SE446742B - STABILIZED FLUID Aqueous Mixture CONTAINING ENZYMES AND / OR COENZYMS FOR USE BY BIOLOGICAL AND DIAGNOSTIC DETERMINATIONS AND SETTING TO STABILIZE Aqueous Enzyme and / or Coenzyme - Google Patents

STABILIZED FLUID Aqueous Mixture CONTAINING ENZYMES AND / OR COENZYMS FOR USE BY BIOLOGICAL AND DIAGNOSTIC DETERMINATIONS AND SETTING TO STABILIZE Aqueous Enzyme and / or Coenzyme

Info

Publication number
SE446742B
SE446742B SE7711853A SE7711853A SE446742B SE 446742 B SE446742 B SE 446742B SE 7711853 A SE7711853 A SE 7711853A SE 7711853 A SE7711853 A SE 7711853A SE 446742 B SE446742 B SE 446742B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
enzyme
coenzyme
organic solvent
water
solution
Prior art date
Application number
SE7711853A
Other languages
Swedish (sv)
Other versions
SE7711853L (en
Inventor
Ivan Endre Modrovich
Original Assignee
Ivan Endre Modrovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ivan Endre Modrovich filed Critical Ivan Endre Modrovich
Publication of SE7711853L publication Critical patent/SE7711853L/en
Publication of SE446742B publication Critical patent/SE446742B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/62—Three oxygen atoms, e.g. ascorbic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

446 742 10 l5 20 25 30 35 2 _ Föremål för uppfinningen Det är därför uppfinningens primära ändamål att åstadkomma en flytande blandning av koenzymer och/eller enzymer som är stabiliserade i en enda behållare. Objects of the Invention It is therefore the primary object of the invention to provide a liquid mixture of coenzymes and / or enzymes which are stabilized in a single container.

Det är vidare ett syfte med uppfinningen att åstadkom- ma en labil enzym- och koenzymblandning av den typ som nämnts i ett vattenhaltigt organiskt lösningsmedel och där stabiliseringen av enzym och koenzym icke påverkar den enzymatiska aktiviteten ens efter en väsentlig tids- period.It is a further object of the invention to provide an unstable enzyme and coenzyme mixture of the type mentioned in an aqueous organic solvent and in which the stabilization of enzyme and coenzyme does not affect the enzymatic activity even after a substantial period of time.

Ett annat framträdande syfte med uppfinningen är att åstadkomma en metod att stabilisera labila enzymer och/eller koenzymer i närvaro av andra labila koenzymer eller på annat sätt andra labila enzymer, varvid bland- ningen erhåller lång livslängdl Uppfinningen avser sålunda en stabiliserad flytande vattenhaltig blandning för användning vid biologiska diagnostiska bestämningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila i vatten- haltiga media, varvid blandningen uppvisar a) en vattenhaltig bärare innehållande en vatten- löslig polymer, b) minst 100 I.U. per liter enzym löst i den vatten- haltiga bäraren och/eller c) minst tillräcklig mängd koenzym för att i kombi- nation med enzymet möjliggöra en bestämning, varvid koenzymet väljes från den klass som består av nikotinamid- adenin-dinukleotid, adenosin-trifosfat, adenosin-5'-di- fosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och adenosin- monofosfat d) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt, med vatten blandbart organiskt lösningsmedel i den vatten- haltiga bäraren, vilket lösningsmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur och e) ett pH från ca 6,0 till 8,5.Another prominent object of the invention is to provide a method of stabilizing labile enzymes and / or coenzymes in the presence of other labile coenzymes or otherwise other labile enzymes, the mixture obtaining a long service life. The invention thus relates to a stabilized liquid aqueous mixture for use in biological diagnostic assays and containing enzymes and / or coenzymes, which are normally unstable in aqueous media, the mixture having a) an aqueous carrier containing a water-soluble polymer, b) at least 100 IU per liter of enzyme dissolved in the aqueous vehicle and / or c) at least sufficient coenzyme to enable a determination in combination with the enzyme, the coenzyme being selected from the class consisting of nicotinamide adenine dinucleotide, adenosine triphosphate, adenosine 5'-diphosphate, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and adenosine monophosphate d) between 5 and 70% by volume of non-reactive, water-miscible organic solvent in the aqueous vehicle, which solvent is liquid at least at room temperature and ) a pH from about 6.0 to 8.5.

Uppfinningen avser även ett sätt att stabilisera en flytande blandning för användning vid biologiska l0 15 20 25 30 35 446 742 3 _ diagnostiska bestämningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila i vatten- haltiga media, varvid följande steg genomförs: a) blanda vatten med ett vattenblandbart, icke-reak- tivt organiskt lösningmedel för att åstadkomma en lösning av vattenblandbart lösningsmedel, där det organiska lösningsmedlet ingår till en mängd av 5 till 70 volym- procent av lösningen, och vilket organiska lösningsmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur, b) tillsätta en polymer till lösningen av vatten- blandbart organiskt lösningsmedel, c) tillsätta till lösningen åtminstone en sádan mängd per liter av ett labilt koenzym, som är tillräcklig för att utföra en bestämning och som löses i lösningen och samverkar med ett enzym vid en bestämningsreaktion och där koenzymets aktivitet förblir opàverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion, varvid koenzymet väljes från den klass, som består av nikotin- amid-adenindinukleotid, adenosintrifosfat, adenosin-5'- -difosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat och adenosinmonofosfat, dl justera pH till ett område mellan 6,0 och 8,5, så att koenzymet stabiliseras, e) tillsätta minst 100 I.U. per liter av ett labilt enzym till lösningen, vilket enzym löses i lösningen och samverkar vid en bestämningsreaktion och där enzymets och koenzymets aktiviteter förblir opåverkade av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en biologisk diagnostisk bestäm- ningsreaktion och f) försegla blandningen i en behållare.The invention also relates to a method of stabilizing a liquid mixture for use in biological diagnostic assays and containing enzymes and / or coenzymes, which are normally unstable in aqueous media, carrying out the following steps: a) mixing water with a water-miscible, non-reactive organic solvent to provide a solution of water-miscible solvent, wherein the organic solvent is present in an amount of 5 to 70% by volume of the solution, and which organic solvent is liquid at least at room temperature, b) add a polymer to the solution of water-miscible organic solvent, c) add to the solution at least an amount per liter of a labile coenzyme sufficient to carry out a determination and which dissolves in the solution and interacts with an enzyme in a determination reaction and where the activity of the coenzyme remains unaffected by the presence of the organic solvent in the n stabilized mixture or in a determination reaction, the coenzyme being selected from the class consisting of nicotinamide amine adenine dinucleotide, adenosine triphosphate, adenosine 5'-diphosphate, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and pH adenosine monophose between 6.0 and 8.5, so that the coenzyme is stabilized, e) add at least 100 IU per liter of an labile enzyme to the solution, which enzyme dissolves in the solution and interacts in a determination reaction and where the activities of the enzyme and coenzyme remain unaffected by the presence of the organic solvent in the stabilized mixture or in a biological diagnostic determination reaction and f) sealing the mixture in a container.

Sammanfattning av uppfinningen Labila enzymer och koenzymer som behandlas enligt uppfinningen ernàr làngtidsstabilitet utan påverkan av den enzymatiska eller koenzymatiska aktiviteten eller fotometriska absorptionsförmágan. Tillhandahållande 10 15 20 25 30 35 446 742 4 av enzymer och koenzymreagenter i stabil flytande form framhäver den kolorimetriska tillämpligheten av de nuvaran- de, till NAD/NADH kopplade metoderna liksom andra metoder, främst emedan en separation av beståndsdelar lätt utföres.Summary of the Invention Labile enzymes and coenzymes treated according to the invention achieve long-term stability without affecting the enzymatic or coenzymatic activity or photometric absorbency. The provision of enzymes and coenzyme reagents in stable liquid form emphasizes the colorimetric applicability of the present methods, linked to NAD / NADH as well as other methods, mainly because a separation of constituents is easily performed.

Stabila flytande reagensmedel är speciellt fördelatkiga, när förbrukningen av NADH och andra koenzymer är grund för mätningen och färgreagensmedlet måste separeras från NADH och huvudreaktionen. I ultraviolett tillstànd er- bjuder det flytande systemet bättre reagenshomogenitet och förpackning liksom flexibilitet vid användningen, i motsats till frystorkade eller torrmedelspreparat.Stable liquid reagents are especially advantageous when the consumption of NADH and other coenzymes is the basis for the measurement and the color reagent must be separated from NADH and the main reaction. In the ultraviolet state, the liquid system offers better reagent homogeneity and packaging as well as flexibility in use, in contrast to lyophilized or dry matter preparations.

