DE2737288A1 - Verfahren zur bestimmung von glycerin in waessrigen fluessigkeiten sowie bestimmungs-reagenz zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

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22. Juli 1977 25/93 Reg.Nr. 125 352

Eastman Kodak Company, 343 State Street, Rochester,
Staat New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Verfahren zur Bestimmung von Glycerin in wäßrigen
Flüssigkeiten sowie Bestimmungs-Reagenz zur Durchführung des Verfahrens

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Verfahren zur Bestimmung von Glycerin in wäßrigen Flüssigkeiten sowie Bestimmungs-Reagenz zur Durchführung des Verfahrens.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man in einer Probe der zu analysierenden Flüssigkeit gegebenenfalls vorhandene Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin hydrolysiert und das freie und/oder durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung umsetzt. Des weiteren betrifft die Erfindung Bestimmungs-Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens.

Die Bestimmung von Serum-Triglyceriden im Blutserum hat in jüngster Zeit bei der Diagnose von mehreren Typen von Hyperlipemia und arteriosklerotischen Herzkrankheiten steigende Bedeutung erlangt. Verwiesen wird beispielsweise auf W. Kahlke, Medizinische Wochenschrift 9± (1966), Seite 26 sowie P.T. Kuo und D.R. Basset, Amer. Intern. Med. , 59_ (1963), Seite 465.

Die üblichen bekannten Verfahren zur Bestimmung des Serum-Triglyceridgehaltes bestehen in einer Hydrolyse der Triglyceride unter Freisetzung von Glycerin und Umsetzung des Glycerins mit verschiedenen Reagenzien unter Erzeugung von Verbindungen, die auf spektrophotometrischem Wege quantitativ bestimmt werden können.

Die Hydrolyse der Triglyceride erfolgt dabei unter Verwendung einer Base. Aus den US-PS 3 703 591 und 3 759 793 ist es jedoch auch bereits bekannt, die Hydrolyse auf enzymatischem Wege herbeizuführen, und zwar nach dem Verfahren der US-PS 3 759 793 unter Verwendung einer Lipase allein und nach dem aus der US-PS 3 703 591 bekannten Verfahren unter Verwendung einer Lipase in Kombination mit einer Protease. Weitere nicht-enzymatische Hydrolyseverfahren sind beispielsweise aus den DT-PS 2 229 849 und 2 323 609 bekannt.

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Es ist des weiteren bekannt, Glycerin auf enzymatischem Wege zu bestimmen. Die Bestimmung kann dabei nach drei verschiedenen enzymatischen Methoden erfolgen, nämlich:

(a) Methode von Garland und Rändle (vergl. P.B. Garland und P.J. Rändle in Nature, 196 (1962), Seiten 987 bis 988)

Glycerin + ATP Glycerin-Kinase _L__a-_Glycerophosphat + ADP ADP ♦ Phosphoenolpyruvat ^pyr^uvat"^Kinase ^ p_yruvat + ATP

Pyruvat ♦ NADH ^Lactat > Lactat + NAD⁺ Dehydrogenase

(b) Verfahren nach Weiland (vergl. 0. Weiland in Biochem. Z., (1957), 329, Seite 313

Glycerin + ATP ^G1ycerin-Kinase_{> L}__a__{Glyceropnospnat +} L-a-Glycerophosphat ♦ NAD⁺ a-Glycerophosphat ^ Dehydrogenase NADH ♦ Dihydroxyacetonphosphat + H

(c) Glycerin-Dehydrogenase-Verfahren (vergl. J.H. Hagen und P.B. Hagen in Can. J. Biochem. und Physiology, 40 (1962), Seite 1129)

Glycerin ♦ NAD^{+ Glyccrin} y Dihydroxyaceton ♦ NADH ♦ H⁺ Dehydrogenase

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Aus der DT-PS 2 665 556, der GB-PS 1 322 462 sowie der US-PS 3 759 793 sind ferner Abwandlungen der Methode (a) bekannt. In allen Fällen wird die Erzeugung von NADH oder das Verschwinden von NADH in einem U.V.-Spektrophotometer bei 340 mn bestimmt. Die Methode (a), zu deren Durchführung Bestimmungs-Reagenzien im Handel erhätlich sind, besteht aus einem 3-Enzymverfahren, wobei das Verschwinden von NADH gemessen wird. Die Methode (b) ist ein 2-Enzymverfahren, bei dem die NADH-Erzeugung gemessen wird. Auch bei der Methode (c), bei der es sich eine ein Enzym verwendende Methode, und zwar eine Glycerin-Dehydrogenase-Reaktion handelt, wird die NADH-Erzeugung gemessen. Nachteilig an den beiden zuletzt genannten Methoden ist ihre extreme pH-Wertsempfindlichkeit und die hiermit verbundene Störanfälligkeit, sofern keine genaue pH-Wertsüberwachung erfolgt. Nachteilig an allen drei Methoden, insbesondere der Methode (a) ist ferner, daß die Stabilität, und zwar nicht nur der diagnostischen Enzyme, sondern auch des Cofaktors, NADH, ein Problem ist. Fehler, die bei Durchführung der bekannten enzymatischen Methoden auftreten können, werden ausführlich von H.P. Chen und S.S. El-Mequid in der Zeitschrift Biochemical Medicine, ]_ (1973), Seite 460 beschrieben.

Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden ist aus der DT-PS 2 139 163 bekannt. Dieses Verfahren besteht in einer Hydrolyse der Triglyceride, Oxidation des erhaltenen Glycerins zu Formaldehyd und Umsetzung des Formaldehyds mit Ammoniak und einem stabilen, wasser- und alkohollöslichen, farblosen Metallkomplex des Acetylacetons unter Erzeugung einer farbigen Verbindung.

Aufgabe der Erfindung ist, ein verbessertes Verfahren für die Bestimmung, insbesondere quantitative Bestimmung von Glycerin und Triglyceriden, insbesondere Serum-Triglyceriden anzugeben, bei dessen Durchführung die Einhaltung ganz bestimmter pH-Werte wie bei den bekannten Verfahren nicht erforderlich ist, und da* des weiteren keine so hohen Anforderungen an die Reagenz-Stabilität

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stellt, wie die bekannten Verfahren.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten, insbesondere Blutserum, bei dem man in einer Probe der zu analysierenden Flüssigkeit gegebenenfalls vorhandene Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin hydrolysiert und das freie und/oder durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung umsetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

1.) das Glycerin in L-a-Glycerophosphat überführt;

2.) das L-a-Glycerophosphat unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid oxidiert und

3.) das erzeugte Wasserstoffperoxid unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung umsetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich somit zur Bestimmung von freiem Glycerin und/oder Glycerin, das durch Hydrolyse von Fettsäureestern des Glycerins freigesetzt werden kann.

In vorteilhafter Weise bringt man die Probe der zu analysierenden Flüssigkeit, beispielsweise eine Blutserumprobe, in Gegenwart eines Elektronenakzeptors mit den erforderlichen Enzymen und anderen Reagenzien, die Äur Durchführung des Verfahrens erforderlich sind, zusammen.

Beim Verfahren der Erfindung werden somit zunächst vorhandene Fettsäureester des Glycerins auf enzymatischem Wege zu Glycerin hydrolysiert. Das in freier Form vorliegende Glycerin und/oder durch Hydrolyse erzeugte Glycerin wird dann in L-a-Glycerophosphat überführt, das dann wiederum auf enzymatischem Wege oxidiert wird, unter Herbeiführung einer feststellbaren Veränderung.

In vorteilhafter Weise führt man das Verfahren in Gegenwart von Sauerstoff als Elektronenakzeptor durch sowie eines Indikators oder eines Indikatorsystems, der bzw. das bei Kontakt mit Wasser-

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stoffperoxid ein bestimmbares Reaktionsprodukt liefert. Das bestimmbare Reaktionsprodukt besteht dabei in vorteilhafter Weise aus einer farbigen Verbindung, die gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung quantitativ mess-bar ist.

Als besonders vorteilhaft hat es sich des weiteren erwiesen, gegebenenfalls vorhandene Triglyceride unter Verwendung einer Lipase zu hydrolysieren.

In vorteilhafter Weise erfolgt des weiteren die Überführung des Glycerirs in L-a-Glycerophosphat unter Verwendung einer Glycerin-Kinase und die Oxidation von L-a-Glycerophosphat erfolgt in Gegenwart von L-a-Glycerpphosphat-Oxidase.

In vorteilhafter Weise verfährt man somit derart, daß man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit in Gegenwart eines Elektronenakzeptors mit einem Bestimmungs-Reagenz in Kontakt bringt, das enthält:

(A) eine Lipase;

(B) eine Glycerin-Kinase;

(C) Adenosintriphosphat und

(D) a-Glycerophosphat-Oxidase.

