JPH03127988A - 酵素の安定化方法 - Google Patents
酵素の安定化方法Info
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- JPH03127988A JPH03127988A JP26742489A JP26742489A JPH03127988A JP H03127988 A JPH03127988 A JP H03127988A JP 26742489 A JP26742489 A JP 26742489A JP 26742489 A JP26742489 A JP 26742489A JP H03127988 A JPH03127988 A JP H03127988A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はフェニルアラニン脱水素酵素（以下ＰＤＨと略
記する）の凍結乾燥による安定化法に関する。
記する）の凍結乾燥による安定化法に関する。
（従来の技術）
ＰＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下ＮＡＤＨと略記する）を補酵素として、フェニルピル
ビン酸からＬ−フェニルアラニンを一段で合成する酵素
として有用であり、またＬ−フェニルアラニン、アンモ
ニアあるいはフェニルピルビン酸を定量する酵素として
、検査用試薬としても有用な酵素である。また近年は診
断薬分野において、ドライケミストリー等の乾式法が用
いられ、乾燥状態での酵素の安定化が必要とされている
。また種々の濃度に溶解させ使用する場合にも乾燥状態
であることが望ましい。ＰＤＨの溶液状態での安定性は
アサノら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２６２．１
０３４６ （１９８７） ）によって記載されているが
、凍結乾燥状態における安定性に関しては記述されてい
ない。一般に臨床検査用酵素、例えば、グルタミン酸脱
水素酵素、ヘキソキナーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコース−６−リン酸脱水素醇素、リンゴ酸脱水素酵
素、乳酸脱水素酵素、グリセロールキナーゼ、ロイシン
アミノペプチダーゼ等の酵素は不安定で、凍結乾燥中お
よび、保存中に一部失活することが知られている。
下ＮＡＤＨと略記する）を補酵素として、フェニルピル
ビン酸からＬ−フェニルアラニンを一段で合成する酵素
として有用であり、またＬ−フェニルアラニン、アンモ
ニアあるいはフェニルピルビン酸を定量する酵素として
、検査用試薬としても有用な酵素である。また近年は診
断薬分野において、ドライケミストリー等の乾式法が用
いられ、乾燥状態での酵素の安定化が必要とされている
。また種々の濃度に溶解させ使用する場合にも乾燥状態
であることが望ましい。ＰＤＨの溶液状態での安定性は
アサノら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２６２．１
０３４６ （１９８７） ）によって記載されているが
、凍結乾燥状態における安定性に関しては記述されてい
ない。一般に臨床検査用酵素、例えば、グルタミン酸脱
水素酵素、ヘキソキナーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコース−６−リン酸脱水素醇素、リンゴ酸脱水素酵
素、乳酸脱水素酵素、グリセロールキナーゼ、ロイシン
アミノペプチダーゼ等の酵素は不安定で、凍結乾燥中お
よび、保存中に一部失活することが知られている。
そのため酵素試薬を凍結乾燥する場合、種々添加物を添
加し安定化を図る方法が提案されている。例えば、熱変
性ゼラチンを添加し、凍結乾燥する方法（特公平１−１
８７１９） 、乳糖を加えて凍結乾燥し安定化する方法
（特開昭６３−２６９９８１）リン脂質を添加して乾燥
し安定化する方法（特公平１−２７７１９）、フラビン
含有物質をグリセロリン酸オキシダーゼに添加し凍結乾
燥する方法（特開昭６３−２６３０８２）等があげられ
る。
加し安定化を図る方法が提案されている。例えば、熱変
性ゼラチンを添加し、凍結乾燥する方法（特公平１−１
８７１９） 、乳糖を加えて凍結乾燥し安定化する方法
（特開昭６３−２６９９８１）リン脂質を添加して乾燥