Det flytande medium som är komponerat för att åstad- komma stabilisering av enzymer och koenzymer och som beskrivs nedan är unikt utbildat, så att en eller flera koenzymer kan stabiliseras i mediet. Dessutom kan ett eller flera enzymer stabiliseras i det flytande mediet.The liquid medium which is composed to effect stabilization of enzymes and coenzymes and which is described below is uniquely trained, so that one or more coenzymes can be stabilized in the medium. In addition, one or more enzymes may be stabilized in the liquid medium.

Ytterligare kan både koenzymer och enzymer stabiliseras i samma flytande media i en enda behållare.In addition, both coenzymes and enzymes can be stabilized in the same liquid media in a single container.

Stabilisering av enzymer och/eller koenzymer utföres genom att lösa en polymer, såsom t ex ett gelatin, i destillerat vatten. Gelatinet löses företrädesvis på en viktbasis av O,l%. Därefter upphettas vatten-gelatin- lösningen till ca 30° för att fullständigt lösa upp gelatinet. I vissa fall kan en azidförening användas, som icke endast tjänar som bakteriostat utan även som stabilisator. Därefter nedkyles denna lösning väsentligen till rumstemperatur eller ca 20°.Stabilization of enzymes and / or coenzymes is performed by dissolving a polymer, such as a gelatin, in distilled water. The gelatin is preferably dissolved on a weight basis of 0.1%. The water-gelatin solution is then heated to about 30 ° to completely dissolve the gelatin. In some cases, an azide compound can be used, which not only serves as a bacteriostat but also as a stabilizer. Thereafter, this solution is cooled substantially to room temperature or about 20 °.

I ett fall tillföres koenzymet, nikotinamid-adenin- dinukleotid (NAD) till lösningen tillsammans med en buffertkomponent, såsom t ex en tri(hydroxymety1) aminome- tan, i syfte att justera pH-värdet. I detta fall justeras pH till ungefär mellan 6,0 och 8,5 med föredraget värde på pH av 7,5. Efter tillförsel av koenzymet tillsättes en polyol, såsom t ex glycerol, på ungefärlig volymbasis av 30%. Efter tillförsel av polyolen kan pH-värdet åter justeras till ca 7,5.In one case, the coenzyme, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is added to the solution together with a buffer component, such as a tri (hydroxymethyl) aminomethane, in order to adjust the pH. In this case, the pH is adjusted to approximately between 6.0 and 8.5 with a preferred pH value of 7.5. After addition of the coenzyme, a polyol, such as glycerol, is added on an approximate volume basis of 30%. After the polyol has been added, the pH can be adjusted again to about 7.5.

Enligt uppfinningen kan mer än ett koenzym stabili- 10 15 20 25 30 35 446 742 5 seras i den ovannämnda lösningen. I detta fall kan det andra koenzymet tillsättas före eller efter tillförsel av NAD. Sá kan t ex vid ett utförande enligt uppfinningen adenosintrifosfat (ATP) tillföras som det andra koenzymet.According to the invention, more than one coenzyme can be stabilized in the above solution. In this case, the second coenzyme may be added before or after the addition of NAD. For example, in one embodiment of the invention, adenosine triphosphate (ATP) may be added as the second coenzyme.

Efter tillsättande av koenzymerna och justering av vätskans pH kan ett enzym, som t ex hexokinas (HK), också tillsättas. I ett typiskt fall kan hexokinas till- föras från en suspension, såsom en glycerolsuspension eller en ammoniumsulfatsuspension. Ytterligare enzym kan också tillföras, såsom t ex glykos-6-fosfat-dehydrogenas.After adding the coenzymes and adjusting the pH of the liquid, an enzyme such as hexokinase (HK) can also be added. In a typical case, hexokinase can be added from a suspension, such as a glycerol suspension or an ammonium sulfate suspension. Additional enzymes may also be added, such as, for example, glucose-6-phosphate dehydrogenase.

Sedan den flytande stabiliserade enzym- och/eller koenzymlösningen har beretts, dispenseras den pá ambra- färgade glasflaskor, som förseglas lufttätt. Dessa flaskor förvaras dessutom iiqpfallet nedkylda. Den förutsatta livs- längden hos de stabiliserade enzymerna och koenzymerna är under dessa fihhållanden upp till 4 år utan väsentlig ned- brytning.After the liquid stabilized enzyme and / or coenzyme solution has been prepared, it is dispensed into amber-colored glass bottles, which are sealed airtight. In addition, these bottles are kept refrigerated in the event of a cold. The assumed lifespan of the stabilized enzymes and coenzymes is under these conditions up to 4 years without significant degradation.

Detaljerad beskrivning Inom det kliniskt-diagnostiska fältet är den kommer- siella användningen av förevarande uppfinning representerad av men icke begränsad till de diagnostiskareagensmedel som används för att fastställa substratkoncentrationer, såsom t ex glykoskoncentrationer i biologiska vätskor och lik- nande. Icke desto mindre kan blandningar beredda enligt uppfinningen användas för att fastställa och kvantifiera andra biologiska beståndsdelar, som t ex följande bestånds- delar i biologiska vätskor: l. Glutarsyra-oxalättiksyre-transaminas (SGOT) 2. Glutarsyra-pyrodruvsyretransaminas (SGPT) 3. Mjölksyre-dehydrogenas (LDH-P) 4. Mjölksyre-dehydrogenas (LDH-L) 5. Kreatin-fosfokinas (CPK) 6. a-Hydroxi-smörsyre-dehydrogenas (U-HBD) 7. Glykos(via Hexokinas-G-6-PDH).Detailed Description In the clinical diagnostic field, the commercial use of the present invention is represented by but not limited to the diagnostic reagents used to determine substrate concentrations, such as, for example, glucose concentrations in biological fluids and the like. Nevertheless, mixtures prepared according to the invention can be used to determine and quantify other biological constituents, such as the following constituents in biological fluids: 1. Glutaric acid-oxalacetic acid transaminase (SGOT) 2. Glutaric acid-pyruvic acid transaminase (SGPT) 3. Lactic acid -dehydrogenase (LDH-P) 4. Lactic acid dehydrogenase (LDH-L) 5. Creatine phosphokinase (CPK) 6. α-Hydroxy-butyric acid dehydrogenase (U-HBD) 7. Glucose (via Hexokinase-G-6- PDH).

De ovan angivna reagensmedlen reagerar ofta likartat, innehåller några gemensamma labila ingredienser och några av de ifrågavarande kemiska reaktionerna är gemensamma. 10 15 20 25 30 35 446 742 6 _ Följande kemiska reaktionsschema presenteras som en modell för att illustrera den generella naturen hos ifrågavarande reaktioner: Reaktionsschema 1 - allmän modell: enzym 1 (1) substrat (S) I * produkt (S) pH enzym 2 (2) produkt/substrat + NAD-NADH2 _,_______1 Nwwë-NAD4-praimt katalysator PH (3) NADH2 + kromogen :::::::::::fi kromogen + NAD (oxiderad) (reducerad) Alla de enzymatiska reaktioner som är förtecknade ovan följer enligt uppfinningen detta generella schema, där reaktionen (2) vanligen betecknas som en kopplings- reaktion, reaktionerna (2) eller (3) är mätreaktioner och reaktionen (l) kan betecknas som primärreaktionen.The reagents listed above often react similarly, contain some common labile ingredients and some of the chemical reactions in question are common. 10 15 20 25 30 35 446 742 6 _ The following chemical reaction scheme is presented as a model to illustrate the general nature of the reactions in question: Reaction scheme 1 - general model: enzyme 1 (1) substrate (S) I * product (S) pH enzyme 2 (2) product / substrate + NAD-NADH2 _, _______ 1 Nwwë-NAD4-prime catalyst PH (3) NADH2 + chromogen :::::::::::: chromogen + NAD (oxidized) (reduced) All the According to the invention, enzymatic reactions listed above follow this general scheme, where the reaction (2) is usually referred to as a coupling reaction, the reactions (2) or (3) are measurement reactions and the reaction (1) can be referred to as the primary reaction.

Emellertid är det underförstått att alla tre reaktionerna icke behövs för mätning; i själva verket kan de begränsas till två eller en. Ifråga om ultraviolett mätning av mjölk- syre-dehydrogenas- (LD)-aktivitet används endast reaktion (2) pà följande sätt.However, it is understood that all three reactions are not required for measurement; in fact, they can be limited to two or one. For ultraviolet measurement of lactic acid dehydrogenase (LD) activity, only reaction (2) is used as follows.

