JPH0446558B2

JPH0446558B2 -

Info

Publication number: JPH0446558B2
Application number: JP58235815A
Authority: JP
Inventors: Takashi Takao; Saburo Harada
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1983-12-13
Filing date: 1983-12-13
Publication date: 1992-07-30
Also published as: JPS60126084A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はグリセロリン酸オキシダーゼの保存安
定化法に関するものである。グリセロリン酸オキシダーゼ（以下GPOと略
称する）はＬ−α−グリセロリン酸を基質として
酸素を消費してジヒドロキシアセトン−３−リン
酸と過酸化水素とを生成するので診断用試薬とし
て使用されている。（特開昭57−26600号号公報）
この従来法においてMgSO₄を測定用組成物に使
用しているが、このMgSO₄はGPOの安定化の目
的ではなく、グリセロキナーゼ（グリセリンキナ
ーゼとも言う）の補因子であるMg⁺⁺イオン放出
塩として使用されていたものにすぎない。しかし
ながら、GPOは不安定であり、特にGPOの低濃
度水溶液においては不安定である。さらにGPO
を含有する組成物は凍結乾燥する場合その間ある
いは凍結乾燥後その活性が相当低下するものであ
つた。上記の欠点を有しない安定化されたグリセロリ
ン酸オキシダーゼ組成物を得るため多くの試みが
なされた。この改善にあたり、従来からのオキシ
ダーゼ系酸素の安定化のための慣用技術であるポ
リオールやフラビンアデニンジヌクレオチド
（FAD）の添加による安定化が利用されたもので
あつた〔蛋白・核酸・酵素187〜195（1976年）別
冊〕。さらにその後、フラビン含有物質、糖類、
アルブミンおよびアミノ酸からなる群から選ばれ
た１種または２種以上の化合物をGPOに添加す
ることによる安定化した組成物に関する報告があ
る（特開昭57−68788号公報）。上記の物質の添加
によるGPOの安定効果を示すものは補酸素であ
るFADすなわちフラビン含有物質であり、上記
の他の物質では安定化の効果がほとんど認められ
ないものであつた。しかし、FADは高濃度で
GPOの安定化の効果がでるが、FAD自体の色素
の影響があるためトリグリセライド測定系（比色
分析）では多量に使用できない欠点があつた。さ
らに酸性アミノ酸例えばグリタミン酸、アスパラ
ギン酸、αーアミノアジピン酸をGPOに添加し
た組成物の報告もある（特開昭58−86083号公
報）。しかしながら、この組成物は一応の効果が
あるが、トリグリセライド測定系ではなお満足す
る安定性を示すものではなかつた。本発明者らは、上記の諸欠点を有しない保存安
定性を有するGPO含有組成物を得ることを目的
として種々研究した結果、飽和ジカルボン酸、芳
香族ジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、不飽
和ジカルボン酸、カルボニルカルボン酸、または
トリカルボン酸またはこれらの水溶性塩類が保存
時の安定化効果を奏することを見い出し、本発明
を完成した。本発明は上記の知見に基づいて完成されたもの
で、GPOを含有する水性組成物またはその凍結
乾燥物の保存安定性において、飽和ジカルボン
酸、芳香族ジカルボン酸、ヒドロキシジカルボン
酸、不飽和ジカルボン酸、カルボニルカルボン酸
またはトリカルボン酸またはそれらの水溶性塩類
からなる群から選ばれた１種または２種以上の化
合物を保存安定化剤とすることを特徴とする
GPOの保存安定化法である。本発明では、上記の安定化剤を使用することに
より低濃度の溶液においても、あるいは凍結乾燥
によつてもGPOの活性低下は認められない優れ
たものである。さらに安定化効果を長期間に亘つ
て持続することができるものである。まず本発明に使用される飽和ジカルボン酸とし
ては例えばシユウ酸、マロン酸、メチルマロン
酸、エチルマロン酸、コハク酸、グルタル酸、ア
ジピン酸など、ジメチルグルタル酸、ジメチルコ
ハク酸、芳香族ジカルボン酸としては例えばフタ
