JPS60126084A - グリセロリン酸オキシダーゼの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は安定化されたクリ七ロリン酸オキシターゼ組成
物ｅこ関するものでおる。

グリセロリン酸オギシグーゼ（以下ＧＰＯと略称する）
はＬ−α−グリセロリン酸を基質として酸素を消費して
ジヒドロキシアセトン−３−リン酸と過酸化水素とを生
成するので診断用試薬として使用されているが、ＧＰＯ
は不安定であり、特にＧＰＯの低濃度水溶液ｅこおいて
は不安定である。

さらｔこＧ、Ｐ　Ｏを含有する組成物は凍結乾燥する場
合その間あるいは′凍結乾燥後その活性が相当低下する
ものであった。

上記の欠点を有しない安定化されたグリセロリン酸オキ
シクーゼ組成物を得るため多くの試みがなされた。この
改善にあたり、従来からのオキシターゼ系酵素の安定化
のための慣用技術であるポリオールやフラビンアデニン
ジヌクレオチド（ＦＡＤ）の添加ｖこよる安定化が利用
されたものであった〔蛋白・核酸・酵素　／ど７〜／９
３＜／９７乙年）別冊〕。さらにその後、フラビン含有
物質、糖類、アルブミンおよびアミノ酸からなる群から
選ばれた／゛種または２種以上の化合物をＧＰ−Ｏｆこ
添加することによる安定化した組成物に関する報告があ
る（特開昭５７−乙ｇＶｇｇ号公報）。

上記の物質の添加によるＧＰＯの安定効果を示すものは
補酵素であるＦＡＤすなわちフラビン含有物質であり、
上記の他の物質では安定化の効果が、はとんど認められ
ないものであった。しかし、ＦＡＤは高ｉｓ度でＧＰＯ
の安定化の効果がでるが、ＦＡＤ自体の色素の影響があ
るためトリクリセライト測定系（比色分析）では多量ｔ
こ使用できない欠点があった。さらに酸性アミノ酸例え
ばクルクミン酸、アスパラギン酸、α−アミノアジピン
酸をＧＰＯＩこ添加した組成物の報告もある（特開昭Ｓ
ど−ｇ乙０１３号公報）。しかしながら、この組成物は
一応の効果があるが、トリクリセライト測定系ではなお
満足する安定性を示すものではなかった。

本発明者らは、上記の諸欠点を有しない安定なＧＰＯ含
有組成物を得ることを目的として種々研究した結果、”
アミノ基を有しないポリカルボン酸およびその水溶性塩
類および硫酸塩からなる群から選ばれた７種または２種
以上の化合物がＧＰＯを極めて良好ｔこ安定化せしめ得
ることを見い出しｌこ　。

本発明は」−紀の知見ｔこ基づいて完成されたもので、
アミノ基を有しないポリカルボン酸またはその水溶性塩
類および硫酸塩からなる群から選ばれた７種または２種
以上の化合物とＧＰＯどを含有する水性組成物またはそ
の凍結乾燥物からなる安定化されたクリ七ロリン酸オキ
シグーゼ組成物である。

本発明では、上記の安定剤を使用することｔこより低濃
度の溶液においても、あるいは凍結乾燥によってもＧＰ
Ｏの活性低下は認められない優れたものである。さらに
安定化効果を長期間に亘つて持続することができるもの
である。

まず本発明に使用されるアミノ基を有しないポリカルボ
ン酸としては、飽和ジカルボン酸例えばシュウ酸、マロ
ン酸、メチルマロン酸、エチルマロン酸、コハク酸、グ
ルタル酸、アジピン酸なと、ジメチルクルクル酸、ジメ
チルコハク酸、芳香族ジカルボン酸、例えばフタル酸、
インフタル酸、テレフタル酸、フェニルコハク酸、フェ
ニルマロン酸、フェニレンジ酢酸ナト、ヒドロキシジカ
ルボン酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、β−オキジグｌレ
タル酸など、不飽和ジカルボン酸、例えばマレイン酸、
フマル酸、グルタコン酸、アリルマロン酸、メサコン酸
、イクコン酸なと、カルボニルジカルボン酸、例えばオ
ギザロ耐酸、α−ケトグ酸などの丸＼ｐボン酸化合物、
イミノカルボン酸系ポリカルボン酸、例えばイミノン酢
酸、β−アラニンｆｌｙ酸、１．３−ジアミノプロパン
四酢酸、ヒドロキシエチルイミノニ酢酸、エチレンジア
ミン二酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ト
ランス−シクロヘキサンジアミン四酢酸、ニトリロ三酌
酸、ニトリロプロピオン酸など、トリカルボン酸、例え
ばクエン酸、インクエン酸、アコニット酸などが挙げら
れる。さらにこれらのポリカルボン酸はその水溶性塩、
例えばナトリウム塩、カリウム塩、す′チウム塩やアン
モニウム塩の形で用いてもよい。