し安定化する方法（特公平１−２７７１９）、フラビン
含有物質をグリセロリン酸オキシダーゼに添加し凍結乾
燥する方法（特開昭６３−２６３０８２）等があげられ
る。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、ＰＤＨの凍結乾燥時においては上記の添
加剤の添加のみでは溶解時に酵素の変性により不溶性の
濁りが生じさらに活性の低下が生ずる等、充分な効果が
得られない。
加剤の添加のみでは溶解時に酵素の変性により不溶性の
濁りが生じさらに活性の低下が生ずる等、充分な効果が
得られない。
（発明を解決するための手段〉
そこで本発明者らは、添加物を種々検討したＭｌ、ＰＤ
Ｈにポリビニルピロリドンと、ゼラチンおよび／または
Ｄ−フルクトースを添加することにより、ＰＤＨの凍結
乾燥時において、直後の活性低下をおこさず、また室温
における安定性が長時間保持されることを見い出し本発
明を完成した。即ち本発明は、Ｐ Ｄ Ｈ含有液にポリ
ビニルピロリドンと、ゼラチンおよび／またはＤ−フル
クトースとの混合した安定化剤を添加し、凍結乾燥する
ことを特徴とする酵素試剤の安定化法を提供するもので
ある。
Ｈにポリビニルピロリドンと、ゼラチンおよび／または
Ｄ−フルクトースを添加することにより、ＰＤＨの凍結
乾燥時において、直後の活性低下をおこさず、また室温
における安定性が長時間保持されることを見い出し本発
明を完成した。即ち本発明は、Ｐ Ｄ Ｈ含有液にポリ
ビニルピロリドンと、ゼラチンおよび／またはＤ−フル
クトースとの混合した安定化剤を添加し、凍結乾燥する
ことを特徴とする酵素試剤の安定化法を提供するもので
ある。
本発明の酵素ＰＤＨはバシルス スフエリカス（Ｂ ａ
ｃ ｉ １１ ｕ ｓ 並り旦二…） （特開昭６１
−２３９８８８）およびパシルス パディウス （Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）（特開昭６３−３２４８
２）等微生物由来の酵素であり、用途によっては補酵素
が共存してもよい。酵素含有液は、一般にリン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン塩酸塩等の緩衝液０．ＯＩＭ−０，１Ｍ
（ｐｌ＋ ６〜９〉、好ましくは、０．０１〜０．０５
Ｍ、 ｐｌ＋ ６．５〜７．５に調製した緩衝液に、酵
素濃度０．０１〜１００■／ｍｌ、好ましくは０．１〜
１０■／−で溶解して用いる。
ｃ ｉ １１ ｕ ｓ 並り旦二…） （特開昭６１
−２３９８８８）およびパシルス パディウス （Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）（特開昭６３−３２４８
２）等微生物由来の酵素であり、用途によっては補酵素
が共存してもよい。酵素含有液は、一般にリン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン塩酸塩等の緩衝液０．ＯＩＭ−０，１Ｍ
（ｐｌ＋ ６〜９〉、好ましくは、０．０１〜０．０５
Ｍ、 ｐｌ＋ ６．５〜７．５に調製した緩衝液に、酵
素濃度０．０１〜１００■／ｍｌ、好ましくは０．１〜
１０■／−で溶解して用いる。
本発明における安定化剤はポリビニルピロリドンとゼラ
チンおよび／またはＤ−フルクトースでポリビニルピロ
リドンは分子量２０，０００〜８０．０００の市販品を
そのまま用い、酵素に対して０．５〜１０重量倍用いれ
ばよい。
チンおよび／またはＤ−フルクトースでポリビニルピロ
リドンは分子量２０，０００〜８０．０００の市販品を
そのまま用い、酵素に対して０．５〜１０重量倍用いれ
ばよい。
またゼラチンは同様に酵素に対して０．５〜１０重量倍
用いる。Ｄ−フルクトースについても同様に酵素に対し
て０．５〜１０重量倍の範囲で用いる。添加量が上記範
囲より少ないと所望の安定化が図られず、上記範囲より
多くても格別の利点はなく経済的に不利となる。これら
の添加剤はいずれも水溶液の状態で酵素溶液と混合し、
凍結状態のまま常法に従い乾燥を行い、ポリビニルピロ
リドンとゼラチン、ポリビニルピロリドンとＤ−フルク
トースの組合せ、または、３者を混合して用いることが
できる。ポリビニルピロリドンの混合添加物中の組成は
ポリビニルピロリドンが２０〜８０重量％であればよい