Reaktíonsschema 2 - LDH _ Lon laktat + NAD T-*-* Omvänt kan flera än de tre angivna reaktionerna er- NADH2 + pyruvat fordras, såsom är fallet vid kreatin-fosfokinas (CPK): Reaktionsschema 3 -CPK CPK (l) CP + ADP ' ' ATP + kreatin HK (2) ATP + glykos ¿_____ glykos-6-fosfat + ADP G-6-PDH (3) glykos-6-fosfat + NAD NADH2 PMS ---+ (4) NADH2 + INT ' INT + NAD (ox) (red) Vid ovanstående reaktionsschema används följande beteckningar: 10 15 20 25 30 35 446 742 7 - CP = kreatin-fosfat CPK = kreatinfosfokinas ADP = adenosin-5'-difosfat AMP = adenosin-monofosfat ATP = adenosin-trifosfat HK = hexokinas NAD = nikotinamid-adenindinukleotid NADP = nikotinamid-adenindinukleotidfosfat NADH2 = nikotinamid-adenindinukleotid, reducerad GLDH = glutamat-dehydrogenas G-6-PDH = glykos-6-fosfat-dehydrogenas G-6-P = glykos-6-fosfat INT = tetrazoliumsalt PEP = fosfoenol-pyruvat PMS = fenazin-metosulfat PK = pyruvat-kinas I detta fall kan reaktionerna (2) och (3) anses som . kopplingsreaktioner, reaktionerna (3) eller (4) mätnings- reaktioner och reaktionen (1) som den primära reaktionen.Reaction Scheme 2 - LDH _ Lon Lactate + NAD T - * - * Conversely, more than the three indicated reactions er- NADH2 + pyruvate may be required, as is the case with creatine phosphokinase (CPK): Reaction Scheme 3 -CPK CPK (1) CP + ADP '' ATP + creatine HK (2) ATP + glucose ¿_____ glucose-6-phosphate + ADP G-6-PDH (3) glucose-6-phosphate + NAD NADH2 PMS --- + (4) NADH2 + INT ' INT + NAD (ox) (red) In the above reaction scheme the following terms are used: 10 15 20 25 30 35 446 742 7 - CP = creatine phosphate CPK = creatine phosphokinase ADP = adenosine-5'-diphosphate AMP = adenosine monophosphate ATP = adenosine -triphosphate HK = hexokinase NAD = nicotinamide adenine dinucleotide NADP = nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NADH2 = nicotinamide adenine dinucleotide, reduced GLDH = glutamate dehydrogenase G-6-PDH-glycose-6-glycosate phosphate INT = tetrazolium salt PEP = phosphoenol pyruvate PMS = phenazine methosulfate PK = pyruvate kinase In this case, reactions (2) and (3) can be considered as. coupling reactions, the reactions (3) or (4) measurement reactions and the reaction (1) as the primary reaction.

Med hänvisning till reaktionsschema 1 - allmän modell - är det tydligt och allmänt känt att användning av reaktions- sekvensen medger analytisk kvantifiering av antingen reak- tionssubstrat/produkter eller de katalyserande enzymerna.With reference to Reaction Scheme 1 - general model - it is clear and generally known that the use of the reaction sequence allows analytical quantification of either the reaction substrate / products or the catalyzing enzymes.

Kvantifieringen av dessa beståndsdelar i biologiska vätskor är ett väl accepterat och omfattande använt diag- nostiskt verktyg vid diagnos och behandling av sjukdoms- tillstånd hos människor och djur.The quantification of these constituents in biological fluids is a well-accepted and widely used diagnostic tool in the diagnosis and treatment of disease states in humans and animals.

Enzymer är komplexa proteinmolekyler med hög molekyl- vikt, vanligen av okänd kemisk struktur. De klassificeras f n genom sin katalytiska aktivitet och extrema substrat- karaktär. Enzymer kan åter definieras som biologiska kata- lysatorer med förmåga att katalysera en reaktion hos ett enskilt substrat eller en reaktion hos en liknande grupp substrater.Enzymes are complex protein molecules with a high molecular weight, usually of unknown chemical structure. They are currently classified by their catalytic activity and extreme substrate character. Enzymes can again be defined as biological catalysts capable of catalyzing a reaction of a single substrate or a reaction of a similar group of substrates.

Koenzymer är organiska kemikalieämnenu med lägre molekylvikt och med väl definierad struktur, vilkas reak- tioner eller samverkan är nödvändiga för specifika enzym- 10 15 20 25 30 35 446 742 8 _ analyser eller reaktioner. Koenzymerna är katalyserade av enzymerna, vilket resulterar i en reversibel förändring i koenzymets struktur och/eller atomiska sammansättning.Coenzymes are lower molecular weight organic substances with a well-defined structure, the reactions or interactions of which are necessary for specific enzyme analyzes or reactions. The coenzymes are catalyzed by the enzymes, which results in a reversible change in the structure and / or atomic composition of the coenzyme.

Koenzymer är mycket användbara vid kliniska analysproce- durer. Några har stark absorbans, deras reaktioner är stökiometriska med substratet och därför kan skapandet eller försvinnandet av den absorberande formen följas fotometriskt. Nikotinamid-adenindinukleotid (NAD) och dess reducerade form (NADH2) används i många viktiga kli- niska analyser, såsom S.G.O.T., S/P.G.T. och LDH analyser, såsom tidigare beskrivits. NAD och NADH2 har en molekyl- vikt på ca 700 och är mycket komplexa organiska molekyler.Coenzymes are very useful in clinical analysis procedures. Some have strong absorbance, their reactions are stoichiometric with the substrate and therefore the creation or disappearance of the absorbent form can be monitored photometrically. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and its reduced form (NADH2) are used in many important clinical assays, such as S.G.O.T., S / P.G.T. and LDH assays, as previously described. NAD and NADH2 have a molecular weight of about 700 and are very complex organic molecules.

NADH2 har stark absorption vid 340 nm, medan NAD icke har någon absorption vid denna våglängd.NADH2 has strong absorption at 340 nm, while NAD has no absorption at this wavelength.

Substrater utgörs av organiska kemikalier med känd struktur, vars reaktioner eller samverkan katalyseras av enzymer och medför en förändring i ämnets struktur, atomiska sammansättning eller stereo-kemiska rotation. I allmänhet är substrat utsatta för mikrobiologisk nedbryt- ning, eftersom de tjänar som föda för bakterier, svampar och andra mikroorganismer. A andra sidan förblir dessa ämnen stabila i vattenhaltiga media vid eller nära neutralt pH (dvs pH inom området 4-10). Typiska substrat är glykos, laktat eller mjölksyra, glukonat och liknande.Substrates consist of organic chemicals of known structure, the reactions or interactions of which are catalyzed by enzymes and cause a change in the structure, atomic composition or stereochemical rotation of the substance. In general, substrates are subject to microbiological degradation, as they serve as food for bacteria, fungi and other microorganisms. On the other hand, these substances remain stable in aqueous media at or near neutral pH (ie pH in the range 4-10). Typical substrates are glucose, lactate or lactic acid, gluconate and the like.

Följande reaktioner illpstrerar bestämningen av glykos genom användande av koenzymerna ATP och NAD HK glykos + ATP 'N G-e-P + Anp G-6-PDH G-6~P + NAD ;________* NADH + 6-fosfoglukonsyra Enzymet i den första reaktionen är hexokinas och enzymet i kopplings- och mätningsreaktionen är G-6-PDH.The following reactions illustrate the determination of glucose using the coenzymes ATP and NAD HK glucose + ATP'N GeP + Anp G-6-PDH G-6 ~ P + NAD; ________ * NADH + 6-phosphogluconic acid The enzyme in the first reaction is hexokinase and the enzyme in the coupling and measurement reaction is G-6-PDH.

I ovanstående reaktion bestämmes glykosen genom att mäta det NADH, som bildas vid mätningsreaktionen. I allt väsent- ligt tillåtes reaktionen att fullbordas och man mäter den mängd koenzym NADH2 som bildas.In the above reaction, the glucose is determined by measuring the NADH formed in the measurement reaction. In essence, the reaction is allowed to complete and the amount of coenzyme NADH2 formed is measured.

NAD, som är instabilt i vatten och i torr form när 10 15 20 25 30 35 446 742 9 _ det utsättes för fuktiga omgivningar, är icke pà lángt när sà instabilt som den reducerade formen NADH2. Följakt- 2 hållas fritt från fukt, medan NAD kan förpackas i en behållare med en vattenhaltig lösning, ligen måste NADH fastän stabiliserat i enlighet med uppfinningen. Stabiliteten är bättre i surt pH, medan vid alkaliskt pH finns en tendens, att NAD sönderfaller. Varken den exakta mekanismen eller slutprodukterna är av betydelse, med undantag av det sönder- fallna NAD, som icke längre effektivt kan fungera som ettkoenzym och icke heller nödvändigtvis har någon ut- släckningskoefficient vid den nödvändiga våglängden.NAD, which is unstable in water and in dry form when exposed to humid environments, is by no means as unstable as the reduced form NADH2. Consequently, while free from moisture, while NAD can be packaged in a container with an aqueous solution, NADH must be stabilized in accordance with the invention. Stability is better at acidic pH, while at alkaline pH there is a tendency for NAD to decompose. Neither the exact mechanism nor the end products are important, with the exception of the decomposed NAD, which can no longer function effectively as a coenzyme, nor does it necessarily have an extinction coefficient at the required wavelength.

