SE446742B - Stabiliserad flytande vattenhaltig blandning innehallande enzymer och/eller koenzymer for anvendning vid biologiska och diagnostiska bestemningar samt sett att stabilisera vattenhaltiga enzym- och/eller koenzymhaltiga b - Google Patents

Description

446 742 10 l5 20 25 30 35 2 _ Föremål för uppfinningen Det är därför uppfinningens primära ändamål att åstadkomma en flytande blandning av koenzymer och/eller enzymer som är stabiliserade i en enda behållare.

Det är vidare ett syfte med uppfinningen att åstadkom- ma en labil enzym- och koenzymblandning av den typ som nämnts i ett vattenhaltigt organiskt lösningsmedel och där stabiliseringen av enzym och koenzym icke påverkar den enzymatiska aktiviteten ens efter en väsentlig tids- period.

Ett annat framträdande syfte med uppfinningen är att åstadkomma en metod att stabilisera labila enzymer och/eller koenzymer i närvaro av andra labila koenzymer eller på annat sätt andra labila enzymer, varvid bland- ningen erhåller lång livslängdl Uppfinningen avser sålunda en stabiliserad flytande vattenhaltig blandning för användning vid biologiska diagnostiska bestämningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila i vatten- haltiga media, varvid blandningen uppvisar a) en vattenhaltig bärare innehållande en vatten- löslig polymer, b) minst 100 I.U. per liter enzym löst i den vatten- haltiga bäraren och/eller c) minst tillräcklig mängd koenzym för att i kombi- nation med enzymet möjliggöra en bestämning, varvid koenzymet väljes från den klass som består av nikotinamid- adenin-dinukleotid, adenosin-trifosfat, adenosin-5'-di- fosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och adenosin- monofosfat d) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt, med vatten blandbart organiskt lösningsmedel i den vatten- haltiga bäraren, vilket lösningsmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur och e) ett pH från ca 6,0 till 8,5.

Uppfinningen avser även ett sätt att stabilisera en flytande blandning för användning vid biologiska l0 15 20 25 30 35 446 742 3 _ diagnostiska bestämningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila i vatten- haltiga media, varvid följande steg genomförs: a) blanda vatten med ett vattenblandbart, icke-reak- tivt organiskt lösningmedel för att åstadkomma en lösning av vattenblandbart lösningsmedel, där det organiska lösningsmedlet ingår till en mängd av 5 till 70 volym- procent av lösningen, och vilket organiska lösningsmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur, b) tillsätta en polymer till lösningen av vatten- blandbart organiskt lösningsmedel, c) tillsätta till lösningen åtminstone en sádan mängd per liter av ett labilt koenzym, som är tillräcklig för att utföra en bestämning och som löses i lösningen och samverkar med ett enzym vid en bestämningsreaktion och där koenzymets aktivitet förblir opàverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion, varvid koenzymet väljes från den klass, som består av nikotin- amid-adenindinukleotid, adenosintrifosfat, adenosin-5'- -difosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat och adenosinmonofosfat, dl justera pH till ett område mellan 6,0 och 8,5, så att koenzymet stabiliseras, e) tillsätta minst 100 I.U. per liter av ett labilt enzym till lösningen, vilket enzym löses i lösningen och samverkar vid en bestämningsreaktion och där enzymets och koenzymets aktiviteter förblir opåverkade av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en biologisk diagnostisk bestäm- ningsreaktion och f) försegla blandningen i en behållare.

Sammanfattning av uppfinningen Labila enzymer och koenzymer som behandlas enligt uppfinningen ernàr làngtidsstabilitet utan påverkan av den enzymatiska eller koenzymatiska aktiviteten eller fotometriska absorptionsförmágan. Tillhandahållande 10 15 20 25 30 35 446 742 4 av enzymer och koenzymreagenter i stabil flytande form framhäver den kolorimetriska tillämpligheten av de nuvaran- de, till NAD/NADH kopplade metoderna liksom andra metoder, främst emedan en separation av beståndsdelar lätt utföres.

Stabila flytande reagensmedel är speciellt fördelatkiga, när förbrukningen av NADH och andra koenzymer är grund för mätningen och färgreagensmedlet måste separeras från NADH och huvudreaktionen. I ultraviolett tillstànd er- bjuder det flytande systemet bättre reagenshomogenitet och förpackning liksom flexibilitet vid användningen, i motsats till frystorkade eller torrmedelspreparat.

Det flytande medium som är komponerat för att åstad- komma stabilisering av enzymer och koenzymer och som beskrivs nedan är unikt utbildat, så att en eller flera koenzymer kan stabiliseras i mediet. Dessutom kan ett eller flera enzymer stabiliseras i det flytande mediet.

Ytterligare kan både koenzymer och enzymer stabiliseras i samma flytande media i en enda behållare.

Stabilisering av enzymer och/eller koenzymer utföres genom att lösa en polymer, såsom t ex ett gelatin, i destillerat vatten. Gelatinet löses företrädesvis på en viktbasis av O,l%. Därefter upphettas vatten-gelatin- lösningen till ca 30° för att fullständigt lösa upp gelatinet. I vissa fall kan en azidförening användas, som icke endast tjänar som bakteriostat utan även som stabilisator. Därefter nedkyles denna lösning väsentligen till rumstemperatur eller ca 20°.

I ett fall tillföres koenzymet, nikotinamid-adenin- dinukleotid (NAD) till lösningen tillsammans med en buffertkomponent, såsom t ex en tri(hydroxymety1) aminome- tan, i syfte att justera pH-värdet. I detta fall justeras pH till ungefär mellan 6,0 och 8,5 med föredraget värde på pH av 7,5. Efter tillförsel av koenzymet tillsättes en polyol, såsom t ex glycerol, på ungefärlig volymbasis av 30%. Efter tillförsel av polyolen kan pH-värdet åter justeras till ca 7,5.

Enligt uppfinningen kan mer än ett koenzym stabili- 10 15 20 25 30 35 446 742 5 seras i den ovannämnda lösningen. I detta fall kan det andra koenzymet tillsättas före eller efter tillförsel av NAD. Sá kan t ex vid ett utförande enligt uppfinningen adenosintrifosfat (ATP) tillföras som det andra koenzymet.

