JPH0147999B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、一般に水性媒体中で不安定なレイビ
ル酵素及び助酵素を含有する、生化学的診断測定
に使用される組成物の安定化方法に関するもので
ある。 現在、商業ベースで行なわれている酵素又は助
酵素の反応能力を安定化させる方法は、主として
製薬等の工業で乾燥粉を錠剤化するときに用いら
れる凍結乾燥又は乾燥混合によつて、ソリツドマ
トリツクスに酵素等を固定化するものとソリツド
マトリツクス中に酵素の化学構造を固定化するも
のである。これらの方法は、実際的でも望ましい
ものでもないし、コストが高くつく不具合もあ
る。メーカーは水分を除去したり、不完全な製品
を供給せざるを得ないのが現状であり、希釈中の
品質管理工程の部分を放棄したり、決定的な製品
の使用を放棄している。製薬所では、包装、試薬
ロス、凍結乾燥及び乾燥混合に高いコストをかけ
ざるを得ないし、製品の有効性は包装様式とサイ
ズにより更に制約される。 更に、製品の均一を良くすることは困難であ
る。このことは大抵の商業ベースの凍結乾燥の標
準血清のびん間の酵素成分の許容度は平均で±10
％であると記録されていることからも分る。 従つて、本発明では、このような酵素及び助酵
素を、所望時に即座に生化学的診断測定に使用で
きる液状組成物として安定化しうる方法を提供す
ることを目的とする。 本発明に従つて不安定な酵素と助酵素を処理す
ると、その結果、酵素又は助酵素の反応性や光学
的吸収能力に影響を与えることなく長期間安定と
なる。安定な液体状の酵素と助酵素試薬を提供す
ることは現在、他の系統的分類法と同様に
NAD／NADHの一緒になつた系統的分類法の比
色適応能力を高める、これは主にその成分の分離
が容易にできるからである。安定な液体試薬は、
NADHと他の助酵素の消費が測定の基礎であり、
カラー試薬がNADHとその主反応から分離せね
ばならないような時には特に有利である。紫外線
モードでは、液体系は、凍結乾燥又は乾燥媒体の
調整品とくらべて使用の柔軟性があるだけでな
く、薬の均一性と包装性に優れている。 以下に述べたような酵素と助酵素の安定性を与
えるよう計画されている液媒では、一つ又はそれ
以上の助酵素がその媒地の中で、安定化できると
いうように、全く特異な系をとるものである。こ
の他一つ又はそれ以上の酵素がその液体媒地で安
定化される。更に助酵素も酵素も単一容器中で、
同じ溶媒地で安定化される。 酵素及び、又は助酵素の安定性は、蒸留水中に
更に付加的にゼラチンのようなポリマーをとかす
ことでなしとげられてもよい。ゼラチンは主成分
の0.1％Ｖ／Ｖになるように溶解するのがよい。
その後水にとかしたゼラチンをゼラチンが全部溶
けるように約30℃まで加熱する。ある場合には、
殺菌剤としてだけでなく、安定剤としても働くア
ジド化合物を用いてもよい。その後、この溶液を
室温即ち約20℃に冷やすことが必要である。 一つのケースとして、助酵素ニコチンアミド―
アデニン ジヌクレオタイド（NAD）を、PHの
調整のためにトリス（ハイドロキシメチル）アミ
ノメタンのような緩衝剤と共に、この溶液に加え
る。この場合、PHは、望ましいPHは7.5であるが、
約6.0から約8.5の間で調整する。助酵素を添加し
た後で、グリセロールのようなポリオールを約30
％Ｖ／Ｖになるように加える。ポリオールを加え
た後に、PHを再び約7.5になるよう調整する。 本発明によると、一つ以上の助酵素が、上記の
溶媒中で安定化される。この場合助酵素の他のも
のはNADの添加前又は後でも加えることができ
る。例えば、本発明の他の実施例として、アデノ
シン トリフオスフエート（ATP）を他の助酵
素として加えることができる。助酵素を添加し、
液体のPHを調整した後に、例えばヘキソナーゼ
（HK）のような酵素も加えることができる。代