Gemäß einer ganz besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung führt man das Verfahren in Gegenwart eines Indikatorsystemes mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer Farbstoffvorläuferverbindung durch, wobei die Farbstoffvorläuferverbindung entweder (1) eine Verbindung sein kann, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität einen Farbstoff erzeugt oder (2) aus einer Verbindung oder mehreren Verbindungen bestehen kann, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität keine feststellbare Veränderung im sichtbaren Bereich des Spektrums herbeiführen, jedoch mit einer anderen Verbindung oder einer Reihe von Verbindungen unter Erzeugung eines quantitativ er-

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faßbaren Reaktionsproduktes zureagieren vermögen, wobei dieses Reaktionsprodukt proportional zum Glycerin- und/oder Triglyceridgehalt der zu analysierenden Probe erzeugt wird.

Uas erfindungsgemäße Verfahren stellt gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik insbesondere deshalb einen technischen Fortschritt dar, weil das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf der Erzeugung oder dem Verschwinden von NADH beruht, und weil das erfindungsgemäße Verfahren demzufolge auch nicht die Nachteile aufweist, die typisch für die bekannten Verfahren sind und in der Literatur beschrieben werden.

Jas Verfahren der Erfindung ermöglicht somit die quantitative Bestimmung von Triglyceriden nach folgendem Reaktionsschema:

1. Triglycerid ♦ HOH ^Lipase^ Glycerin ♦ Fettsäuren

2. Glycerin + ATF Glycerin-Kinase^ L-a-Glycerophosphat + ADP

3. L-a-Glycerophosphat + Elektronenakzeptor ^a"^GP"^Oxidase

Dihydroxyacetonphosphat + Verbindungen zur analytischen Bestimmung

Bei Verwendung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor wird H₂O₂ als analytisch bestimmbare Verbindung in der Reaktion (3) erzeugt. In vorteilhafter Weise kann die l^C^-Bestimmung nach folgendem Reaktionsschema erfolgen.

4. H₂O₂ ♦ H₂A (red.) ^Pe*^oxidase > A(ox) ♦ H₂O

(bestimmbare Verbindung)

wobei bedeuten:

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H₂A (red.) eine Farbstoffvorläuferverbindung, bei der es sich um die reduzierte Form des Farbstoffes handelt.

A(ox) einen Farbstoff, der durch Oxidation von H₂A erhalten wird.

Bei den kombinierten Reaktionen der bevorzugt verwendeten Bestimmungs-Reagenzien erfolgt die Bildung bestimmbarer Verbindungen proportional zum Glycerin- und/oder Triglyceringehalt der zu analysierenden Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat besondere Bedeutung für klinische Untersuchungen, insbesondere die Bestimmung von Serum-Triglyceriden.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber bekannten Verfahren viele Vorteile auf. Erstens lassen sich alle Leucofarbstoffe, die Peroxidase als Elektronendonor benutzen können, in dem Indikatorsystem verwenden, weshalb man je nach dem ausgewählten Farbstoff die Umsetzung bei einer von mehreren verschiedenen Wellenlängen des sichtbaren Spektrums messen kann. Zweitens sind die im sichtbaren Spektrum durchführbaren Messungen weniger störanfällig als Messungen, die bei einer Wellenlänge von 340 mn durchgeführt werden müssen. Drittens lassen sich außer Farbstoffen praktisch alle Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid einsetzen. Viertens braucht keine Sorge für die Stabilität von NAD⁺ oder NADH getragen zu werden, da O₂ der Kofaktor der α-Glycerophosphat-Oxidasereaktion ist. Fünftens wird das erfindungsgemäße Verfahren nicht durch Serumkomponenten, die NAD oder NADH/verwenden (beispielsweise Lactat ♦ Lactat-Dehydrogenase), gestört, welche die Reaktionsfolge bekannter Verfahren stören können. Sechstens können alle Mittel, die einen O₂-Verbrauch messen, als Bestimmungsmittel eingesetzt werden, wenn O₂ als Elektronenakzeptor verwendet wird. Schließlich sind die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme innerhalb eines vergleichsweise breiten pH-Wert-Bereiches aktiv, so daß eine sorgfältige pH-Wertkontrolle nicht erforderlich ist.

/" als Kofaktorcn

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Die erfindungsgemäß verwendbaren Bestimmungs-Reagenzien können in Form von Lösungen vorliegen oder in Form von Trockenansätzen oder in lyophilisierter Form, in welchem Falle sie durch Zusatz von Wasser unmittelbar vor ihrer Verwendung in gebrauchsfertige Lösungen überführt werden können.

Hydrolyse:

Wie bereits dargelegt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Triglyceridgehaltes von wäßrigen Flüssigkeiten, beispielsweise Blutserum. In diesem Falle können die Triglyceride nach üblichen bekannten Methoden zu freiem Glycerin hydrolysiert werden. Vorzugsweise wendet man dabei enzymatische Methoden an. In vorteilhafter Weise erfolgt eine Behandlung der Serumprobe mit einer Lipase oder einer Kombination aus einer Lipase und einem Effektor, beispielsweise einer Protease oder einer oberflächenaktiven Verbindung, je nach der Natur der vorliegenden Triglyceride. Dabei kann beispielsweise nach Methoden verfahren werden, wie sie aus den US-PS 3 703 591 und 3 759 793 bekannt sind. Bei dem aus der US-PS 3.703 591 bekannten Verfahren wird eine lipase verwendet, vorzugsweise von Rhizopus arrhizus (var. delemar) sowie ähnliche Verbindungen in Kombination mit einer Protease, während bei dem aus der US-PS 3 759 793 bekannten Verfahren eine Lipase von Rhizopus arrhizus allein für die Hydrolyse verwendet wird.

Ein weiteres bekanntes Verfahren besteht in der Hydrolyse von Serum-Triglyceriden unter Verwendung einer verträglichen Mischung aus einer Lipase, die normalerweise selbst nicht dazu befähigt ist, Protein gebundene Triglyceride zu hydrolysieren, wie sie im Serum vorliegen, und einem Effektor, d.h. einer verträglichen oberflächenaktiven Verbindung. Eine geeignete verträgliche oberflächenaktive Verbindung ist dabei eine Verbindung, die die Triglycerid-Hydrolyse durch die Lipase stimuliert, wie es in dem folgenden Test beschrieben wird. Dies bedeutet also, daß eine verträgliche oberflächenaktive Verbindung eine solche ist, die die Aktivität der Lipase nicht inhibiert, sondern erhöht.

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Vorteilhafte Lipasen sind solche von Candida cylindracea (Candida rugosa).

Ganz allgemein jedoch lassen sich die verschiedensten Lipasen für die Triglycerid-Hydrolyse verwenden, und zwar solche pflanzlichen wie auch tierischen Ursprungs.

Als besonders vorteilhaft tür Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens haben sich Lipasen mikrobiologischen Ursprungs erwiesen, d.h. Lipasen von Candida cylindracea, und zwar insbesondere dann, wenn die Lipase in Kombination mit einer oberflächenaktiven Verbindung verwendet wird. Als besonders vorteilhafte Lipasen habendich des weiteren solche von Chromobacterium viscosum, variant paralipolyticum, roh oder gereinigt, sowie Lipasen von Rhiζopus arrhizus (variant delemar), gereinigt, erwiesen, beispielsweise, wie sie von Fukumoto und Mitarbeitern in der Zeitschrift J. Gen. Appli. Microbiol., 10, (1964), Seiten 257 bis 26S beschrieben werden sowie Lipasepräparate mit ähnlicher Aktivität.

Vorteilhafte, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Lipasen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind des weiteren bekannt aus den US-PS: 2 888 385, 3 168 448, 3 189 529, 3 262 863 sowie 3 513 073.

Da die Lipasen leicht in lyophilisierter Form zugänglich sind, lassen sie sich leicht zur Herstellung von Trockenmischungen verwenden, die mit Wasser in gebrauchsfertige Lösungen überführt werden können. Des weiteren liefern sie stabile Lösungen, die leicht mit anderen Lösungen kombiniert werden können, die dann zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden können.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie zur Herstellung erfindungsgemäßer Bestimmungs-Reagenzien lassen sich im Handel erhältliche Lipasen verwenden. Als besonders vorteilhafte handelsübliche Lipasen haben sich Weizenkeimlipasen erwiesen, z.B. solche, die von der Firma Miles Laboratories of Elkhart, Indiana in den Handel gebracht",werden, ferner die Lipase 3000,

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Hersteller Wilson Laboratories, ferner Steapsin, Hersteller Sigma Chemical Company, d.h. pancreatische Enzyme sowie Lipase M (von Candida cylindracea (Candida rugosa)), Hersteller Enzyme Development Company, USA.