Efter tillsättande av koenzymerna och justering av vätskans pH kan ett enzym, som t ex hexokinas (HK), också tillsättas. I ett typiskt fall kan hexokinas till- föras från en suspension, såsom en glycerolsuspension eller en ammoniumsulfatsuspension. Ytterligare enzym kan också tillföras, såsom t ex glykos-6-fosfat-dehydrogenas.

Sedan den flytande stabiliserade enzym- och/eller koenzymlösningen har beretts, dispenseras den pá ambra- färgade glasflaskor, som förseglas lufttätt. Dessa flaskor förvaras dessutom iiqpfallet nedkylda. Den förutsatta livs- längden hos de stabiliserade enzymerna och koenzymerna är under dessa fihhållanden upp till 4 år utan väsentlig ned- brytning.

Detaljerad beskrivning Inom det kliniskt-diagnostiska fältet är den kommer- siella användningen av förevarande uppfinning representerad av men icke begränsad till de diagnostiskareagensmedel som används för att fastställa substratkoncentrationer, såsom t ex glykoskoncentrationer i biologiska vätskor och lik- nande. Icke desto mindre kan blandningar beredda enligt uppfinningen användas för att fastställa och kvantifiera andra biologiska beståndsdelar, som t ex följande bestånds- delar i biologiska vätskor: l. Glutarsyra-oxalättiksyre-transaminas (SGOT) 2. Glutarsyra-pyrodruvsyretransaminas (SGPT) 3. Mjölksyre-dehydrogenas (LDH-P) 4. Mjölksyre-dehydrogenas (LDH-L) 5. Kreatin-fosfokinas (CPK) 6. a-Hydroxi-smörsyre-dehydrogenas (U-HBD) 7. Glykos(via Hexokinas-G-6-PDH).

De ovan angivna reagensmedlen reagerar ofta likartat, innehåller några gemensamma labila ingredienser och några av de ifrågavarande kemiska reaktionerna är gemensamma. 10 15 20 25 30 35 446 742 6 _ Följande kemiska reaktionsschema presenteras som en modell för att illustrera den generella naturen hos ifrågavarande reaktioner: Reaktionsschema 1 - allmän modell: enzym 1 (1) substrat (S) I * produkt (S) pH enzym 2 (2) produkt/substrat + NAD-NADH2 _,_______1 Nwwë-NAD4-praimt katalysator PH (3) NADH2 + kromogen :::::::::::fi kromogen + NAD (oxiderad) (reducerad) Alla de enzymatiska reaktioner som är förtecknade ovan följer enligt uppfinningen detta generella schema, där reaktionen (2) vanligen betecknas som en kopplings- reaktion, reaktionerna (2) eller (3) är mätreaktioner och reaktionen (l) kan betecknas som primärreaktionen.

Emellertid är det underförstått att alla tre reaktionerna icke behövs för mätning; i själva verket kan de begränsas till två eller en. Ifråga om ultraviolett mätning av mjölk- syre-dehydrogenas- (LD)-aktivitet används endast reaktion (2) pà följande sätt.

Reaktíonsschema 2 - LDH _ Lon laktat + NAD T-*-* Omvänt kan flera än de tre angivna reaktionerna er- NADH2 + pyruvat fordras, såsom är fallet vid kreatin-fosfokinas (CPK): Reaktionsschema 3 -CPK CPK (l) CP + ADP ' ' ATP + kreatin HK (2) ATP + glykos ¿_____ glykos-6-fosfat + ADP G-6-PDH (3) glykos-6-fosfat + NAD NADH2 PMS ---+ (4) NADH2 + INT ' INT + NAD (ox) (red) Vid ovanstående reaktionsschema används följande beteckningar: 10 15 20 25 30 35 446 742 7 - CP = kreatin-fosfat CPK = kreatinfosfokinas ADP = adenosin-5'-difosfat AMP = adenosin-monofosfat ATP = adenosin-trifosfat HK = hexokinas NAD = nikotinamid-adenindinukleotid NADP = nikotinamid-adenindinukleotidfosfat NADH2 = nikotinamid-adenindinukleotid, reducerad GLDH = glutamat-dehydrogenas G-6-PDH = glykos-6-fosfat-dehydrogenas G-6-P = glykos-6-fosfat INT = tetrazoliumsalt PEP = fosfoenol-pyruvat PMS = fenazin-metosulfat PK = pyruvat-kinas I detta fall kan reaktionerna (2) och (3) anses som . kopplingsreaktioner, reaktionerna (3) eller (4) mätnings- reaktioner och reaktionen (1) som den primära reaktionen.

Med hänvisning till reaktionsschema 1 - allmän modell - är det tydligt och allmänt känt att användning av reaktions- sekvensen medger analytisk kvantifiering av antingen reak- tionssubstrat/produkter eller de katalyserande enzymerna.

Kvantifieringen av dessa beståndsdelar i biologiska vätskor är ett väl accepterat och omfattande använt diag- nostiskt verktyg vid diagnos och behandling av sjukdoms- tillstånd hos människor och djur.

Enzymer är komplexa proteinmolekyler med hög molekyl- vikt, vanligen av okänd kemisk struktur. De klassificeras f n genom sin katalytiska aktivitet och extrema substrat- karaktär. Enzymer kan åter definieras som biologiska kata- lysatorer med förmåga att katalysera en reaktion hos ett enskilt substrat eller en reaktion hos en liknande grupp substrater.

Koenzymer är organiska kemikalieämnenu med lägre molekylvikt och med väl definierad struktur, vilkas reak- tioner eller samverkan är nödvändiga för specifika enzym- 10 15 20 25 30 35 446 742 8 _ analyser eller reaktioner. Koenzymerna är katalyserade av enzymerna, vilket resulterar i en reversibel förändring i koenzymets struktur och/eller atomiska sammansättning.

Koenzymer är mycket användbara vid kliniska analysproce- durer. Några har stark absorbans, deras reaktioner är stökiometriska med substratet och därför kan skapandet eller försvinnandet av den absorberande formen följas fotometriskt. Nikotinamid-adenindinukleotid (NAD) och dess reducerade form (NADH2) används i många viktiga kli- niska analyser, såsom S.G.O.T., S/P.G.T. och LDH analyser, såsom tidigare beskrivits. NAD och NADH2 har en molekyl- vikt på ca 700 och är mycket komplexa organiska molekyler.

NADH2 har stark absorption vid 340 nm, medan NAD icke har någon absorption vid denna våglängd.