表的な例としては、ヘキソナーゼをグリセロール
サスペンジヨン又は、硫酸アンモニウムサスペン
ジヨンのようなサスペンジヨンにして加えること
ができる。例えば、グルコース―６―フオスフエ
ート デハイドロゲナーゼのような他の酵素も加
えられてもよい。 安定化した液状の酵素及び、又は助酵素溶液を
準備した後、アンバーガラスびんに移し、密封の
状態にシールする。更に、これらのびんは、代表
的な場合には、冷凍下で貯蔵される。安定化した
酵素と助酵素の保存性は、顕著な減成なしに、こ
れらの条件下で４年間までのびる。 本発明を更に詳細に説明する。臨床診断の分野
における本発明の商業的応用は、これに限定され
るものではないが、例えば生物分泌液のグルコー
ス濃度などというように基質濃度を決めるために
用いられる診断試薬で示される。にも拘わらず、
本発明に関連して調整された組成物は、他の生物
的成分を決定し、定量することができる。例えば
生物分泌液中の次のような成分を決定し、定量で
きる。 １ グルタミツク―オキザロアセテイツクトラン
スアミナーゼ（SGOT） ２ グルタミツク―ピルビツク トランスアミナ
ーゼ（SGPT） ３ ラクテイツク デヒドロゲナーゼ（LDH―
Ｐ） ４ ラクテイツク デヒドロゲナーゼ（LDH―
Ｌ） ５ クレアチン フオスフオキナーゼ（CPK） ６ α―ハイドロキシブテイリツク デヒドロゲ
ナーゼ（α―HBD） ７ グルコース（ヘキソナーゼ―Ｇ―６―PDH
経由） これら上述の試薬は、しばしば同じように反応
し、いくつかの共通な不安定成分を含み、そこに
含まれているいくつかは共通している。次の化学
反応式は、含まれる反応の一般的な性質を図示す
るモデルとして示す。 反応式１……一般的モデル (1) 基質酸素１ ――→ ←―― PH生成物（Ｓ） (2) 生成物／基質＋NAD−NADH₂酸素２ ――→ ←―― PH NADH₂＋生成物 (3) NADH₂＋クロモーゲン （酸化物）触媒 ――→ ←―― クロモーゲン （還元物）＋NAD 上にあげたすべての酵素反応は、本発明と一致
して、この一般式に従うであろう。ここでの反応
(2)は、常にカツプリング反応として参照され、反
応(2)又は(3)は、測定反応として、又反応(1)は、初
期反応として特徴づけられる。しかしながら、こ
れら３つのすべての反応が測定に必要なのでな
く、事実それらは、二つ又は一つに限定してもよ
いということが分つている。ラクテイツク デヒ
ドロゲナーゼ（LD）活性の紫外線測定の場合に
は、反応(2)のみが含まれ、下記の通りである。 反応式２……LDH ラクテート＋NADLDH ――→ ←―― NADH₂＋ビルバート 逆に、上述の３つの反応以上のものが、クレア
チン フオスフオキナーゼ（CPK）の場合のよ
うに、含まれるかもしれない。 反応式３……CPK (1) GP＋ADPCPK ――→ ←―― ATPクレアチン (2) ATP＋グルコースグルコース−６−フオ
スフエート＋ADP (3) グルコース−６−フオスフエート ＋NADＧ−６−PDH ――――→ ←――――← NADH₂ (4) NADH₂＋INT （酸化）PMS ――→ ←―― INT （還元）＋NAD 記号： CK＝クレアチン キナーゼ CP＝クレアチン フオスフアーゼ CPK＝クレアチン フオスフエート ADP＝アデノシン―5′―ジフオスフエ
ート AM＝アデノシン モノフオスフエー
ト ATP＝アデノシン トリフオスフエー
ト HK＝ヘキソナーゼ NAD＝ニコチンアミド―アデニン ジ
ヌクレオタイド NADP＝ニコチンアミド―アデニン ジ
ヌクレオタイド フオスフエート NADH₂＝ニコチンアミド―アデニン ジ
ヌクレオタイド 還元形 GLDH＝グルタメート デヒドロゲナー
ゼ Ｇ―６―PDH＝グルコース―６―フオスフエー
ト デヒドロゲナーゼ Ｇ―６―Ｐ＝グルコース―６―フオスフエー