Lipase-Präparate, die selbst nicht in der Lage sind, Serum-Triglyceride zu hydrolysieren, werden in vorteilhafter Weise in Kombination mit nicht-ionogenen und/oder anionischen oberflächenaktiven Verbindungen verwendet. Als besonders vorteilhafte oberflächenaktive Verbindungen haben sich beispielsweise Octyl- und Nonylphenoxypolyäthoxyäthanole erwiesen, beispielsweise solche, die unter der Handelsbezeichnung Triton (Hersteller Rohm & Haas Company) im Handel sind. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit solchen oberflächenaktiven Verbindungen dann erhalten, wenn die HLB-Zahl (d.h. die hydrophile-lipophile Balance) unter etwa 15 liegt und die Anzahl an Polyoxyäthyleneinheiten in der Polyoxyäthylenkette unter 20 liegt.

Vorteilhafte, verträgliche Kombinationen von Lipase und oberflächenaktiver Verbindung lassen sich leicht nach folgendem Test ermitteln:

Die zu untersuchende oberflächenaktive Verbindung wird einem nicht-abgepufferten, synthetischen Serum zugesetzt, (beispielsweise einem Serum vom Typ Validate, Hersteller General Diagnostics Division of Warner Lambert Company, Morris Plains, N.J., USA), und zwar in verschiedenen Konzentrationen zwischen etwa 0 und 10 Gew.-I, worauf die Lösung etwa 5 Minuten bei 37°C inkubiert wird. Daraufhin wird eine Probe des Lipase-Präparates zugesetzt, worauf nochmals etwa 20 Minuten lang inkubiert wird. Verschiedene Anteile dieser Lösung (etwa 0,2 ml) werden dann auf 1,6 ml durch Zusatz von Wasser mit einem Gehalt von 1,3 mM CaCl₂ zur Erzeugung eines Niederschlages verdünnt, worauf die verdünnten Lösungen 10 Minuten lang in ein siedendes Wasserbad gebracht werden, worauf sie vor Klärung zentrifugiert werden (4°C, 37000 Xg, 10 Minuten). Von der klaren überstehenden Flüssigkeit des zentrifugieren Materials wird dann eine 0,4 ml große Probe abgezogen,

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die zur quantitativen Glycerinbestimmung bei einem Gesamtvolumen von 1,2 ml nach der Methode von P.B. Garland und P.J. Rändle, veröffentlicht Nature, 196 (1962), Seiten 987 bis 988 verwendet wird. Jede Mischung aus oberflächenaktiver Verbindung und Lipase, die die Freisetzung von mindestens etwa 50 \ der theoretischen Konzentration an verfügbarem Glycerin bewirkt, wird als im Sinne der Erfindung als geeignet angesehen.

Bei Durchführung des beschriebenen Tests hat es sich als vorteilhaft erwiesen, einen Null-Versuch mit sämtlichen Komponenten der Mischung jedoch ohne das Lipase-Präparat, durchzuführen, so daß eine jede Reaktion auf Grund von vorhandenem freiem Glycerin oder anderen Komponenten des Serums abgezogen werden kann.

Als besonders vorteilhafte Präparate haben sich solche erwiesen, die eine mindestens 75 Sige Hydrolyse der verfügbaren Triglyceride zu Glycerin in weniger als 10 Minuten bewirken. Die bevorzugt verwendeten Präparate sind diejenigen, die eine praktisch vollständige Hydrolyse der verfügbaren Triglyceride in Glycerin bewirken, d.h. eine über etwa 90tige Hydrolyse, und zwar in weniger als etwa 10 Minuten. Beispiele derartiger,bevorzugt verwendeter Präparate sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Wenn aus irgendeinem Grunde für die Hydrolyse eine Protease-Lipase-Kombination des Standes der Technik verwendet wird, so können hierzu die verschiedensten üblichen bekannten Proteasen verwendet werden. Hierzu gehören beispielsweise Chymotrypsin, Streptomyces griseus protease (im Handel unter der Handelsbezeichnung "Pronase" erhältlich), Proteasen von Aspergillus oryzae und Bacillus subtilis, Elastase, Papain und Bromelain. Auch können Mischungenderartiger Enzyme verwendet werden.

Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen an Lipase und anderen Effektoren, beispielsweise oberflächenaktiven Verbindungen, Protease und dergleichen, können sehr verschieden sein, je nach dem zeitlichen Begrenzungen des BestimmungsVerfahrens. Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen lassen sich leicht ermit-

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teln. Typische geeignete Konzentrationen ergeben sich aus den später folgenden Beispielen.

Die Hydrolyse der Triglyceride kann auch nach den üblichen bekannten "nicht-enzyraatischen" Methoden durchgeführt werden, beispielsweise auch durch Behandlung mit einer starken Base. Es ist lediglich darauf zu achten, daß das durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin dem enzymatischen Glycerin-Bestimmungsreagenz in einem Medium zugeführt wird, das keine Stoffe enthält, die die Enzyme des Glycerin-Bestimmungssystemes inhibieren oder die in anderer Weise den Ablauf der Reaktionen, die zur Erzielung eines exakten Glycerin-Bestimmungsergebnisses erforderlich sind, beeinträchtigen könnten.

Glycerin-Bestimmung

Sobald die Triglycerid-Hydrolyse erfolgt ist, kann die neue erfindungsgemäfie enzymatische Glycerin-Bestimmung durchgeführt werden.

Das erste Enzym der Glycerinbestimmung besteht aus Glycerin-Kinase, die die Umwandlung von Glycerin in L-a-Glycerophosphat in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) katalysiert. Zur Durchführung des Verfahrens eignen sich die bekannten Glycerin-Kinasen. Als besonders vorteilhafte Glycerin-Kinasen haben sich solche erwiesen, die sich von E. coli und Candida mycoderna erhalten lassen. Eine Obersicht über verwendbare Glycerin-Kinasen, ihre Herstellung und ihre Reaktionsfähigkeit findet sich beispielsweise in dem "Enzyme Handbook" von T.E. Barman, Band I, Springer-Verlag, N.Y. (1969), Seiten 401 bis 402. Im übrigen sind zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung geeignete Glycerin-Kinasen im Handel erhälflieh, beispielsweise von der Firma Worthington Biochemical Company.

Die nächste Stufe des Bestimmungsverfahrens besteht in der Oxidation von L-a-Glycerophosphat in Gegenwart von L-a-Glycerophosphat-Oxidase und einem Elektronenakzeptor unter Hervorrufung einer feststellbaren Änderung. Diese feststellbare Änderung besteht

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vorzugsweise aus einer Farbveränderung oder Farbbildung, die vorzugsweise quantitativ von dem GlyceringehalVder untersuchten Probe abhängig ist. Die feststellbare Veränderung braucht jedoch nicht unbedingt in einer Farbveränderung oder Farbbildung zu bestehen. Vielmehr ist es beispielsweise auch möglich, andere feststellbare Veränderungen zu bestimmen, beispielsweise den Sauerstoffverbrauch.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendbar sind die verschiedensten Elektronenakzeptoren, die eine Oxidation des ct-Glycerophosphates in Gegenwart des Oxidase-Enzymes unter gleichzeitiger Hervorrufung einer feststellbaren Veränderung ermöglichen. Besonders vorteilhafte Elektronenakzeptoren sind solche, die auf direktem oder indirektem Wege ein radiometrisch feststellbares, vorzugsweise farbiges Produkt liefern. Die Verwendbarkeit eines speziellen Elektronenakzeptors läßt sich auf experimentellem Wege leicht feststellen.

Als besonders vorteilhafter Elektronenakzeptor hat sich Sauerstoff erwiesen, der das L-a-Glycerophosphat in Gegenwart von Oxidase zu Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid oxidiert. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Messung des Verbrauches von Sauerstoff in Reaktionen dieses Typs sind bekannt.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird als Elektronenakzeptor eine farbige oder nicht-farbige Verbindung verwendet, die einer Farbveränderung unterliegt oder die ein farbiges Reaktionsprodukt liefert, und zwar als Folge einer Reduktion in Gegenwart des Enzymes und des Substrates. Wie bereits dargelegt, lassen sich derartige Verbindungen leicht durch einen Test ermitteln, wie er beispielsweise in dem später folgenden Beispiel S beschrieben wird. Nach diesem Test-Verfahren sind beispielsweise Indophenole, Kaliumferricyanid und Tetrazoliumsalze geeignete Elektronenakzeptoren. Insbesondere hat sich gezeigt, daß 2,6-Dichlorphenolindolphenol allein oder in Kombination mit Phenazinmethosulfat und 2-(p-I»dophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-S-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid entweder allein oder in Kombination mit Phenazinmethosulfat vorteilhafte Elektronenakzeptoren darstellen.

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Die feststellbare Veränderung läßt sich gegebenenfalls auch durch Durchführung von potentiometrischen Meßmethoden ermitteln, beispielsweise durch Messung des SauerstoffVerbrauches unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode.