。
用いる。Ｄ−フルクトースについても同様に酵素に対し
て０．５〜１０重量倍の範囲で用いる。添加量が上記範
囲より少ないと所望の安定化が図られず、上記範囲より
多くても格別の利点はなく経済的に不利となる。これら
の添加剤はいずれも水溶液の状態で酵素溶液と混合し、
凍結状態のまま常法に従い乾燥を行い、ポリビニルピロ
リドンとゼラチン、ポリビニルピロリドンとＤ−フルク
トースの組合せ、または、３者を混合して用いることが
できる。ポリビニルピロリドンの混合添加物中の組成は
ポリビニルピロリドンが２０〜８０重量％であればよい
。
２０重量％以下ではＤ−フルクトースとの混合系で安定
性が低下し、８０重量％以上の添加では室温保存では問
題はないが低温下ではその効果が低下する。
性が低下し、８０重量％以上の添加では室温保存では問
題はないが低温下ではその効果が低下する。
保存は室温もしくは４℃以下の低温保存が好ましく、特
にポリビニルピロリドンとＤ−フルクトースの系では４
℃以下の低温に保存することにより、長期間の安定性が
確保できる。またこの添加系においてはタンパク性の添
加剤が含まれていないため比活性の低下が生じないこと
、さらに溶解が容易であることという利点がある。
にポリビニルピロリドンとＤ−フルクトースの系では４
℃以下の低温に保存することにより、長期間の安定性が
確保できる。またこの添加系においてはタンパク性の添
加剤が含まれていないため比活性の低下が生じないこと
、さらに溶解が容易であることという利点がある。
以上、本発明により得られたＰＤＨは凍結乾燥時および
保存中の酵素の活性の低下が抑えられ長期間の安定性が
維持され、加えて溶解性の低下が生じない。
保存中の酵素の活性の低下が抑えられ長期間の安定性が
維持され、加えて溶解性の低下が生じない。
次に実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定され
るものではない。
るものではない。
実施例１
バシルス スフエリカス（Ｂ ａ ｃ ｉ Ｉ ｌ ｕ
ｓ 狸り牡紅用）由来ＰＤＨ２５μｇにポリビニルピ
ロリドン（Ｐ）とゼラチン（Ｇ）をそれぞれ１２５μｇ
ずつ添加し、０．０５Ｍ ＋） ン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）’ｔ’全量０．１ｄとした後、−２０℃に
冷却凍結後、４時間０．１〜０．２トル（Ｔｏｒｒ）の
真空下凍結乾燥を行なった。溶液状態と乾燥直後の酵素
活性を測定し、経時的に１．２および４週間後の酵素活
性を測定した。
ｓ 狸り牡紅用）由来ＰＤＨ２５μｇにポリビニルピ
ロリドン（Ｐ）とゼラチン（Ｇ）をそれぞれ１２５μｇ
ずつ添加し、０．０５Ｍ ＋） ン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）’ｔ’全量０．１ｄとした後、−２０℃に
冷却凍結後、４時間０．１〜０．２トル（Ｔｏｒｒ）の
真空下凍結乾燥を行なった。溶液状態と乾燥直後の酵素
活性を測定し、経時的に１．２および４週間後の酵素活
性を測定した。
第１図に３０℃における残存活性（％）の経時変化を示
す（Ｐ／Ｇ）。
す（Ｐ／Ｇ）。
活性：ｌ単位は２５℃において１分間当りＮＡＤＨ１マ
イクロモル増加せしめる酵素量として定義される。
イクロモル増加せしめる酵素量として定義される。
酵素活性の測定は、０．１ＭＬ−グリシンＫＣｌ −Ｋ
ＯＨ（ｐｌ＋ １０．５）、２．５ｍ Ｍ Ｎ Ａ
Ｄ ”および１０ｍＭ Ｌ−フェニルアラニンにサン
プル適当量を加え全量ｌ−とし、対照はＬ−フェニルア
ラニンを除き１Ｗｄｌとし、分光光度計により吸光度３
４０ｎｍの初期増加速度から求めた。
ＯＨ（ｐｌ＋ １０．５）、２．５ｍ Ｍ Ｎ Ａ
Ｄ ”および１０ｍＭ Ｌ−フェニルアラニンにサン
プル適当量を加え全量ｌ−とし、対照はＬ−フェニルア
ラニンを除き１Ｗｄｌとし、分光光度計により吸光度３
４０ｎｍの初期増加速度から求めた。
比較例１
バシルススフエリカス（Ｂ ａ ｃ ｉ Ｉ Ｉ ｕ
ｓ 狸雑肛Ｒｕ）ＰＤＨ２５μｇにゼラチン（Ｇ）３０
０μｇまたはポリビニルピロリドン（Ｐ）３００μｇを
加え実施例１と同様に凍結乾燥し、３０℃における残存
活性（％）の経時変化を求めた。
ｓ 狸雑肛Ｒｕ）ＰＤＨ２５μｇにゼラチン（Ｇ）３０
０μｇまたはポリビニルピロリドン（Ｐ）３００μｇを