Föreningarna ADP, ATP och AMP föreligger kemiskt i form av nukleotider. Emellertid hänvisas ofta häri till dessa föreningar ADP, ATP och AMP som koenzymer eller kofaktorer, även om de i klassisk betydelse är nukleo- tider. Sålunda hänvisar man häri till ADP, ATP och AMP som koenzymer eller kofaktorer för att anpassa sig till en för dessa föreningar ofta använd nomenklatur och för att de i själva verket utgör en nödvändig och betydelse- full del av en koenzymstrukturl En av uppfinningens unika fördelar är att alla kompo- nenter kan stabiliseras i ett enda reagenskärl. Allmänt sett föreligger två primära övervägande vid sammansättning av stabiliserat enzym eller koenzym. Det första av dessa överväganden är att åstadkomma ett högstabilt enzym eller koenzym i ett flytande medium och det andra övervägandet är att begränsa antalet förpackningar så mycket som möjligt.The compounds ADP, ATP and AMP are chemically present in the form of nucleotides. However, these compounds ADP, ATP and AMP are often referred to herein as coenzymes or cofactors, although in the classical sense they are nucleotides. Thus, ADP, ATP and AMP are referred to herein as coenzymes or cofactors in order to adapt to a nomenclature often used for these compounds and to in fact constitute a necessary and significant part of a coenzyme structure. One of the unique advantages of the invention is that all components can be stabilized in a single reagent vessel. In general, there are two primary considerations in the composition of stabilized enzyme or coenzyme. The first of these considerations is to provide a highly stable enzyme or coenzyme in a liquid medium and the second consideration is to limit the number of packages as much as possible.

Vid stabilisering av koenzymer, sådana som NAD, har man observerat att NAD är mycket mer stabilt än NADH. Följ- aktligen är det icke nödvändigt att använda de komplexa stabiliseringstekniker som erfordras för NADH. I enlighet härmed kan allareagensmedel förpackas i en lösning.When stabilizing coenzymes, such as NAD, it has been observed that NAD is much more stable than NADH. Consequently, it is not necessary to use the complex stabilization techniques required for NADH. Accordingly, all reagents can be packaged in a solution.

Vid stabiliering av enzymer och koenzymer enligt uppfinningen löses en polymer, som t ex gelatin, i destil- lerat vatten. Polymeren ingår företrädesvis i den stabili- serade lösningen upp till en sådan mängd, att den förblir i homogen lösning under kylning utan att utfällas. Polyme- 10 15 20 25 30 35 446 742 10 ren bör ingå i en mängd av åtminstone ca 0,01% och normält ca 0,5% baserat på hela blandningen och företrädesvis inom ett område på 0,05% till ca 0,25%. De vattenlösliga polymerer som är användbara som stabiliseringsämnen enligt uppfinningen är sådana, som icke inhiberar den enzymatiska aktiviteten och har förmågan att fånga in enzymet i polymer- matrisen. Polymeren kan vara ett syntetiskt eller organiskt ämne, såsom polyvinylpyrrolidin eller dextran av biologiskt ursprung, t ex gelatin som är denaturerad kollagen.When stabilizing enzymes and coenzymes according to the invention, a polymer, such as gelatin, is dissolved in distilled water. The polymer is preferably included in the stabilized solution up to such an amount that it remains in homogeneous solution during cooling without precipitation. The polymer should be present in an amount of at least about 0.01% and normally about 0.5% based on the whole mixture and preferably in a range of 0.05% to about 0.25%. %. The water-soluble polymers useful as stabilizers according to the invention are those which do not inhibit the enzymatic activity and have the ability to trap the enzyme in the polymer matrix. The polymer may be a synthetic or organic substance, such as polyvinylpyrrolidine or dextran of biological origin, eg gelatin which is denatured collagen.

Polymeren kan lösas i vattnet genom uppvärmning, van- ligen till över 30°C. Det förhållande i vilket polymeren kan lösas ökar med ökad temperatur.The polymer can be dissolved in the water by heating, usually to over 30 ° C. The ratio in which the polymer can be dissolved increases with increasing temperature.

Sedan polymeren har lösts fullständigt i vatten, kan en azid, t ex Na-azid, tillsättas, företrädesvis i en mängd på ca 0,1 vikt%. Emellertid kan den mängd azid- komponent, som tillföres, variera från 0,01% till ca 0,5%.After the polymer has been completely dissolved in water, an azide, eg Na-azide, may be added, preferably in an amount of about 0.1% by weight. However, the amount of azide component added may vary from 0.01% to about 0.5%.

Man har funnit att azidkomponenten uppvisar det ganska överraskande resultatet att hjälpa till att stabilisera enzymerna. Tidigare hade man endast den uppfattningen att azidkomponenten tjänade som bakeriostatiskt ämne.It has been found that the azide component exhibits the rather surprising result of helping to stabilize the enzymes. Previously, it was only thought that the azide component served as a bakeriostatic substance.

Fastän den fullständiga mekanismen vid stabilisering med en azidförening i kombination med de andra ämnena icke kan förstås helt, har det framkommit att azídföreningen verkligen åstadkommer ökad stabilitet. I flera fall är azidsaltet icke nödvändigt och kan utelämnas. I många fall är således det polymera och organiska lösningsmedlet i vattenmediet tillräckliga för att åstadkomma önskad stabilisering av de labila komponenterna. I några fall måste azidsaltet utelämnas, såtillvida som det kan ha en tendens att störa stabiliseringen eller på annat sätt i väsentlig grad påverka substratet, t ex glykos.Although the complete mechanism of stabilization with an azide compound in combination with the other substances cannot be fully understood, it has been found that the azide compound does indeed provide increased stability. In several cases the azide salt is not necessary and can be omitted. Thus, in many cases, the polymeric and organic solvents in the aqueous medium are sufficient to achieve the desired stabilization of the labile components. In some cases, the azide salt must be omitted, insofar as it may have a tendency to interfere with stabilization or otherwise significantly affect the substrate, eg glucose.

Utöver vad som sagts tidigare kan man använda andra baktericida eller fungicída ämnen, som icke reagerar kemiskt med substrat eller förhindrar enzymreaktionen. Så kan t ex några av de ämnen som används tillsammans med natriumazid utgöras av bensoesyra, fenol, tymol eller pentaklorfenol.In addition to what has been said before, other bactericidal or fungicidal substances can be used which do not chemically react with substrates or prevent the enzyme reaction. For example, some of the substances used together with sodium azide may be benzoic acid, phenol, thymol or pentachlorophenol.

I några fall kan det vara önskvärt att använda en 10 15 20 25 30 35 446 742 11 _ metall, som t ex magnesium, för att hjälpa till att initiera en reaktion, när den stabiliserade blandningen används.In some cases, it may be desirable to use a metal, such as magnesium, to help initiate a reaction when the stabilized mixture is used.

Magnesium i saltform som magnesiumklorid är ett föredraget ämne för detta ändamål. Detta ämne behöver icke ingå i de stabiliserade blandningarna enligt uppfinningen och kan, om det användes, tillföras vid användningstillfället eller införlivas under beredningen. Detta ämne, som akti- verar kopplingsenzymerna, bör användas i en mängd av ca 0,01% till ca 1% och företrädesvis ca 0,03%.Magnesium in salt form as magnesium chloride is a preferred substance for this purpose. This substance need not be included in the stabilized mixtures according to the invention and can, if used, be added at the time of use or incorporated during the preparation. This substance, which activates the coupling enzymes, should be used in an amount of about 0.01% to about 1% and preferably about 0.03%.

Vid denna punkt i processen kan lösningen kylas till ungefär rumstemperatur, exempelvis till ca 20°-25°C i ett vattenbad. Sedan lösningen har kylts, kan ett buffertämne, som t ex tri(hydroxymetyl)aminometan tillföras. I ett typiskt fall tillföres detta buffertämne i en mängd av ca 50 millimoler till ca 200 millimoler men åtminstone tillräckligt för att bibehålla pH-värdet inom området 6,0 till ca 8,5. Andra kända buffertämnen och andra former av buffertämnen kan också användas i processen. I några fall kan buffertsalter av den typ, som beskrives nedan, användas. Buffertsaltet tillföres i en mängd som är nöd- vändig för att bibehálla pH-värdet mellan 6,0 och 8,5.At this point in the process, the solution can be cooled to about room temperature, for example to about 20 ° -25 ° C in a water bath. After the solution has cooled, a buffer substance such as tri (hydroxymethyl) aminomethane can be added. Typically, this buffer is added in an amount of about 50 millimoles to about 200 millimoles, but at least sufficient to maintain the pH in the range of 6.0 to about 8.5. Other known buffer substances and other forms of buffer substances can also be used in the process. In some cases, buffer salts of the type described below may be used. The buffer salt is added in an amount necessary to maintain the pH between 6.0 and 8.5.