L-a-Glycerophosphat-Oxidase ist ein mikrobiologisches Enzym, das verschiedenen Ursprungs sein kann. Die Eigenschaften von Enzymen von bestimmten Enzymlieferanten können gegebenenfalls etwas vorteilhafter sein als die Eigenschaften von Enzymen von anderen Lieferanten. Als besonders vorteilhafte Enzyme haben sich solche erwiesen, die von Streptococcaceae, Lactobacillaceae und Pediococcus erhalten werden. Ein vorteilhaftes Enzym ist weiterhin ein Enzym von Kulturen von Streptococcus faecalis, wovon Stämme beispielsweise von der American Type Culture Collection erhältlich sind. Besonders vorteilhafte Enzyme sind erhältlich von den Stämmen ATCC 11700, ATCC 19634 sowie ATCC 12755 der American Type Culture Collection.

Wie später noch näher beschrieben werden wird, weist beispielsweise das Enzym von ATCC 12755 eine Aktivität innerhalb eines etwas breiteren pH-Bereiches auf als Enzyme von den anderen beiden Stämmen, weshalb sich ein Enzym von ATCC 12755 als besonders vorteilhaft erwiesen hat.

Nähere Angaben bezüglich des Enzymes sowie Verfahren: zu ihrer Herstellung und Extraktion finden sich beispielsweise in den folgenden Literaturetellen:

L.K. Koditschek und W.W. Umbreit "a-Glycerophosphate Oxidase in Streptococcus faecium, F 24," Journal of Bacteriology, Band 98, Nr. 3 (1969), Seiten 1063 bis 1068 und N.J. Jacobs und P.J. Van Demark, "The Purification and Properties of the α-Glycerophosphate Oxidizing Enzyme of Streptococcus faecalis, 10 Cl.", in "Archives of Biochemistry and Riophvsics", Rd, 88, (1P6§), Seiten 250-255.

Nach den bekannten Verfahren hergestellte Enzyme lassen sich in

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vorteilhafter Weise im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwenden.

Werden Enzympräparate unbekannter Herkunft verwendet, so ist zu überprüfen, ob nicht Verunreinigungen extrahiert werden müssen, welche die Bestimmungsergebnisse beeinträchtigen könnten. So kann es beispielsweise möglich sein, daß bestimmte L-a-Glycerophosphat-Oxidase-Präparate derart hohe Konzentrationen an Verunreinigungen enthalten, daß das rohe Präparat gereinigt werden muß, wozu übliche bekannte Fraktionierungs- und Kolonnen-Trennmethoden angewandt werden können.

In vorteilhafter Weise erfolgt die Bestimmung von Glycerin in wäßrigen Lösungen, die Glycerin und/oder Triglyceride enthalten, beispielsweise in Blutserum, unter Verwendung eines Indikatorsystems, durch das die Wasserstoffperoxidkonzentration festgestellt wird, die bei der Oxidation von L-ot-Glycerophosphat in Gegenwart von Sauerstoff erzeugt wird.

Indikatorsysteme für die Ermittlung von auf enzymatischem Wege erzeugtem Wasserstoffperoxid sind bekannt, insbesondere die Indikatorsysteme, die bei der enzymatischen Bestimmung von Glucose und Harnsture verwendet werden. Derartige Indikatorsysteme sind beispielsweise aus den US-PS 3 092 465 und 2 981 606 bekannt.

Die Wasserstoffperoxid-Indikatorsysteme bestehen im allgemeinen aus einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, vorzugsweise

undjBMBBC einer Farbstoff Vorläuferverbindung, die einer Farbbildungreaktion oder Farbveränderung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität unterliegt. Erfindungsgemäß verwendbare Indikatorsysteme sind beispielsweise aus der US-PS 2 981 606 bekannt. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Indikatorsystemen mit Farbstoffvorlauferverbindungen erwiesen, d.h. Verbindungen, die ein farbiges Reaktionsprodukt durch eine Kupplungsreaktion liefern.

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Eine Peroxidase ist bekanntlich ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, bei der Wasserstoffperoxid oder ein anderes Peroxid eine andere Substanz oxidiert. Peroxidasen sind in allgemeinen komplexe Proteine mit Eisenporphyrin. Peroxidasen kommen beispielsweise in Meerrettich, Kartoffeln, Feigensäften und Rüben vor, in welchem Falle es sich um pflanzliche Peroxidasen handelt. Peroxidasen kommen jedoch auch beispielsweise in Milch vor, in welchem Falle man von Lacto-Peroxidasen spricht. Sie sind ferner in weißen Blutkörperchen vorhanden, in welchem Falle sie als Verdoperoxidasen bezeichnet werden. Sie kommen des weiteren beispielsweise in Mikroorganismen vor. Verwendbar sind auch synthetische Peroxidasen, wie sie beispielsweise von Theorell und Maehly in der Zeitschrift "Acta Chem. Scand.", Band 4 (1950), Seiten 422 bis 434 beschrieben werden. Verwendbar, wenn auch nicht vorzugsweise verwendet, sind Substanzen, wie Hämin, Methämoglobin, Oxyhämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkalisches Hämatin, Hämin-Oerivate und andere Substanzen mit peroxidativer Aktivität. Andere Substanzen, bei denen es sich um keine Enzyme handelt, die jedoch peroxidative Aktivität haben, sind beispielsweise Eisensulfocyanat, Eisentannat, Ferroferrocyanid und Chromisalze, z.B. Kaliumchromisulfat, absorbiert von Silica gel und dergleichen. Diese Substanzen sind nicht so vorteilhaft wie Peroxidasen, jedoch verwendbar.

FarbstoffVorläuferverbindungen, die gegebenenfalls unter Verwendung einer Farbkupplerverbindung zu einer farbbildenden Reaktion in Gegenwart von Nasserstoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität geeignet sind, sind beispielsweise:

(1) Monoamine, z.B. Anilin und Anilinderivate, o-Toluidin und p-Toluidin;

(2) Diamine, z.B. o-Phenylendiamin, N,N'-Dimethy1-p-phenylendiamiη, Ν,Ν'-Diäthylphenylendiamin, Benzidin und Dianisidin;

(3) Phenole, z.B. Phenol selbst, Thymol, ο-, m- und p-Kresole, a-Naphthol und ft-Naphthol;

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(4) Polyphenole, z.B. Brenzcatechin, Guaiacol, Orcin, Pyrogallol, ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl sowie Phloroglucin;

(5) Aromatische Säuren, z.B. Salicylsäure, Pyrocatechuic Säure sowie Gallensäuren;

(6) Leucofarbstoffe, z.B. Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein;

(7) Farbstoffe, wie beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol;

(8) Verschiedene biologische Substanzen, z.B. Epinphrin, Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin sowie Tryptophan;

(9) andere Substanzen wie beispielsweise Gum guaiac, Guaiaconsäure, Kalium, Natrium und andere wasserlösliche Iodide sowie Bilirubin und

(10) spezielle Farbstoffe, z.B. 2,2'-Azin-di(3-äthylbenzothiazolin-(o)-sulfonsäure) sowie 3,3'-Diaminobenzidin.

Weitere Indikatoren oder Indikatorsysteme, die durch Peroxide in Gegenwart von Peroxidase oxidierbar sind und die radiometrisch bestimmbare Reaktionsprodukte liefern, sind bestimmte Farbstoffe liefernde Substanzen. So können geeignete Indikatorsysteme beispielsweise Verbindungen aufweisen, die, wenn sie in Gegenwart von Peroxidase oxidiert werden, mit sich selbst oder mit ihrer reduzierten Form unter Bildung eines Farbstoffes reagieren. Derartige auto-kuppelnden Verbindungen können beispielsweise aus den verschiedensten Hydroxyverbindungen bestehen, beispielsweise aus o-Aminophenolen, 4-Alkoxynaphtholen, 4-Amino-5-pyrazolonen, Kresolen, Pyrogallol, Guaiacol, Orcin, Phloroglucin, ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl, Gallensäuren (gallic acid), Pyrocatechuic Säure, Salicylsäure und dergleichen. Verbindungen dieses Typs sind bekannt und werden in der Literatur beispielsweise in dem Buch von Mees und James, "The Theory of the Photographic Process", 1969, insbesondere in Kapitel 17, beschrieben.

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Die feststellbare oder bestimmbare Veränderung kann des weiteren beispielsweise durch Oxidation eines Leucofarbstoffes in Gegenwart von Peroxidase unter Erzeugung des entsprechenden Farbstoffes erfolgen. Typische Leucofarbstoffe, die erfindungsgemäß verwendbar sind, sind beispielsweise Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein. Weitere Leucofarbstoffe, die auch unter der Bezeichnung "oxichromogene Verbindungen" bekannt sind, werden beispielsweise in der US-PS 3 880 658 beschrieben, woraus auch bekannt ist, daß derartige Verbindungen mit entsprechenden Substituenten diffusionsfähig sind. Die aus der US-PS 3 880 658 bekannten nicht-stabilisierten oxichromogenen Verbindungen lassen sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens in besonders vorteilhafter Weise verwenden.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann eine feststellbare oder bestimmbare Veränderung durch ein Indikatorsystem herbeigeführt werden, das eine Verbindung enthält, die in Gegenwart von Peroxidase oxidierbar ist und die zu einer oxidativen Kondensationsreaktion mit Kupplerverbindungen befähigt ist, z.B. solchen Farbkupplerverbindungen mit phenolischen Gruppen oder aktivierten Methylengruppen.