加え実施例１と同様に凍結乾燥し、３０℃における残存
活性（％）の経時変化を求めた。
同様にしてＰＤＨ２５０μｇに対してゼラチン（Ｇ）と
Ｄ−フルクトース（Ｆ）を夫々３５０μｇ加え凍結乾燥
後、経時的に残存活性を測定した。
Ｄ−フルクトース（Ｆ）を夫々３５０μｇ加え凍結乾燥
後、経時的に残存活性を測定した。
第１図にゼラチン（Ｇ）とＤ−フルクトース（Ｆ）の混
合、ゼラチン（Ｇ）またはポリビニルピロリドン（Ｐ）
添加の結果を示す。
合、ゼラチン（Ｇ）またはポリビニルピロリドン（Ｐ）
添加の結果を示す。
また対照として、添加剤無添加（Ｎ）の結果を同様にし
て示す。
て示す。
実施例２
バシルススフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ狸田牡丘川）
ＰＤＨ２５用ｇにポリビニルピロリドン（Ｐ）１２５μ
ｇおよびＤ−フルクトース（Ｆ）１２５μｇを加えて実
施例１と同様にして凍結乾燥し、経時的に活性の変化を
測定した。
ＰＤＨ２５用ｇにポリビニルピロリドン（Ｐ）１２５μ
ｇおよびＤ−フルクトース（Ｆ）１２５μｇを加えて実
施例１と同様にして凍結乾燥し、経時的に活性の変化を
測定した。
第２図に（Ｐ／Ｆ）の４℃における残存活性（％）の経
時変化を示す。
時変化を示す。
比較例２
パシルススフェリカス（Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ
ｓ 狸田肛Ｋｕ）ＰＤＨ２５μｇにＤ−フルクトースま
たはポリビニルピロリドン２５０μｇを加え、実施例１
と同様に凍結乾燥し、４℃における残存活性（％）の経
時変化を求めた。
ｓ 狸田肛Ｋｕ）ＰＤＨ２５μｇにＤ−フルクトースま
たはポリビニルピロリドン２５０μｇを加え、実施例１
と同様に凍結乾燥し、４℃における残存活性（％）の経
時変化を求めた。
第２図にＤ−フルクトース（Ｆ）またはポリビニルピロ
リドン（Ｐ）添加の結果を示す。
リドン（Ｐ）添加の結果を示す。
また対照として添加剤無添加（Ｎ）の結果を同様にして
示す。
示す。
実施例３
バシルスバディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ
）由来ＰＤＨ２５μｇにポリビニルピロリドン（Ｐ）と
ゼラチン（Ｇ）それぞれ１２５μｇを加え実施例１と同
様に凍結乾燥を行い、３０℃における残存活性（％）の
経時変化を測定した。
）由来ＰＤＨ２５μｇにポリビニルピロリドン（Ｐ）と
ゼラチン（Ｇ）それぞれ１２５μｇを加え実施例１と同
様に凍結乾燥を行い、３０℃における残存活性（％）の
経時変化を測定した。
第３図（Ｐ／Ｇ）にその結果を示す。
比較例３
バシルス バデイウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕ
ｓ）ＰＤＨ２５μｇにゼラチン（Ｇ）またはポリビニル
ピロリドン（Ｐ）２５０μｇを加え、実施例１と同様に
凍結乾燥を行い、３０℃における残存活性（％）の経時
変化を求めた。
ｓ）ＰＤＨ２５μｇにゼラチン（Ｇ）またはポリビニル
ピロリドン（Ｐ）２５０μｇを加え、実施例１と同様に
凍結乾燥を行い、３０℃における残存活性（％）の経時
変化を求めた。
第３図にゼラチン（Ｇ）またはポリビニルピロリドン（
Ｐ）添加の結果を示す。
Ｐ）添加の結果を示す。
また対照として添加剤無添加（Ｎ）の結果を同様にして
示す。
示す。
実施例４
パシルススフェリカス（Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ Ｉ ｕ
ｓ 耗堕牡に■）Ｐ Ｄ Ｈ（１１、またはバシルスバ
ディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂａｄｉｕｓ） Ｐ Ｄ
Ｈ（２）のそれぞれ２５μｇに対してポリビニルピロ
リドン（Ｐ）、ゼラチン（Ｇ）およびＤ−フルクトース
（Ｆ）の３種の添加剤それぞれ８０μｇずつを加え、常
法に従い凍結乾燥を行い、乾燥直後４℃に保存して、ｌ
、および３週間後の残存活性を測定した。
ｓ 耗堕牡に■）Ｐ Ｄ Ｈ（１１、またはバシルスバ
ディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂａｄｉｕｓ） Ｐ Ｄ
Ｈ（２）のそれぞれ２５μｇに対してポリビニルピロ