Substrater utgörs av organiska kemikalier med känd struktur, vars reaktioner eller samverkan katalyseras av enzymer och medför en förändring i ämnets struktur, atomiska sammansättning eller stereo-kemiska rotation. I allmänhet är substrat utsatta för mikrobiologisk nedbryt- ning, eftersom de tjänar som föda för bakterier, svampar och andra mikroorganismer. A andra sidan förblir dessa ämnen stabila i vattenhaltiga media vid eller nära neutralt pH (dvs pH inom området 4-10). Typiska substrat är glykos, laktat eller mjölksyra, glukonat och liknande.

Följande reaktioner illpstrerar bestämningen av glykos genom användande av koenzymerna ATP och NAD HK glykos + ATP 'N G-e-P + Anp G-6-PDH G-6~P + NAD ;________* NADH + 6-fosfoglukonsyra Enzymet i den första reaktionen är hexokinas och enzymet i kopplings- och mätningsreaktionen är G-6-PDH.

I ovanstående reaktion bestämmes glykosen genom att mäta det NADH, som bildas vid mätningsreaktionen. I allt väsent- ligt tillåtes reaktionen att fullbordas och man mäter den mängd koenzym NADH2 som bildas.

NAD, som är instabilt i vatten och i torr form när 10 15 20 25 30 35 446 742 9 _ det utsättes för fuktiga omgivningar, är icke pà lángt när sà instabilt som den reducerade formen NADH2. Följakt- 2 hållas fritt från fukt, medan NAD kan förpackas i en behållare med en vattenhaltig lösning, ligen måste NADH fastän stabiliserat i enlighet med uppfinningen. Stabiliteten är bättre i surt pH, medan vid alkaliskt pH finns en tendens, att NAD sönderfaller. Varken den exakta mekanismen eller slutprodukterna är av betydelse, med undantag av det sönder- fallna NAD, som icke längre effektivt kan fungera som ettkoenzym och icke heller nödvändigtvis har någon ut- släckningskoefficient vid den nödvändiga våglängden.

Föreningarna ADP, ATP och AMP föreligger kemiskt i form av nukleotider. Emellertid hänvisas ofta häri till dessa föreningar ADP, ATP och AMP som koenzymer eller kofaktorer, även om de i klassisk betydelse är nukleo- tider. Sålunda hänvisar man häri till ADP, ATP och AMP som koenzymer eller kofaktorer för att anpassa sig till en för dessa föreningar ofta använd nomenklatur och för att de i själva verket utgör en nödvändig och betydelse- full del av en koenzymstrukturl En av uppfinningens unika fördelar är att alla kompo- nenter kan stabiliseras i ett enda reagenskärl. Allmänt sett föreligger två primära övervägande vid sammansättning av stabiliserat enzym eller koenzym. Det första av dessa överväganden är att åstadkomma ett högstabilt enzym eller koenzym i ett flytande medium och det andra övervägandet är att begränsa antalet förpackningar så mycket som möjligt.

Vid stabilisering av koenzymer, sådana som NAD, har man observerat att NAD är mycket mer stabilt än NADH. Följ- aktligen är det icke nödvändigt att använda de komplexa stabiliseringstekniker som erfordras för NADH. I enlighet härmed kan allareagensmedel förpackas i en lösning.

Vid stabiliering av enzymer och koenzymer enligt uppfinningen löses en polymer, som t ex gelatin, i destil- lerat vatten. Polymeren ingår företrädesvis i den stabili- serade lösningen upp till en sådan mängd, att den förblir i homogen lösning under kylning utan att utfällas. Polyme- 10 15 20 25 30 35 446 742 10 ren bör ingå i en mängd av åtminstone ca 0,01% och normält ca 0,5% baserat på hela blandningen och företrädesvis inom ett område på 0,05% till ca 0,25%. De vattenlösliga polymerer som är användbara som stabiliseringsämnen enligt uppfinningen är sådana, som icke inhiberar den enzymatiska aktiviteten och har förmågan att fånga in enzymet i polymer- matrisen. Polymeren kan vara ett syntetiskt eller organiskt ämne, såsom polyvinylpyrrolidin eller dextran av biologiskt ursprung, t ex gelatin som är denaturerad kollagen.

Polymeren kan lösas i vattnet genom uppvärmning, van- ligen till över 30°C. Det förhållande i vilket polymeren kan lösas ökar med ökad temperatur.

Sedan polymeren har lösts fullständigt i vatten, kan en azid, t ex Na-azid, tillsättas, företrädesvis i en mängd på ca 0,1 vikt%. Emellertid kan den mängd azid- komponent, som tillföres, variera från 0,01% till ca 0,5%.

Man har funnit att azidkomponenten uppvisar det ganska överraskande resultatet att hjälpa till att stabilisera enzymerna. Tidigare hade man endast den uppfattningen att azidkomponenten tjänade som bakeriostatiskt ämne.

Fastän den fullständiga mekanismen vid stabilisering med en azidförening i kombination med de andra ämnena icke kan förstås helt, har det framkommit att azídföreningen verkligen åstadkommer ökad stabilitet. I flera fall är azidsaltet icke nödvändigt och kan utelämnas. I många fall är således det polymera och organiska lösningsmedlet i vattenmediet tillräckliga för att åstadkomma önskad stabilisering av de labila komponenterna. I några fall måste azidsaltet utelämnas, såtillvida som det kan ha en tendens att störa stabiliseringen eller på annat sätt i väsentlig grad påverka substratet, t ex glykos.

Utöver vad som sagts tidigare kan man använda andra baktericida eller fungicída ämnen, som icke reagerar kemiskt med substrat eller förhindrar enzymreaktionen. Så kan t ex några av de ämnen som används tillsammans med natriumazid utgöras av bensoesyra, fenol, tymol eller pentaklorfenol.

I några fall kan det vara önskvärt att använda en 10 15 20 25 30 35 446 742 11 _ metall, som t ex magnesium, för att hjälpa till att initiera en reaktion, när den stabiliserade blandningen används.

Magnesium i saltform som magnesiumklorid är ett föredraget ämne för detta ändamål. Detta ämne behöver icke ingå i de stabiliserade blandningarna enligt uppfinningen och kan, om det användes, tillföras vid användningstillfället eller införlivas under beredningen. Detta ämne, som akti- verar kopplingsenzymerna, bör användas i en mängd av ca 0,01% till ca 1% och företrädesvis ca 0,03%.