Vanligen är bufferten en kombination av 0,1-1% av en alkalihydroxid och 0,5-3% av ett surt alkalimetallkarbonat eller -fosfat. Den totala saltmängden påverkar också den mängd polymer, som erfordras. Vid högre salthalt, t ex över 4 vikt%, erfordras mindre mängd polymer, beroende på den elektrostatiska stabilisering som åstadkommas av saltet. Vid högre salthalter kan emellertid polymeren grumla lösningen eller falla ut, varvid det är nödvändigt att värma lösninen för att lösa den på nytt.Usually the buffer is a combination of 0.1-1% of an alkali hydroxide and 0.5-3% of an acidic alkali metal carbonate or phosphate. The total amount of salt also affects the amount of polymer required. At higher salt contents, eg above 4% by weight, less polymer is required, due to the electrostatic stabilization provided by the salt. At higher salinities, however, the polymer may cloud the solution or precipitate, necessitating heating the solution to redissolve it.

Sedan lösningens pH har justerats till önskat omrâde, kan det första koenzymet, t ex ATP eller NAD, tillsättas.After the pH of the solution has been adjusted to the desired range, the first coenzyme, eg ATP or NAD, can be added.

I detta fall tillsättes ATP på en bas av ca 0,3 till ca 30 millimoler, räknat på den färdiga blandningen.In this case, ATP is added on a base of about 0.3 to about 30 millimoles, based on the finished mixture.

Såsom tidigare angivits, är det möjligt att bilda lösningar av både stabiliserade enzymer och koenzymer.As previously stated, it is possible to form solutions of both stabilized enzymes and coenzymes.

Sålunda kan två eller flera koenzymer och två eller flera 446 742 10 15 20 25 30 35 12 - enzymer stabiliseras i samma lösning. Sá kan t ex koenzymet ATP stabiliseras på det sätt som beskrivits här. Å andra sidan kan också NAD stabiliseras för sig på det sätt som beskrivits här. Det oaktat kan, när tvâ eller flera koen- zymer stabiliseras, koenzymerna vanligen tillsättas sam- tidigt eller i godtycklig ordning. NAD tillsättes före- trädesvis i en mängd av 0,6 till ca 60 millimoler, räknat på den färdiga lösningen.Thus, two or more coenzymes and two or more enzymes can be stabilized in the same solution. Thus, for example, the coenzyme ATP can be stabilized in the manner described here. On the other hand, NAD can also be stabilized separately in the manner described here. Nevertheless, when two or more coenzymes are stabilized, the coenzymes can usually be added simultaneously or in any order. NAD is preferably added in an amount of 0.6 to about 60 millimoles, based on the finished solution.

Vid denna till ett värde eller mindre och företrädesvis till 7,5. punkt i processen bör pH äter justeras åtminstone inom området 6,5 till ca 8,0 Efter justering av pH-värdet kan ett passande organiskt lösningsmedel, t ex glycerol, tillsättas. I detta fall tillsättes det igen mängd av 25-40 volym%, ehuru i det mest föredragna utförandet åtminstone 30 volym% av det organiska lösningsmedlet tillsätts. Emellertid bör mängden organiskt lösningsmedel vara åtminstone S volym% och kan variera frân ca 5 till 70 volym%.At this to a value or less and preferably to 7.5. point in the process, the pH of the food should be adjusted at least in the range 6.5 to about 8.0 After adjusting the pH, a suitable organic solvent, eg glycerol, can be added. In this case, an amount of 25-40% by volume is added again, although in the most preferred embodiment at least 30% by volume of the organic solvent is added. However, the amount of organic solvent should be at least 5% by volume and may vary from about 5% to 70% by volume.

Det organiska lösningsmedlet bör ha följande karakte- ristika: l. pH-område på 4-10 2. flytande form vid rums- och kylskàpstemperaturer, 3. icke reagera med NAD eller ATP eller liknande med undantag för bildande av elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, 4. blandbart med vatten, 5. låg normal fri solvolysenergi (normal resonans upprätthálles).The organic solvent should have the following characteristics: 1. pH range of 4-10 2. liquid form at room and refrigerator temperatures, 3. does not react with NAD or ATP or the like except for the formation of electrostatic (ie hydrogen) bonds , 4. miscible with water, 5. low normal free solvolysis energy (normal resonance is maintained).

Lösningsmedlet måste vara blandbart med vatten, flytan- de vid rums- och kylskåpstemperatur och icke reagera ned- brytande med enzymernas eller koenzymernas reaktionsbenägna del på antalet sätt än genom bildande av elektrostatiska bindningar. Användbara lösningsmedel är vanligen stabila organiska lösningsmedel, såsom etrar, ketoner, sulfoner, sulfoxider och alkoholer, som metanol, etanol, propanol, butanol, aceton, dioxan, DMSO, dimetylsulfon och THF.The solvent must be miscible with water, liquid at room and refrigerator temperature and not react degradatively with the reactive part of the enzymes or coenzymes in any way other than by the formation of electrostatic bonds. Useful solvents are usually stable organic solvents, such as ethers, ketones, sulfones, sulfoxides and alcohols, such as methanol, ethanol, propanol, butanol, acetone, dioxane, DMSO, dimethyl sulfone and THF.

Emellertid har man funnit högre aktivitet vid lägre lös- 10 15 20 25 30 35 446 742 13 __ ningsmedelskoncentration vid denna behandling hos flytande polyollösningsmedel. Flytande polyoler som innehåller 2-4 hydroxylgrupper och 2-l0 kolatomer föredrages, t ex glycerol, etylenglykol, propylenglykol eller butandiol.However, higher activity has been found at lower solvent concentration in this treatment of liquid polyol solvent. Liquid polyols containing 2-4 hydroxyl groups and 2 to 10 carbon atoms are preferred, for example glycerol, ethylene glycol, propylene glycol or butanediol.

Glycerol, propylenglykol, 1,2-propandiol har befunnits äga alla dessa egenskaper och utgöra de lösningsmedel som utvalts.Glycerol, propylene glycol, 1,2-propanediol have been found to possess all these properties and constitute the solvents selected.

När det valda organiska lösningsmedlet utgöres av en polyol, är det icke nödvändigt att använda azid eller andra bakteriostatiska ämnen, eftersom polyolen effektivt fungerar som ett bakteriostatiskt ämne. Trots att det valda lösningsmedlet och polymeren medför den önskade stabiliteten hos den vattenhaltiga lösningen, föredrages ibland en azidförening, eftersom den tycks öka kopplingen mellan polymeren och enzymerna.When the selected organic solvent is a polyol, it is not necessary to use azide or other bacteriostatic substances, since the polyol effectively acts as a bacteriostatic substance. Although the chosen solvent and polymer provide the desired stability of the aqueous solution, an azide compound is sometimes preferred because it appears to increase the coupling between the polymer and the enzymes.

Sedan glycerolen eller annan polyol tillförts, justeras pH-värdet hos den lösning som man erhållit. Vid typiska fall kan pH vara svagt basiskt och därför kan en 1-normal HC1 tillföras för att justera pH. På samma sätt, om pH är svagt surt, kan passande bas tillföras för att uppnå ett pH pà 7,5.After the glycerol or other polyol has been added, the pH of the solution obtained is adjusted. In typical cases, the pH can be slightly alkaline and therefore a 1-normal HCl can be added to adjust the pH. Similarly, if the pH is slightly acidic, suitable base can be added to achieve a pH of 7.5.

En av de viktigaste aspekterna är att koenzymet NAD är närvarande i överskott. Såsom angivits, utföres bestäm- ningen av glykos genom att mäta det NADH som bildas från NAD. NADH är instabilt i sur omgivning och nedbrytes vid ett pH på 6 och nedbrytes ytterligt snabbt vid ett pH på 4. Lösningens pH bibehålles därför ovanför ett neutralt pH på 7. Emedan NAD faktiskt är mera stabilt i sur omgivning, har man enligt uppfinningen funnit, att det icke nedbrytes i någon väsentlig grad vid en svagt basisk omgivning med ett pH pá 7,5. Trots detta tillföres NAD med avsevärt överskott, så att alltid tillräcklig mängd icke nedbrutet NAD finns närvarande, t o m efter åtskilliga år i denna flytande omgivning.One of the most important aspects is that the coenzyme NAD is present in excess. As indicated, the determination of glucose is performed by measuring the NADH formed from NAD. NADH is unstable in acidic environments and degrades at a pH of 6 and degrades extremely rapidly at a pH of 4. The pH of the solution is therefore maintained above a neutral pH of 7. Since NAD is actually more stable in acidic environments, it has been found according to the invention, that it is not degraded to any significant degree in a weakly alkaline environment with a pH of 7.5. Despite this, NAD is supplied with a considerable excess, so that a sufficient amount of undigested NAD is always present, even after several years in this liquid environment.

Vanligen är alla koenzymer närvarande i en mängd, som åtminstone är tillräcklig för att utföra den önskade bestämningen. I typfallet finns ingen maximihalt koenzym, 10 15 20 25 30 35 446 742 14 men maximihalten begränsas av kommersiellt praktiska för- hàllanden och bedömningar av koenzyminhibering hos en analys.Usually all coenzymes are present in an amount which is at least sufficient to carry out the desired determination. Typically, there is no maximum coenzyme content, but the maximum content is limited by commercially practical conditions and assessments of coenzyme inhibition in an assay.

