DE2929530A1

DE2929530A1 - Glycerinoxidase und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2929530A1
Application number: DE19792929530
Authority: DE
Inventors: Hiroko Akita; Tokio Machida; Osamu Terada; Takayuki Uwajima
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1978-07-21
Filing date: 1979-07-20
Publication date: 1980-02-07
Also published as: JPS6031471B2; JPS5515736A; GB2025979A; DE2929530C2; GB2025979B; US4255519A

Description

Die Erfindung betrifft ein Glycerin oxidierendes Enzym, das nachstehend als "Glycerinoxidase II" bezeichnet wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses oxidierenden Enzyms. In der DE-OS 28 17 087 ist eine Glycerinoxidase (im folgenden als Glycerinoxidase I bezeichnet) beschrieben, die bei Züchtung eines Mikroorganismus der Gattungen Aspergillus oder Neurospora in der Gärflüssigkeit erhalten wird.

Erfindungsgemäss wurden Untersuchungen mit anderen Glycerinoxidasen unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Penicillium durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die erfindungsgemässe Glycerinoxidase II die gleiche Wirkung wie die in der vorgenannten DE-OS beschriebene Glycerinoxidase I aufweist, aber in bezug auf Substratspezifität, pH-Optimum, stabilen pH-Bereich, Temperatur-Optimum der Wirkung und Substrataffinität (Michaelis-Konstante für Glycerin) Unterschiede zu der bekannten Glycerinoxidase aufweist.

Erfindungsgemäss lässt sich Glycerinoxidase II erhalten, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Penicillium, der zur Bildung eines Glycerin oxidierenden Enzyms in der Lage ist, in einem Nährmedium, das entsprechende Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Bestandteile und andere Nährstoffe enthält, züchtet und die Glycerinoxidase II

aus der erhaltenen Gärflüssigkeit gewinnt. 35

909888/0778

Es können beliebige Mikroorganismen der Gattung Penicillium verwendet werden, sofern sie zur Bildung von Glycerinoxidase II in der Lage sind. Ein Beispiel für einen geeigneten Mikroorganismenstamm ist Penicillium sp KY 868 (FERM-P 4567, NRRL 11339).

Fig. 1 zeigt die Menge der Sauerstoffaufnähme in einem Reaktionssystem, in dem Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt wird. Dabei gibt die Kurve A die Menge der Sauerstoffaufnähme in einem Reaktionssystem ohne Katalase und die Kurve B die Menge der Sauerstoffaufnahme in Gegenwart von Katalase wieder.

Fig. 2 zeigt die relativen Aktivitäten nach 10-minütiger ° Inkubation bei 37 C und verschiedenen pH-Werten.

Fig. 3 zeigt die Restaktivitäten nach 15-minütiger Behandlung bei 3O°C und verschiedenen pH-Werten.

Ζ® Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und der optischen Dichte bei 500 nm bei der Messung der Enzymaktivität.

Fig. 5 zeigt die Enzymaktivität nach 10-minütiger Inkubation ^ beim pH-Wert 8 und verschiedenen Temperaturen.

Fig. 6 zeigt die Restaktivitäten nach 15-minütiger Behandlung bei verschiedenen Temperaturen.

® Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der Werte von Tabelle IV.

Das erfindungsgemässe Enzym weist folgende enzymologische und physikochemische Eigenschaften auf:

909886/0778

^ (a) Wirkung

Die erfindungsgemässe Glycerinoxidase oxidiert Glycerin unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd.

(b) Substratspezifität

Das erfindungsgemässe Enzym reagiert spezifisch mit Glycerin und Dihydroxyaceton.

(c) pH-Optimum
7,8 bis 8,6

(d) Stabiler pH-Bereich
7,5 bis 10,0

(e) Temperaturoptimum der Wirkung
37°C

(f) Michaelis-Konstante für Glycerin (K -Wert) 8,0 χ 1O~³ m

(g) Bedingungen für die pH-Inaktivierung Glycerinoxidase II wird durch 30-minütige Behandlung bei pH-Werten über 10,5 oder unter 7,0 inaktiviert.

(h) Bedingungen für eine Inaktivierung durch Temperatureinwirkung
Glycerinoxidase II wird durch eine 30-minütige Behandlung bei 45 C zu etwa 15 Prozent und durch eine 30-minütige Be-

o

handlung bei 50 C zu etwa 65 Prozent inaktiviert.

(i) Enzyminhibitoren

Die nach Zusatz von verschiedenen Inhibitoren in einer Konzentration von 1 millimolar erhaltenen Enzymaktivitäten sind

in Tabelle I zusammengestellt, wobei die Enzymaktivität ohne

909886/0778

2929S30

Inhibitorzusatz als 100 definiert wird. Die Aktivität wird aufgrund der Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnähme bei der Umsetzung, die mit einem Warburg-Manometer gemessen wird, berechnet.

Tabelle I

Inhibitor

relative Geschwindigkeit, %

ohne

AgNO₃ HgCl₂ Pb(CH₃COO)₂ p-Chloromercuribenzoat

ZnCl₂ FeSO₄ NH₂OH o-Phenanthrolin

ex, «Χ' -Dipyridyl

EDTA

Neocuproin

Diäthyldithiocarbamat

1OO

79,O 26,3 81,4 84,3

65,5 75,7 82,8 8O, 3

(i) Stabilisierung des Enzyms

Die Wärmebeständigkeit und Lagerbeständigkeit des Enzyms wird durch TES-Puffer nach Good (N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl· 2-amino-äthansulfonsäure; Biochemistry, Bd. 5 (1966), S. bis 477) verbessert.