Vid denna punkt i processen kan lösningen kylas till ungefär rumstemperatur, exempelvis till ca 20°-25°C i ett vattenbad. Sedan lösningen har kylts, kan ett buffertämne, som t ex tri(hydroxymetyl)aminometan tillföras. I ett typiskt fall tillföres detta buffertämne i en mängd av ca 50 millimoler till ca 200 millimoler men åtminstone tillräckligt för att bibehålla pH-värdet inom området 6,0 till ca 8,5. Andra kända buffertämnen och andra former av buffertämnen kan också användas i processen. I några fall kan buffertsalter av den typ, som beskrives nedan, användas. Buffertsaltet tillföres i en mängd som är nöd- vändig för att bibehálla pH-värdet mellan 6,0 och 8,5.

Vanligen är bufferten en kombination av 0,1-1% av en alkalihydroxid och 0,5-3% av ett surt alkalimetallkarbonat eller -fosfat. Den totala saltmängden påverkar också den mängd polymer, som erfordras. Vid högre salthalt, t ex över 4 vikt%, erfordras mindre mängd polymer, beroende på den elektrostatiska stabilisering som åstadkommas av saltet. Vid högre salthalter kan emellertid polymeren grumla lösningen eller falla ut, varvid det är nödvändigt att värma lösninen för att lösa den på nytt.

Sedan lösningens pH har justerats till önskat omrâde, kan det första koenzymet, t ex ATP eller NAD, tillsättas.

I detta fall tillsättes ATP på en bas av ca 0,3 till ca 30 millimoler, räknat på den färdiga blandningen.

Såsom tidigare angivits, är det möjligt att bilda lösningar av både stabiliserade enzymer och koenzymer.

Sålunda kan två eller flera koenzymer och två eller flera 446 742 10 15 20 25 30 35 12 - enzymer stabiliseras i samma lösning. Sá kan t ex koenzymet ATP stabiliseras på det sätt som beskrivits här. Å andra sidan kan också NAD stabiliseras för sig på det sätt som beskrivits här. Det oaktat kan, när tvâ eller flera koen- zymer stabiliseras, koenzymerna vanligen tillsättas sam- tidigt eller i godtycklig ordning. NAD tillsättes före- trädesvis i en mängd av 0,6 till ca 60 millimoler, räknat på den färdiga lösningen.

Vid denna till ett värde eller mindre och företrädesvis till 7,5. punkt i processen bör pH äter justeras åtminstone inom området 6,5 till ca 8,0 Efter justering av pH-värdet kan ett passande organiskt lösningsmedel, t ex glycerol, tillsättas. I detta fall tillsättes det igen mängd av 25-40 volym%, ehuru i det mest föredragna utförandet åtminstone 30 volym% av det organiska lösningsmedlet tillsätts. Emellertid bör mängden organiskt lösningsmedel vara åtminstone S volym% och kan variera frân ca 5 till 70 volym%.

Det organiska lösningsmedlet bör ha följande karakte- ristika: l. pH-område på 4-10 2. flytande form vid rums- och kylskàpstemperaturer, 3. icke reagera med NAD eller ATP eller liknande med undantag för bildande av elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, 4. blandbart med vatten, 5. låg normal fri solvolysenergi (normal resonans upprätthálles).

Lösningsmedlet måste vara blandbart med vatten, flytan- de vid rums- och kylskåpstemperatur och icke reagera ned- brytande med enzymernas eller koenzymernas reaktionsbenägna del på antalet sätt än genom bildande av elektrostatiska bindningar. Användbara lösningsmedel är vanligen stabila organiska lösningsmedel, såsom etrar, ketoner, sulfoner, sulfoxider och alkoholer, som metanol, etanol, propanol, butanol, aceton, dioxan, DMSO, dimetylsulfon och THF.

Emellertid har man funnit högre aktivitet vid lägre lös- 10 15 20 25 30 35 446 742 13 __ ningsmedelskoncentration vid denna behandling hos flytande polyollösningsmedel. Flytande polyoler som innehåller 2-4 hydroxylgrupper och 2-l0 kolatomer föredrages, t ex glycerol, etylenglykol, propylenglykol eller butandiol.

Glycerol, propylenglykol, 1,2-propandiol har befunnits äga alla dessa egenskaper och utgöra de lösningsmedel som utvalts.

När det valda organiska lösningsmedlet utgöres av en polyol, är det icke nödvändigt att använda azid eller andra bakteriostatiska ämnen, eftersom polyolen effektivt fungerar som ett bakteriostatiskt ämne. Trots att det valda lösningsmedlet och polymeren medför den önskade stabiliteten hos den vattenhaltiga lösningen, föredrages ibland en azidförening, eftersom den tycks öka kopplingen mellan polymeren och enzymerna.

Sedan glycerolen eller annan polyol tillförts, justeras pH-värdet hos den lösning som man erhållit. Vid typiska fall kan pH vara svagt basiskt och därför kan en 1-normal HC1 tillföras för att justera pH. På samma sätt, om pH är svagt surt, kan passande bas tillföras för att uppnå ett pH pà 7,5.

En av de viktigaste aspekterna är att koenzymet NAD är närvarande i överskott. Såsom angivits, utföres bestäm- ningen av glykos genom att mäta det NADH som bildas från NAD. NADH är instabilt i sur omgivning och nedbrytes vid ett pH på 6 och nedbrytes ytterligt snabbt vid ett pH på 4. Lösningens pH bibehålles därför ovanför ett neutralt pH på 7. Emedan NAD faktiskt är mera stabilt i sur omgivning, har man enligt uppfinningen funnit, att det icke nedbrytes i någon väsentlig grad vid en svagt basisk omgivning med ett pH pá 7,5. Trots detta tillföres NAD med avsevärt överskott, så att alltid tillräcklig mängd icke nedbrutet NAD finns närvarande, t o m efter åtskilliga år i denna flytande omgivning.

Vanligen är alla koenzymer närvarande i en mängd, som åtminstone är tillräcklig för att utföra den önskade bestämningen. I typfallet finns ingen maximihalt koenzym, 10 15 20 25 30 35 446 742 14 men maximihalten begränsas av kommersiellt praktiska för- hàllanden och bedömningar av koenzyminhibering hos en analys.