特に好ましくは、コハク酸、クエン酸、酒石酸、マロン
酸、シュウ酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸であ
る。

また使用される硫酸塩としては、水溶性の塩類Ｌｉ２５
ｏ、、　（Ｎ２Ｈ，）Ｓｏ、が挙げられる。特ｔこ好ま
しく　ハ（ＮＨ，）２Ｓｏ、　、　Ｍｇ５Ｏ，、Ｎａ２
５Ｏ’４．　Ｌｉ２５ｏ、である。

これらの添加剤は、単独または混合して使用してもよく
、また上記のポリカルボン酸と硫酸塩とを任意の割合で
混合して使用してもよい。

本発明の組成物は緩衝液にＧＰＯと、添加物質としてア
ミノ基を有しないポリカルボン酸およびその水溶性塩類
および硫酸塩からなる群から選ばれた７種または２種以
上の化合物とを任意の順序で添加して調製したものであ
る。緩衝剤としては例えばトリス緩衝液、ピペス緩衝液
、ジメチ）ｖクルクル酸緩衝液が使用され、該水性組成
物のｐ　Ｈを通常Ｓ〜１０、好ましくはｐＨ７〜ｇとす
ればよい。

本発明の組成物ｔこは必要をこより他の成分を添加する
ことができる。例えばＫＣ３ＮａＣ１などの一般的な塩
類を用いてイオン強度（イオン濃度）をあげることは目
的どする組成物の安定性がより増加するので有利である
。

本発明の組成物ｔこおいて、ヒリカルポン酸またはその
水溶性塩の添加濃度としては、００７Ｍ以上であればよ
く、通常００７〜０．３　Ｍ程度で、好ましくはＯ，Ｏ
Ｓ〜０．’１Ｍ１Ｍ程ある。

また硫酸塩の添加濃度としては、０．０　／、Ｍ　ＩＪ
、１であればよく、通常０，０／〜ｇＭ程度で、好まし
くはＯ，ＯＳ〜０．５Ｍ程度である。このよりゃこ調製
した組成物は、水性液であるが、これを凍結乾燥したも
−のであってもよい。またこのようなＧＰＯ組成物は、
／テスート当り、例えばＧ　Ｐ　ＯＯ，／〜ＳＯＵを含
有する０１〜３ｍｌ溶液として使用される。

なおＧＰＯの活性測定法は、以下の通りである。

〔反応液〕

ＤＬ−グリ七ロリン酸・１００　ｍｍｏｌｅｓ２ナトリ
ウム グーアミノアンチピリン　／、　３　ｍ　ｍｏｌｅ８フ
　エ　ノ　−ル　、ｌ、’／　ｍ　ｍｏ　ｌ　ｅｓパー
オキシグーゼ　３　Ｕ／ｍｌ トリス（ヒドロキシメチル） ７ミ／ｊり’Ｊ　１１０　ｍｍｏｌｅｓｐＨＩＱ 〔反応停止液〕 ０２５％ラウリル硫酸ナトリウム 〔酵素希釈液〕 ０７％牛アルグミン、０４Ｍ硫酸アンモニウム含有２０
　ｍ　Ｍ　）リスーＭＣＩ緩衝液（ｐＨｆｏ） 上記の反応液／、　Ｑ　ｍｌを正確シこ小試験管をこ採
り、３７℃恒温槽ｔこ入れ、Ｓ分間予加温を行なう。

酵素液を０．０２　ｍｌ正確ｅこ採り、反応液に加え、
静かｔこ混合して反応せしめる。正確に１０分後、反応
停止液λＱｍｌを加え、次いで波長３００　ｎ　ｒｎに
おける吸光度（Ａｓ）を測定する。

またブランクは、酵素液の代りをこ酵素希釈液ＯＱ−？
ｍｌを加え、以下同様の反応を行ない、この吸光度（Ａ
　ｂ　）を読む。

△Ａ：Ａｓ−ＡＩ） Ｘ　：酵素液中のＧＰＯｅ嗅ｃｍＹ／ｍｌり次に本発明
を実施例により説明するが、これｔこ限定されるもので
はない。

Ｇ　Ｐ　ＯＯ，’　２３　Ｕ　／　ｍｌを／　ＯｍＭ　
ｌ・！Ｊ　ス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨｆＯ）＋こ溶解した
水性液（３０ツトを用いた）について３７℃で４０分間
Ｑこおける残存活性を測定して、ＧＰＯの安定性を試験
した。