Sedan koenzymerna har tillförts den flytande lös- ningen, kan de utvalda enzymerna tillföras. Liksom ifråga om koenzymerna kan enzymerna tillföras i godtycklig ordning. Ävensá kan ett eller flera enzymer tillföras lösningen.After the coenzymes have been added to the liquid solution, the selected enzymes can be added. As with the coenzymes, the enzymes can be added in any order. One or more enzymes can also be added to the solution.

I det föredragna utförandet av uppfinningen och enligt det enzymsystem, som angivits ovan, är de två enzymerna HK och G-6-PDH. Företrädesvis tillföres HK i en mängd som icke understiger 100 I.U. per liter (pH på 7,6 25°C).In the preferred embodiment of the invention and according to the enzyme system set forth above, the two enzymes are HK and G-6-PDH. Preferably, HK is added in an amount not less than 100 I.U. per liter (pH of 7.6 25 ° C).

Emellertid är det gynnsamt att tillföra minst 1.000 I.U. per liter av HK.However, it is beneficial to add at least 1,000 I.U. per liter of HK.

Företrädesvis utgöres G-6-PDH av L-mesenteroidbakte- rier, och bör ha en koncentration inom omrâdet från ca 100 I.U. per liter till ca 30.000 I.U. per liter eller högre. Vid det föredragna utförandet av uppfinningen är mängden normalt ca 3.000 I.U. per liter av denna typ G-6-PDH, vilken används vid ett pH på ca 7,8 vid 25°C.Preferably, G-6-PDH is comprised of L-mesenteroid bacteria, and should have a concentration in the range of about 100 I.U. per liter to about 30,000 I.U. per liter or higher. In the preferred embodiment of the invention, the amount is normally about 3,000 I.U. per liter of this type G-6-PDH, which is used at a pH of about 7.8 at 25 ° C.

Vart och ett av enzymerna bör förekomma med en halt av minst 100 I.U. (International Units) per liter, ehuru i de flesta kommersiella reagenslösningar enzymet, t ex hexokinas, ingår med minst ca 1.000 I.U. per liter. Vid normala kommersiella förpackningar ingår enzymet med ca 1.000 till ca 10.000 I.U. vid ett pH på 7,6 och vid en temperatur av ca 25°C. Emellertid är miximimängden enzym obegränsad, ehuru normalt vid praktiskt taget alla till- lämpningar, mängden enzym icke överstiger 100.000 I.U.Each of the enzymes should be present at a level of at least 100 I.U. (International Units) per liter, although in most commercial reagent solutions the enzyme, eg hexokinase, is included with at least about 1,000 I.U. per liter. In normal commercial packaging, the enzyme is included with about 1,000 to about 10,000 I.U. at a pH of 7.6 and at a temperature of about 25 ° C. However, the miximi amount of enzyme is unlimited, although normally in virtually all applications, the amount of enzyme does not exceed 100,000 I.U.

Det är viktigt att vid processen enligt uppfinningen enzymerna tillföres efter det att det slutliga pH är jus- terat. Medan hela mekanismen för att åstadkomma enzymernas och koenzymernas stabilisering icke är fullt klarlagd, tror man att det valda lösningsmedlet stabiliserar enzymet i det flytande mediet genom att skydda den reaktionsbenägna delen, dvs den del av molekylen, där substratreaktionen uppträder eller på annat sätt katalyseras. Dessutom tror man attstabiliseringen àstadkommes genoma att enzymerna ' och koenzymerna skyddas från mikrobial förorening och 10 15 20 25 30 35 446 742 15 därigenom nedbrytning. Koenzymet NAD skiljer sig från koenzymet NADH därigenom, att NAD icke i märkbar grad löses i det valda lösningsmedlet, t ex propylenglykol.It is important that in the process according to the invention the enzymes are added after the final pH has been adjusted. While the whole mechanism for effecting the stabilization of the enzymes and coenzymes is not fully understood, it is believed that the chosen solvent stabilizes the enzyme in the liquid medium by protecting the reactive moiety, i.e. the part of the molecule where the substrate reaction occurs or is otherwise catalyzed. In addition, the stabilization is believed to be accomplished by protecting the enzymes and coenzymes from microbial contamination and thereby degrading them. The coenzyme NAD differs from the coenzyme NADH in that NAD is not appreciably dissolved in the chosen solvent, eg propylene glycol.

Emellertid är NAD mera stabilt i vatten och koenzymet synes icke stabiliseras av polyolen. En ren polyol denatu- rerar enzymerna, men vid närvaro av en vattenhaltig lösning, t ex en blandning av vatten och lösningsmedel, denaturerar icke enzymerna. Tydligen kräves en polär grupp hos det organiska lösningsmedlet för att bibehålla enzymernas reaktionsbenägna delar i ett stabilit förhållande. Det är tydligt att någon form av fysikalisk eller kemisk reak- tion inträffar i det koncentrerade lösningsmedlet av vatten och organiskt ämne, eftersom enzymerna och koenzymerna bibehåller katalytisk aktivitet och icke nedbrytes vid de angivna koncentrationerna.However, NAD is more stable in water and the coenzyme does not appear to be stabilized by the polyol. A pure polyol denatures the enzymes, but in the presence of an aqueous solution, eg a mixture of water and solvent, does not denature the enzymes. Clearly, a polar group of the organic solvent is required to maintain the reactive moieties of the enzymes in a stable ratio. It is clear that some form of physical or chemical reaction occurs in the concentrated solvent of water and organic matter, since the enzymes and coenzymes retain catalytic activity and are not degraded at the indicated concentrations.

Utöver ovanstående synes polymeren reagera på något sätt med azidföreningen för att bilda en elektrostatisk eller kovalent bindning mellan enzymerna och polymeren.In addition to the above, the polymer appears to react in some way with the azide compound to form an electrostatic or covalent bond between the enzymes and the polymer.

I allt väsentligt synes det också som om polymeren kan tänja sig för att något inkapsla och därigenom skydda enzymernas reaktionsbenägna delar. På detta sätt förhindras eller.inträffar icke enzymdenaturering eller någon annan form av nedbrytning.In essence, it also appears that the polymer can stretch to encapsulate and thereby protect the reactive parts of the enzymes. In this way, enzyme denaturation or any other form of degradation is not prevented or occurs.

Såsom angivits ovan, är det möjligt att stabilisera minst två eller flera koenzymer eller minst två eller flera enzymer i samma lösning. Dessutom, och detta är viktigare, är det möjligt att stabilisera både enzymer och koenzymer i samma lösning. Man tror att den vatten- haltiga lösningen av det organiska lösningsmedlet är den primära faktorn vid stabilisering av koenzymet, ehuru polymeren tycks medföra viss stabiliserande effekt. Vid stabilisering av enzymet synes det organiska lösningsmedlet och polymeren vara de primära faktorer, som medför stabili- seringen. I många fall bidrager dessutom azidsaltet till att öka stabilíseringen. I vilket fall som helst kan man observera att både enzymer och koenzymer fortfarande före- kommer i samman gemensamma lösning. 10 15 20 25 30 35 446 742 16 _ Några av de ytterligare reaktioner som har utförts med de stabiliserade enzymerna och koenzymsammansättningarna återges nedan. Den reaktion som innebär fosforylering av kreatin är: CPK kreatin + ATP 4___________ CP + ADP (pH 8-9) Återstáende reaktioner förstås av sig själva med hänvisning till den förteckning över beteckningar, som angivist ovan.As stated above, it is possible to stabilize at least two or more coenzymes or at least two or more enzymes in the same solution. In addition, and this is more important, it is possible to stabilize both enzymes and coenzymes in the same solution. It is believed that the aqueous solution of the organic solvent is the primary factor in stabilizing the coenzyme, although the polymer appears to have some stabilizing effect. When stabilizing the enzyme, the organic solvent and the polymer appear to be the primary factors leading to the stabilization. In many cases, the azide salt also contributes to increasing the stabilization. In any case, it can be observed that both enzymes and coenzymes still exist in a common solution. Some of the additional reactions that have been performed with the stabilized enzymes and coenzyme compositions are set forth below. The reaction involving phosphorylation of creatine is: CPK creatine + ATP 4___________ CP + ADP (pH 8-9) The remaining reactions are understood by themselves with reference to the list of designations given above.

För en NADP-reaktion: G-6-PDH G-6-P + NADP ;_________b NADPH + 6-fosfoglukonsyra.For a NADP reaction: G-6-PDH G-6-P + NADP; _________ b NADPH + 6-phosphogluconic acid.