Sedan koenzymerna har tillförts den flytande lös- ningen, kan de utvalda enzymerna tillföras. Liksom ifråga om koenzymerna kan enzymerna tillföras i godtycklig ordning. Ävensá kan ett eller flera enzymer tillföras lösningen.

I det föredragna utförandet av uppfinningen och enligt det enzymsystem, som angivits ovan, är de två enzymerna HK och G-6-PDH. Företrädesvis tillföres HK i en mängd som icke understiger 100 I.U. per liter (pH på 7,6 25°C).

Emellertid är det gynnsamt att tillföra minst 1.000 I.U. per liter av HK.

Företrädesvis utgöres G-6-PDH av L-mesenteroidbakte- rier, och bör ha en koncentration inom omrâdet från ca 100 I.U. per liter till ca 30.000 I.U. per liter eller högre. Vid det föredragna utförandet av uppfinningen är mängden normalt ca 3.000 I.U. per liter av denna typ G-6-PDH, vilken används vid ett pH på ca 7,8 vid 25°C.

Vart och ett av enzymerna bör förekomma med en halt av minst 100 I.U. (International Units) per liter, ehuru i de flesta kommersiella reagenslösningar enzymet, t ex hexokinas, ingår med minst ca 1.000 I.U. per liter. Vid normala kommersiella förpackningar ingår enzymet med ca 1.000 till ca 10.000 I.U. vid ett pH på 7,6 och vid en temperatur av ca 25°C. Emellertid är miximimängden enzym obegränsad, ehuru normalt vid praktiskt taget alla till- lämpningar, mängden enzym icke överstiger 100.000 I.U.

Det är viktigt att vid processen enligt uppfinningen enzymerna tillföres efter det att det slutliga pH är jus- terat. Medan hela mekanismen för att åstadkomma enzymernas och koenzymernas stabilisering icke är fullt klarlagd, tror man att det valda lösningsmedlet stabiliserar enzymet i det flytande mediet genom att skydda den reaktionsbenägna delen, dvs den del av molekylen, där substratreaktionen uppträder eller på annat sätt katalyseras. Dessutom tror man attstabiliseringen àstadkommes genoma att enzymerna ' och koenzymerna skyddas från mikrobial förorening och 10 15 20 25 30 35 446 742 15 därigenom nedbrytning. Koenzymet NAD skiljer sig från koenzymet NADH därigenom, att NAD icke i märkbar grad löses i det valda lösningsmedlet, t ex propylenglykol.

Emellertid är NAD mera stabilt i vatten och koenzymet synes icke stabiliseras av polyolen. En ren polyol denatu- rerar enzymerna, men vid närvaro av en vattenhaltig lösning, t ex en blandning av vatten och lösningsmedel, denaturerar icke enzymerna. Tydligen kräves en polär grupp hos det organiska lösningsmedlet för att bibehålla enzymernas reaktionsbenägna delar i ett stabilit förhållande. Det är tydligt att någon form av fysikalisk eller kemisk reak- tion inträffar i det koncentrerade lösningsmedlet av vatten och organiskt ämne, eftersom enzymerna och koenzymerna bibehåller katalytisk aktivitet och icke nedbrytes vid de angivna koncentrationerna.

Utöver ovanstående synes polymeren reagera på något sätt med azidföreningen för att bilda en elektrostatisk eller kovalent bindning mellan enzymerna och polymeren.

I allt väsentligt synes det också som om polymeren kan tänja sig för att något inkapsla och därigenom skydda enzymernas reaktionsbenägna delar. På detta sätt förhindras eller.inträffar icke enzymdenaturering eller någon annan form av nedbrytning.

Såsom angivits ovan, är det möjligt att stabilisera minst två eller flera koenzymer eller minst två eller flera enzymer i samma lösning. Dessutom, och detta är viktigare, är det möjligt att stabilisera både enzymer och koenzymer i samma lösning. Man tror att den vatten- haltiga lösningen av det organiska lösningsmedlet är den primära faktorn vid stabilisering av koenzymet, ehuru polymeren tycks medföra viss stabiliserande effekt. Vid stabilisering av enzymet synes det organiska lösningsmedlet och polymeren vara de primära faktorer, som medför stabili- seringen. I många fall bidrager dessutom azidsaltet till att öka stabilíseringen. I vilket fall som helst kan man observera att både enzymer och koenzymer fortfarande före- kommer i samman gemensamma lösning. 10 15 20 25 30 35 446 742 16 _ Några av de ytterligare reaktioner som har utförts med de stabiliserade enzymerna och koenzymsammansättningarna återges nedan. Den reaktion som innebär fosforylering av kreatin är: CPK kreatin + ATP 4___________ CP + ADP (pH 8-9) Återstáende reaktioner förstås av sig själva med hänvisning till den förteckning över beteckningar, som angivist ovan.

För en NADP-reaktion: G-6-PDH G-6-P + NADP ;_________b NADPH + 6-fosfoglukonsyra.

För ADP-reaktion: CPK 4________. (pH 6-7) Vid följande reaktion skall begynnelsereaktionen för kreatin CP + ADP kreatin + ATP + ATP användas för att åstadkomma ADP. Därefter: PK ADP + PEP 'H ATP + pyruvat LDH pyruvat + NADH -J laktat + NAD Éöljande reaktion visar användningen av ureas och GLDH-enzymer vid stabiliserade flytande kompositioner: ureas urinämne r 2 NH: + C02 (pH 6-8) GLDH + :__-tå NH4 +a -ketoglutanat + NAD 4____-_- glutamat + NADH Genom följande exempel tydliggöres uppfinningen utan att därmed begränsas: I Ca 0,7 g gelatinpolymer tillsättes till ca 700 ml Vatten. Denna lösning uppvärmes sedan till över 30°C för att lösa gelatinpolymeren.

Sedan polymeren tillsatts, sâttes lösningen i vatten- bad för att begränsa temperaturen till ca 22°C. 10 15 20 25 30 35 446 742 17 * pH justeras därefter att ligga inom området 6,5-8,0.

Sedan temperaturen sänkts och pH justerats, tillsättes ca 2,0 g ATP till lösningen, varefter i sin tur tillsättes 4,6 g NAD. 3 g av ett magnesiumklorídsalt tillsättes till- sammans med NAD. Därefter tillsättes 300 ml glycerol.

