JPH07236483A - 生理活性蛋白質の安定化方法 - Google Patents
生理活性蛋白質の安定化方法Info
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- JPH07236483A JPH07236483A JP5525394A JP5525394A JPH07236483A JP H07236483 A JPH07236483 A JP H07236483A JP 5525394 A JP5525394 A JP 5525394A JP 5525394 A JP5525394 A JP 5525394A JP H07236483 A JPH07236483 A JP H07236483A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】生理活性蛋白質を安定化する為の効果的且つ汎
用的方法を提供する。 【構成】クリスタリン（Crystallin）を生理活性蛋白質
の溶液に含有せしめることにより該生理活性蛋白質を安
定化する。
用的方法を提供する。 【構成】クリスタリン（Crystallin）を生理活性蛋白質
の溶液に含有せしめることにより該生理活性蛋白質を安
定化する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生理活性蛋白質の安定
化方法に関する。より詳細にはクリスタリン（Crystall
in）を生理活性蛋白質の溶液に含有せしめることによ
る、該生理活性蛋白質を安定化する方法に関する。
化方法に関する。より詳細にはクリスタリン（Crystall
in）を生理活性蛋白質の溶液に含有せしめることによ
る、該生理活性蛋白質を安定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より各種の生理活性蛋白質及び生理
活性ペプチドが報告されている。しかしながらそれらは
熱などに対して不安定なものが多く、安定性を十分に確
保するための様々な試みがなされている。
活性ペプチドが報告されている。しかしながらそれらは
熱などに対して不安定なものが多く、安定性を十分に確
保するための様々な試みがなされている。
【０００３】例えば酵素は、温和な条件で触媒作用を示
す為、従来より、臨床検査、生化学、食品工業等の分野
で酵素の利用が盛んに行われている。特に臨床検査分野
において用いられる各種生体成分測定用キットでは、従
来は凍結乾燥した酵素を含有する試薬を、用時適当な緩
衝液などで溶解して酵素溶液とし、用手法或いはオート
アナライザーによる生体成分測定に適用していた。
す為、従来より、臨床検査、生化学、食品工業等の分野
で酵素の利用が盛んに行われている。特に臨床検査分野
において用いられる各種生体成分測定用キットでは、従
来は凍結乾燥した酵素を含有する試薬を、用時適当な緩
衝液などで溶解して酵素溶液とし、用手法或いはオート
アナライザーによる生体成分測定に適用していた。
【０００４】この溶解して得られた酵素含有試薬は測定
に使用する場合の温度、化学物質、他の蛋白質等の影響
を受けやすく、長期の使用を可能ならしめるために試薬
中の酵素の安定性を高める目的で、従来より各種の添加
剤が検討されてきた。更に、最近になって、緩衝液中に
測定に必要な試薬類を既に溶解してそのままオートアナ
ライザー等に適用できる、いわゆる液状試薬なるキット
の要望が高まっている。
に使用する場合の温度、化学物質、他の蛋白質等の影響
を受けやすく、長期の使用を可能ならしめるために試薬
中の酵素の安定性を高める目的で、従来より各種の添加
剤が検討されてきた。更に、最近になって、緩衝液中に
測定に必要な試薬類を既に溶解してそのままオートアナ
ライザー等に適用できる、いわゆる液状試薬なるキット
の要望が高まっている。
【０００５】これまでは、酵素試薬などは凍結乾燥した
形態で供給されることが常であったため、凍結乾燥時に
酵素の失活、変性を防止する方法について種々研究がな
されてきている。例えばグルタミン酸ソーダ、アルブミ
ン、スキムミルク等のアミノ酸又は蛋白質、シュクロー
ス、マルトース等の糖類、グルタチオン、メルカプトエ
タノール等の還元剤、グリセロール、ソルビトール等の
多価アルコールをそれぞれ添加する方法等が一般的な酵
素の安定化方法として知られている。
形態で供給されることが常であったため、凍結乾燥時に
酵素の失活、変性を防止する方法について種々研究がな
されてきている。例えばグルタミン酸ソーダ、アルブミ
ン、スキムミルク等のアミノ酸又は蛋白質、シュクロー
ス、マルトース等の糖類、グルタチオン、メルカプトエ
タノール等の還元剤、グリセロール、ソルビトール等の
多価アルコールをそれぞれ添加する方法等が一般的な酵
素の安定化方法として知られている。
【０００６】また、溶液中での安定化効果を発揮する添
加物としては、酵素毎に種々の組み合わせが報告されて
