JPH0118719B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、安定な酵素試薬の製造法に関する。

近時、生化学及び臨床化学の著しい進歩にとも
なつて、体液、たとえば尿や血液中の各種成分を
酵素を用いて分析する方法が繁用されている。た
とえば肝機能検査において下記式（）および
（）の原理により血液中のGPT（グルタミン酸
−ピルビン酸トランスアミナーゼ）やGOT（グル
タミン酸−オキザル酢酸トランスアミナーゼ）を
測定する方法がある。

（ただし、NADはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドであり、NADHは還元型NADであ
る。） この場合、連結酵素である乳酸脱水素酵素やリ
ンゴ酸脱水素酵素及び補酵素NADHは、あらか
じめ凍結乾燥した形態で供給されるのが一般的で
ある。よく知られているようにこれらの酵素や補
酵素は不安定な物質で、凍結乾燥時及び保存中に
一部失活する。そのため酵素試薬の凍結乾燥時に
各種添加物を添加して、安定化をはかる方法が
種々提案されている。たとえば牛血清アルブミン
をはじめ、キレート試薬、チオール類、マンニツ
ト（特開昭49−127635号公報）などがある。

しかしながら、これら公知の安定化剤は充分な
安定効果が得られなかつたり、安定化剤中に混在
する不純物質のために測定が妨げられたり、溶解
した際に濁りが生じる等の欠点がある。本発明
は、上記の欠点を改善するべく種々の添加剤を検
討し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ウレアーゼ、グルタミン
酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、グルコースオキ
シターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、
コレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵
素、リポプロテインリパーゼ、グリセロキナー
ゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ロ
イシンアミノペプチダーゼ、ウリカーゼ及びパー
オキシターゼより選択される１種又は２種以上の
酵素含有液に、ゼラチンを80〜120℃で５〜20分
間加熱して得られる加熱変性ゼラチン（以下、
「変性ゼラチン」という）を添加して凍結乾燥す
ることを特徴とする安定な酵素試薬の製造法に関
する。

本発明の酵素としては、ウレアーゼ、グルタミ
ン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、コレステロールエステラーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水
素酵素、リポプロテインリパーゼ、グリセロキナ
ーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、
ロイシンアミノペプチダーゼ、ウリカーゼ及びパ
ーオキシダーゼがあり、これらは目的に応じ二種
以上を併用することができる。また、目的に応
じ、補酵素が共存していてもよい。

上記酵素は一般に緩衝液に溶解して酵素含有液
とされる。緩衝液は特に制限がなく、使用する酵
素に応じて適宜選択される。例えば、リン酸塩
（一水素リン酸塩と二水素リン酸塩の組合せ、塩
としてはNa塩、Ｋ塩等がある）、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンと塩酸の組合せ、ピペ
ラジン−Ｎ、N′−ビス（２−エタンスルホン酸）
と水酸化ナトリウムの組合せ、バルビタールとそ
の塩（Na塩、Ｋ塩等）の組合せ等の緩衝剤の水
溶液がある。

酵素含有液における酵素の濃度は任意であり、
酵素が溶解した状態が好ましい。

本発明の変性ゼラチンは、ゼラチンの水溶液を
加熱処理して変性されたものであり、この処理に
より、冷却してもゲル化しない。上記加熱処理
は、約80〜120℃で、５〜20分間加熱することに
より行なうことができる。このようにして得られ
る変性ゼラチンは、平均分子量が約5000〜10000
である。変性ゼラチンは凍結乾燥後の乾燥粉末中
に好ましくは５〜80重量％、特に好ましくは、10
〜60重量％になるように使用される。変性ゼラチ
ンが少なすぎると安定化の効果が小さくなり、多
すぎると乾燥粉末を溶解するのに時間がかかるよ
うになる。変性ゼラチンは、水溶液の形で使用し
てもよい。

また変性ゼラチンの添加時期は酵素溶液の調合
時に添加すればよく、そののち凍結乾燥する。凍
結乾燥は酵素含有液を凍結した状態で減圧下に静
置すればよく、公知の方法で実施すればよい。