(k) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht von Glycerinoxidase II beträgt 3OO 0OO oder mehr, wie sich aus dem Elutionsverhalten bei der Gelfiltration unter Verwendung einer mit dreidimensional vernetztem Dextran (Sephadex G-2OO) gepackten Säule ergibt.

909886/0778

-⁷- 292953Q

(1) Kristallstruktur und Elementaranalyse Eine Kristallisation des Enzyms ist bisher nicht gelungen. Eine Bestimmung der Elementaranalyse wurde bisher nicht durchgeführt.

Der vorzugsweise zur Herstellung des erfindungsgemässen Enzyms verwendete Stamm Penicillium sp KY 868 weist die nachstehend angegebenen morphologen Eigenschaften auf.

l. Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Medien:

(a) Auf Czapek-Agar zeigen die Kolonien ein sehr geringes Wachstum und erreichen innerhalb 1 Woche einen Durchmesser von etwa 15 mm. Die Kolonien sind dünn und halbtransparent.

(b) Auf Malzextrakt-Agar ergibt sich ein Kolonienwachstum von etwa 32 mm Durchmesser. Die Kolonien sind flach und kompakt. Der Kolonienrand ist weiss und der Konidienbereich olivfarben (1 1/2 ni- 1 1/2 pi, Color Harmony Manual, Container Corp. of America). Es bildet sich kein Exsudat. Die Rückseite ist weiss.

2. Konidiophoren wachsen bis zu etwa 50 ,um Länge und 3 pam Durchmesser mit einer einfachen oder doppelten asymmetrischen (Asymmetrica) Verzweigung. Die Wände sind etwas granuliert.

3. Metulae stark divergierend (Divaricata), etwa 9 χ 12^um auf 2,5 bis 3 ^um mit granulierten Wänden.

4. Sterigmata von etwa 8 bis 9;nm auf 2,5 bis 3 pm die in Richtung zu den Spitzen Verengungen und Ausbuchtungen aufweisen und die Gestalt von Figuren beim Kegelspiel haben.

5. Konidien von etwa 3 ;um Durchmesser, klar seeigelartig aber nicht auffallend.

909886/0778

' 6. Sclerotia und Perithecia: keine

7. Wachsturns temperatur

Auf Malzextrakt-Agar massiges Wachstum bei 25°C und reichliehe Sporenbildung, bei 30⁰C Wachstum vollständig begrenzt ohne Sporenbildung.

8. Nährstoffbedarf

Auf Czapek-Agar bei 25°C sehr geringes Wachstum (1, (a)) . Auf "steep"-Agar breiteres und dickeres Wachstum bei reichlicher Sporenbildung und auf Malzextrakt-Agar wesentlich besseres Wachstum.

9. Physiologische Bedingungen

'° (a) Optimale Wachstumsbedingungen

pH-Wert 4 bis 7, Temperatur: 20 bis 25°C. (b) Wachstumsbereich

pH-Wert: 2 bis 9, Temperatur: 0 bis 30°C.

Gemäss "A Manual of the Penicilla", K.B. Raper, C.Thorn, D.I. Fennel, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, ergibt sich, dass der Penicillium sp-Stamm mit den vorstehenden morphologischen Eigenschaften zu den Pilzen der Reihe Penicillium nigricans gehört. Die genaue Einordnung dieses Pilzes wurde in der Literatur bisher noch nicht vorgenommen.

Im erfindungsgemässen Verfahren können beliebige Mikroorganismen verwendet werden, die zur Gattung Penicillium gehören und zur Bildung von Glycerinoxidase II in der Lage sind. Wie bereits erwähnt, ist Penicillium sp KY 868 (FERM-P 4567, NRRL 11339) ein bevorzugtes Beispiel für einen geeigneten Mikroorganismenstamm.

Es können beliebige synthetische und natürliche Medien ver-

wendet werden, sofern sie entsprechende Kohlenstoffquellen,

909886/0778

Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthalten.

Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose und Rohrzuckermelassen, und Zuckeralkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit.

Als Stickstoffquellen kommen wässriges Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumverbindungen, wie Ammonium-

^O chlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumphosphat, Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff, und stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, entfettete Sojabohnen oder Hydrolyseprodukte davon, in Frage.

Beispiele für anorganische Materialien sind Metallsalze, wie Natrium-, Kalium-, Mangan-, Magnesium-, Calcium-, Kobalt-, Nickel-, Zink- und Kupfersalze, sowie Salze von Chromsäure,

Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und Salzsäure. 20

Glycerinoxidase II wird in optimalen Ausbeuten erhalten, wenn ein Glycerinoxidase II bildender Mikroorganismenstanun in einem Medium, das Glycerin enthält, gezüchtet wird.

^ Die Züchtung wird im allgemeinen bei Temperaturen von 18 bis 3O°C und vorzugsweise von 20 bis 35 C durchgeführt, wobei beim Züchtungsbeginn der pH-Wert 6 bis 8 und vorzugsweise etwa 6,5 beträgt. Nach 30- bis 72-stündiger Züchtung unter Schütteln oder unter Submersbedingungen unter Belüftung und

Bewegung bildet sich in der Gärflüssigkeit eine beträchtliche Menge an Glycerinoxidase II.