その結果は第１図に示した。第１図よりＧＰＯのの希薄
溶液は特ｔこ不安定であることがわかった。

（Ａ）硫酸塩ｔこよるＧＰＯの安定性試験Ｇ　Ｐ　ＯＯ
，２３Ｕ　／　ｍｌおよび第１表記載の添加物質を／　
ＯｍＭ　）　ＩＪ　ス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ，！ｒ、ｏ
）に溶解した水性液を３７℃で６０分間放置後ＧＰＯの
残存活性を測定した。その結果を第１爽に示した。第１
表よりＧＰＯの希薄溶液は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
よりも水溶性塩を添加して水性液中のイオン強度を高め
る方が安定化されるもので、硫酸ナトリウム（Ｎａ　２
Ｓｏ、　）　、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ，）　、硫
酸アンモニウムＣ（ＮＩ（ａ　）　２８０４　）が優れ
たものであった。特に（Ｎ）（４）２Ｓ０４　の添加効
果が大きいことがわかった。

さらに、（ＮＨ，）　２Ｓｏ、のＧＰＯ安定化の効果を
、糖類や他のポリオール、アミノ酸等による安定化の比
較を行なった。

なお、この試験においては、下記の組成を有するｌ　Ｊ
Ｊグリセライド測定用試薬を用い、かつＧＰｏ　２　Ｕ
　／　ｍｌを用いた。

その結果、各添加物質によるＧＰＯの残存活性（３７℃
、４Ｉ！ｓ分後）を第２表に示し、また第３表に２３℃
、２１１”時間後の残存活性を示すものである。

第２表 第３表 なおトリグリセライド測定用試薬は下記の組成を有する
。

１・１Ｊ７−ＨＣＩ緩衝液　１１０ｍＭフ　エ　ノ　−
ル　２．／　ｍ　Ｍ ｌ−アミノアンチピリン　／、３ｍＭ ＡＴＰ−２Ｎａ　／、０ｍＭ Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２　／、　Ｏｍ　Ｍ ト　リ　ト　ンＸ　７１００　０．／　％パーオキシダ
ーゼ　、！　Ｕ　／　ｍｌリパーゼ　／　３０　Ｕ’／
　ｍｌ グリセロキナーゼ　Ｏ０３Ｕ　／　ｍｌＧ　Ｐ　Ｏ２Ｕ
　／　ｍｅ ｐＨｆ、０ さらに種々の硫酸塩によるＧＰＯの安定化の効果をめた
。測定に当って、Ｇ　Ｐ　Ｏ３０Ｕ　／　ｍｌの亀とし
て／　００ｍＭ　）　’Ｊ　７−−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
どＯ）に溶解し、かつこれに種々の硫酸塩を添加し、３
７℃、６０分間後の残存活性をめたものである。その結
果を第１表に挙げるもので、いずれの硫酸塩も良好な安
定化効果を示した。

第を表 （Ｂ）ポリカルボン酸ＱこよるＧＰＯの安定性試験ＧＰ
Ｏ３０Ｕ；／ｍｅを１００ｍＭ）すｙ、−ＨＣ１緩衝液
（ｐＨｇＯ）に溶解した水性液に各種ポリカルボン酸を
添加し、３７℃、６０分間放置後ＧＰＯの残存活性を測
定した。その結果を第５表に示した。第５表より芳香族
モノカルボン酸（安息香酸）、およびアミン化合物は安
定化効果が劣ることがわかった。特に好ましいポリカル
ボン酸はコハク酸、クエン酸、イソクエン酸、酒石酸、
マロン酸、シュ酸、リンゴ酸、ジメチルグルグル酸であ
った。

第５表 （Ｃ）硫酸塩とポリカルボン酸（ジカルボン酸）との併
用によるＧＰＯの安定性試験 ＧＰＯ３０Ｕ／ｍｅを／　ＯＯｍ　Ｍ　ｌ・リスーＨＣ
ＩＪ＠液（ｐＨｙＯ）に溶解した水性液を３７℃で６０
分間放置後ＧＰＯの残存活性を測定した。この試験では
硫酸ナトリウムを基準としてこれに硫酸リチウム、グル
タミン酸、クエン酸およびコハク酸を添加した場合、お
よび硫酸リチウムを基準としてこれｔこグルタミン酸、
クエン酸およびコハク酸を添加した場合について試験し
た。その結果を第乙表に示した。

第乙表 （Ｄ）添加物質の濃度がＧＰＯの安定性におよぼす影響 （ｉ）Ｇ　Ｐ　００．３　Ｕ　／　ｍｌを／　Ｏｍ　Ｍ
　）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ−、ｊｒＯ）ｔこ溶解し
た水性液を基準として各種濃度の（ＮＩ（４）２Ｓ０４
を添加し、３７℃で７時間、２時間およびＳ時間後の残
存活性を測定した、その結果は第７表に示した。