För ADP-reaktion: CPK 4________. (pH 6-7) Vid följande reaktion skall begynnelsereaktionen för kreatin CP + ADP kreatin + ATP + ATP användas för att åstadkomma ADP. Därefter: PK ADP + PEP 'H ATP + pyruvat LDH pyruvat + NADH -J laktat + NAD Éöljande reaktion visar användningen av ureas och GLDH-enzymer vid stabiliserade flytande kompositioner: ureas urinämne r 2 NH: + C02 (pH 6-8) GLDH + :__-tå NH4 +a -ketoglutanat + NAD 4____-_- glutamat + NADH Genom följande exempel tydliggöres uppfinningen utan att därmed begränsas: I Ca 0,7 g gelatinpolymer tillsättes till ca 700 ml Vatten. Denna lösning uppvärmes sedan till över 30°C för att lösa gelatinpolymeren.For ADP reaction: CPK 4________. (pH 6-7) In the following reaction, the initial reaction for creatine CP + ADP creatine + ATP + ATP should be used to produce ADP. Then: PK ADP + PEP 'H ATP + pyruvate LDH pyruvate + NADH -J lactate + NAD The following reaction shows the use of urease and GLDH enzymes in stabilized liquid compositions: urease urea r 2 NH: + CO 2 (pH 6-8) GLDH +: __- toe NH4 + α-ketoglutanate + NAD 4 ____-_- glutamate + NADH The following examples clarify the invention without limiting it: In about 0.7 g of gelatin polymer is added to about 700 ml of water. This solution is then heated to above 30 ° C to dissolve the gelatin polymer.

Sedan polymeren tillsatts, sâttes lösningen i vatten- bad för att begränsa temperaturen till ca 22°C. 10 15 20 25 30 35 446 742 17 * pH justeras därefter att ligga inom området 6,5-8,0.After the polymer was added, the solution was added to a water bath to limit the temperature to about 22 ° C. 10 15 20 25 30 35 446 742 17 * The pH is then adjusted to be in the range 6.5-8.0.

Sedan temperaturen sänkts och pH justerats, tillsättes ca 2,0 g ATP till lösningen, varefter i sin tur tillsättes 4,6 g NAD. 3 g av ett magnesiumklorídsalt tillsättes till- sammans med NAD. Därefter tillsättes 300 ml glycerol.After lowering the temperature and adjusting the pH, about 2.0 g of ATP is added to the solution, after which 4.6 g of NAD is added. 3 g of a magnesium chloride salt are added together with NAD. Then 300 ml of glycerol are added.

Sedan glycerolen tillsatts, justeras pH till ca 7,5 genom tillsättande av l-normal saltsyra.After the glycerol is added, the pH is adjusted to about 7.5 by adding 1-normal hydrochloric acid.

Sedan den fullständiga lösningen erhållits, hälles den i en plast- eller glasbehàllare, som därefter till- slutes. Behállarna förseglas och lagras kylda. Det har befunnits att en stabiliserad koenzymblandning på detta sätt erbjuder en lagringsstabilitet pà upp till 4 år utan väsentlig nedbrytning.After the complete solution has been obtained, it is poured into a plastic or glass container, which is then closed. The containers are sealed and stored refrigerated. It has been found that a stabilized coenzyme mixture in this way offers a storage stability of up to 4 years without significant degradation.

II Det prov som framställts enligt exempel I tillföres enzymet hexokinas, innan det förseglas i glasbehâllaren.II The sample prepared according to Example I is added to the enzyme hexokinase, before being sealed in the glass container.

Samma lagringslivslängd erhålles utan väsentlig nedbrytning.The same shelf life is obtained without significant degradation.

III Provet i exempel II tillföres också enzymet G-6-PDH, innan det förseglas i glasbehàllaren och samma långa lag- ringslivslängd utan väsentlig nedbrytning erhålles.III The sample in Example II is also added to the enzyme G-6-PDH, before it is sealed in the glass container and the same long shelf life is obtained without significant degradation.

IV Ca 1,0 g av en dextranpolymer sättes till ca 700 ml vatten. Denna lösning uppvärmes därefter till över 30°C för att lösa polymeren. Lösningen insättes i ett vattenbad för att sänka temperaturen till ca 22°C.IV About 1.0 g of a dextran polymer is added to about 700 ml of water. This solution is then heated to over 30 ° C to dissolve the polymer. The solution is placed in a water bath to lower the temperature to about 22 ° C.

Sedan temperaturen har sänkts, tillsättes ca 2,2 g NADP till lösningen, vilket i sin tur följes av 4,0 g ATP.After the temperature has been lowered, about 2.2 g of NADP are added to the solution, which in turn is followed by 4.0 g of ATP.

Lösningens pH justeras inom omrâdet 6,5-8,0. 325 ml glycerol tillsättes därefter.The pH of the solution is adjusted in the range 6.5-8.0. 325 ml of glycerol are then added.

Sedan glycerolen tillsatts, justeras pH till ca 7,5 genom tillsats av l-normal saltsyra.After the glycerol is added, the pH is adjusted to about 7.5 by adding 1-normal hydrochloric acid.

Sedan fullständig lösning erhållits, hälles lösningen i en plast- eller glasbehállare, som sedan tillslutes.After complete solution is obtained, the solution is poured into a plastic or glass container, which is then closed.

Behállarna förseglas lufttätt och lagras under kylning.The containers are sealed airtight and stored during cooling.

Man har funnit att en stabilierad koenzymblandning är ungefär lika effektiv som blandningen i exempel I, fast inget azidsalt tillsatts. 446 742 10 15 20 25 30 35 18 _ Följande exempel återges i schematisk form men visar reagensmedlen och de mängder som tillsatts de olika viktiga stegen för att framställa de stabiliserade blandningarna enligt uppfinningen.It has been found that a stabilized coenzyme mixture is about as effective as the mixture in Example I, although no azide salt has been added. 446 742 10 15 20 25 30 35 18 _ The following examples are given in schematic form but show the reagents and the amounts added to the various important steps for preparing the stabilized mixtures according to the invention.

V Stabiliserad ADP, AMP och NAD ca 700 ml vatten 0,5 g gelatin lös genom uppvärmning 0,7 g natriumfosfat kyl till rumstemperatur 50 g kreatinfosfat 4 g ADP 20 g AMP 15 g NAD lös upp och injustera pH mellan 7 och 9 300 ml glycerol blanda och injustera pH häll pá flaska och försegla VI Stabiliserad ADP, AMP, NAD, HK och G-6-PDH Ca 300 I.U. tillsättes ca 15.000 I.U. per liter G-6-PDH och ca-loo I.U. till ta 10.000 1.0. per liter HK tillsätts lösningen enligt exempel V, innan denna förpackas.V Stabilized ADP, AMP and NAD about 700 ml water 0.5 g gelatin dissolved by heating 0.7 g sodium phosphate cool to room temperature 50 g creatine phosphate 4 g ADP 20 g AMP 15 g NAD dissolve and adjust pH between 7 and 9 300 ml glycerol mix and adjust pH pour into bottle and seal VI Stabilized ADP, AMP, NAD, HK and G-6-PDH Approx. 300 IU is added about 15,000 I.U. per liter of G-6-PDH and ca-loo I.U. to take 10,000 1.0. per liter of HK, the solution according to Example V is added before it is packaged.

VII 1,5 g NAD lös i 5 ml vatten tillsätt 5 ml glycerol injustera pH till under 5 VIII Stabilisering av NAD och Hg 1,5 g NAD lös i 10 ml buffert av 0,1-molar pipes+ injustera pH till 6-7 tillsätt l0 ml glycerol justera åter pH-värdet tillsätt och lös 10 mg HK med en koncentration av 150 10 15 20 25 446 742 19 ' I.U. per milligram + pipes = piperazin (bis) etansulfonsyra IX Stabilisering av kreatin, ATP och PEP 1000 ml vatten tillsätt 12,1 g tri (hydroxymetyl) aminometan tillsätt 1,0 g gelatin lös i värme över 30°C kyl till rumstemperatur tillsätt 2,0 g ATP tillsätt 2 g PEP tillsätt 10,0 g kreatin lös och injustera pH till 9 X Till den stabiliserade lösningen i exempel IX sattes 100-10.000 I.U. per liter LDH 100-10.000 I.U. per liter PK före förpackningen. och Var och en av blandningarna i exemplen V till X har samma långa lagringslivslängd utan någon väsentlig ned- brytning. Dessutom är vart och ett av ovan anförda.exempel grundat på prov, som verkligen iordningsställts och prövats enligt uppfinningen.VII 1.5 g NAD dissolved in 5 ml water add 5 ml glycerol adjust pH to below 5 VIII Stabilization of NAD and Hg 1.5 g NAD dissolved in 10 ml buffer of 0.1 molar pipes + adjust pH to 6-7 add 10 ml glycerol readjust the pH add and dissolve 10 mg HK at a concentration of 150 10 15 20 25 446 742 19 'IU per milligram + pipes = piperazine (bis) ethanesulfonic acid IX Stabilization of creatine, ATP and PEP 1000 ml water add 12.1 g tri (hydroxymethyl) aminomethane add 1.0 g gelatin dissolved in heat above 30 ° C cool to room temperature add 2, 0 g ATP add 2 g PEP add 10.0 g creatine loose and adjust the pH to 9 X To the stabilized solution in Example IX was added 100-10,000 IU per liter LDH 100-10,000 I.U. per liter PK before packaging. and Each of the mixtures in Examples V to X has the same long shelf life without any significant degradation. In addition, each of the above examples is based on samples which have actually been prepared and tested according to the invention.