ト INT＝テトラゾリウム塩 PEP＝フオスフオエノール ビルベー
ト PMS＝フエナジン メンサフエート PK＝ビルベート キナーゼ この場合に、反応(2)と(3)はカツプリング反応と
考えられ、反応(3)と(4)は測定反応、そして反応(1)
は初期反応であろう。 反応式１……一般式を参照して、この反応順序
を利用することで、反応基質／生成物か又は触媒
酵素かのいずれかの定量分析をすることができる
ということを明らかとなり、一般に知られてい
る。 生物学の分野におけるこれらの構成要素の定量
化は人又は動物の病状の診断や処置の手段として
広く受け容れられ使用される。 酵素は大きな分子量をもつ複雑な蛋白質分子
で、通常その化学構造は未知のものが多く、現在
その触媒能力と、基質特異性で分類されている。
酵素は単一の基質、又は類似の基質群の反応を触
媒することのできる生物的触媒として再定義され
るであろう。 助酵素はよく定義づけられた構造をもつ低分子
量の生物的化学物質で、その反応又は相互作用
は、特殊な酵素の分析又は反応に必要である。助
酵素は触媒として、その構造又は原子組成に不可
逆的な変化を生じる。助酵素は、臨床分析処置に
非常に有用である。あるものは非常に強い吸光を
もち、その反応は基質に従い化学量論的であり、
それ故、吸光形の出現と消失を測定分析的に追跡
できる。ニコチンアミド―アデニン ジヌクレオ
タイド（NAD）と、その還元形（NADH₂）は、
上述のS.G.O.T.，S.P.G.T.，LDH分析のような
多くの重要な臨床分析に用いられている。NAD
とNADH₂は約700の分子量をもつ非常に複雑な
生物分子である。NADH₂は340nmに強い吸収を
もち、一方NADはこの波長では吸収しない。 基質は既知の構造をもつ有機化合物で、それら
反応物又は相互反応物が酵素によつて触媒され
て、その成分の構造や原子組成や、立体的化学ロ
ーテーシヨンに変化を生じないものである。一般
に基質は、それらがバクテリアや菌類や、他の微
生物の食物として使われて微生物的減成をする傾
向がある。換言すれば、これらの化合物は水媒中
又は、中性に近いPH（PH４から10の範囲）内で安
定を保つ。顕著な基質は、グルコース、ラクテー
ト、又はラクテイツク アシツド グルコネート
などである。 次の反応式は、助酵素ATPとNADを使つて、
グルコースを決定することを図示したものであ
る。 グルコース＋ATPHK ――→ ←―― ―Ｇ−６−Ｐ＋ADP Ｇ−６−Ｐ＋NADＧ−６−PDH ―――――→ ←――――― NADH ＋６−フオスフオグルコ酸 初期反応を起こす酵素はヘキソキナーゼであ
り、そしてカツプル反応及測定反応をおこす酵素
は、Ｇ―６―PDHである。上の反応においてグ
ルコースは測定反応で生じたNADHを測定する
ことで決定される。実際は、この反応は、完全に
終了するまで行ない、生成した助酵素NADHの
量を本質的に測定すればよい。 NADは、水の中と乾燥状態では不安定である
が、湿気のある状態にさらされた時には、
NADH₂から還元されたものほどもう不安定では
ない。従つて、NADH₂は湿気のあるところで保
存しなければならない。一方NADは、本発明に
従つて、水溶液中で容器にパツクでき、安定化さ
れる。酸性PHでは安定性は良いが、アルカリPHで
はNADはこわれやすい傾向がある。正確なメカ
ニズムも、最終生成物も明らかではないが、破壊
されたNADは、もはや助酵素として効果的に働
くことができないということだけで充分だし、必
要な波長で有効な影響ももつていない。 本発明のユニークな利点の一つは、すべての成
分が、一つの試薬びんの中で安定化できるという
ことである。一般に、安定化した酵素又は助酵素
を簡単に述べると二つの重要な価値がある。これ
らの価値の一つは、水媒中で非常に安定性の高い
酵素又は助酵素を供給するということであり、第