いる。例えば、リン酸塩とグルコースオキシダーゼを組
み合わせる方法（特開平3-139278）、アデノシン三リン
酸とグリセロールキナーゼを組み合わせる方法（特開昭
59-21390）、ＦＡＤ、キレート剤とＬ−α−グリセロー
ル−３−リン酸オキシダーゼを組み合わせる方法（特開
昭59-14788）、シュウ酸、フタル酸、リンゴ酸、α−ケ
トグルタル酸などとグリセロリン酸オキシダーゼを組み
合わせる方法（特開昭60-126084）、グリセリン、ヨウ
化カリウム、界面活性剤等の特定割合とコレステロール
エステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを組み合わ
せる方法（特開昭57-79885）、マグネシウムイオンとコ
レステロールエステラーゼを組み合わせる方法（特公昭
61-21076）、アルコキシフェノールとペルオキシダーゼ
の組み合わせ（特開昭64-63380）、アミノピリンとペル
オキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭61-224987）
などが挙げられる。
加物としては、酵素毎に種々の組み合わせが報告されて
いる。例えば、リン酸塩とグルコースオキシダーゼを組
み合わせる方法（特開平3-139278）、アデノシン三リン
酸とグリセロールキナーゼを組み合わせる方法（特開昭
59-21390）、ＦＡＤ、キレート剤とＬ−α−グリセロー
ル−３−リン酸オキシダーゼを組み合わせる方法（特開
昭59-14788）、シュウ酸、フタル酸、リンゴ酸、α−ケ
トグルタル酸などとグリセロリン酸オキシダーゼを組み
合わせる方法（特開昭60-126084）、グリセリン、ヨウ
化カリウム、界面活性剤等の特定割合とコレステロール
エステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを組み合わ
せる方法（特開昭57-79885）、マグネシウムイオンとコ
レステロールエステラーゼを組み合わせる方法（特公昭
61-21076）、アルコキシフェノールとペルオキシダーゼ
の組み合わせ（特開昭64-63380）、アミノピリンとペル
オキシダーゼを組み合わせる方法（特開昭61-224987）
などが挙げられる。
【０００７】一般的な酵素に適用できる方法としては、
デキストラン等の水溶性高分子を酸化したのち還元剤で
アルデヒド体とし、このものに酵素を共有結合で固定化
させる安定化方法（特開昭64-60380）がある。
デキストラン等の水溶性高分子を酸化したのち還元剤で
アルデヒド体とし、このものに酵素を共有結合で固定化
させる安定化方法（特開昭64-60380）がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記に述べたように、
酵素溶液に安定化剤を添加する方法は、酵素の種類によ
り、添加する安定化剤が異なるのが一般的であり、酵素
の種類により添加する安定化剤を選択する必要があっ
た。又、安定化剤の安定化作用は、酵素との非特異的な
相互作用によることが多く、そのために高濃度に添加す
る必要があった。
酵素溶液に安定化剤を添加する方法は、酵素の種類によ
り、添加する安定化剤が異なるのが一般的であり、酵素
の種類により添加する安定化剤を選択する必要があっ
た。又、安定化剤の安定化作用は、酵素との非特異的な
相互作用によることが多く、そのために高濃度に添加す
る必要があった。
【０００９】また、各種の酵素を特異的に安定化する効
果のある添加物が、酵素を用いた臨床検査用キットに添
加された場合、オートアナライザーを用いた多項目検査
においては、その測定に支障を与えることがあり、使用
が制限される等の問題点を有していた。例えば、コレス
テロールエステラーゼの安定化剤としてのマグネシウム
イオンの添加は、同一セルを用いるオートアナライザー
においてはマグネシウムの測定にプラスの誤差を与え、
グルコースオキシダーゼの安定化にリン酸塩を使用した
キットは同様に無機リンの測定に誤差を与えることとな
る。
果のある添加物が、酵素を用いた臨床検査用キットに添
加された場合、オートアナライザーを用いた多項目検査
においては、その測定に支障を与えることがあり、使用
が制限される等の問題点を有していた。例えば、コレス
テロールエステラーゼの安定化剤としてのマグネシウム
イオンの添加は、同一セルを用いるオートアナライザー
においてはマグネシウムの測定にプラスの誤差を与え、
グルコースオキシダーゼの安定化にリン酸塩を使用した
キットは同様に無機リンの測定に誤差を与えることとな
る。
【００１０】また、汎用性のある安定化剤としての牛血
清アルブミンは濁りの発生、腐敗等の問題があった。
清アルブミンは濁りの発生、腐敗等の問題があった。
【００１１】このように、溶液中の酵素の変性を防止
し、更に活性の低下を防ぎ、長期間安定化する方法で、
なおかつ他の測定系に影響を与えない効率的で汎用的な