Sedan glycerolen tillsatts, justeras pH till ca 7,5 genom tillsättande av l-normal saltsyra.

Sedan den fullständiga lösningen erhållits, hälles den i en plast- eller glasbehàllare, som därefter till- slutes. Behállarna förseglas och lagras kylda. Det har befunnits att en stabiliserad koenzymblandning på detta sätt erbjuder en lagringsstabilitet pà upp till 4 år utan väsentlig nedbrytning.

II Det prov som framställts enligt exempel I tillföres enzymet hexokinas, innan det förseglas i glasbehâllaren.

Samma lagringslivslängd erhålles utan väsentlig nedbrytning.

III Provet i exempel II tillföres också enzymet G-6-PDH, innan det förseglas i glasbehàllaren och samma långa lag- ringslivslängd utan väsentlig nedbrytning erhålles.

IV Ca 1,0 g av en dextranpolymer sättes till ca 700 ml vatten. Denna lösning uppvärmes därefter till över 30°C för att lösa polymeren. Lösningen insättes i ett vattenbad för att sänka temperaturen till ca 22°C.

Sedan temperaturen har sänkts, tillsättes ca 2,2 g NADP till lösningen, vilket i sin tur följes av 4,0 g ATP.

Lösningens pH justeras inom omrâdet 6,5-8,0. 325 ml glycerol tillsättes därefter.

Sedan glycerolen tillsatts, justeras pH till ca 7,5 genom tillsats av l-normal saltsyra.

Sedan fullständig lösning erhållits, hälles lösningen i en plast- eller glasbehállare, som sedan tillslutes.

Behállarna förseglas lufttätt och lagras under kylning.

Man har funnit att en stabilierad koenzymblandning är ungefär lika effektiv som blandningen i exempel I, fast inget azidsalt tillsatts. 446 742 10 15 20 25 30 35 18 _ Följande exempel återges i schematisk form men visar reagensmedlen och de mängder som tillsatts de olika viktiga stegen för att framställa de stabiliserade blandningarna enligt uppfinningen.

V Stabiliserad ADP, AMP och NAD ca 700 ml vatten 0,5 g gelatin lös genom uppvärmning 0,7 g natriumfosfat kyl till rumstemperatur 50 g kreatinfosfat 4 g ADP 20 g AMP 15 g NAD lös upp och injustera pH mellan 7 och 9 300 ml glycerol blanda och injustera pH häll pá flaska och försegla VI Stabiliserad ADP, AMP, NAD, HK och G-6-PDH Ca 300 I.U. tillsättes ca 15.000 I.U. per liter G-6-PDH och ca-loo I.U. till ta 10.000 1.0. per liter HK tillsätts lösningen enligt exempel V, innan denna förpackas.

VII 1,5 g NAD lös i 5 ml vatten tillsätt 5 ml glycerol injustera pH till under 5 VIII Stabilisering av NAD och Hg 1,5 g NAD lös i 10 ml buffert av 0,1-molar pipes+ injustera pH till 6-7 tillsätt l0 ml glycerol justera åter pH-värdet tillsätt och lös 10 mg HK med en koncentration av 150 10 15 20 25 446 742 19 ' I.U. per milligram + pipes = piperazin (bis) etansulfonsyra IX Stabilisering av kreatin, ATP och PEP 1000 ml vatten tillsätt 12,1 g tri (hydroxymetyl) aminometan tillsätt 1,0 g gelatin lös i värme över 30°C kyl till rumstemperatur tillsätt 2,0 g ATP tillsätt 2 g PEP tillsätt 10,0 g kreatin lös och injustera pH till 9 X Till den stabiliserade lösningen i exempel IX sattes 100-10.000 I.U. per liter LDH 100-10.000 I.U. per liter PK före förpackningen. och Var och en av blandningarna i exemplen V till X har samma långa lagringslivslängd utan någon väsentlig ned- brytning. Dessutom är vart och ett av ovan anförda.exempel grundat på prov, som verkligen iordningsställts och prövats enligt uppfinningen.

Ehuru uppfinningen beskrivits i anslutning till ett antal utföringsformer, kan den dock pà godtyckligt sätt varieras inom ramen för efterföljande patentkrav.

Claims (46)

10 15 20 25 30 35 446 742 20 _ PATENTKRAV

1. l. Stabiliserad flytande vattenhaltig blandning för användning vid biologiska diagnostiska bestämningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila i vattenhaltiga media, k ä n n e - t e c k n a d a) en vattenhaltig bärare innehållande en vatten- av att blandningen uppvisar löslig polymer, b) minst 100 I.U. per liter enzym löst i den vatten- haltiga bäraren och/eller c) minst tillräcklig mängd koenzym för att i kombina- tion med enzymet möjliggöra en bestämning, varvid koen- zymet väljes från den klass som består av nikotinamid- adenin-dinukleotid, adenosintrifosfat, adenosin-5'-di- fosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och adenosin- monofosfat d) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt, med vatten blandbart organiskt lösningsmedel i den vatten- haltigabärarenvilket lösningmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur och é) ett pa från ca 6,0 till 8,5.

2. Blandning enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d därav, att enzymet väljes från den klass som består -av glykos-6-fosfat-dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehyd- rogenas, kreatin-fosfokinas, pyruvatkinas och alkalifos- fatas.

3. Blandning enligt krav 2, därav, att den innefattar ett första labilt koenzym och minst ett andra labilt koenzym, som också stabiliseras k ä n n e t e c k n a d av åtminstone nämnda organiska lösningmedel.

4. Blandning enligt krav 2, därav, att den innefattar en vattenlöslig polymer, som k ä n n e t e c k n a d icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet.

5. Blandning enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar ett första labilt enzym och åtminstone ett andra labilt enzym, som också stabiliseras 10 15 20 25 30 35 446 742 21 genom åtminstone nämnda lösningsmedel och polymer.

6. Blandning enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar en bakteriostat, som åstad- kommer såväl stabilisering som bakteriostatísk verkan.

7. Blandning enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d att bakteriostaten utgöres av en azidförening. k ä n n e t e c k n a d därav,

8. Blandning enligt krav 2, att lösningsmedlet har följande karakteristika: a) pH på 4-10, b) flytande vid rums- och kylskàpstemperaturer, c) icke reagerar med koenzymerna eller enzymerna på annat sätt än genom att utbilda elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten e) låg normal frisolvolysenergi (normal reso- nans etableras).