Die auf diese Weise in der Gärflüssigkeit gebildete Glycerinoxidase II kann auf folgende Weise gewonnen werden:

909886/0778

Da Glycerinoxidase II im allgemeinen in den Mikroorganismenzellen entsteht, wird nachstehend ein Verfahren zur Gewinnung des Enzyms aus den Mikroorganismenzellen beschrieben. Nach beendeter.Züchtung werden die durch Filtration der Gärflüssigkeit erhaltenen Mikroorganismenzellen in ausreichendem Umfang mit Wasser oder Pufferlösung gewaschen- Anschliessend werden die Zellen in einer entsprechenden Menge einer Pufferlösung suspendiert und aufgebrochen. Das Aufbrechen der Zellen erfolgt durch mechanische Zerkleinerung, beispielsweise in einem der folgenden Geräte: Mörser, Dyno-Mühle, "Manton goulin", französische Presse, "Fuse-Presse" und Ultraschallzerkleinerer.

Feste Bestandteile werden von der nach dem Aufbrechen der Mikroorganismenzellen erhaltenen Lösung durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Anschliessend wird aus der Lösung die Glycerinoxidase II nach einem üblichen Verfahren zur Isolierung von Enzymen gewonnen. Beispielsweise lasst sich ein Enzympulver durch (1) fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat, (2) Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose,

(3) Fraktionierung mit einem Molekularsieb (Sephadex), (4) Säulenchromatographie an Hydroxylapatit und (5) Gefriertrocknung der aktiven Fraktionen erhalten. Die einzelnen Verfahrensstufen können selbstverständlich wiederholt angewendet werden. Ferner können auch andere herkömmliche Reinigungsverfahren gegebenenfalls in Kombination mit den vorstehend genannten Reinigungsschritten eingesetzt werden.

Nachstehend sind die enzymologischen und physikochemischen Eigenschaften von Glycerinoxidase II detaillierter angegeben und zwar für das gereinigte Präparat von Beispiel 1.

1. Wirkung

Glycerinoxidase II oxidiert Glycerin unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Wasserstoffperoxid und GIycerinaldehyd.

909886/0778

^Γ .η- 2929539

(a) Bestätigung der Bildung von Wasserstoffperoxid:

(a)-l. Glycerinoxidase II wird mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt. Anschliessend wird das Enzymsystem mit Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin versetzt, wobei Chinonimin-Pigment

im Reaktionssystem gebildet wird {Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin gemäss Clin. Chem., Bd. 20 (1974), S. 2O.

(a)-2. Glycerinoxidase wird mit Glycerin in Gegenwart

von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid umgesetzt. Zur Zersetzung des gebildeten Wasserstoffperoxids wird Katalase zugegeben. Anschliessend werden Peroxidase, Phenol und 4-Amino

antipyrin zugesetzt, um die vorstehend genannte Umsetzung vorzunehmen. Im Reaktionssystem bildet sich aber kein Chinonimin-Pigment.

(a)-3. Bei Anwesenheit von Katalase im durch Glycerinoxidase in Gegenwart von Sauerstoff katalysierten Glycerin-Oxidationssystem sinkt die Sauerstoffaufnahme auf die Hälfte. Dies wird durch folgende experimentelle Befunde gestützt:

(a)-3-l. Zusammensetzung des Reaktionssystems A (ohne

Katalase):
Reaoentien

wässrige 0,Ol m Glycerinlösung 0,5 ml

O,1 m TES-Puffer (pH-Wert 8,0) 1,OmI

wässrige Lösung von Glycerinoxidase O,2 ml *1

wässrige 2,4 millimolare Lösung

von 4-Aminoantipyrin O,5 ml

wässrige 42 millimolare Phenollösung 0, 5 ml

wässrige Lösung von Peroxidase 0,2 ml *

Wasser 0,1 ml

909886/0778

* 1: Mit einem Gehalt an 5 ^uMoI Glycerinoxidase mit einer spezifischen Aktivität von 6,3, erhalten gemäss Beispiel 1
jfc 2: Produkt der Sigma Corp. (V.St.A.) mit einem Gehalt an 200 Einheiten der spezifischen Aktivität lOOO.

(a)-3-2, Zusammensetzung des Reaktionssystems B (mit Katalase):

in Reaqentien

wässrige 0,01 m Glycerinlösung O,5 ml

0,1 m TES-Puffer (pH-Wert 8,0) I₁O ml

wässrige Lösung von Glycerinoxidase O,2 ml *

wässrige Lösung von Katalase 1,O ml *

Wasser O,3 ml

* 1: vgl. Reaktionssystem A

* 3: Produkt der Sigma Corp. (V.St.A.) mit einem Gehalt an

lOO Katalaseeinheiten mit einer spezifischen Aktivität von 100.

(a)-3-3, Reaktionsdurchführung:

Im Fall des Systems ohne Katalase werden die Reagentien des Reaktionssystems A vermischt.

Die Reaktion wird bei 37°C unter Rühren durchge

führt. Die Menge der Sauerstoffaufnahme wird mit einem Warburg-Manometer gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengestellt.

Im Fall des Systems mit einem Gehalt an Kata

lase werden die Reagentien des Reaktionssystertis B vermischt. Die Reaktion wird bei 37 C durchgeführt. Die Menge der Sauerstoffaufname wird auf die vorstehend beschriebene Weise gemessen.

Die Ergebnisse sind ebenfalls in Fig. 1 zusammen

gestellt. Wie sich aus Fig. 1 ergibt, werden in

909886/0778

Abwesenheit von Katalase (Kurve A von Fig. 1)

bei 5,0/iMol Glycerin als Substrat 4,98 ;jMo1 Sauerstoff verbraucht- In Gegenwart von Katalase (Kurve B von Fig. 1) werden 2,51^uMoI Sauerstoff verbraucht, was etwa der Hälfte des

SauerstoffVerbrauchs von (A) entspricht.

Die vorstehend unter (a)-l, (a)-2 und (a)-3 aufgeführten Befunde bestätigen, dass das erfindungsgemässe Enzym zur Bildung von Wasserstoffperoxid in der Lage ist.