方法は従来は知られていなかった。
し、更に活性の低下を防ぎ、長期間安定化する方法で、
なおかつ他の測定系に影響を与えない効率的で汎用的な
方法は従来は知られていなかった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、溶液中で
生理活性蛋白質を安定化する効率的且つ汎用的方法を求
め鋭意検討した。そして、生理活性蛋白質溶液中にクリ
スタリンを添加することにより、効率的且つ汎用的に生
理活性蛋白質を安定化できることを知り、本発明を完成
した。
生理活性蛋白質を安定化する効率的且つ汎用的方法を求
め鋭意検討した。そして、生理活性蛋白質溶液中にクリ
スタリンを添加することにより、効率的且つ汎用的に生
理活性蛋白質を安定化できることを知り、本発明を完成
した。
【００１３】即ち、本発明は生理活性蛋白質にクリスタ
リンを添加し、生理活性蛋白質とクリスタリンとの特異
的な相互作用により生理活性蛋白質を安定化する方法に
関する。
リンを添加し、生理活性蛋白質とクリスタリンとの特異
的な相互作用により生理活性蛋白質を安定化する方法に
関する。
【００１４】本発明の対象とする生理活性蛋白質として
は、酵素や各種の生理活性ポリペプチド等であり、とり
わけ酵素を対象として安定化する効果が認められる。
は、酵素や各種の生理活性ポリペプチド等であり、とり
わけ酵素を対象として安定化する効果が認められる。
【００１５】酵素は動物、植物及び微生物由来のいずれ
でもよく、その種類としては、酸化還元酵素、転移酵
素、加水分解酵素等のいずれでもよい。また、酵素の分
子量、１次構造、２次構造、立体構造、４次構造（オリ
ゴマー状態）の違いにも左右されない。
でもよく、その種類としては、酸化還元酵素、転移酵
素、加水分解酵素等のいずれでもよい。また、酵素の分
子量、１次構造、２次構造、立体構造、４次構造（オリ
ゴマー状態）の違いにも左右されない。
【００１６】より具体的に示すと、リパーゼ、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、アシラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、コレステロールエステラーゼ、アシルCoAオキシ
ダーゼ、アシルCoAシンセターゼ、ビリルビンオキシダ
ーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデ
ヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリ
セロフォスフェイトオキシダーゼ、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼ、リポプロテインリパーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、ムタロターゼ、ペルオキシダーゼ等を対象と
することができる。
ゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、アシラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、コレステロールエステラーゼ、アシルCoAオキシ
ダーゼ、アシルCoAシンセターゼ、ビリルビンオキシダ
ーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデ
ヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリ
セロフォスフェイトオキシダーゼ、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼ、リポプロテインリパーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、ムタロターゼ、ペルオキシダーゼ等を対象と
することができる。
【００１７】本発明の対象となる生理活性蛋白質溶液の
濃度としては特に限定されるものではないが、溶液状態
であれば通常例えば数μg/mlから数mg/mlの範囲であ
る。
濃度としては特に限定されるものではないが、溶液状態
であれば通常例えば数μg/mlから数mg/mlの範囲であ
る。
【００１８】本発明に使用するクリスタリンとは、動物
の水晶体に特異的に存在する蛋白であり、レンズの透明
度を維持する役目がある蛋白として知られている。この
クリスタリンはα−クリスタリンとβ−クリスタリンの
２形がほぼ等量に存在するとされ、魚類、両生類、ほ乳
類のレンズにはこのほかにγ−クリスタリンも含まれて
いる。また爬虫類、鳥類の場合にはδ−クリスタリンが
あることが知られている。更に、α−クリスタリンはα
Ａ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン等に分類されて
いる。