二の価値は、可能な限り包装の数を制限できると
いうことである。NADのような助酵素の安定性
について、NADはNADHよりもずつと安定であ
るということが観察されている。それ故、
NADHの場合に、必要な複雑な安定化の技術を
使う必要はない。従つて、すべての試薬は、一つ
の溶液中にパツクできる。 本発明の酵素と助酵素を安定化するに際し、例
えば、ゼラチンのようなポリマーを蒸留水にとか
してもよい。このポリマーは冷凍下で沈澱を生ぜ
ず、均一な混合物でいられる量だけ、安定した溶
液に添加するのが望ましい。このポリマーは、全
組成物に対して、約0.01％から約0.5％の量だけ
存在すべきであり、0.05％から0.25％の範囲が適
当である。本発明に用いられる安定剤として有用
な水溶性ポリマーはいずれも酵素活性を阻害しな
いものであり、かつポリマーマトリツクス中で、
酵素を固定することができるものである。このポ
リマーは、ポリビニールピロリジンのような合成
物質又は、変性したコラーゲンであるゼラチンの
ような生物的に生成したデキストランのような有
機物質であつてもよい。 ポリマーは、一般的に約30℃まで加熱すること
により、水に溶かす。ポリマーの水に対する溶解
度は温度の増加に伴つてふえる。 ポリマーが完全に水にとけたあと、アジド塩の
ようなアジド化合物を加えることができるが、そ
の量は約0.1％Ｗ／Ｗが望ましい。しかしながら
アジド化合物の量は0.01％から約0.5％の範囲で
あつてもよい。アジド化合物は、酵素の安定性を
助けるのにむしろ驚くほどの効果を示すことが、
本発明で見出された。従来はアジド化合物は単に
バクテリアの働きをとめるもの又は殺菌剤として
働くと考えられていた。他の成分とのくみ合わせ
下で、アジド化合物の安定化の完全なメカニズム
は完全には理解されていないが、アジド化合物が
安定性を増すということが確立された。多くの場
合、アジド塩は必要でなく、除去することもでき
る。かくして多くの場合、水媒中のポリマー及び
有機溶媒だけで不安定成分の必要な安定性を与え
るのに充分である。ある二三の場合には、アジド
塩は安定化を妨害したり、例えばグルコースのよ
うな基質に本質的な影響を与える傾向があるの
で、除去しなければならない。 前述に加え、基質と化学的に反応しない又は、
酵素反応を阻害しない他の殺菌剤や殺微剤が採用
される。例えばアジド塩に添加して用いられるこ
れらの殺菌剤等のいくつかは、安息香酸、フエノ
ール、チモール又は、ペンタクロフエノールであ
る。 ある場合には、安定化した組成物を使うとき、
反応の開始を助長するマグネシウムのような金属
を採用するのが望ましい。塩化マグネシウムとい
う塩の形で用いられるマグネシウムは、この目的
のために提供された試薬の一つである。この試薬
は、本発明の安定化した組成物に加えるのでな
く、使用の際に加えるのである。カツプルする酵
素を活性化するこの試薬は、約0.01％から約１％
までの量で使うべきであるが、約0.03％が望まし
い。 このプロセス中のこの時点で、溶液を、水浴中
で約20℃から25℃くらいの室温に冷やす。この溶
液を冷やした後で、トリス（ハイドロキシメチ
ル）アミノメタンのような緩衝剤を加える。代表
的には、この緩衝剤は約50ミリモルから200ミリ
モルの量を加えるが、少くともPHを6.0から約8.5
の範囲内に保つのに充分な量である。他の既知の
緩衝剤及び他の形の緩衝剤がこのプロセスに採用
することができる。ある場合に、緩衝塩をPHを
6.0から8.5の間に維持するのに必要な量だけ加え
る。一般的に、緩衝剤は、0.1から１％のアルカ
リ金属の水酸化物と、0.5から３％のアルカリ金
属の酸性炭酸塩の組み合わせである。全塩容量は
必要とするポリマーの量にも影響される。更に高
い塩容量例えば重量で４％以上では、塩によつて
与えられる静電安定化のためにポリマーの必要量