Eine qudiititative Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids wird durch eine quantitative colorimetrische Bestimmung des gebildeten Chinonimin-Pigments durchgeführt. Dabei ergibt sich, dass im Reaktionssystem A gemäss dem nachstehend erläuterten Verfahren 4-AA 4,9O_xUMoI Wasserstoffperoxid aus ^uMoI Glycerin gebildet werden.

(b) Bestätigung der Bildung von Glycerinaldehyd

(b)-1. Glycerinoxidase wird mit Glycerin in Gegenwart

von Sauerstoff umgesetzt. Ein Reaktionsprodukt wird als Glycerinaldehyd identifiziert.

(b)-l-l. Verfahren zur Identifikation 25

(b)-l-l-(l): Reaktionslösung:

5 Tropfen einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 5O mg/ml Glycerin, 5 Tropfen einer Lösung mit einem Gehalt an 10 U/ml Glycerinoxidase in O,02 m TES-Puffer und 1 Tropfen Kata-30

läse mit 14 000 U/ml werden vereinigt. Die Umsetzung wird unter Schütteln 20 Stunden bei 30°C durchgeführt.

(b)-l-l-(2): Identifikation;

Bei der nachstehend erläuterten Dünnschichtchromatographie lässt sich als Produkt in der

909886/0778

292953Q

Reaktionslösung Glycerinaldehyd durch Vergleich mit einer authentischen Probe nachweisen.

Zur Dünnschichtchromatographie wird eine Kieselgel-Platte G-6OF-254 (E.Merck, Darmstadt) verwendet. Als Laufmittel dienen das Lösungsmittelsystem 1 (Butanol:Essigsäure: Wasser im Verhältnis 4:1:1 (Volumteile)) und das Lösungsmittelsystem 2 (Butanol : Pyridin: Wasser im Verhältnis 3 : 2 :1,5 (Volumteile)).

Nach der Durchführung der Dünnschichtchromatographie werden drei verschiedene Reaktionen auf der Platte durchgeführt, nämlich die p-Anisidin-Reaktion, die Perjodsäure-Benzidin-Reaktion und die 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reaktion. Dabei ergeben sich R^-Werte und Färbungen der Flecken, die mit der authentischen Probe übereinstimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Identifikation der bei der Dünnschichtchromatographie

erhaltenen Reaktionsprodukte (R^-Werte und Farbreaktionen)

Färbe reagens	"~"~ Lauf mi 11 e 1 Probe ~--—	Lösungsmittel system 1	Lösungsmittel system 2
p-Anisidin- Chlorwasser- stoffsäure- Reagens 1)	Glycerinaldehyd (au thentische Probe)	R_f-Wert 0,67 (braun)	0,76 (braun)
Perjod- säure- Benzidin- Reagens 2)	Reaktionsprodukt	R_f-Wert 0,69 (braun)	0,78 (braun)
2,4-Dinitro- phenyl- hydrazin- Reagens 3)	Glycerinaldehyd (au thentische Probe)	R.-Wert 0,66 *^£ (♦).**	0,76 (♦) *
Reaktionsprodukt	R.-Wert 0,68 M *	0,78 (♦) *
Glycerinaldehyd (au thentische Probe)	R_f-Wert 0,67 (orangefarben)	0,77 (orangefarben)
I Reaktionsprodukt j	R_f-Wert O,69 (orangefarben)	0,78 (orangefarben)

909886/0778

-is- 292953Q

Die in Klammern angegebenen Farbangaben beziehen sich auf die Färbung der Flecken.

(*) * Beim Perjodsäure-Benzidin-Reagens bedeutet einen

weissen Flecken mit blauem Hintergrund. 5

Anmerkungen:

1) p-Anisidin-Chlorwasserstoff-Reagens: Reduktive Carbonylverbindungen, wie Zucker, reagieren mit p-Anisidin-Chlorwasserstoffsäure unter Bildung einer für die jeweilige Struktur charakteristischen Färbung.

2) Perjodsäure-Benzidin-Reagens: Polyalkohole und Verbindungen ähnlicher Struktur verbrauchen Perjodsäure, so dass eine Reaktion mit Benzidin verhindert wird. Somit lassen sich diese Verbindungen als weisse Flecken nachweisen.

3) 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens: Carbonylverbindungen reagieren mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin unter Bildung von 2,4-Dinitrophenylhydrazonen, die sich als orangefarbene Flecken nachweisen lassen.

Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, dass die erhaltenen Produkte und die authentische Probe von Glycerinaldehyd sich in bezug auf R_f-Werte und Anfärbung vollkommen gleich verhalten. Dies stellt eine Bestätigung dafür dar, dass es sich bei dem Produkt, das durch Umsetzung der Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff erhalten worden ist, um Glycerinaldehyd handelt.

(b)-2. Die Menge an Glycerinaldehyd, die bei der Umsetzung von Glycerinoxidase mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff gebildet wird, ist fast äquimolar zur verbrauchten Glycerinmenge. Dieser Befund wird durch Zusatz von 2,4-Dinitrophenylhydrazin zum Reaktionssystem bestätigt. Dabei wird das entsprechende 2,4-Dinitrophenylhydrazon gebildet, das durch Colorimetrie quantitativ bestimmt wird.

L J

909886/0778

(c) Bestätigung der Menge der Sauerstoffaufnahme Der Sauerstoffverbrauch im System, in dem Glycerinoxidase mit Glycerin umgesetzt wird, wird mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode und einem Warburg-Manometer gemessen. Dabei wird bestätigt, dass die Menge der Sauerstoffaufnähme der Menge an gebildetem Glycerinaldehyd entspricht.