の水晶体に特異的に存在する蛋白であり、レンズの透明
度を維持する役目がある蛋白として知られている。この
クリスタリンはα−クリスタリンとβ−クリスタリンの
２形がほぼ等量に存在するとされ、魚類、両生類、ほ乳
類のレンズにはこのほかにγ−クリスタリンも含まれて
いる。また爬虫類、鳥類の場合にはδ−クリスタリンが
あることが知られている。更に、α−クリスタリンはα
Ａ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン等に分類されて
いる。
【００１９】これらのクリスタリンは、ヒート・ショッ
ク・プロテイン（heat shock protein）の一種であり、
最近は水晶体以外の組織にも存在が確認され、その作用
が注目されている。
ク・プロテイン（heat shock protein）の一種であり、
最近は水晶体以外の組織にも存在が確認され、その作用
が注目されている。
【００２０】本発明には、何れの起源からのクリスタリ
ンも使用できるが、供給源の安定性から動物眼球由来の
クリスタリンが利用できる。また、より好ましくは、α
−クリスタリンが挙げられる。
ンも使用できるが、供給源の安定性から動物眼球由来の
クリスタリンが利用できる。また、より好ましくは、α
−クリスタリンが挙げられる。
【００２１】クリスタリンは、例えば新鮮な牛の眼球よ
りProc. Natl. Acad. Sci. USA 89巻, 10449-10453頁
（1992）記載の方法によって調製することができる。
りProc. Natl. Acad. Sci. USA 89巻, 10449-10453頁
（1992）記載の方法によって調製することができる。
【００２２】その精製度合いは、本発明である生理活性
蛋白質を安定化させる効果が発揮される程度であればよ
く、その添加量としては特に限定されない。
蛋白質を安定化させる効果が発揮される程度であればよ
く、その添加量としては特に限定されない。
【００２３】溶液状態の酵素に対する添加量について具
体的に挙げれば、通常、酵素の0.01倍モル濃度以上で使
用する。より好適には、0.05〜１倍モル濃度で使用す
る。
体的に挙げれば、通常、酵素の0.01倍モル濃度以上で使
用する。より好適には、0.05〜１倍モル濃度で使用す
る。
【００２４】クリスタリンは、上記記載したように単一
の生理活性蛋白質の安定化効果を発揮するばかりでな
く、複数の生理活性蛋白質成分を含有する場合において
も効果を発揮することができる。例えば、複数の酵素反
応を利用して生体成分を測定する臨床検査用キット組成
においても各酵素による相互の影響を回避することがで
きる。
の生理活性蛋白質の安定化効果を発揮するばかりでな
く、複数の生理活性蛋白質成分を含有する場合において
も効果を発揮することができる。例えば、複数の酵素反
応を利用して生体成分を測定する臨床検査用キット組成
においても各酵素による相互の影響を回避することがで
きる。
【００２５】即ち、通常臨床検査用に使用される酵素は
通常は充分に精製されているが、僅かに夾雑する雑蛋白
やキット系に含まれる他の成分（例えば、界面活性剤
等）、他の酵素（共役酵素等）が相互に影響を及ぼしあ
い、キットでは酵素単独よりもその酵素活性が不安定に
なることが多く、更に液状試薬では濁りを発生すること
も多い。
通常は充分に精製されているが、僅かに夾雑する雑蛋白
やキット系に含まれる他の成分（例えば、界面活性剤
等）、他の酵素（共役酵素等）が相互に影響を及ぼしあ
い、キットでは酵素単独よりもその酵素活性が不安定に
なることが多く、更に液状試薬では濁りを発生すること
も多い。
【００２６】本発明の方法はこれらの影響に対して、キ
ット系での配合された各種酵素間での相互作用による活
性の低下や濁りの発生等をも押さえることができる。
ット系での配合された各種酵素間での相互作用による活
性の低下や濁りの発生等をも押さえることができる。
【００２７】また、クリスタリンを添加した酵素は溶液
状態のみならず、凍結乾燥時の失活を防ぐこともでき、
凍結乾燥品の溶解時に発生しやすい濁りの生成を防ぐこ
とも可能である。
状態のみならず、凍結乾燥時の失活を防ぐこともでき、
凍結乾燥品の溶解時に発生しやすい濁りの生成を防ぐこ
とも可能である。
【００２８】更にまた、クリスタリンはそれ自体が生理
活性を有するものではないため、クリスタリンを配合し
た場合でも主たる活性を阻害したり、他に影響を及ぼす
こともなく、全ての生理活性蛋白質に適用することが可
能である。
活性を有するものではないため、クリスタリンを配合し
た場合でも主たる活性を阻害したり、他に影響を及ぼす
こともなく、全ての生理活性蛋白質に適用することが可
能である。
【００２９】以下、実施例にて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】尚、各実施例における各種の酵素活性は以