は少なくなる。しかしながらこの高い塩容量で
は、ポリマーが溶液を濁らせたり、沈澱したりす
るので、再溶解するために、溶液をあたためる必
要がある。 溶液のPHを所望の範囲に調整してから、ATP
又はNAD等のような、最初の助酵素を加える。
この場合、ATPは、全組成物の約0.3ミリモルか
ら約30ミリモルの間で加える。 前述のように、安定化した酵素及び助酵素相方
を含む溶液を形成することができる。このように
して、２以上の助酵素及び２以上の酵素を同一溶
液中で安定化できる。例えば、助酵素ATPは、
ここで述べる方法で安定化される。他方、NAD
も又ここで述べる方法によつて独自に安定化され
る。しかしながら、２以上の助酵素を安定化する
とき、その助酵素は、一般的に同時に加えてもよ
いし、どんな順序で加えてもよい。NADは、全
組成物の約0.6ミリモルから約60ミリモルの範囲
で加えるのが望ましい。 このプロセス中のこの時点で、PHは少くとも
6.5から約8.0以下の範囲に調整するべきであり、
7.5のPHが望ましい。 PH調整後、グリセロールのような適当な有機溶
媒を加える。この場合、25％から40％Ｖ／Ｖの範
囲内であるが、一番望ましいのは、有機溶媒を30
％Ｖ／Ｖ加えることである。しかしながら、有機
溶媒の量は、約５％から70％Ｖ／Ｖの間で変化さ
せうる。 有機溶媒は次の特性をもつべきである。 １ PHが４から10の範囲； ２ 室温又は冷凍温度下で液体であること； ３ 静電気結合（水素結合）を生成する以外は、
NAD又はATP及び同様のものと反応しない； ４ 水と混和しやすい； ５ 加溶媒分解の標準フリーエネルギーが低い
（ノルマルレゾナンスが決つている）。 溶剤は、水にとけ、室温又は冷凍温度下で液体
で、かつ静電気結合を形成する以外は、酵素と助
酵素の反応基と反応して減成しないものでなけれ
ばならない。有効な溶剤は一般に、エーテル類、
ケトン類、スルホン類、スルホキシド類のような
安定な有機溶媒と、メタン、エタノール、プロパ
ノール、ブタノールのようなアルコール類、アセ
トン、ジオキサン、DMSOジメチルスルフオン
及びTHFである。しかしながら、この処理段階
での溶媒の濃度が低いほど高い活性が、液体ポリ
オール溶媒の場合に見出されている。例えば、グ
リセロール、エチレングルコール、プロピレング
ルコール又はプタンジオールのような２ないし４
の水酸基と２ないし10の炭素原子を含む液体ポリ
オール類が望ましい。グリセロール、プロピレ
ン、グルコール、１，２―プロパンジオールは、
これらすべての特性をもつていることが分つてお
り、よりぬきの溶媒である。 選ばれた有機溶媒がポリオールであるとき、ア
ジド化合物や他の殺菌剤をこのために用いる必要
はない。というものは、ポリオールが殺菌剤とし
て有効に働くからである。しかしながら、選ばれ
た溶媒及びポリマーが、水溶液中で必要な安定性
を与えるとはいえ、ポリマーと酵素間のカツプリ
ングを増加すると考えられる限りにおいてはアジ
ド化合物が時として望ましいものである。 グリセロール又は他のポリオールを添加後、で
きた溶液のPHを再調整する。代表的には、PHはわ
ずかに塩基性に傾くので、１規定のHClを添加し
てPHを調整する。同様にして、もしPHがわずかに
酸性になるならば適当な塩基を加えて、PHを7.5
に調整する。 重要なことの一つは、助酵素NADが過剰量存
在するということである。前述のようにグルコー
スの決定は、NADから生成するNADHを測定す
ることで達成される。NADHは、酸性環境では
不安定で、PH６で減成しはじめるし、更に、PH４
では非常にすみやかに減成する。従つて、溶液の
PHは、中性PH７以上を保つべきである。NADは、
酸性環境下で実際には安定であるが、本発明によ
ると、PH7.5のわずかに塩基性の環境下でも本質
的に減成しないことが分つている。NADは、か