Typische derartige oxidierbare Verbindungen sind beispielsweise Benzidin und Benz idinhomologe, p-Phenylendiämine, p-Aminophenole, 4-Aminoantipyrine und dergleichen. Derartige Kuppler sowie autokuppelnde Verbindungen sind aus der Literatur bekannt und werden beispielsweise in den bereits zitierten Buch von Mees und James sowie in dem Buch von Kosar, "Light-Sensitive Systems", 1965, Seiten 215 bis 248, beschrieben.

Als besonders vorteilhafter Indikator für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich 4-Methoxy-1-naphthol erwiesen, das in oxidiertem Zustand einer Selbstkupplung unterliegt oder eine Kombination aus 1,7-Dihydroxynaphthalin und 4-Aminoantipyrin (HCl). Im letzteren Falle kuppelt die oxidierte Pyrinverbindung mit dem Dihydroxynaphthalin.

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Die optimale Konzentration der Bestandteile der verschiedenen Indikatorsysteme, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwenden lassen, hängt zu einem großen Teil von der Konzentration des Glycerins in der zu untersuchenden Probe ab, der Bestimmungsvorrichtung und dem erzeugten Farbstoff. Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen lassen sich leicht ermitteln. Typische Konzentrationswerte ergeben sich aus den später folgenden Beispielen.

Die Bestimmung des Wasserstoffperoxides kann jedoch auch auf andere Weise erfolgen. So können beispielsweise die Enzyme und anderen Reagenzien, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich sind, in Membranen von Sauerstoff-sensitiven polarographischen Elektroden untergebracht werden, wie sie beispielsweise von Rebecca L. Rawls unter der Oberschrift "Electrodes Hold Promise in Biomedical Uses" in der Zeitschrift "Chemical and Engineering News", Januar 1976, Seite 19 beschrieben werden.

Anstatt das erzeugte Wasserstoffperoxid zu bestimmen, ist es des weiteren auch möglich, den Sauerstoffverbrauch zu ermitteln, und zwar unter Verwendung einer Sauerstoff-sensitiven Elektrode, in welchem Falle die Menge an Sauerstoff bestimmt wird, die bei der Umsetzung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor mit L- -Glycerophosphat verbraucht wird.

Die optimalen Konzentrationen der anderen Komponenten eines erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenz können ebenfalls sehr verschieden sein, je nach der zu analysierenden Lösung (z.B. Blutserum, verdünnt oder unverdünnt oder der Zusammensetzung anderer komplexer wäßriger Lösungen von Glycerin und/oder Triglyceriden.

In der folgenden Tabelle I sind allgemein verwendbare und bevorzugt verwendbare Konzentrationsbereiche der einzelnen Komponenten erfindungsgemäß verwendbarer Bestimmungsreagenzien angegeben.

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	Tabelle I	Vorzugsweise angewandte Meng· (E/ml)
Enzym	Allgemein anwend barer Bereich (E/ml)	80
Lipase (falls verwendet)	20 - 160	0,2
Glycerin-Kinase	0,05 - 1	4
Glycerophosphat-Oxidase	1 - 10	1200,0
Protease (falls ver wendet)	300 - 2400	0,7
Peroxidase	0,2 - 1,4	g/ml 0,02
g/ml Oberflächenaktive Substanz (falls verwendet) 0,01 - 0,05

Gegebenenfalls können jedoch auch vorteilhafte Ergebnisse dann erhalten werden, wenn Enzym-Konzentrationen außerhalb der angegebenen Bereiche angewendet werden.

In der Tabelle I ist eine internationale Einheit eines Enzymes definiert als die Enzymmenge, die die Umwandlung eines Mikromoles eines Substrates in einer Minute bei 37°C und einem pH-Wert von 7 bewirkt.

Es ist bekannt, daß ein jedes Enzym ein pH-Aktivitäts-Profil aufweist, d.h. daß die Aktivität eines jeden Enzymes pH-Wertabhängig ist. Beispielsweise ergibt sich aus dem pH-Aktivitäts-Profil von L-a-Glycerophosphat-Oxidase eine Spitze zwischen einem pH-Wert von etwa 5 und 8,5. Aus der folgenden Tabelle II ergeben sich die pH-Bereiche, in denen die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Enzyme besonders aktiv sind.

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Tabelle II

pH-Wertbereich

Lipase 5-9

Glycerin-Kinase 7-9 L-ct-Glycerophosphat-Oxidase 6,3 - 8,0 Peroxidase 6-8

Aus der Tabelle ergibt sich, daß es vorteilhaft ist, die erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und etwa 8,0, insbesondere zwischen etwa 7,0 und etwa 8,0 abzupuffern. Dabei können übliche bekannte Methoden angewandt werden. Beispielsweise können entsprechende Konzentrationen an Puffersubstanzen in den erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien gelöst, dispergiert oder in anderer Weise verteilt werden. Andererseits können jedoch auch Puffersubstanzen in trockener Form verwendet werden, beispielsweise dann, wenn die Bestimmungs-Reagenzien in trockener Form in Form von Mischungen hergestellt werden.

Zur Herstellung der Bestimmungs-Reagenzien geeignete Puffersubstanzen sind bekannt und werden im Detau beispielsweise von Good in der Zeitschrift "Biochemistry", £, (1966), Seite 467 beschrieben. Besonders vorteilhafte Puffersubstanzen sind Phosphate, beispielsweise Kaliumphosphat.

Die Konzentrationen der erzeugten Verbindungen, die zu bestimmen sind, können nach üblichen bekannten Methoden ermittelt werden, beispielsweise durch Vergleich mit einer standardisierten Farbkarte, auf spektrophotometrischem Wege und dergleichen.

In den später folgenden Beispielen wurden die folgenden Enzympräparate und standardisierten Verfahren angewandt:

Standard-Lösungen: Die genauen Konzentrationen von Glycerin-Standard-Lösungen wurden

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nach der Methode von Garland und Rändle (Nature, 196 (1962), Seite 987 bis 988) bestimmt.

Wasserstoffperoxid-Lösungen wurden standardisiert durch Messung der optischen Absorption bei 240 nm (A₂4(P ^{und unter} Verwendung von E₂AO ^s 43,6 für entsprechende Berechnungen. Die Serumproben wurden auf ihren Triglyceridgehalt nach der halb-automatisierten fluorometrischen Methode von Kessler und Lederer untersucht (vergl. "Fluorometric Measurement of Triglycerides, Automation in Analytical Chenistry", Technican Symposia, L.T. Sheggs, Jr., td. Medical Inc., N.Y., N.Y. 341 (1966)).

Quantitative Glycerin- und Triglyceridbestimmung nach der ot-GP-Oxidase-Methode:

Inkubationsmischungen für die Glycerinbestimmung enthielten in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml:

20OyU Mole Kaliumphosphat-Puffersubstanz, pH-Wert ■ 8,0, 4,2-Purpurogallin-Einheiten Meerrettich-Peroxidase, 2,5 u Mole MgSO₄, 2,4 u Mole ATP, 10 mg Triton X-IOO, 96 η g 4-Aminoantipyren-Hydrochlorid, 32 u g 1,7-Dihydroxynaphthalin (zugesetzt in Form einer 0,8 ligen Lösung in Äthanol) und 4 Einheiten a-GP-Oxidase (überschüssige Glycerin-Kinase war in dem a-GP-Oxidase-Präparat vorhanden).

Für die quantitativen Triglyceridbestimmungen enthielten die Inkubierungs-Mischungen 10 mg (8 Einheiten/mg) Lipase von Candida

rugosa zusätzlich zu den oben angegebenen Komponenten.

Sämtliche Komponenten wurden durch 5 Minuten langes Stehenlassen bei 37°C ins Gleichgewicht gebracht, worauf die Absorption bei 490 nm (A₄₉₀) ermittelt wurde.

Die Reaktionen wurden dann dadurch eingeleitet, daß entweder eine Glycerin-Standardlösung (5-100 η Mole) oder eine Serum-Standardlösung (20 ul) zugegeben wurde, worauf die Mischung 20 bis 30 Minuten lang stehengelassen wurde. Daraufhin wurde

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von neuem die Absorption bei 490 nm gemessen, und zwar diesmal der (A4Q0) Endwert. Abweichungen von diesem Standardsystem werden, falls notwendig, angegeben.

Berechnung der Triglycerid-Konzentrationen:

Triglycerid-Glycerin-Konzentrationen von unbekannten Proben wurden in der folgenden Weise bestimmt:

Der AAjQQ-Wert (A_4gQ-Wert (Endwert) minus A_4gQ-Wert (Anfangswert)) der Proben, die in Gegenwart des Standard-Glycerin-Bestimmungssystems inkubiert wurden, wurde abgezogen von dem AA._go-Wert der gleichen Probe, die in Gegenwart von Lipase M und der Standard-Glycerin-Bestimmungssystems inkubiert wurden.