ル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フエニルコ
ハク酸、フエニルマロン酸、フエニレンジ酢酸な
ど、ヒドロキシジカルボン酸としては例えばリン
ゴ酸、酒石酸、β−オキシグルタル酸など、不飽
和ジカルボン酸としては例えばマレイン酸、フマ
ル酸、グルタコン酸、アリルマロン酸、メサコン
酸、イタコン酸など、カルボニルジカルボン酸と
しては例えばオギザロ酢酸、α−ケトグルタル
酸、β−ケトグルタル酸、α−ケトマロン酸など
のジカルボン酸化合物、トリカルボン酸としては
例えばクエン酸、イソクエン酸、アコニツト酸な
どが挙げられる。さらにこれらのポリカルボン酸
はその水溶性塩、例えばナトリウム塩、カリウム
塩、リチウム塩やアンモニウム塩の形で用いても
よい。特に好ましくは、コハク酸、クエン酸、酒石
酸、マロン酸、シユウ酸、リンゴ酸、である。これらの添加剤は、単独または混合して使用し
てもよく、また上記のポリカルボン酸と、例えば
（NH₄）₂SO₄、MgSO₄、Na₂SO₄、Li₂SO₄などの
硫酸塩を通常0.01〜4M、好ましくは0.05〜0.5M
程度の濃度にて混合して使用してもよい。本発明の組成物は緩衝液にGPOと、添加物質
として上記ポリカルボン酸およびその水溶性塩類
からなる群から選ばれた１種または２種以上の化
合物とを任意の順序で添加して調製したものであ
る。緩衝剤としては例えばトリス緩衝液、ピペス
緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液が使用され、
該水性組成物のPHを通常５〜10、好ましくはPH７
〜８とすればよい。本発明の組成物には必要により他の成分を添加
することができる。例えばKCl、NaClなどの一
般的な塩類を用いてイオン強度（イオン濃度）を
あげることは目的とする組成物の安定性がより増
加するので有利である。本発明の組成物において、ポリカルボン酸また
はその水溶性塩の添加濃度としては、0.01M以上
であればよく、通常0.01〜0.5M程度で、好まし
くは0.05〜0.4M程度である。このように調製した組成物は、水性液である
が、これを凍結乾燥したものであつてもよい。ま
たこのようなGPO組成物は、１テスト当り、例
えばGPO0.1〜50Uを含有する0.1〜５ml溶液とし
て使用される。なおGPOの活性測定法は、以下の通りである。〔反応液〕 DL−グリセロリン酸・２ナトリウム
100m moles ４−アミノアンチピリン 1.5m moles フエノール 2.1m moles パーオキシダーゼ 5U／ml トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
40m moles PH 8.0 〔反応停止液〕 0.25％ラウリル硫酸ナトリウム〔酵素希釈液〕 0.1％牛アルブミン、0.5M硫酸アンモニウム
含有20mMトリス−HCl緩衝液（PH8.0）上記の反応液0.1mlを正確に小試験管に採り、
37℃恒温槽に入れ、５分間予加温を行なう。酵素液を0.02ml正確に採り、反応液に加え、静
かに混合して反応せしめる。正確に10分後、反応
停止液2.0mlを加え、次いで波長500nmにおける
吸光度（As）を測定する。またブランクは、酵素液の代りに酵素希釈液
0.02mlを加え、以下同様に反応を行ない、この吸
光度（Ab）を読む。比活性（Ｕ／mg）＝ΔA／10／13.3×１／２×3.02／0
.02×１／Ｘ ΔA：As−Ab Ｘ：酵素液中のGPO濃度（mg／ml）次に本発明を実施例により説明するが、これに
限定されるものではない。 GPO0.25U／mlを10mMトリス−HCl緩衝液
（PH8.0）に溶解した水性液（３ロツトを用いた）
について37℃で60分間における残存活性を測定し
て、GPOの安定性を試験した。その結果は第１
図に示した。第１図よりGPOの希薄溶液は特に
不安定であることがわかつた。なお、参考として糖類や他のポリオール、アミ
ノ酸等による安定化の比較を行なつた。なお、この試験においては、下記の組成を有す
るトリグリセライド測定用試薬を用い、かつ
GPO2U／mlを用いた。その結果、各添加物質によるGPOの残存活性
（37℃、45分後）を第１表に示し、また第２表に
25℃、24時間後の残存活性を示すものである。