リドン（Ｐ）、ゼラチン（Ｇ）およびＤ−フルクトース
（Ｆ）の３種の添加剤それぞれ８０μｇずつを加え、常
法に従い凍結乾燥を行い、乾燥直後４℃に保存して、ｌ
、および３週間後の残存活性を測定した。
その結果を第４図に示す。
（発明の効果）
本発明では上記安定剤の使用により、凍結乾燥における
フェニルアラニン脱水素解毒の活性低下を防止し、安定
性を保持せしめることができるものである。
フェニルアラニン脱水素解毒の活性低下を防止し、安定
性を保持せしめることができるものである。
４、
図面の説明
第１図〜第４図はＰ Ｄ Ｈの残存活性の経時変化を示
すグラフである。
すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）フェニルアラニン脱水素酵素をポリビニルピロリド
ンとゼラチンおよび／またはＤ−フルクトースとの混合
した安定剤を加えて、凍結乾燥することを特徴とする酵
素の安定化方法。 ２）フェニルアラニン脱水素酵素がバシルススフェリカ
ス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ￥）
およびバシルスバディウス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ｂ
ａｄｉｕｓ￥）由来である、請求項１記載の安定化方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26742489A JPH03127988A (ja) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | 酵素の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26742489A JPH03127988A (ja) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | 酵素の安定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03127988A true JPH03127988A (ja) | 1991-05-31 |
Family
ID=17444656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26742489A Pending JPH03127988A (ja) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | 酵素の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03127988A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994029424A1 (en) * | 1993-06-07 | 1994-12-22 | Buckman Laboratories International, Inc. | Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions |
| KR100346180B1 (ko) * | 1999-07-14 | 2002-07-26 | 제일제당주식회사 | 효소의 안정성 및 활성 증진방법 및 조성물 |
-
1989
- 1989-10-13 JP JP26742489A patent/JPH03127988A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994029424A1 (en) * | 1993-06-07 | 1994-12-22 | Buckman Laboratories International, Inc. | Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions |
| KR100346180B1 (ko) * | 1999-07-14 | 2002-07-26 | 제일제당주식회사 | 효소의 안정성 및 활성 증진방법 및 조성물 |
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