Die Triglycerid-Konzentrationen wurden von dieser Lipase M abhängigen Absorptionsveränderung unter Verwendung einer Eichkurve mit entweder Glycerin oder vor-analysierten Serumproben als Standardlösungen bestimmt.

Züchtung von S. faecalis

S. faecal is-Stämme (vergl. die Angaben in der später folgenden Tabelle III) wurden auf Schrägen mit 0,1 1 Glucose, 1 I Trypton, 1 % Hefeextrakt, 0,65 I K₂HPO₄ und 1,5 \ Agar gezüchtet. Wäßrige Suspensionen der Schrägen-Kolonien (0,2 ml einer 1,0 ml-Suspension pro Kolben) wurden zur Inokulierung von Kolben verwendet, die mit jeweils 25 ml Medium gefüllt waren. Die Kolben wurden dann 22 Stunden lang bei 30⁰C in einem Inkubierungs-Schüttelgerät (New Brunswick Psycrotherm Incubator Shaker) bei 120 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.

Herstellung der zellfreien Extrakte Geerntet wurden die Zellen von 100 ml Medium durch Zentrifugieren

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(4°C, 10 000 X g, 10 Minuten). Sie wurden nit 40 ml einer kalten 0,05 solaren Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, nochmals zentrifugiert und dann in 10 ml Pufferlösung suspendiert. Die Zellen wurden dann durch Ultraschallbehandlung in einer Rosett-Kühlzelle aufgebrochen. Die Behandlung dauerte 7 Minuten. Verwendet wurde ein Gerät vom Typ Branson J-I7A Sonifier bei einer Einstellung von 40. Die Temperatur wurde unterhalb 8°C gehalten. Die nach 10 Minuten Zentrifugieren bei 10 000 X g erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde als Enzymlieferant verwendet. In allen Fällen erreichte die Menge an löslichem Protein während der angegebenen Beschallungsperiode ein Maximum. Bei Verwendung von Bovin-Serum-Albumin als Standard wurde die Proteinkonzentration nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern bestimmt (vergl. D.H. Lowry, N.S. Roseborough, A.L. Farr und R.J. Randall in J. Biol. Chem. JJ)JS (1951), Seite 265).

Isolierung von q-Glycerophosphat-Oxidase von Streptococcus faecalis

In der folgenden Tabelle III sind die Ergebnisse zusammengestellt, die im Falle von drei Stämmen von Streptococcus faecalis erhalten wurden.

In jedem Falle wurden die Organismen aerob 22 Stunden lang bei 30°C in einem Glucosemedium kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und durch Beschallung zerstört.

Die überstehende Flüssigkeit von einer Zentrifugierung bei 10 X g wurde dann als Enzymlieferant (roher Extrakt) verwendet. Jedoch blieb die Oxidase in Lösung auch nach einer einstündigen Zentrifugierung bei 100 000 X g. In allen Fällen war die Abnahme an gelöstem Sauerstoff proportional zur Menge an rohem Extrakt und hing ab von sowohl D, L-a-Glycerophosphat und dem Extrakt.

Wie sich aus der folgenden Tabelle III ergibt, zeigen alle drei Stämme eine Sauerstoff-gebundene Aktivität. Das Enzym von dem Stamm ATCC 11700 hatte ein pH-Optimum bei 5,8 und die Oxidase von

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dem Stamm ATCC 19634 zeigte ein Maximum bei einem pH-Wert von 7.0. Dieser Trend ergibt sich ebenfalls aus Tabelle III. In analoger Weise war die Aktivität des Enzymes von dem Stamm 12755 ähnlich zu dem Enzym von dem Stamm ATCC 19634.

Tabelle III

Isolation von a-Glycerophosphat-Oxidase von drei Stämmen von Streptococcus faecalis

Die Reaktionen wurden bei 21°C in einer 0.05 molaren Kaliumphosphat-Pufferlösung bei dem angegebenen pH-Wert durchgeführt, unter Verwendung von 0,13 M DL-a-Glycerophosphat als Substrat.

S. faecalis Kultur	pH-Wert der Inku- bations-Mischung	Abnahme an gelöstem °2 in *
		ΔΙ/Min./mg
ATCC 11700	6,0 7,3	4.52 1,49
ATCC 19634	6.1 7,5	3.94 6.90
ATCC 12755	5.9 6,8	4,93 7,10
Bestimmung von	a-Glycerophosphat-Oxidase mit	einer Sauerstoff-
Elektrode

Die L-ct-Glycerophosphat-Oxidase wurde bestimmt durch Messung der Verminderung vom gelösten Sauerstoff in einem Analysegerät vom Typ New Brunswick D.O. Analyzer.

Die Sauerstoff-Elektrode wurde sowohl gegenüber N^ als auch gegenüber mit Wasser gesättigter Luft geeicht, und zwar bei konstantem Rühren mit einem Magnetrührer. Die Inkubierungsmischungen enthielten Puffersubstanz sowie D,L-a-Glycerophosphat bei einem Gesamtvolumen von 7,5 al. Eine Gleichgewichtseinstellung wurde bei 21°C herbeigeführt. Die Reaktionen wurden dann eingeleitet

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durch Enzymzusatz, worauf die Abnahme an gelöstem Sauerstoff aus dem linearen Teil der Kurve ermittelt wurde.

Spektrophotometrische Bestimmung von q-Glycerophosphat-Oxidase.

a-GP-Oxidase wurde mittels eines Reagenzes bestimmt, das in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml enthielt: 10Ou Mole Kaliumphosphat-Puffer, pH-Wert * 7,0, 66,u g o-Dianisidin, 25 u g Meerrettich-Peroxidase (4,6 Purpurogallin-Einheiten) und 20Ou Mole D,L- Glycerophosphat (bei einem pH-Wert von 7,0).

Eine Gleichgewichtseinstellung des Reagenzes erfolgte bei 37°C. Die Reaktionen wurden durch Zusatz gleicher Enzymmengen eingeleitet. Die Aktivität wurde aus der anfangs linearen Neigung der Reaktionsspur bei 430 nm mit ε * 1,08 χ ΙΟ⁴ berechnet.

Eigenschaften der q-Glycerophosphat-Oxidase in rohen Extrakten

Ein pH-Aktivitäts-Profil von a-Glycerophosphat-Oxidase des Stammes 12755 ist in Fig. 1 dargestellt. Eine optimale Aktivität wurde innerhalb des breiten pH-Wertsbereiches von 6,3 bis 7,5 beobachtet. Unterhalb eines pH-Wertes von 6,0 und oberhalb eines pH-Wertes von 8,0 nahm die Aktivität rasch ab. Aus Fig. 1 ergibt sich des weiteren die offensichtliche Inhibierung des Enzyms durch entweder Tris-HCl/ü-Δ) oder Glycin-KOH (X) Puffer. Bei einem pH-Wert von 7,7 war die Aktivität in einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung 4 mal so groß als die Aktivität, die im Falle einer 0,1 molaren Glycin-KOH-Lösung beobachtet wurde. Erfolgte die Inkubation jedoch in Gegenwart von sowohl einer 0,1 molaren Glycin-KOH-Lösung wie auch in Gegenwart einer 0,07 molaren Kaliumphosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,7, so ergaben sich 82 I der ursprünglichen Aktivität (in Gegenwart einer 0,1 molaren Kaliumphosphatpufferlösung). Hieraus ergibt / Tris (hydroxyriethyl)arainoniethanhydrochlorid

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sich, daß Tris-HCl und ülycin-KOH keine Inhibitoren sind, sondern daß vielmehr eine Kaliumphosphatpufferlösung das Enzym aktiviert. Auch muß eine Natriumacetatpufferlösung das Enzym stimulieren (Fig. 1), da bei einem pH-Wert von 6,5 die Aktivität in der Natriumacetatpufferlösung mindestens 90 X der Aktivität betrug, die im Falle einer Kaliumphosphatpufferlösung zu beobachten war.

L-a-Glycerophosphat-Oxidase-Reinigung

Untersuchungen des o-GIycerophosphat-Oxidase-Glycerin-Bestimmungssystemes zeigten, daß das rohe a-Glycerophosphat (a-GP)-Oxidase-Präparat Verunreinigungen enthielt. Einige dieser Verunreinigungen verhinderten die Verwendung des rohen Enzymes bei Serumuntersuchungen, da im Serum ganz offensichtlich Substrate für diese Enzyme in Konzentrationen vorhanden waren, die vergleichbar waren mit den normalen Triglycerid-Konzentrationen. Bestimmte dieser Verunreinigungen wirkten des weiteren auf im Serum vorhandene Substrate unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid, wodurch das bevorzugte Bestimmungsverfahren gestört wurde.