また、各種濃度のＮａ２ＳＯ４およびＬｉ２５Ｏ，を添
加し、Ｇ’ＰＯＪ　ＯＵ／ｍｌノ／　０ｍ−Ｍ　）　Ｉ
Ｊ　ノーＨＣｌ緩衝液（ｌ（ｆＯ）の条件で３７℃、６
０分間放置後の残存活性を測定し、その結果を第５表に
示した。

また第７表（低濃度Ｇ　’Ｐ　Ｏの場合）より、硫酸塩
添加の場合、７〜３Ｍ添加した場合ＧＰＯの安定化度は
１００％に達し、それ以上の余分の量を添加しても添加
効果は現われないことがわかった。

好ましい添加量は少なくとも０．３Ｍであることかわか
った。

また第５表から、少なくとも！；　Ｏｍ　Ｍ　（０，０
！；Ｍ）以上の濃度にて添加すればよいことがわかった
。

第７表 第５表 コハク酸）についてＧＰＯの安定化試験をＧＰＯ３０Ｕ
　／　ｍｌ　／　Ｏｍ　Ｍ　）すｙ、−ＨＣｌ緩衝液（
、ｐ　Ｈｇ０）で３７℃、６０分間放置し、その残存活
性を測定した。

その結果を第り表ｔこ示した。

第７表より、ポリカルボン酸およびその塩の添加量は、
好ましくは０．／Ｍ程度であることがわかった。

（Ｅ）　Ｇ　Ｐ　Ｏ凍結乾燥品に対する本発明の各種添
加物質が安定性におよぼす影響 Ｇ　Ｐ　Ｏ３０Ｕ　／　ｍｌ　を　／　ＯｍＭ　）　リ
　ス−ＨＣＩ　緩衝液（、ｐＨ１Ｏ）に溶解した。該溶
液に第７０表ｔこ示した添加物質を加え、凍結乾燥した
。次いでこの凍結乾燥品を３７℃、３週間放置後、ＧＰ
Ｏの安定性を試験した。その結果は第１Ｏ表に示した。

第７０表より硫酸塩およびポリカルボン酸およびその塩
を添加した凍結乾燥製品は無添加物に比べ著しく安定性
が改善されたものであった。

第７０表

【図面の簡単な説明】

第１図はＧＰＯの希薄溶液での安定性を示したものであ
る。 特許出願人　東洋醸造株式会社 代表者　高田哲男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　アミノ基を有しないポリカルボン酸およびその
   水溶性塩類、および硫酸塩からなる群から選ばれた７種
   または２種以上の化合物とグリセロリン酸オギシグーセ
   とを含有する水性組成物またはその凍結乾燥物からなる
   ことを特許とする安定化されたグリセロリン酸オギシグ
   ーゼ組成物。 （２）　アミノ基を有しないｌすカルボン酸が、飽和ジ
   カルボン酸、芳香族ジカルボン酸、ヒドロキシンカルボ
   ン酸、不飽和ジカルボン酸またはカルボニルジカルボン
   酸である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 （３）飽和ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、コハ
   ク酸、アジピン酸、ジメチルグルタルある特許請求の範
   囲第２項記載の組成物。 （４）　芳香族ジカルボン酸が、フタル酸、フェニルマ
   ロン酸である特許請求の範囲第２項記載の組成物。 （５）　ヒドロキシジカルボン酸が、リンゴ酸、酒石酸
   、である特許請求の範囲第２項記載の組成物。 （６）不飽和ジカルボン酸が、マレイン酸、グルタコン
   酸である特許請求の範囲第２項記載の組成物。 （１）　カルボニルジカルボン酸が、α−ケトクルタル
   酸、α−ケトマロン酸である特許請求の範囲第２項記載
   の組成物。 （８）　アミノ基を有しないポリカルボン酸が、イミノ
   カルボン酸系ポリカルボン酸である特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 （９）イミノ酢酸系ポリカルボン酸が、エチレンジアミ
   ン四酢酸である特許請求の範囲第５項記載の組成物。 （１０）アミノ基を有しないポリカルボン酸が、トリカ
   ルボン酸系化合物である特許請求の範囲第１項記載の゛
   組成物。 （■）トリカルボン酸が、クエン酸、イソクエン酸であ
   る特許請求の範囲第１Ｏ項記載の組成物。 （１２）硫酸塩が、（閣（ａ　）ｇｓｏ、　、　（ＮＩ
   （４）ＩＥ（Ｓｏ、　。 Ｎａ２５Ｏａ、　Ｌ；２ｓｏ４．　Ｍｇ５Ｏ，、（Ｎ２
   Ｈ４）Ｓｏ、　’ｔ；ある特許請求の範囲第１項記載の
   組成物。