なり過剰に加えても、この液体環境下で、数年経
過後にも常に充分な減成しないNADが存在する。 一般にいつて、所望の決定を行なうのに少なく
とも十分な量ですべての助酵素を含ませる。助酵
素の最大量は商業的な実用性によつて制限される
が、本質的に最大量はない。 助酵素を液体溶液に加えた後、選んだ酵素を加
える。助酵素の場合と同様、酵素はどんな順序で
加えてもよい。又１つ又はそれ以上の酵素を同一
の溶液に加えてもよい。本発明による望ましい観
点および、上述の酵素系によると、二つの酵素
は、HKとＧ―６―PDHである。HKはリツトル
当り111l.V.以上加えるのが望ましい（PHが7.6、
25℃）。しかしながら、少なくともリツトル当り
1.000I.U.のHKを加えるのが望ましい。 Ｇ―６―PDHは、Ｌ―メセンテロイド菌から
形成し、リツトル当り約100I.U.から30.000I.U.又
はそれ以上の範囲に濃縮するのが望ましい。本発
明によると、通常PHが約7.8で、25℃で使われる
とき、２つのタイプのＧ―６―PDHの量は約
3.000I.U.が望ましい。 酵素の量は少くともリツトル当り100I.U.（イン
ターナシヨナルユニツト）存在すべきであるが、
大抵の商業ベースの試薬では、酵素例えばヘキソ
ナーゼは、少くともリツトル当り1.000I.U.存在す
べきである。通常の商業ベースの包装品では酵素
はPH7.6で約25℃の温度下で約1.000から10.000I.U.
存在する。しかしながら、通常大抵の場合、酵素
の量は100.000I.U.を越さないものであるが、酵素
の最大量には制限はない。 本発明のプロセスでは、酵素は最終のPHが調整
されたあとで加えるということが重要である。酵
素と助酵素の安定化成就する全メカニズムは、ま
だ完全には分つていないが、基質反応が現実に起
反分子の一部であるか又は他に触媒化される官能
基をその選ばれた溶媒が保護することによつて、
溶媒中の酵素を安定化させると考えられる。更
に、安定化は、酵素と助酵素を微生物的汚染を防
ぎ、かつ減成を防ぐことによつて、得られると考
えられる。助酵素NADは、助酵素NADHと
NADがプロピレングリコールのような溶剤に多
少溶けにくいという点で異つている。しかし、
NADは、水に対し更に安定であり、助酵素はポ
リオールによつて安定化されるようだ。純粋なポ
リオールは、酵素を変性するが、水と溶媒の混合
物のような水溶液の存在下では、酵素は変性しな
い。極性基が安定状態に酵素の活性基を維持する
ために有機溶媒中に必要であるということは明ら
かである。明らかに、酵素及び助酵素は、触媒活
性を保持し、指定濃度に減成しない限りにおい
て、ある形の物理的又は化学的反応が濃縮した水
性有機溶媒中で起つている。 更に、ポリマーは酵素とポリマーの間に静電気
又は共有結合が生じるために、アジド化合物とあ
る形で反応するようだ。実際は、ポリマーは酵素
の活性基をいくらかカプセル化するためにひつぱ
り、それによつて、保護するようである。こうし
て酵素の減成又は、他の形の減成が防止された
り、あるいは起らなくなる。 上述のように、同一溶液中において少なくとも
２以上の助酵素又は２以上の酵素を安定化させる
ことができる。更にもつと重要なことは、同一溶
液で酵素と助酵素双方を安定化することが可能で
あるということである。ポリマーがある程度の安
定効果を持つようだが、有機溶媒の水溶液が助酵
素を安定化する主な要因であると考えられる。酵
素の安定化において、有機溶媒とポリマーの双方
が、安定化を生じる主な要因であるようだ。加え
て、多くの場合、アジド塩が安定性を増すことを
助ける。いずれの場合にも、酵素も助酵素もまた
同一の溶液であることが観察できる。 安定化された酵素及び助酵素組成物で達成され
るその後の反応のいくつかは以下の通りである。
クレアチンのリン酸化を含む反応は次の通りであ