Die Ergebnisse der Reinigung unter Anwendung von Protein-Fraktionierungsverfahren sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

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Tabelle IV

Reinigung von	a-Glycerophosphat-Oxidase von	Gesamt- Protein, ag	Einhei ten a- GP OX mg Pro tein	S. Faecalis	ATCC
12755		9850	0,64
Verfahren	Gesaat- Einhei- ten* o-GP OX	9540	0,66	Reinigung	Ausbeute
Roher Zeil-frei er Extrakt	6300	4700	1.2	1	100
Protamin · SO4- Fraktionierung (0,05 I)	6280	1007	3,6	1,03	100
Ammonium · SO.- Fraktionierung (50 bis 80t)	5590	1007	4,22	1.9	89
DEAE-CeIlulose- Frakt ionierung	3600		5,6	57
Dialyse und Kon zentration	4250	6.6	68

1 Einheit entspricht der Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 JuMol Substrat in 1 liMol Produkt in 1 Minute bei 37°C zu überführen.

Stabilität von q-Glycerophosphat-Oxidase

Die Enzym-Lösung erwies sich mindestens 4 Monate lang als stabil, wenn sie bei -20°C aufbewahrt wurde. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen denaturierte das Enzym nicht. Auch wurde das Enzym nicht durch Triton X-100 inhibiert, und zwar selbst nicht bei Konzentrationen des oberflächenaktiven Substanz von 2 i.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1; Eich-Kurve für Glycerin und Wasserstoffperoxid Eine Glycerin-Ansprech-Kurve ist in Fig. 2 dargestellt.

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Zunächst wurden Mischungen, wie oben unter der Oberschrift "Quantitative Glycerin- und Triglyceridbestimraung nach der a-GP-Oxidase-Methode" beschrieben hergestellt.

üann wurden Reaktionen durch Substratzusatz eingeleitet, die nach 15 Minuten bei 37°C im wesentlichen beendet waren. Es wurde eine gute Beziehung zwischen den Glycerin-Konzentrationen (.) und der Farbstoffbildung (χ) für die gekoppelten Reaktionen 2, 3 und 4 festgestellt.

Beispiel 2: Quantitative Bestimmung eines Triglycerid-Substrates

Eine Triglycerid-Emulsion wurde dadurch hergestellt, daß eine Mischung von Olivenöl (3,6 yMole/ml) in 0,4t Triton X-100 (Octylphenoxypolyäthoxyäthanol, Hersteller Rohm und Haas Company) in einem Eisbade 10 Minuten lang einer Behandlung mit Ultraschallwellen ausgesetzt wurde.

Eine quantitative Bestimmung des Triglycerid-Substrates durch die gekoppelten Reaktionen 1, 2, 3 und 4 wurde mit der quantitativen Bestimmungsmethode von Garland und Rändle verglichen. Es wurden ausreichende Mengen an Lipase von Candida rugosa zugesetzt, um die Hydrolyse des Triglycerides rasch (weniger als 1 Minute) und vollständig zu katalysieren. Das Triglycerid-Glycerin wurde bestimmt durch einen Vergleich des AA^^-Wertes nach einer 30 minütigen Inkubation mit dar Glycerln-Konzentration-Ansprechkurve, ähnlich Fig. 2. Die in Tabelle V dargestellten Werte zeigen eine gute Obereinstimmung zwischen den beiden Methoden. Die Triglyceridwerte, die nach der a-Glycerophosphat-Oxidase-Methode ermittelt wurden, lagen in allen Fällen etwas höher, jedoch war der Unterschied lediglich im Falle der Probe 2 größer als 10t.

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Tabelle V
Triglycerid-Konzentration

Probe Methode nach Garland α-Glycerophosphat-Oxidase- und Rändle Methode

1	18,4
2	36,8
3	73,6
4	110,0

19,0 42,0

78,0

114,0

Beispiel 3: Quantitative Bestimmung von Serum-Triglyceriden nach der q-Glycerophosphat-Oxidase-Methode

Unter Verwendung des bevorzugt verwendeten Puffersystems, d.h. eines 0,2 molaren Kaliumphosphatpuffers bei einem pH-Wert von 8,0 wurden 10 Serum-Proben auf ihren Triglycerid-Glyceringehalt bei Konzentrationen von 0,50 bis 6,50 mM untersucht.

Die Vergleichsmischungen enthielten lediglich die Standard-Komponenten für die Glycerin-Bestimmung; die Probenmischungen enthielten Lipase von Candida rugosa sowie die Standardkomponen ten für die Glycerin-Bestimmung.

Die Gleichgewichtseinstellung sämtlicher Mischungen erfolgte durch 5 Minuten langes Erwärmen auf 37°C, worauf die Ausgangsermittelt wurden.

Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 20 ul einer jeden Serumprobe eingeleitet, wonach nach einer Inkubationsdauer von 20 Minuten die endgültigen A^_go-Werte ermittelt wurden.

Die Triglycerid-Glycerinkonzentrationen wurden unter Verwendung einer wäßrigen Glycerin-Eichkurve, wie in Fig. 2 dargestellt, ermittelt, nachdem die AA._go-Werte der Vergleichsproben von dem AAjfQ-Werten der Proben abgezogen worden waren. In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen unter Ein-

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- 3C -

beziehung der Methode von Kessler und Lederer/angegeben. Wie sich aus den Daten ergibt, besteht eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden.

Tabelle VI

Vergleich der quantitativen Serum-Triglyceridbestinunung unter Verwendung des a-Glycerophosphat-Oxidasesystems mit einer halbautomatischen chemischen Methode

	Triglycerid-Konzentration	560,15	ι	mg/dl
Proben-Nr.	Vergleichs-Methode mM mg/dl	409,70	a-Glycerophosphat- Oxidase-Methode	550,80
	6,59	319,60	mM	416,50
1	4,82	280,50	6,48	337,45
2	3,76	170,00	4,90	314,50
3	3,30	145,35	3,97	161,50
4	2,00	90,10	3,70	93,50
5	1,71	50,15	1,90	42,50
6	1,06	106,25	1,10	53,55
7	0,59	85,00	0,50	114,75
8	1,25		0,63	80,75
9	1,00	1,35
10		0,95
Beispiel 4

Die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde durch wiederholte Bestimmung von zwei verschiedenen Serumproben getestet. Eine Serumprobe enthielt eine normale Triglycerin-Konzentration und die andere Semaprob· «la· höh· Triglycerid-Keazentration. Die dabei erhaltenen Ergebnis·· aiad ia der folgeadea Tabelle VII xusamaeaf··teilt. Ia Fall· der aeraalea Prob· wurde ein Abweichung·-leeffitient rea 1,1 t bestiaat Hai ia Fall· der abaoraalea Fr«b· ei» entsprechender leeffisieat vea 2,6

/' vergl. "Fluorometric Measurement of Triglyceride·", Automation in Analytical Chemistry, Technlcon Symposia, L.T.Skeggs, Jr. Editor, M«d*e/lp Inc., New York, New York, 341 (1966).

• Oltl

	Tabelle VII	mM	Hoher Serumspiegel
Reproduzierbarkeit des	a-GP-Oxidase-Systeras für die quantitative	4,90
Trislyceridbes timmung		4,82
Triglycerid-Konzentration	4,80
	5,25
Normaler Serumspiegel	4,72
1,60	5,00
1,66	4,78
1,61	4,92
1,42	4,96
1,62	4,83
t,55	4,91
1,54	4,79
1,70	4,90
1,66	4,80
1,54	4,89 0,13
	2,60
	anderer Elektronenakzeptoren
Mittelwert - 1,59 S.D. * - 0,081
COV - 5,10
Beispiel 5: Verwendung

Dies Beispiel veranschaulicht, daß außer Sauerstoff auch andere Elektronenakzeptoren verwendet werden können. Zu diesem Zweck
wurden Reaktionsmischungen mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:

0,1 M Kaliumphosphat-Puffer für die Einstellung eines pH-Wertes von 7;

0,2 M DfL-a-Glycerophosphat;

Elektronenakzeptor,,wie in der folgenden Tabelle VIII angegeben.

In jeden Falle erfolgte eine Gleichgewichtseinstellung der Mischung bei 37°C, worauf die Reaktion durch Enzymzusatz eingeleitet wurde. Die Aktivität des verwendeten Enzymes wurde in der

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beschriebenen Weise berechnet, unter Verwendung von E,

g ,_QQ -

16 χ 10³ für 2,6-Dichloi/indof>henol; E₄₀₀ « 1x10³ für K₃Fe(CN₅) und L₅₀₅ -. 18,5 χ 10³ für 2-(p-I°dophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2M-tetrazoliumchlorid (INT).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII zus ammenges teilt.