9. Blandning enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar minst två koenzymer och minst två enzymer.

10. Blandning enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den uppvisar a) minst 30 volym% icke-reaktiv vattenhaltig bärare, b) ett organiskt lösningsmedel vars närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion icke påverkar koenzymets aktivitet.

11. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den innefattar en vattenlöslig polymer, vilken icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet och att den innefattar ett labilt andra koenzym, som också stabiliseras genom åtminstone nämnda organiska lösnings- medel eller polymer.

12. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d att den innefattar en bakteriostat, som åstadkommer såväl stabilisering som bakteriostatisk verkan.

13. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - att det organiska lösningsmedlet icke därav, n a d därav, reagerar med nämnda koenzym och vattenhaltiga bärare vid rums- och kylskåpstemperaturer¿ 10 15 20 25 30 35 446 742 22

14. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k : n a d därav, att koenzymet väljes från den klass, som består av NAD, ATP, ADP, CK, CP och NADP.

15. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d därav, att koenzymet utgöres av NAD med en kon- centration över 1,2 g/1 flytande blandning.

16. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d därav, att nämnda organiska lösningsmedel har följande karakteristika: a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskàpstemperaturer, c) inte reagerar med koenzymer på annat sätt än genom utbildning av elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten, e) har låg normalfri solvolysenergi (normal resonans upprätthàlles).

17. Stabiliserad blandning enligt krav 15, k ä n - n e t e c k n a d därav, att det organiska lösnings- medlet utgöres av en polyol.

18. Blandning enligt kravet 1 för biologiska bestämningar,nEd i ett vattenhaltigt medium insuflfilt enzym, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den uppvisar _a) en vattenhaltig bärare, b) minst 100 I.U. per liter enzym löst i den vatten- haltiga bärare, klass som består av glykos-6-fosfat-dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehydrogenas, kreatin-fosfokinas, pyruvatkinas och alkalifosfatas, c) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt, med vatten blandbart, organiskt lösningsmedel som är flytande vilket enzym väljes från den åtminstone vid rumstemperatur och vars närvaro icke pà- verkar enzymets aktivitet, d) minst 0,01% av en vattenlöslig polymer i nämnda lösning och som icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet, e) en bakteriostat, som medför stabilisering åtmin- stone genom bakteriostatisk verkan.

19. Blandning enligt krav 18, att den innefattar ett labilt andra enzym, k ä n n e t e c k - n a d därav, 10 15 20 25 30 35 446 742 23 vilket också stabiliseras av åtminstone nämnda organiska lösningsmedel eller polymer.

20. Blandning enligt krav 18, därav, k ä n n e t e c k - n a d att bakteriostaten utgöres av en azid- lösning.

21. Blandning enligt krav 18, k ä n n e t e c k - n a d därav, att det organiska lösningsmedlet har följande karakteristika: ' a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskàpstemperaturer, C) icke reagerar med enzymer på annat sätt än genom utbildning av elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten, e) låg normal frisolvolysenergi (normal resonans upprätthàlles).

22. Blandning enligt krav 21, k ä n n e t e c k - n a d därav, att det organiska lösningsmedlet icke reagerar med nämnda enzym och vattenhaltiga bärare vid rums- och kylskåpstemperaturer.

23. Blandning enligt krav 18, att enzymet väljes från den klass, som k ä n n e t e c k - n a d därav, består av G-e-PDH, HK, GLDH, cK, PK och PEP.

24. '24. Sätt att stabilisera en flytande blandning enligt krav 1 för användning vid biologiska diagnostiska bestäm- ningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila 1 vattenhaltiga media, k ä n n e t e c k n a t av stegen att a) blanda vatten med ett vattenblandbart, icke-reaktivt organiskt lösningsmedel för att åstadkomma en lösning av vattenblandbart lösningsmedel, där det organiska lös- till en mängd av 5 till 70 volymprocent vilket organiska lösningsmedel är flytan- ningsmedlet ingàr av lösningen, och de åtminstone vid rumstemperatur, b) tillsätta en polymer till lösningen av vatten- blandbart organiskt lösningsmedel, c) tillsätta till lösningen åtminstone en sådan mängd per liter av ett labilt koenzym, som är tillräcklig för att utföra en bestämning och som löses i lösningen 10 15 20 25 30 35 446 742 24 och samverkar med ett enzym vid en bestämningsreaktion - och där koenzymets aktivitet förblir opäverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion, varvid koenzymet väljes från den klass, som består av nikotin- amid-adenindinukleotid, adenosintrifosfat, adenosin-5'- -difosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat och adenosinmonofosfat, d) justera pH till ett område mellan 6,0 och 8,5, så att koenzymet stabiliseras, e) tillsätta minst 100 I.U. per liter av ett labilt enzym till lösningen, vilket enzym löses i lösningen och sam- verkar vid en bestämningsreaktion och där enzymets och koenzymets aktiviteter förblir opåverkade av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en biologisk diagnostisk bestämningsreaktion och f) försegla blandningen i en behållare.

25. Sätt enligt krav 24, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymet väljes från den klass som består av glykos-6-fosfat- dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehydro- genas, kreatin-fosfokinas, pyruvat-kinas och alkalifosfatas.

26. Sätt enligt krav 25, av steget att tillföra en bakteriostatisk agent, som k ä n n e t e c k n a t också verkar som enzymstabiliserande agent.

27. Sätt enligt krav 26, att den bakteriostatiska agenten utgöres av en k ä n n e t e c k n a t därav, azidförening.

28. sätt enligt krav 25, av steget att tillsätta ett andra koenzym till lösningen, k ä n n e t e c k n a t vilket också stabiliseras i denna.

29. Sätt enligt krav 25, k ä n n e t e c k n a t av steget att tillföra ett andra enzym till lösningen, vilket också stabiliseras i denna efter justering av pH- värdet.

30. Sätt enligt krav 25, av steget att tillsätta ett lösningsmedel med följande k ä n n e t e c k n a t karakteristika: 10 15 20 25 30 35 446 742 25 a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskåpstemperaturer, c) icke reagerar med enzymerna eller koenzymerna på annat sätt än genom att utbilda elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten, e) làgnormalfri solvolysenergi (normal reso- _ nans upprätthàlles).