下のようにして測定した。 コレステロールデヒドロゲナーゼ活性測定法 コレステロール溶液（１mg／ml）２ml、pH8.5のβ-NAD+
溶液（３mg／ml）１mlに酵素溶液0.1mlを加え25℃で反
応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのN
ADHを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
下のようにして測定した。 コレステロールデヒドロゲナーゼ活性測定法 コレステロール溶液（１mg／ml）２ml、pH8.5のβ-NAD+
溶液（３mg／ml）１mlに酵素溶液0.1mlを加え25℃で反
応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μmoleのN
ADHを生成するのに要する酵素量を１単位とする。
【００３１】コレステロールエステラーゼ活性測定法 リノール酸コレステロール溶液（0.4mg／ml）１ml、pH
7.0の発色試薬（0.3mg／ml アミノアンチピリン、１mg
/ml フェノール、３u/ml ペルオキシダーゼ、0.5u/ml
コレステロールオキシダーゼ）２mlに酵素溶液0.1ml
を加え37℃で反応し、500nmの吸光度を測定する。１分
間に１μmoleのコレステロールを生成するのに要する酵
素量を１単位とする。
7.0の発色試薬（0.3mg／ml アミノアンチピリン、１mg
/ml フェノール、３u/ml ペルオキシダーゼ、0.5u/ml
コレステロールオキシダーゼ）２mlに酵素溶液0.1ml
を加え37℃で反応し、500nmの吸光度を測定する。１分
間に１μmoleのコレステロールを生成するのに要する酵
素量を１単位とする。
【００３２】Ｌ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼ活性測定法 発色試薬（アミノアンチピリン0.6mg／ml、フェノール
1.5mg／ml及びペルオキシダーゼ４単位／ml）1.5ml、pH
７のDL−α−グリセロリン酸２Na・６H2O溶液（0.65mg／
ml）1.5mlに酵素溶液0.1mlを加え37℃で反応し、505nm
の吸光度を測定する。１分間に１μmoleのH2O2を生成す
るのに要する酵素量を１単位とする。
ダーゼ活性測定法 発色試薬（アミノアンチピリン0.6mg／ml、フェノール
1.5mg／ml及びペルオキシダーゼ４単位／ml）1.5ml、pH
７のDL−α−グリセロリン酸２Na・６H2O溶液（0.65mg／
ml）1.5mlに酵素溶液0.1mlを加え37℃で反応し、505nm
の吸光度を測定する。１分間に１μmoleのH2O2を生成す
るのに要する酵素量を１単位とする。
【００３３】グリセロールキナーゼ活性測定法 ATP-2Na（３mg／ml）１ml、pH9.8のβ-NAD+溶液（１mg
／ml）１ml、グリセロール溶液（9.2mg／ml）１ml及びG
-3PDH（1700単位／ml）0.02mlに酵素溶液0.1mlを加え25
℃で反応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μm
oleのNADHを生成するのに要する酵素量を１単位とす
る。
／ml）１ml、グリセロール溶液（9.2mg／ml）１ml及びG
-3PDH（1700単位／ml）0.02mlに酵素溶液0.1mlを加え25
℃で反応し、340nmの吸光度を測定する。１分間に１μm
oleのNADHを生成するのに要する酵素量を１単位とす
る。
【００３４】
実施例１ コレステロールデヒドロゲナーゼのクリスタ
リンによる安定化効果 以下の試薬組成において37℃でのコレステロールデヒド
ロゲナーゼの安定性を測定した。 酵素：ＣＨＤＨ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM HEPES緩衝液（pH7.5） ５mM β−NAD+ ５mM コール酸ナトリウム １mM ＥＤＴＡ 0.1% トリトンX-100 0.05% アジ化ナトリウム クリスタリンの添加量：コレステロールデヒドロゲナー
ゼの1/10モル量 測定時間：１〜４時間 その結果を表１に示す。
リンによる安定化効果 以下の試薬組成において37℃でのコレステロールデヒド
ロゲナーゼの安定性を測定した。 酵素：ＣＨＤＨ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM HEPES緩衝液（pH7.5） ５mM β−NAD+ ５mM コール酸ナトリウム １mM ＥＤＴＡ 0.1% トリトンX-100 0.05% アジ化ナトリウム クリスタリンの添加量：コレステロールデヒドロゲナー
ゼの1/10モル量 測定時間：１〜４時間 その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】明らかにクリスタリンを添加することによ