Tabelle VIII

Verwendung anderer Elektronenakzeptoren für die a-GP-Oxidase-Reaktion

Elektronenakzeptor

uMole oxidiertes o-GP/Min./mg	Relative Ge- + schwindigkeit
80	1
4	0,05
70	0,88
21	0,26
35	0,44
0,8	0,01
12	0,15

Sauerstoff

2,6-Dichlorphenolindolphenol (70.um)

2,6-Dichlorphenolindolphenol (70 um)
Phenazinmethosulfat (60 um)

K₃Fe(CN)₆ (1 mM)
K₃Fe(CN)₆ (1 mM)
Phenazinmethosulfat (60 um) INT⁺* (0,16 mM)

INT (0,16 mM)
Phenazinmethosulfat (60 um)

Verglichen mit Sauerstoff als Elektronenakzeptor,

INT - 2-(p-Iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid

Die Erfindung ermöglicht die quantitative Bestimmung eines jeden Reagenzes und Enzymes, das in dem erfindungsgemäßen Reagenz-System verwendet wird. So läßt sich beispielsweise ATP mit einem Bestimmungs-Reagenz bestimmen, das sämtliche Reagenzien außer ATP enthält, das mit der zu analysierenden Probe zugeführt wird. In entsprechender Weise lassen sich Glycerin-Kinase, Lipase und a-Glycerophosphat bestimmen, indem entsprechende Bestimmungsreagenzien verwendet werden, die alle Komponenten enthalten, außer

/~ phenol

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den zu bestimmenden Komponenten.

üie erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien können des weiteren in vorteilhafter Weise in eine Matrix aus einem absorbierenden Material bekannten Aufbaues eingearbeitet werden, beispielsweise durch Imprägnieren der Matrix.

Auf diese Weise lassen sich Testmaterialien und Testelemente herstellen, die sich fUr die qualitative oder halbquantitative Bestimmung von Glycerin und/oder Triglyceriden eignen, üie Bestimmungs-Reagenzien können des weiteren zur Herstellung analytischer Elemente verwendet werden, die beispielsweise aus einem Schichtträger und verschiedenen hierauf aufgebrachten Schichten, beispielsweise einer Ausbreitschicht, und einer Reagenzschicht bestehen können. Dies bedeutet, daß die Bestimmungs-Reagenzien der Erfindung beispielsweise zur Herstellung analytischer Elemente verwendet werden können, wie sie im Aufbau beispielsweise aus den folgenden US-PS bekannt sind:

3 092 465, 3 418 099, 3 418 083, 2 893 843, 2 893 844, 2 912 309, 3 008 879, 3 802 842, 3 798 064, 3 298 739, 3 915 647, 3 917 453, 3 933 596 und 3 936 357.

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Claims (28)

Patentansprüche

1. 'Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Tri- - glyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man in einer Probe der zu analysierenden Flüssigkeit gegebenenfalls vorhandene Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin hydrolysiert und das freie und/oder durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin unter Urzeugung einer feststellbaren Veränderung umsetzt, dadurch gekennzeichnet, daß man

1.) das Glycerin in L-a-Glycerophosphat überführt;

2.) das L-a-Glycerophosphat unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid oxidiert und

3.) das erzeugte Wasserstoffperoxid unter Urzeugung einer feststellbaren Veränderung umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit in Gegenwart eines Elektronenakzeptors mit einem Bestimmungs-Reagenz in Kontakt bringt, das enthält:

(Λ) eine Lipase;

(B) Glycerin-Kinase;

(C) Adenosintriphosphat und

(D) a-Glycerophosphat-Oxidase.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit in Gegenwart von Sauerstoff als Elektronenakzeptor mit dem Bestimmungs-Reagenz in Kontakt bringt.

4. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit in Gegenwart von Sauerstoff als Elektronenakzeptor mit einem BeStimmungs-

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ORIGINAL INSPECTED

Reagenz in Kontakt bringt, das enthält:

(A) eine Lipase;

(B) Glycerin-Kinase;

(C) Adenosintriphosphat;

(D) a-Glycerophosphat-üxidase und

(E) einen Indikator oder ein Indikatorsystem, der bzw. das in Gegenwart von Wasserstoffperoxid eine feststellbare Veränderung herbeiführt.

5. Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lipase mikrobiologischen Ursprungs von Rhizopus arrhizus, Candida rugosa oder Chromobacterium viscosum verwendet.

6. Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine a-Glycerophosphat-Oxidase mikrobiologischen Ursprungs von Streptococcaceae oder Lactobacillaceae verwendet.

7. Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Glycerin-Kinase von E. coli oder Candida mycoderma verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man L-a-Glycerophosphat-Oxidase von Streptococcus faecalis verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Indikatorsystem aus einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer FarbstoffVorläuferverbindung, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität einer feststellbaren Veränderung unterliegt, verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Indikatorsystem verwendet, das als Substanz mit peroxidativer Aktivität Peroxidase enthält.

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11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Indikatorsystem verwendet, das als FarbstoffVorläuferverbindung einen Leucofarbstoff enthält, der in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase zu einem Farbstoff oxidiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Indikatorsystem mit einer FarbstoffVorläuferverbindung verwendet, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase zu einem farblosen Reaktionsprodukt oxidiert wird, das mit einer Farbkupplerverbindung im Verhältnis zur Menge des vorhandenen Wasserstoffperoxides zu einer farbigen Verbindung umgesetzt wird.

13. Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder gebundenen Glycerins im Blutserum nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man im wäßrigen Medium in Gegenwart von Sauerstoff eine Probe des Blutserums mit einem auf einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 abgepufferten Bestimmungs-Reagenz in Kontakt bringt, das enthält:

(A) eine Lipase;

(B) einen Effektor, bestehend aus Protease oder einer oberflächenaktiven Verbindung;

(C) Glycerin-Kinase, vorzugsweise von E. coli oder Candida mycoderma;

(D) Adenosintriphosphat;

(E) o-Glycerophosphat-Oxidase, vorzugsweise von Streptococcus faecalis und

(F) ein Indikatorsystem mit Peroxidase und einer Farbstoffvorläuferverbindung, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase einer quantitativ erfaßbaren Farbveränderung unterliegt.

14. BeStimmungs-Reagenz für die Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

(a) eine Lipase;

(b) eine Glycerin-Kinase;

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(c) Adenosintriphosphat;

(d) a-Glycerophosphat-Oxidase sowie gegebenenfalls

(e) einen Elektronenakzeptor.

15. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

(a) eine Lipase;

(b) eine Glycerin-Kinase;

(c) Adenosintriphosphat;

(d) a-Glycerophosphat-Oxidase und

(e) einen Indikator oder ein Indikatorsystem, das in Gegenwart von Wasserstoffperoxid eine feststellbare Veränderung herbeiführt.

16. Bestimmungs-Reagenz nach Ansprüchen 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lipase mikrobiologischen Ursprungs von Rhizopus arrhizus, Candida rugosa oder Chromobacterium viscosum enthält.

17. Bestimmungs-Reagenz nach Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich eine Protease oder eine oberflächenaktive Verbindung als Hydrolyse-Stimulator enthält.

18. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Protease bestehend aus Chymotrypsin, Elastase, Papain, Bromelain oder eine Protease von Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae oder Bacillus subtilis enthält.

19. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es als oberflächenaktive Verbindung ein Octyl- oder Nonylphenoxypolyäthoxyäthanol enthält.

20. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oberflächenaktive Verbindung mit einer hydrophilen-lipo-

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philen Balance-Zahl von unter 15 mit einer Polyoxyäthylenkette enthält, wobei die Anzahl von Oxyäthyleneinheiten in der Polyoxyäthylenkette unter 20 liegt.

21. Bestimmungs-Reagenz nach Ansprüchen 14 bis IS, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Glycerin-Kinase von E. coli oder Candida mycoderma enthält.

22. Bestimmungs-Reagenz nach Ansprüchen 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine a-Glycerophosphat-Oxidase mikrobiologischen Ursprungs von Streptococcaceae oder Lactobaci1laceae enthält.

23. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es eine a-Glycerophosphat-Oxidase von Streptococcus faecalis enthält.

24. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Indikatorsystem mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer FarbstoffVorläuferverbindung, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität eine feststellbare Veränderung herbeiführt, enthält.

25. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substanz mit peroxidativer Aktivität Peroxidase enthält.

26. Bestimmungs-Reagenz für die Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 13 zur Bestimmung von Glycerin in wäßrigen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

(a) eine Glycerin-Kinase;

(b) Adenosintriphosphat;

(c) o-Glycerophosphat-Oxidase und

(d) einen Elektronenakzeptor.

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27. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

(a) eine Glycerin-Kinase;

(b) Adenosintriphosphat;

(c) eine α-Glycerophosphat-Oxidase und

(d) ein Indikatorsystem mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer Farbstoffvorläuferverbindung, die in Gegenwart eines Peroxides und der Substanz mit peroxidativer Aktivität eine feststellbare Veränderung herbeiführt.

28. Bestimmungs-Reagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat in wäßriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

(a) Glycerin;

(b) eine Glycerin-Kinase;

(c) α-Glycerophosphat-Oxidase und

(d) einen Elektronenakzeptor.