る。 クレアチン＋ATPCK ――→ ←―― CP＋ADP 残る反応はすべて上述の記号表を参照して、自ず
から説明される。NADP反応については、 Ｇ―６―Ｐ＋NAPPＧ−６−PDH ―――――→ ←――――― NADDH ＋６―フオスフオグルコン酸 ADP反応に対しては CP＋CK ――――→ ←―――― PH６−７クレアチン＋ATP 次の反応においては、クレアチン＋ATPの出
発反応がADPを供給するために採用される。従
つて、 ADP＋PEPPK ――→ ←―― ATP＋ビルベール ビルベート＋NADHLPH ――→ ←―― ラクテート ＋NAD 次の反応は、安定化した液体組成物中で、ウレ
アーゼとGLDH酵素を使用した場合を示す。 尿素ウレアーゼ ―――――→ ←――――― PH６−８2NH₄ ⁺＋CO₂ NH₄ ⁺＋α−ケトグルタレート＋NAD GLDH ―――→ ←――― グルタメート＋NADH 本発明はこれに限るものではないが、更に示す
と次のような実施例がある。 実施例 (1) 約0.7ｇのゼラチンポリマーを約700mlの水に加
える。この溶液を、ゼラチンポリマーを溶解する
ために約30℃以上に加熱する。 ポリマー添加後、温度を約22℃に下げるために
水浴に入れる。 それからPHを6.5から8.0の範囲内に調整する。
温度が下がり、PH調整後、約２ｇのATPをこの
溶液に加え、次に４ｇのNADを加える。３ｇの
塩化マグネシウムをNADと共に加える。それか
ら300mlのグリセロールを加える。 グリセロール添加後、PHを１規定の塩酸を添加
して約7.5に調整し、安定化した助酵素組成物を
得た。 この助酵素組成物に酵素ヘキソナーゼを加え、
得られた溶液をガラス容器に移し、密閉して冷凍
下で貯蔵した。このようにして安定化したレイビ
ル酵素を助酵素を含有する溶液は、安定して最高
４年まで貯蔵できた。 実施例 (2) 実施例(1)のサンプルは又、ガラス容器に密閉す
る前に、酵素Ｇ―６―PDHを加えることができ、
保存性も特別な減成なしに同様にながいものが得
られる。 実施例 (3) 安定化したADP，AMD，NAD，HK及びＧ―
６―PDH 約700mlの水、 0.5ｇのゼラチン 加熱溶解 0.7ｇのアジド塩 室温まで冷却 50ｇのクレアチンフオスフエート ４ｇのADP 20ｇのAMP 15ｇのNAD 溶解後、PHを７から９の間で調整 300mlのグリセロール 混合後PHを再調整し、得られた助酵素溶液にリ
ツトル当たり約300I.U.から約15000I.U.のＧ―６
―PDH及びリツトル当たり約100I.U.から約
10000I.U.のHKを加えた。 実施例 (4) NAD及びHKの安定化 1.5ｇのNAD 0.1モルのPH７のピペラジン ビス エタン
スルフオン酸緩衝液の10mlに溶解 PHを６から７に調整 10mlのグリセロールを添加 PHを再調整 ミリグラム当り150I.U.の活性をもつHKを10mg
添加し溶解 実施例 (5) 安定化したクレアチン、ATP，PEP，LDH及
びPK 1.000mlの水 12.1ｇのトリス（ハイドロキシ メチル）アミ
ノメタンを添加 1.0ｇのゼラチンを添加 30℃以上に加熱溶解 室温に冷却 2.0ｇのATPを添加 ２ｇのPEPを添加 10.0ｇのクレアチンを添加 溶解後PHを９に調整 このようにして得た溶液に、リツトル当り100
から10.000I.U.のLDHを加え、そしてリツトル当
り100から10.000I.U.のPKを加え、包装する。 実施例(3)〜(5)で得られた組成物は、各々何ら本
質的な減成もなく、４年近くの長期保存性を有
し、その保存安定性は現在市販されている凍結乾
燥品より以上のものであつた。 次に、本発明を利用した診断測定試薬について
実施例を示す。 実施例 (6) グルコース試薬 それぞれ18〜36ケ月の貯蔵寿命をもつ水象酵素
試率と水性助酵素試薬を用いて、下記の組成から