31. Sätt enligt krav 30, därav, k ä n n e t e c k n a t att det organiska lösningsmedlet utgöres av en polyol, som innehåller 2-4 hydroxylgrupper och 2-10 kol- atomer.

32. Blandning enligt krav 25, k ä n n e t e c k n a d därav, att lösningsmedlet tillsättes till en mängd av ca 25 till ca 40 volym%

33. Blandning enligt krav 25, k ä n n e t e c k - n a d därav, att nämnda polymer ingår med en mängd av minst 0,01 %.

34. Sätt att stabilisera en blandning enligt krav k ä n n e t e c k n a t a) lösa koenzymet i den vattenhaltiga bäraren b) förena nämnda koenzym innehållande vattenhal- 24, av stegen, att tiga_bärare med minst 5 volym% av ett icke reaktivt vatten- blandbart organiskt lösningsmedel för att åstadkomma en stabiliserad blandning där koenzymets aktivitet förblir opàverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro.

35. Sätt enligt krav 34, k ä n n e t e c k n a t av steget att lösa en sådan vattenlöslig polymer i bland- ningen, som icke väsentligt förhindrar enzymatisk aktivitet.

36. Sätt enligt krav 34, k ä n n e t e c k n a t av steget att tillföra ett andra koenzym till lösningen, vilket också stabiliseras i denna.

37. Sätt enligt krav 34, k ä n n e t e c k n a t därav, att lösningsmedlet uppvisar följande karakteristika: a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskåpstemperaturer, c) icke reagerar med koenzymer pà annat sätt än genom att bilda elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, 446 742 10 15 20 25 30 35 26 - d) blandbart med vatten, e) låg normal fri solvolysenergi (normal resonans upprätthålles).

38. Sätt enligt krav 34, därav, att lösningsmedlet tillföres till en mängd av ca 25 till ca 50 volym%.

39. Sätt enligt krav 37, att lösningsmedlet utgöres av en flytande polyol, k ä n n e t e c k n a t k ä n n e t e c k n a t därav, innehållande från 2-10 kolatomer och 2-4 hydroxylgrupper.

40. 46. Sätt enligt krav 35, k ä n n e t e c k n a t därav, att polymeren utgöres av gelatin, ingående i lös- ningen i en mängd av minst 0,01 %.

41. Sätt att stabilisera ett labilt enzym enligt krav 18, k ä n n e t e c k n a t av stegen att a) sammanföra vatten med ett vattenblandbart, or- ganiskt lösningsmedel för att bilda en lösning därav och vilket organiska lösningsmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur, så att lösningsmedlet ingår till en mängd av 5 till 70 volymprocent, b) tillsätta minst 0,01% vattenlöslig polymer till lösningen, c) tillsätta en bakteriostatisk agent, som också stabiliserar enzymet i nämnda lösning, åtminstone genom bakteriostatisk verkan, d) lösa minst l00 I.U. per liter av ett enzym i nämnda lösning för att bilda blandningen och vilket enzym i första hand är aktivt för påverkan av den biologiska beståndsdelens reaktivitet vid en biologisk diagnostisk bestämning och där enzymets aktivitet förblir opåverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en biologisk diagnostisk bestämningsreaktion, e) enzymet väljes från den klass, som består av glykos- 6-fosfat-dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehydrogenas, kreatin-fosfokinas, pyruvatkinas och alkalifosfatas och f) försegla blandningen.

42. Sätt enligt krav 41, k ä n n e t e c k n a t därav, att den bakteriostatiska agenten utgöres av en azidförening. 10 15 20 25 30 35 446 742 27 _

43. Sätt enligt krav 41, av steget att tillsätta ett andra enzym till lösningen, k ä n n e t e c k n a t vilket också stabiliseras i denna.

44. Blandning enligt krav 2 för biologiska diagnos- tiska bestämningar av kreatin-fosfokinas eller glykos k ä n n e t e c k n a d av, att blandningen innefattar a) åtminstone tillräcklig mängd av ett första koenzym, vald från den klass som innefattar nikotinamid-adenin- dinukleotid, reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotid och nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och ett andra koenzym, valt fràn den klass, som innefattar adenosin-5'- difosfat, adenosinmonofosfat och adenosintrifosfat lösta i den vattenhaltiga bäraren, b) ett enzym, valt från den klass, som innefattar glykos-6~fosfat-dehydrogenas och hexokinas och löst i den vattenhaltiga bäraren, c) mellan 5 och 70 volym~procent icke-reaktiv polyol såsom lösningsmedel och där enzymernas och koenzymernas aktiviteter förblir opåverkade av det organiska lösnings- medlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion, d) en vattenlöslig polymer ibäraren,smninte i väsent- lig grad förhindrar enzymatisk aktivitet.

45. Blandning enligt krav 1 för biologiska diagnos- tiska bestämningar av kreatin-fosfokinas eller glykos, k ä n n e t e c k n a d av, att den innefattar a) minst 30 volym% icke-reaktiv vattenhaltig bärare, b) minst tillräcklig mängd av ett första koenzym, valt fràn den klass, som innefattar nikotinamid-adenin- dinukleotid, reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotid och nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och ett andra koenzym, valt från den klass. som innefattar adenosin-5'- difosfat, adenosinmonofosfat och adenosintrifosfat, löst i den vattenhaltiga.bärare och.samverkande i en bestämnings- reaktion, c) såsom lösningsmedel enmed vatten blandbar polyol i den vattenhaltigabärare därkoenzymernas aktivitet för- blir opåverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro. 10 15 446 742 28

46. Blandning enligt krav 18 för biologiska diagnos- . tiska bestämningar av kreatin-fosfokinas eller glykos, k ä n n e t e c k n a d därav, att den uppvisar a) en vattenhaltig bärare, b) minst 100 I.U. hexokinasenzym per liter, löst i den vattenhaltiga bärare, c) minst 100 I.U. glukos-6-fosfatdehydrogenasenzym per liter löst i den vattenhaltiga basen, d) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt med vatten blandbart organiskt lösningsmedel i den vatten- haltiga bäraredär enzymernas aktivitet förblir opàverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro, -dye) minst 0,01% av en vattenlöslig polymer i nämnda lösning och som icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet, och, f) en bakteriostat som medför stabilisering åtmin- stone genom bakteriostatisk verkan.