ってコレステロールデヒドロゲナーゼの活性が安定化さ
れている。また、クリスタリンが添加されていない試料
溶液は濁りを生じたが、クリスタリンを添加した試料溶
液については全く濁りの生成は認められなかった。
ってコレステロールデヒドロゲナーゼの活性が安定化さ
れている。また、クリスタリンが添加されていない試料
溶液は濁りを生じたが、クリスタリンを添加した試料溶
液については全く濁りの生成は認められなかった。
【００３７】実施例２ Ｌ−α−グリセロフォスフェー
トオキシダーゼのクリスタリンによる安定化効果 以下の試薬組成において37℃でのＬ−α−グリセロフォ
スフェートオキシダーゼの安定性を測定した。 酵素：ＧＰＯ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM PIPES緩衝液（pH6.5） １mM ＥＤＴＡ 0.1% トリトンX-100 0.02% アジ化ナトリウム 0.02% デヒドロ酢酸ナトリウム クリスタリンの添加量：Ｌ−α−グリセロフォスフェー
トオキシダーゼの1/10モル量 測定時間：１〜６日 その結果を表２に示す。
トオキシダーゼのクリスタリンによる安定化効果 以下の試薬組成において37℃でのＬ−α−グリセロフォ
スフェートオキシダーゼの安定性を測定した。 酵素：ＧＰＯ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM PIPES緩衝液（pH6.5） １mM ＥＤＴＡ 0.1% トリトンX-100 0.02% アジ化ナトリウム 0.02% デヒドロ酢酸ナトリウム クリスタリンの添加量：Ｌ−α−グリセロフォスフェー
トオキシダーゼの1/10モル量 測定時間：１〜６日 その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】明らかにクリスタリンを添加することによ
ってＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの活
性が安定化されている。
ってＬ−α−グリセロフォスフェートオキシダーゼの活
性が安定化されている。
【００４０】実施例３ コレステロールエステラーゼの
クリスタリンによる安定化効果 以下の試薬組成において37℃でのコレステロールエステ
ラーゼの安定性を測定した。 酵素：ＣＨＥ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM PIPES緩衝液（pH6.8） １mM ＥＤＴＡ 0.1% エマルゲン709 0.08% デヒドロ酢酸ナトリウム 10mM 酢酸マグネシウム 上記の試薬組成に10mMのコール酸ナトリウムを加えた場
合と10mMのコール酸ナトリウムとクリスタリンを1/10Ｍ
添加した場合を比較した。 測定時間：１〜３日 その結果を表３に示す。
クリスタリンによる安定化効果 以下の試薬組成において37℃でのコレステロールエステ
ラーゼの安定性を測定した。 酵素：ＣＨＥ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM PIPES緩衝液（pH6.8） １mM ＥＤＴＡ 0.1% エマルゲン709 0.08% デヒドロ酢酸ナトリウム 10mM 酢酸マグネシウム 上記の試薬組成に10mMのコール酸ナトリウムを加えた場
合と10mMのコール酸ナトリウムとクリスタリンを1/10Ｍ
添加した場合を比較した。 測定時間：１〜３日 その結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】クリスタリンを添加することによってコー
ル酸ナトリウム添加によるコレステロールエステラーゼ
の活性低下を防止することができることが明らかであ
る。
ル酸ナトリウム添加によるコレステロールエステラーゼ
の活性低下を防止することができることが明らかであ
る。
【００４３】実施例４ グリセロールキナーゼ、ペルオ
キシダーゼ及びＬ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼを添加したキット系での各酵素のクリスタリンに
よる37℃での安定化効果 対象として単独の酵素についてクリスタリンの効果を測
定した。 酵素：ＧＫ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） ＧＰＯ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） ＰＯ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM PIPES緩衝液（pH6.5） ３mM ＡＴＰ 1.5mM ＴＯＯＳ 10mM 酢酸マグネシウム １mM ＥＤＴＡ 0.1% エマルゲン７０９ 0.02% アジ化ナトリウム 0.02% デヒドロ酢酸ナトリウム クリスタリンの添加量：各酵素の1/10モル量 測定時間：１〜６日 その結果を表４に示す。