(d) Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmungen der Menge an Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd und der Menge der Sauerstoffaufnahme, die gemäss den vorstehend erläuterten Verfahren (a), (b) und (c) durchgeführt worden sind, stehen im Einklang mit der angenommenen Stöchiometrie.

Die vorstehenden qualitativen und quantitativen Untersuchungen bestätigen, dass das erfindungsgemässe System Glycerin unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd gemäss nachstehender Gleichung oxidiert.

CH-OH CH-OH

. ι o- r *

CEOH =—> CEOH. +

ι ι ■

CH₂OH CHO

Dieses Enzym wird somit als Glycerinoxidase II bezeichnet.

II. Substratspezifität

Die -relative Aktivität wird unter Verwendung von anderen Substraten gemessen. Diese Substrate werden in äquimolaren Mengen zum Glycerin im Verfahren zur Messung der Aktivität gemäss 4-AA verwendet.

Die relativen Aktivitäten bezüglich der weiteren Substrate sind in Tabelle III zusammengestellt, wobei die Glycerinaktivität als 100 gesetzt wird.

909886/0778

f ;. -ι

292953Q

Tabelle III Substratspezifitat Substrat relative Aktivität

Glycerin 100

Glycerin-3-phosphorsäure 12

Dihydroxyaceton 293

1,2-Propandiol 11

1,3-Propandiol 23

1,3-Butandiol 11

2,3-Butandiol 16

1,4-Butandiol 11

Äthanol 11

n-Propanol 11

Isopropanol 23

sek.-Butanol 9

Isobutanol 14

n-Butanol 7

III. pH-Optimum und stabiler pH-Bereich

Das pH-Optimum liegt im Bereich von 7,8 bis 8,6. Die Aktivi-

* ο

täten werden nach 10-minütiger Inkubation bei 37 C bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung von TES-Puffer gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengestellt.

Der stabile pH-Bereich beträgt 7,5 bis 10,0. Die restlichen Aktivitäten werden nach 15-minütiger Behandlung bei 37°C bei

verschiedenen pH-Werten unter Verwendung von TES-Puffer ge-30

messen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 zusammengestellt.

IV. Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität Die enzymatische Aktivität wird in "Einheiten" ausgedrückt. __ Eine Enzymeinheit ist als die Enzymmenge definiert, die in 1 Minute in Gegenwart von Sauerstoff 1 ^MoI Glycerin bei

909886/0778

- ie - 232953Q

' 37°C zersetzt. Die Bestimmung der Enzymaktivität wird folgendermassen durchgeführt: Glycerin wird unter Rübren mit Glycerinoxidase II unter Bildung von Wasserstoffperoxid umgesetzt. Das gebildete Wasserstoffperoxid wird in Gegenwart von Peroxidase mit 4-Aminoantipyrin und Phenol umgesetzt, wodurch ein Chinonimin-Pigment gebildet wird- Die optische Dichte des erhaltenen Chinonimin-Pigments im sichtbaren Bereich, die ein Mass für das gebildete Wasserstoffperoxid darstellt, wird gemessen. Auf diese Weise wird die Enzymaktivität (nachstehend bezeichnet als "4-AA-Verfahren") bestimmt.

Erfindungsgemäss ist die spezifische Aktivität als Einheiten pro 1 mg Protein definiert. Die Menge des Enzymproteins wird gemäss dem Lowry-Verfahren unter Verwendung eines Kupfer-Folin-Reagens gemessen; vgl. O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr und R.J. Randall, J. Biol. Chem., Bd. 193 (1951), S. 265.

(a) Prinzip

Die Bestimmung der Enzymaktivität wird durch Umsetzung des enzymatisch gebildeten Wasserstoffperoxids mit 4-Aminoantipyrin und Phenol in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Chinonimin-Pigments durchgeführt. Das gebildete Chinonimin-Pigment wird quantitativ bestimmt. Die vorstehenden Um-

Setzungen lassen sich durch die Reaktionsgleichungen (1) und (2) darstellen:

909886/0 7 78

CHOH

CH₂OH

- 19 -

Glycerinoxidase II

292953Q

CH-OH

I ²

CHOH

CHO

^{+ H}2°2

(1)

Peroxidase

CH-

4-Aioi.no an tipyrin

(2)

Das Reaktionsprinzip der Gleichung (2) ergibt sich aus CC. Allain und Mitarb., Clin. ehem., Bd. 20 (1974), S. 470.

(b) Reaqentien

(1) Substrat: wässrige 0,1m Glycerinlösung

(2) Puffer: O,1 m TES-Puffer vom pH-Wert 8

(3) 4-Aminoantipyrin: wässrige 2,4 millimolare Lösung

(4) Phenol: 42 millimolare wässrige Lösung

(5) wässrige Lösung von Peroxidase: Proteinmenge 2 mg/ml, spezifische Aktivität 100

(6) Wasser

(7) wässrige Enzymlösung

O, 5	ml
1,0	ml
0,5	ml
O, 5	ml
0,1	ml
0,3	ml
0,1	ml

909886/0778

^ (c) Versuchsdurchführunq

Die Reagentien (1) bis (6) werden in einem Reagenzglas vermischt und sodann 5 Minuten bei 37°C geschüttelt. Sodann wird die Enzymlösung zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird mit TES-Puffer auf 3 ml aufgefüllt. Die Umsetzung wird IO Minuten unter Schütteln bei 37 C durchgeführt. Zu Vergleichszwecken wird ein entsprechendes Verfahren unter Verwendung von Wasser anstelle der Testlösung durchgeführt. Die optische Dichte der Reaktionslösung bei 500 nm wird gemessen. Die Differenz zur Kontrollösung wird als ΔOD (optische Dichte) bestimmt.