以上、本発明により得られた酵素試薬は凍結乾
燥時及び保存中の酵素の失活が少なく長期安定性
を有し、溶解性にすぐれる。

また、変性ゼラチンは分析精度に影響しない。

実施例 １ 乳酸脱水素酵素（LDH、豚心臓由来）
6300単位 リンゴ酸脱水素酵素（MDH、豚心臓由来）
6300単位 NADH（二ナトリウム塩） 1.2g 変性ゼラチン（ゼラチン水溶液を100℃で20分
間加熱処理して得たもの） 3.0g 上記材料を0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン−塩酸緩衝液（PH7.8）に溶解し、
容量を100mlとした。この溶液１mlをバイアル瓶
に分注し、溶液を凍結させて、0.05〜0.08トル
（Torr）、棚温度25℃で凍結乾燥し、凍結乾燥後
N₂ガスを充填し、ゴム栓で密封した。変性ゼラ
チンの量は乾燥物中約60重量％である。

得られた酵素試薬の安定性を検討するため、37
℃の恒温器に保存し、一週間ごとの酵素及び補酵
素の残存率を調べた。その結果を第１〜３図に示
す。

上記酵素試薬を200mMのＬ−アスパラギン酸
を含有する80mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン−塩酸緩衝液（PH7.8）100mlに溶解し
ようとしたところ、酵素試薬の溶解性が良く、透
明な液になつた。

比較例 １ 実施例１において、変性ゼラチンの代りに牛血
清アルブミン3gを用いて同様に製剤した酵素試
薬の酵素及び補酵素の残存率を調べた。

第１図は、実施例１および比較例１における酵
素試薬（いずれも、GOT測定用酵素試薬）の
LDH残存率を示し、第２図は同様のMGH残存率
および第３図は同様のNADH残存率を示す。

いずれの場合も実施例１の酵素試薬のグラフ
１，３および５は、それぞれ、比較例１の酵素試
薬のグラフ２，４および６よりも上位になり、本
発明により得られる酵素試薬の安定性が優れるこ
とを示す。

なお、LDHの残存率はハンス・ウルリツヒ・
ベルグマイヤー（Hans Ulrich Bergmeyer）
編、アカデミツク・プレス（Academic Press）
発行（Methods of Enzymatic Analysis）第480
頁に記載の方法およびMDHの残存率は同第485
頁に記載の方法により測定した。NADHの残存
率は340μmの吸光度により測定した。

比較例 ２ 乳酸脱水素酵素（LDH、豚心臓由来）
6300単位 リンゴ酸脱水素酵素（MDH、豚心臓由来）
6300単位 NADH（二ナトリウム塩） 1.2g 加熱変性していない精製ゼラチン 3.0g 上記材料を実施例１と同様にして酵素試薬を製
造した。

この酵素試薬を200mMのＬ−アスパラギン酸
を含有する80mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン−塩酸緩衝液（PH7.8）100mlに溶解し
ようとしたところ、酵素試薬の溶解性が悪く、濁
つた液になり、実用に供することができなかつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１および比較例１で得られた酵
素試薬を37℃で保存したときの酵素試薬中の乳酸
脱水素酵素（LDH）の残存量、第２図は同じ酵
素試薬中のリンゴ酸脱水素酵素（MDH）の残存
量および第３図は同じ酵素試薬を37℃で保存した
ときの酵素試薬中のNADHの残存量を示すグラ
フである。 符号の説明 １，３，５……実施例１の酵素試
薬に関するグラフ、２，４，６……比較例１の酵
素試薬に関するグラフ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ウレアーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ヘキ
   ソキナーゼ、グルコースオキシターゼ、グルコー
   ス−６−リン酸脱水素酵素、コレステロールエス
   テラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、リンゴ
   酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リポプロテイン
   リパーゼ、グリセロキナーゼ、グリセロール−３
   −リン酸オキシダーゼ、ロイシンアミノペプチダ
   ーゼ、ウリカーゼ及びパーオキシターゼより選択
   される１種又は２種以上の酵素含有液に、ゼラチ
   ンを80〜120℃で５〜20分間加熱して得られる加
   熱変性ゼラチンを添加して凍結乾燥することを特
   徴とする安定な酵素試薬の製造法。