キシダーゼ及びＬ−α−グリセロフォスフェートオキシ
ダーゼを添加したキット系での各酵素のクリスタリンに
よる37℃での安定化効果 対象として単独の酵素についてクリスタリンの効果を測
定した。 酵素：ＧＫ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） ＧＰＯ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） ＰＯ”Ａｍａｎｏ”（天野製薬製） 試薬組成： 50mM PIPES緩衝液（pH6.5） ３mM ＡＴＰ 1.5mM ＴＯＯＳ 10mM 酢酸マグネシウム １mM ＥＤＴＡ 0.1% エマルゲン７０９ 0.02% アジ化ナトリウム 0.02% デヒドロ酢酸ナトリウム クリスタリンの添加量：各酵素の1/10モル量 測定時間：１〜６日 その結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
【００４５】クリスタリンを添加することによって各酵
素は安定化する。グリセロールキナーゼ及びペルオキシ
ダーゼは元来比較的安定なためクリスタリンの効果とし
ては明確にでていない。しかしながら、Ｌ−α−グリセ
ロフォスフェートオキシダーゼついては、実施例２と同
様に試薬組成が変化してもその安定性を改善する効果は
明らかである。
素は安定化する。グリセロールキナーゼ及びペルオキシ
ダーゼは元来比較的安定なためクリスタリンの効果とし
ては明確にでていない。しかしながら、Ｌ−α−グリセ
ロフォスフェートオキシダーゼついては、実施例２と同
様に試薬組成が変化してもその安定性を改善する効果は
明らかである。
【００４６】上記の各酵素を配合したキット系の処方に
おけるクリスタリンの効果を測定した。使用した酵素及
び試薬組成は上記と同一にした。尚、クリスタリンの添
加量は酵素総量の1/10モル量とした。その結果を表５に
示す。
おけるクリスタリンの効果を測定した。使用した酵素及
び試薬組成は上記と同一にした。尚、クリスタリンの添
加量は酵素総量の1/10モル量とした。その結果を表５に
示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】クリスタリンを添加しないキット系におい
ては配合した酵素が相互に作用し、クリスタリンを添加
しない場合の酵素単独の場合よりも酵素の安定性が低下
している。それと比較して、クリスタリンを添加したキ
ット系では酵素単独にクリスタリンを添加する効果と同
様な安定性が得られる。更に、ＡＴＰなどの安定性も改
善されている。
ては配合した酵素が相互に作用し、クリスタリンを添加
しない場合の酵素単独の場合よりも酵素の安定性が低下
している。それと比較して、クリスタリンを添加したキ
ット系では酵素単独にクリスタリンを添加する効果と同
様な安定性が得られる。更に、ＡＴＰなどの安定性も改
善されている。
【００４９】
【発明の効果】本発明により生理活性蛋白質の安定性が
改善され、更に各々の酵素が相互に及ぼす影響も回避す
ることができ、臨床検査分野に用いる臨床検査用の酵素
試薬の液状での安定性を改善することができる。また、
クリスタリンは測定系に影響を及ぼさないため、いずれ
の系にも安定剤として広く使用することができる。
改善され、更に各々の酵素が相互に及ぼす影響も回避す
ることができ、臨床検査分野に用いる臨床検査用の酵素
試薬の液状での安定性を改善することができる。また、
クリスタリンは測定系に影響を及ぼさないため、いずれ
の系にも安定剤として広く使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/34 6807−4Ｂ 1/48 Ｚ 6807−4Ｂ
Claims (9)
- 【請求項１】生理活性蛋白質或いは生理活性ペプチドに
クリスタリンを含有せしめることを特徴とする生理活性
蛋白質の安定化方法。 - 【請求項２】酵素にクリスタリンを含有せしめることを
特徴とする酵素活性の安定化方法。 - 【請求項３】酵素溶液にクリスタリンを含有せしめるこ
とを特徴とする、該溶液中の酵素活性の安定化方法。 - 【請求項４】クリスタリンがα−クリスタリンである請
求項１乃至請求項３記載の安定化方法。 - 【請求項５】クリスタリンを含有する安定な生理活性蛋
白質組成物。 - 【請求項６】クリスタリンを含有する安定な生理活性ペ
プチド組成物。 - 【請求項７】クリスタリンを含有する安定な酵素組成
物。 - 【請求項８】クリスタリンを含有する安定な臨床検査用
試薬組成物。 - 【請求項９】クリスタリンがα−クリスタリンである請
求項５乃至請求項９記載の組成物。
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|---|---|---|---|