(d) Berechnung der Enzymaktivität

Wie bereits erwähnt, ist 1 Einheit Glycerinoxidase II als die Enzymmenge definiert, die in 1 Minute bei 37°C 1 uMol Glycerin zersetzt.

Der Absorptionskoeffizient von 1 millimolar Chinonimin-Pigment beträgt 5,33 (vgl. Clin. Chem. Bd., 20 (1974), S. 47O). Ergibt sich für die optische Dichte (AOD) bei 5OO nm der gemäss dem vorstehenden Verfahren IV-(c) erhaltenen 3 ml Reaktionslösung ein Wert von a., so lässt sich die Enzymaktivität (A) pro 1 ml Enzymlösung nach folgender Formel berechnen:

A = a_ χ χ 3 χ

5,33 IO

= a. χ 0,56 (Einheiten/ml)

Die OD-Werte bei 500 nm werden unter Veränderung der Reaktionszeit (bei der Messung der enzymatischen Aktivität) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 zusammengestellt. Aus Fig. 4 ergibt sich, dass die OD-Werte bei 5OO nm proportional zur Reaktionszeit sind.

V. Optimaler Temperaturbereich der Wirkung

Die Enzymaktivität nach 10-minütiger Inkubation beim pH-Wert

909886/0778

8 und bei verschiedenen Temperaturen sind in Fig. 5 zusammengestellt. Das Temperaturoptimum beträgt etwa 37°C.

VI. Inaktivierung durch pH- und Temperatureinfluss^ und derql. Inafrtivi,erunq durch pH-Einflüsse.

Wie vorstehend unter III. (pH-Optimum und stabiler pH-Bereich) erläutert, wird das Enzym unterhalb eines pH-Werts von 7,0 bzw. oberhalb eines pH-Werts von 10,5 inaktiviert.

Inaktivierung durch Temperatureinflüsse Nach einer 15-minütigen Erwärmung bei einem pH-Wert von 7,8 in 0,1 m TES-Pufferlösung werden die restlichen Aktivitäten gemessen. Wie sich den in Fig. 6 wiedergegebenen Ergebnissen * entnehmen lässt, ist das Enzym bis zu 40⁰C 100-prozentig

¹S stabil und wird bei 45°C zu etwa 15 Prozent inaktiviert.

V||_r Hemmung,Aktivierung und Stabilisierung Diesbezüglich wird auf die vorstehenden Erläuterungen verwiesen.
20

VIII. Substrataffinität

Die Michaelis-Konstante (vgl. H. Lineweaver und D. Burk, J. Amer. Chem. Soc, Bd. 56 (1934), S. 658) (K_m~Wert)für das Substrat Glycerin beträgt bei dem durch Mikroorganismen der Gattung Penicillium gebildeten Enzym 8,0 χ 10 m. Die K Werte für Glycerinoxidase I (vgl. DE-OS 28 17 087) betragen

—2 für Aspergillus japonicus 1,85 χ 10 m und für Neurospora

2
crassa 1,90 χ 10 m. Somit ist der K -Wert des Enzyms aus Mikroorganismen der Gattung Penicillium etwa halb so gross wie bei Enzymen aus Mikroorganismen der Gattungen Aspergillus und Neurospora.

Somit weist die durch Mikroorganismen der Gattung Penicilliurn gebildete Glycerinoxidase eine hohe Affinität gegen Glycerin auf. Dieses Enzym ist somit zur Bestimmung von Glycerin besonders geeignet.

909886/0778

- 22 - 292-953Q

^ Das erfindungsgemässe Enzym. Glycerinoxidase II wird vorzugsweise zur quantitativen Bestimmung von Glycerin verwendet. Entsprechende Verfahren sind nachstehend angegeben.

(a) Verfahren unter Umsetzung von Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff, wobei das gebildete Wasserstoffperoxid quantitativ bestimmt wird.

(b) Verfahren, bei dem der gemäss (a) gebildete Glycerinaldehyd mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin unter Bildung von 2,4-Dinitrophenylhydrazon umgesetzt wird. Eine quantitative colorimetrische Bestimmung des 2,4-Dinitrophenylhydrazons ermöglicht eine quantitative Bestimnung des Glycerins.

(c) Verfahren, bei dem Glycerinoxidase II mit Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff umgesetzt wird und die Menge der Sauerstoffaufnähme im System gemessen wird-

Die Prinzipien und die Verfahren gemäss (a), (b) und (c) sind vorstehend unter Abschnitt I. erläutert. Nachstehend wird ein Beispiel für das Verfahren (a) für die quantitative Bestimmung von Glycerin unter Messung der Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid erläutert.

Die optische Dichte der Reaktionslösungen bei 5OO nra wird gemäss den Ausführungen unter Abschnitt IV-(c) bestimmt, wobei Lösungen mit einem Gehalt an 0,1 mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 2,4/ml verwendet werden. Die Konzentration der Substratlösung (Glycerinlösung) beträgt

0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 5,0 und 10,0 millimolar (vgl. Abschnitt IV-(c)). Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Substratkonzentration
(millimolar) 0,1 0,2 0,5 1,0 5,0 1O,O

OD-Wert bei 5OO nm 0,058 0,116 0,3Ol O,598 2,995 5,99Ο

909886/0778

' Es lässt sich eine lineare Beziehung zwischen der Substratkonzentration (Glycerinkonzentration) und der optischen Dichte der Reaktionslösung bei 500 nm feststellen. Auf dieser Basis lässt sich die Glycerinkonzentration einer unbekannten Lösung quantitativ bestimmen.