【表】

【表】なおトリグリセライド測定用試薬は下記の組成
を有する。トリス−HCl緩衝液 40mM フエノール 2.1mM ４−アミノアンチピリン 1.5mM ATP・2Na 1.0mM MgCl₂ 1.0mM トリトンＸ−100 0.1％パーオキシダーゼ 2U／ml リパーゼ 130U／ml グリセロキナーゼ 0.3U／ml GPO 2U／ml PH 8.0 (A) ポリカルボン酸によるGPOの安定性試験 GPO30U／mlを100mMトリス−HCl緩衝液
（PH8.0）に溶解した水性液に各種ポリカルボン酸
を添加し、37℃、60分間放置後GPOの残存活性
を測定した。その結果を第３表に示した。第３表
より芳香族モノカルボン酸（安息香酸）、および
アミン化合物は安定化効果が劣ることがわかつ
た。特に好ましいポリカルボン酸はコハク酸、ク
エン酸、イソクエン酸、酒石酸、マロン酸、シユ
酸、リンゴ酸、ジメチルグルタル酸であつた。

【表】

【表】 (B) 硫酸塩とポリカルボン酸（ジカルボン酸）と
の併用によるGPOの安定性試験 GPO30U／mlを100Mmトリス−HCl緩衝液
（PH8.0）に溶解した水性液を37℃で60分間放置後
GPOの残存活性を測定した。この試験では硫酸
ナトリウムを基準としてこれに硫酸リチウム、グ
ルタミン酸、クエン酸およびコハク酸を添加した
場合、および硫酸リチウムを基準としてこれにグ
ルタミン酸、クエン酸およびコハク酸を添加した
場合について試験した。その結果を第４表に示し
た。

【表】 (C) 添加物質の濃度がGPOの安定性におよぼす
影響 (i) 各種濃度のポリカルボン酸（クエン酸、コハ
ク酸）についてGPOの安定化試験を
GPO30U／ml10mMトリス−HCl緩衝液（PH
8.0）で37℃、60分間放置し、その残存活性を
測定した。その結果を第５表に示した。第５表より、ポリカルボン酸およびその塩の添
加量は、好ましくは0.1M程度であることがわか
つた。

【表】 (D) GPO凍結乾燥品に対する本発明の各種添加
物質が安定性におよぼす影響 GPO30U／mlを10mMトリス−HCl緩衝液（PH
8.0）に溶解した。該溶液に第６表に示した添加
物質を加え、凍結乾燥した。次いでこの凍結乾燥
品を37℃、３週間放置後、GPOの安定性を試験
した。その結果は第６表に示した。第６表よりポ
リカルボン酸およびその塩を添加した凍結乾燥製
品は無添加物に比べ著しく安定性が改善されたも
のであつた。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図はGPOの希薄溶液での安定性を示した
ものである。

Claims

【特許請求の範囲】１グリセロリン酸オキシダーゼを含有する水性
組成物またはその凍結乾燥物の保存安定化におい
て、飽和ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、ヒ
ドロキシジカルボン酸、不飽和ジカルボン酸、カ
ルボニルジカルボン酸またはトリカルボン酸また
はそれらの水溶性塩類からなる群より選ばれた１
種または２種以上の化合物を保存安定化剤とする
ことを特徴とするグリセロリン酸オキシダーゼの
保存安定化法。２飽和ジカルボン酸が、シユウ酸、マロン酸、
コハク酸、アジピン酸、ジメチルグルタル酸であ
る特許請求の範囲第１項記載の安定化法。３芳香族ジカルボン酸が、フタル酸、フエニル
マロン酸である特許請求の範囲第１項記載の安定
化法。４ヒドロキシジカルボン酸が、リンゴ酸、酒石
酸、である特許請求の範囲第１項記載の安定化
法。５不飽和ジカルボン酸が、マレイン酸、グルタ
コン酸である特許請求の範囲第１項記載の安定化
法。６カルボニルジカルボン酸が、α−ケトグルタ
ル酸、α−ケトマロン酸である特許請求の範囲第
１項記載の安定化法。７トリカルボン酸が、クエン酸、イソクエン酸
である特許請求の範囲第１項記載の安定化法。