| JP05525394A JP3696267B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | 生理活性蛋白質の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05525394A JP3696267B2 (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | 生理活性蛋白質の安定化方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07236483A true JPH07236483A (ja) | 1995-09-12 |
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Family
ID=12993438
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|---|---|
| JP (1) | JP3696267B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09313178A (ja) * | 1996-05-29 | 1997-12-09 | Internatl Reagents Corp | 酵素の安定化方法及び酵素組成物 |
| JP2005176834A (ja) * | 2003-11-28 | 2005-07-07 | Sysmex Corp | コレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素酵素含有組成物及びコレステロール測定試薬 |
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| CN113660953A (zh) * | 2019-04-01 | 2021-11-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于稳定含蛋白质制剂的组合物和方法 |
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| JP2011241206A (ja) | 2010-04-23 | 2011-12-01 | Arkray Inc | 標識抗体の安定化方法 |
-
1994
- 1994-02-28 JP JP05525394A patent/JP3696267B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09313178A (ja) * | 1996-05-29 | 1997-12-09 | Internatl Reagents Corp | 酵素の安定化方法及び酵素組成物 |
| JP2005176834A (ja) * | 2003-11-28 | 2005-07-07 | Sysmex Corp | コレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素酵素含有組成物及びコレステロール測定試薬 |
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| EA017436B1 (ru) * | 2006-04-26 | 2012-12-28 | УАЙТ ЭлЭлСи | Новые составы, стабилизирующие иммуногенные композиции и ингибирующие их осаждение |
| US8562999B2 (en) | 2006-04-26 | 2013-10-22 | Wyeth Llc | Formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
| US8883146B2 (en) | 2007-11-30 | 2014-11-11 | Abbvie Inc. | Protein formulations and methods of making same |
| US9085619B2 (en) | 2007-11-30 | 2015-07-21 | Abbvie Biotechnology Ltd. | Anti-TNF antibody formulations |
| US11167030B2 (en) | 2007-11-30 | 2021-11-09 | Abbvie Biotechnology Ltd | Protein formulations and methods of making same |
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| JP3696267B2 (ja) | 2005-09-14 |
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