なる水性複合試薬を作成した。

【表】 この複合溶液は2゜〜８℃で４ケ月、23℃で10日
間安定であつた。 実施例 (7) クレアチン キナーゼ 試薬 クレアチンフオスフエートとグルコースをPH約
9.8の30％Ｖ／Ｖグリセロール水溶液に含む水性
助酵素試薬溶液10容量部と、PH6.0〜6.2の６％グ
リセロール水溶液に酵素を含む水性基質試薬90容
量部を用いて、下記の組成からなる安定な複合試
薬を作成した。（前記助酵素試薬及び基質試薬の
貯蔵寿命はいずれも18〜36ケ月であつた。）

【表】

【表】 この複合試薬は２〜８℃で約２ケ月の貯蔵寿命
を有するものであつた。 実施例 (8) ポリマー含有クレアチン キナーゼ系試薬 下記のCK―UV基質、助酵素及び緩衝剤水溶
液はいずれも２〜８℃で18―36ケ月の貯蔵寿命を
有するものであつた。 １ CK―UV基質：クレアチン フオスフエー
ト300mM；アデノシン―5′―ジフオスフエー
ト（ADP）28mM；アデノシン―5′―モノフオ
スフエート（AMP）25mM；グルコース―６
―フオスフエート デヒドロゲナーゼ（L.メセ
ンテロイド類）≧40000IU／；アジ化ナトリ
ウム１％wgt／Ｖ；グリセロール30容量％。 ２ CK―UV助酵素：ニコチンアミド アデニ
ン ジヌクレオチド（NAD）30mM；アデノ
シン―5′―モノフオスフエート（AMP）
22mM；ヘキソナーゼ（イースト）≧160000I.
U.／（PH8.0）；マグネシウム200mM；グリ
セロール50容量％。 ３ CK―UV緩衝剤：Ｄ―グリコース83mM；
Ｎ―アセチルシステイン12mM；ジチオトレイ
トール65mM；イミダゾール25mM；EDTA、
デキストリン、PH5.3。 容量比１：１：10の割合でこれらを用いて、下
記の組成の複合溶液を作成した。

【表】 複合溶液は２〜８℃で10日間安定であつた。 なお、実施例(6)〜(8)に貯蔵寿命18〜36ケ月とあ
るのは、測定された貯蔵寿命が36ケ月で、市販時
に保証される寿命が18ケ月であることを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ａ 少なくとも生化学的診断測定をするに十
   分な量のニコチンアミド―アデニンジヌクレオ
   タイド、アデノシントリフオスフエート、アデ
   ノシン―5′―ジフオスフエート、ニコチンアミ
   ド―アデニンジヌクレオタイドフオスフエート
   及びアデノシンモノフオスフエートからなる群
   から選ばれる助酵素を、少なくとも室温で液体
   である水混和性の非反応性有機溶媒を５％Ｖ／
   Ｖないし50％Ｖ／Ｖの量で含有する水混和性有
   機溶媒溶液に混合して、水性助酵素溶液を調製
   し、 ｂ そのPHを6.0ないし8.5に調整して、上記助酵
   素を安定化し、更に ｃ この溶液に、グルコース―６―フオスフエー
   トデハイドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グル
   タメイトデハイドロゲナーゼ、クレアチンフオ
   スフオキナーゼ、クレアチンキナーゼ、ピルベ
   ートキナーゼ及びアルカリフオスフアターゼか
   らなる群から選ばれる酵素を少なくとも１当
   たり100I.U.添加するものであり、 上記酵素が最終PH調整後の溶液に添加されるこ
   とを特徴とする、生化学的診断測定において生物
   学的成分の反応性に協同して影響を与える、一般
   に水性媒体中で不安定な酵素及び助酵素を含む、
   生化学的診断測定に使用される組成物を安定化す
   る方法。 ２ 上記ａ）工程の水混和性有機溶媒溶液に、本
   質的に酵素反応を阻害しない水溶解性のポリマー
   が添加されることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法。