Somit kann die Glycerinkonzentration einer Lösung unter Verwendung von Glycerinoxidase II gemessen werden- Damit wird erfindungsgemäss ein neues Verfahren und ein Reagentiensatz ™ zur quantitativen Bestimmung von Glycerin zur Verfügung gestellt.

Insbesondere auf dem Gebiet der Biochemie besteht ein Bedarf nach Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin. Es sind verschiedene Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Triglyceriden bekannt, wobei die Triglyceride im Serum unter Bildung von Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert werden und das Glycerin bestimmt wird.

Es sind verschiedene chemische Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glycerin bekannt, z.B. das Chromotropsäure-Verfahren, das Acetylaceton-Verfahren, das Triazol-Verfahren, das Randrup-Verfahren und das Mendelsohn-Fluoreszenz-Verfahren. Jedoch haben alle diese Verfahren den Nachteil, dass sie

nicht spezifisch für Glycerin sind. Zur enzymatischen Glycerin bestimmung kann beispielsweise Glycerokinase (E.C. 2.7.1.30) verwendet werden. Jedoch muss diese Reaktion zusammen mit Pyruvat-kinase (E.C.2.7.1.40) und Lactat-dehydrogenase (E-C. 1.1.1.27) durchgeführt werden. Somit ist die Messung sehr zeit

aufwendig und zu einer Bestimmung einer grossen Anzahl von Pro ben ungeeignet.

Es wurde festgestellt, dass das erfindungsgemässe Enzym Glycerinoxidase II Glycerin direkt unter stöchiometrischer BiI-

dung von Wasserstoffperoxid oxidiert. Das erhaltene Wasserstoffperoxid lässt sich leicht in ein gefärbtes System überführen. Somit steht ein quantitatives Verfahren zur Bestim-

909886/0778

mung von Glycerin und infolgedessen auch von Triglyceriden zur Verfügung, das sehr einfach und spezifisch aufgrund der genannten colorimetrischen Bestimmung durchgeführt werden

kann.
5

Aus den vorstehenden Erläuterungen ergibt sich, dass Glycerinoxidase II aus Mikroorganismen der Gattung Penicillium die gleiche Wirkung wie Glycerinoxidase I aus Mikroorganismen der Gattungen Aspergillus oder Neurospora aufweisen, wobei sich jedoch Unterschiede in bezug auf das pH-Optimum, die Substratspezifität und andere Eigenschaften ergeben.

Ferner hat sich herausgestellt, dass das erfindungsgemässe Enzym Glycerinoxidase II sich aufgrund seiner Wärmebeständigkeit und seines niedrigen K -Werts besonders zur quantitativen Glycerinbestimmung eignet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

3OO ml eines Anzuchtmediums mit einem Gehalt an 30 g/Liter Glycerin, 6 g/Liter Maisquellflüssigkeit und 2 g/Liter Hefeextrakt (pH-Wert 6,5 vor der Sterilisation) werden in eine 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben mit Penicillium sp KY (FERM-P 4567, NRRL 11339) beimpft. Die Züchtung wird unter Schütteln 48 Stunden bei 25°C durchgeführt.

900 ml (Inhalt von 3 Kolben) der erhaltenen Anzuchtkultur werden auf 15 Liter Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung

wie das Anzuchtmedium, das sich in einem 30 Liter-Fermenter befindet, übertragen. Die Züchtung wird unter Belüftung (15 Liter /min) und Rühren (250 U/min) 40 Stunden bei 25°C durchgeführt. Anschliessend wird die Gairf lüssigkeit abgenutscht. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen. Man erhält 73 g (Trocken-

gewicht) Mikroorganismenzellen.

909886/0778

_ 25 - 292953Q ~

Diese Mikroorganismenzellen werden in 5 Liter 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 suspendiert und anschliessend mit einer Dyno-Mühle (Willy A., Bachofen, Schweiz) aufgebrochen. Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension unter Verwendung einer Kühlzentrifuge (2O Minuten bei 20 OOO g) zentrifugiert. Man erhält 4,5 Liter Überstand mit einem Proteingehalt von 23 g und einer spezifischen Aktivität von 0,01 Einheit/mg. Der Überstand wird mit Ammoniumsulfat versetzt. Die bei 30-bis 70-prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat '° ausgefällte Fraktion wird gewonnen und in 50 ml 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 gelöst. Die Lösung wird gegen 10 Liter 10 millimolaren TES-Puffer unter Verwendung eines Schlauches aus regenerierter Cellulose (Cellophan)

dialysiert.
15

Die Dialyse wird 48 Stunden mit einer Gesamtmenge von 40 Liter Dialyseflüssigkeit durchgeführt, wobei das Dialysebad in Abständen von 12 Stunden erneuert wird. Die dialysierte Enzymlösung

wird über eine mit DEAE-Cellulose (Serva Co., Heidelberg) 20

gepackte Säule der Abmessungen 5,5 χ 40 cm, die vorher mit 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 äquilibriert worden ist, gegeben. Dabei wird das Enzym adsorbiert. Nichtadsorbierte Proteinverunreinigungen werden mit dem gleichen Puffer ausgewaschen. Anschliessend wird die Glycerinoxi-

dase eluiert, wozu 2 Liter O,Ol m TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 mit einem Gehalt an O,1 m NaCl verwendet werden. 5OO ml aktive Fraktionen mit einem Proteingehalt von 0,6 g und einer spezifischen Aktivität von 0,21 werden gesammelt. Diese Lösung wird bis zu einer Sättigung von 70 Prozent mit Ammonium-

sulfat versetzt, wodurch das Enzym ausgefällt wird.

