und damit diagnostisch wertlos.
Ein Problem der derzeitigen in den diagnostischen Stoffgemischen verwendeten chromogenen Substanzen liegt ferner darin, daß die reduzierte Ausgangsform nicht nur mit Wasserstoffperoxid, sondern auch langsam mit Luftsauerstoff reagieren kann. Das führt zu erheblichen Stabilitätsproblemen in der Routineanwendung.
Bei dem erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenz handelt es sich um Stoffgemische, die als chromogene Substanz gleiche oder verschiedene Cytochrome enthalten. Wie aus Untersuchungen der Grundlagenforschung bekannt ist, werden besonders die Cytochrome der C-Gruppe nicht durch Luftsauerstoff oxidiert, sie sind nicht autoxidabel. Es können somit in den diagnostischen Stoffgemischen stabile Chromogene in Form von reduziertem Cytochrom (Fe2 -Cytochrom) verwendet werden.
Hinzu kommt, daß die Extinktionsdifferenz zwischen reduziertem und oxidiertem Cytochrom im Bereich von 40.000 pro Mol Wasserstoffperoxid liegt, gemessen bei etwa 550 nm. Damit ist die Nachweisempfindlichkeit der erfindungsgemäßen diagnostischen Stoffgemische ungewöhnlich hoch (UV-Test 6.200; Trinder 22.000).
Durch Mischung verschiedener Cytochrome mit vergleichbarem Red-Ox-Potentialtaber unterschiedlichem Absorptionsmaximum können weiterhin die Absorptionsgipfel verbreitert und damit die Meßbarkeit verbessert werden.
Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung von Cytochrom als chromogene Substanz liegt in der Möglichkeit, eine Cytochromspezifische Peroxidase zu verwenden (z.B. P. aeruginosa Cytochrom-C-Peroxidase).
In diesem Fall entfällt das Problem der unspezifischen Wasserstoffperoxidübertragung auf Fremdsubstanzen.
Schließlich ist der Zeitraum bis zur Beendigung der Reaktionen bei Verwendung des Cytochrom-Chromogens besonders kurz (z.B. Harnsäure 1 Min.; sonst 10-30 Min.).
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Stoffgemische sind in folgenden Beispielen dargestellt: Beispiel 1 Diagnostisches Stoffgemisch zur Bestimmung von Harnsäure: Zu 100 ml 50 m mol/l Trispuffer pH 7,6 werden 2 ml einer Lösung pipettiert, die 12 g Pferde-Herz-Cytochrom C (Fe2+), 6000 U Uricase und 150 000 U Peroxidase (EC 1.11.1.7) pro Liter Trispuffer 100 m mol/l, pH 8,5 enthält. Diese Reagenzlösung (102 ml) ist im Kühlschrank gelagert mehrere Monate verwendbar. Zur Harnsäurebestimmung werden zum Beispiel 1 ml der Reagenzlösung und 10 Zl Serum gemischt und in einem Photometer die Extinktionsänderung E bei 550 nm nach 1 Min. gemessen. Die Konzentration der Harnsäure im Serum beträgt C = 41 x E (mg/dl).
Beispiel 2 Diagnostisches Stoffgemisch zur Bestimmung von Cholesterin: Zu 100 ml Trisputter 50 m mol/l, pH 7,4,werden 2 ml einer Lösung pipettiert, die 10 mg Pseudomonds Cytochrom C-551 (Fe2+), 5,5 U Cholesterinoxidase, 7 U Cholesterinesteresterase und 50 U P. aeruginosa Cytochrom C-Peroxidase pro ml 10 m mol/l Trispuffer pH 7,4 enthält. Zur Cholesterinbestimmung werden zum Beispiel 2 ml der obigen Reagenzlösung (102 ml) mit 2 iil Plasma gemischt und die Extinktionsänderung E bei 551 nm nach 10 Min. gemessen.
Die Cholesterinkonzentration im Plasma beträgt C = 957 x E (mg/dl).
Beispiel 3 Diagnostisches Stoffgemisch zur Bestimmung von Glucose: Zu 100 ml Phosphatpuffer 0,1 mol/l, pH 7,0, werden 2 ml einer Lösung pipettiert, die 5 mg Algen-Cytochrom 551 (Fe2+) plus 5 mg Algen-Cytochrom 554 (Fe2+), 100 U Glucoseoxidase und 100 U Peroxidase (EC 1.11.1.7) pro ml Phosphatpuffer 0,1 mol/l, pH 7,0,enthält. Zur Glucosebestimmung werden zum Beispiel 2 ml der obigen Reagenzlösung (102 ml) mit 1 Fl Serum oder 1 pl Glucosestandard-Lösung gemischt und die Extinktionsänderung E bei 551-554 nm nach 5 Minuten gemessen. Die Glucosekonzentration ergibt sich aus dem Extinktionsvergleich von E zur Glucosestandard-Lösung.

Claims

Verfahren zur diagnostischen Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Wasserstoffperoxid bildenden Substrat/Enzymmischungen Patentansprüche 1. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Wasserstoffperoxid bildenden Substrat/ Enzymmischungen, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß Cytochrom- und Peroxidasehaltige Stoffgemische verwendet und als Fertigreagenzien zu diagnostischen Zwecken angewendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t,, daß ß Cytochrom C und eine Cytochrom-C-spezifische Peroxidase verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß zur Verbreiterung der Absorptionsgipfel mehrere Cytochrome mit vergleichbarem Red-Ox-Potential aber unterschiedlichem Absorptionsmaximum zur Anwendung kommen.