Anschliessend werden die Niederschläge durch 20-minütige Zentrifugation bei 20 000 g gewonnen und hierauf in 23 ml

10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 gelost. Die Logg

sung wird über eine mit dreidimensional vernetzten! Dextran

909886/0778

- 26 - 29-2953Q

(Sephadex G-IOO; Pharmacia Fine Chemicals Co., Schweden) gepackte Säule der Abmessungen 5,5 χ 80 cm, die vorher mit 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 äquilibriert worden ist, gegeben. Zur Elution werden 1 Liter IO millimolarer TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 über die Säule gegeben.

Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Man erhält 3OO ml einer Fraktion mit einer hohen spezifischen Aktivität (Proteingehalt 14Ο mg, spezifische Aktivität 0,61). Diese Lösung wird bis zu einer Sättigung von 7O Prozent mit Ammoniumsulfat versetzt. Das dadurch ausgefällte Enzym wird abzentrifugiert (20 Minuten bei 20 000 g) und sodann in 10 ml 10 millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 gelöst. Die erhaltene Lösung wird 24 Stunden gegen 5 Liter IO millimolaren TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 dialysiert, wobei als Dialysemembran ein Schlauch aus regenerierter Cellulose (Cellophan) verwendet wird und das Dialysebad 2 mal erneuert wird. Nach der Dialyse wird die erhaltene Enzymlösung über eine mit Hydroxylapatit gepackte Säule der Abmessungen 5,5 χ 2O cm, die vorher mit IO millimolarem TES-Puffer vom pH-Wert 7,8 äquilibriert worden ist, gegeben. Weitere 250 ml des gleichen Puffers werden über die Säule gegeben. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen mit einer hohen spezifischen Aktivität werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 4,9 mg gereinigtes, pulverförmiges Enzympräparat von Glycerinoxidase II mit einer spezifischen Aktivität von 6,3. Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms beträgt etwa das 630-fache des Zellextrakts. Die Ausbeute in bezug auf die Aktivität beträgt 11,4 Prozent.

Beispiel2 Verwendete Reaqentien

(1) Testlösung: wässrige Glycerinlösung (von unbekannter Konzentration)

(2) Puffer: O,1 m TES-Puffer vom pH-Wert 8

(3) 4-Aminoantipyrin:wässrige 2,4 millimolare Lösung

(4) Phenol: wässrige 42 millimolare Lösung

909886/0778

ο,	5	ml
	°	ml
ο,	5	ml
ο,	5	ml

(5) Peroxidase: wässrige Lösung von Peroxidase mit einem Proteingehalt von 2O mg/ml und einer spezifischen Aktivität von 1000 O₁1 ml

(6) Wasser O,3 ml

(7) Enzym: Proteingehalt 1,0 mg/ml, spezifische

Aktivität 2,4 O,1 ml

(b) Verfahren

Die vorstehend genannten Reagentien (1) bis (6) werden in ein Reagenzglas gegeben und 5 Minuten bei 37°C mit ausreichender Intensität geschüttelt. Anschliessend wird die Enzymlösung zugesetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird mit TES-Puffer auf 3 ml aufgefüllt. Die Umsetzung wird 10 Minuten unter Schütteln bei 37°C durchgeführt. Das entsprechende Verfahren wird zu Vergleichszwecken wiederholt, wobei anstelle der Testlösung Wasser verwendet wird. Der OD-Wert bei 5OO nm der Testlösung wird gemessen. Die Differenz /IOD zur Vergleichslösung beträgt 0,322. Aus der Kurve von Fig. lässt sich ein Glyceringehalt der Testlösung von O,532 millimolar ermitteln.

909886/0778

Claims

VOSSIUS · VOSSIUS - HILTL ■ TAUCHNGR · :H£iJ N ζΜΑΝΝ

SIEBERTSTRASSE A- ■ BOOO MÖNCHEN 86 · PHONE: (O89) 474Ο75 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 5-29453 VOPAT D

2 0 JUL 1979

u.Z. : P 262
Case: 240-4

KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
Tokyo, Japan

"Glycerinoxidase und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Priorität: 21. Juli 1978, Japan, Nr. 88261/1978 15

Patentansprüche

ι. Glycerin oxidierendes Enzym mit folgenden Eigenschaften:

(1) Wirkung: Oxidation von Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd;

(2) Substratspezifität: Spezifische Wirkung auf Glycerin und Dihydroxyaceton;

(3) pH-Optimum: 7,8 bis 8,6;

(4) pH-Stabilitätsbereich: 7,5 bis 10,0;

(5) Temperatur-Optimum der Wirkung: 37°C; und

(6) Michaelis-Konstante gegen Glycerin (K -Wert): 8,Ox 10~³m.
2. Oxidierendes Enzym nach Anspruch 1, erhältlich durch Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Penicillium.
3. Oxidierendes Enzym nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Penicillium sp KY 868 (FERM-P 4567, NRRL 11339) verwendet worden

ist.
L

909886/0778
4. Oxidierendes Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Molekulargewicht von 300 000 oder mehr aufweist.
5. Verfahren zur Herstellung eines Glycerin oxidierenden Enzyms, das Glycerin in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid und Glycerinaldehyd oxidiert, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Gattung Penicillium, der zur Bildung dieses Enzyms in der Lage ist, in einem Nährmedium züchtet und das Enzym aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Nährmedium verwendet, das

zu Beginn der Züchtung einen pH-Wert von 6 bis 8 aufweist, und dass man die Züchtung bei Temperaturen von 18 bis 4O°C unter Bewegen 30 bis 72 Stunden durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Penicillium sp KY 868 (FERM-P 4567, NRRL 11339) verwendet.

909886/0778