Ehuru uppfinningen beskrivits i anslutning till ett antal utföringsformer, kan den dock pà godtyckligt sätt varieras inom ramen för efterföljande patentkrav.Although the invention has been described in connection with a number of embodiments, it may, however, be arbitrarily varied within the scope of the appended claims.

Claims (46)

10 15 20 25 30 35 446 742 20 _ PATENTKRAV10 15 20 25 30 35 446 742 20 _ PATENTKRAV 1. l. Stabiliserad flytande vattenhaltig blandning för användning vid biologiska diagnostiska bestämningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila i vattenhaltiga media, k ä n n e - t e c k n a d a) en vattenhaltig bärare innehållande en vatten- av att blandningen uppvisar löslig polymer, b) minst 100 I.U. per liter enzym löst i den vatten- haltiga bäraren och/eller c) minst tillräcklig mängd koenzym för att i kombina- tion med enzymet möjliggöra en bestämning, varvid koen- zymet väljes från den klass som består av nikotinamid- adenin-dinukleotid, adenosintrifosfat, adenosin-5'-di- fosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och adenosin- monofosfat d) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt, med vatten blandbart organiskt lösningsmedel i den vatten- haltigabärarenvilket lösningmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur och é) ett pa från ca 6,0 till 8,5.1. l. Stabilized liquid aqueous mixture for use in biological diagnostic assays and containing enzymes and / or coenzymes which are normally unstable in aqueous media, characterized in) an aqueous carrier containing an aqueous solution of the mixture having a soluble polymer , b) at least 100 IU per liter of enzyme dissolved in the aqueous vehicle and / or c) at least a sufficient amount of coenzyme to enable a determination in combination with the enzyme, the coenzyme being selected from the class consisting of nicotinamide adenine dinucleotide, adenosine triphosphate, adenosine 5'-diphosphate, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and adenosine monophosphate d) between 5 and 70% by volume of non-reactive, water-miscible organic solvent in the aqueous vehicle which solvent is liquid at least at room temperature and at) from about 6.0 to 8.5. 2. Blandning enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d därav, att enzymet väljes från den klass som består -av glykos-6-fosfat-dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehyd- rogenas, kreatin-fosfokinas, pyruvatkinas och alkalifos- fatas.Mixture according to claim 1, characterized in that the enzyme is selected from the class consisting of glucose-6-phosphate dehydrogenase, hexokinase, glutamate dehydrogenase, creatine phosphokinase, pyruvate kinase and alkali phosphatase. 3. Blandning enligt krav 2, därav, att den innefattar ett första labilt koenzym och minst ett andra labilt koenzym, som också stabiliseras k ä n n e t e c k n a d av åtminstone nämnda organiska lösningmedel.A mixture according to claim 2, wherein it comprises a first labile coenzyme and at least a second labile coenzyme, which is also stabilized by at least said organic solvent. 4. Blandning enligt krav 2, därav, att den innefattar en vattenlöslig polymer, som k ä n n e t e c k n a d icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet.A mixture according to claim 2, in that it comprises a water-soluble polymer which may not substantially inhibit enzymatic activity. 5. Blandning enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar ett första labilt enzym och åtminstone ett andra labilt enzym, som också stabiliseras 10 15 20 25 30 35 446 742 21 genom åtminstone nämnda lösningsmedel och polymer.A mixture according to claim 4, characterized in that it comprises a first labile enzyme and at least a second labile enzyme, which is also stabilized by at least said solvent and polymer. 6. Blandning enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar en bakteriostat, som åstad- kommer såväl stabilisering som bakteriostatísk verkan.6. A composition according to claim 2, characterized in that it comprises a bacteriostat which provides both stabilization and bacteriostatic action. 7. Blandning enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d att bakteriostaten utgöres av en azidförening. k ä n n e t e c k n a d därav,Mixture according to Claim 2, characterized in that the bacteriostat is an azide compound. k ä n n e t e c k n a d thereof, 8. Blandning enligt krav 2, att lösningsmedlet har följande karakteristika: a) pH på 4-10, b) flytande vid rums- och kylskàpstemperaturer, c) icke reagerar med koenzymerna eller enzymerna på annat sätt än genom att utbilda elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten e) låg normal frisolvolysenergi (normal reso- nans etableras).Mixture according to claim 2, that the solvent has the following characteristics: a) pH of 4-10, b) liquid at room and refrigerator temperatures, c) does not react with the coenzymes or enzymes other than by forming electrostatic (ie hydrogen) bonds, d) miscible with water e) low normal frisol volysis energy (normal resonance is established). 9. Blandning enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar minst två koenzymer och minst två enzymer.9. A composition according to claim 2, characterized in that it comprises at least two coenzymes and at least two enzymes. 10. Blandning enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den uppvisar a) minst 30 volym% icke-reaktiv vattenhaltig bärare, b) ett organiskt lösningsmedel vars närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion icke påverkar koenzymets aktivitet.Mixture according to Claim 1, characterized in that it has a) at least 30% by volume of non-reactive aqueous carrier, b) an organic solvent whose presence in the stabilized mixture or in a determination reaction does not affect the activity of the coenzyme. 11. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den innefattar en vattenlöslig polymer, vilken icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet och att den innefattar ett labilt andra koenzym, som också stabiliseras genom åtminstone nämnda organiska lösnings- medel eller polymer.A composition according to claim 10, characterized in that it comprises a water-soluble polymer which does not substantially inhibit enzymatic activity and that it comprises a labile second coenzyme which is also stabilized by at least said organic solvent or polymer. 12. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d att den innefattar en bakteriostat, som åstadkommer såväl stabilisering som bakteriostatisk verkan.12. A composition according to claim 10, characterized in that it comprises a bacteriostat which provides both stabilization and bacteriostatic action. 13. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - att det organiska lösningsmedlet icke därav, n a d därav, reagerar med nämnda koenzym och vattenhaltiga bärare vid rums- och kylskåpstemperaturer¿ 10 15 20 25 30 35 446 742 2213. A mixture according to claim 10, characterized in that the organic solvent does not react therefrom, n a d thereof, with said coenzyme and aqueous carriers at room and refrigerator temperatures¿ 44 15 74 25 22 14. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k : n a d därav, att koenzymet väljes från den klass, som består av NAD, ATP, ADP, CK, CP och NADP.A mixture according to claim 10, characterized in that the coenzyme is selected from the class consisting of NAD, ATP, ADP, CK, CP and NADP. 15. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d därav, att koenzymet utgöres av NAD med en kon- centration över 1,2 g/1 flytande blandning.Mixture according to Claim 10, characterized in that the coenzyme consists of NAD with a concentration of more than 1.2 g / l of liquid mixture. 16. Blandning enligt krav 10, k ä n n e t e c k - n a d därav, att nämnda organiska lösningsmedel har följande karakteristika: a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskàpstemperaturer, c) inte reagerar med koenzymer på annat sätt än genom utbildning av elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten, e) har låg normalfri solvolysenergi (normal resonans upprätthàlles).Mixture according to claim 10, characterized in that said organic solvent has the following characteristics: a) pH between 4 and 10, b) liquid at room and refrigerator temperatures, c) does not react with coenzymes other than by formation of electrostatic (ie hydrogen) bonds, d) miscible with water, e) has low normal-free solvolysis energy (normal resonance is maintained). 17. Stabiliserad blandning enligt krav 15, k ä n - n e t e c k n a d därav, att det organiska lösnings- medlet utgöres av en polyol.Stabilized mixture according to Claim 15, characterized in that the organic solvent is a polyol. 18. Blandning enligt kravet 1 för biologiska bestämningar,nEd i ett vattenhaltigt medium insuflfilt enzym, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den uppvisar _a) en vattenhaltig bärare, b) minst 100 I.U. per liter enzym löst i den vatten- haltiga bärare, klass som består av glykos-6-fosfat-dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehydrogenas, kreatin-fosfokinas, pyruvatkinas och alkalifosfatas, c) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt, med vatten blandbart, organiskt lösningsmedel som är flytande vilket enzym väljes från den åtminstone vid rumstemperatur och vars närvaro icke pà- verkar enzymets aktivitet, d) minst 0,01% av en vattenlöslig polymer i nämnda lösning och som icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet, e) en bakteriostat, som medför stabilisering åtmin- stone genom bakteriostatisk verkan.Mixture according to claim 1 for biological determinations, nEd in an aqueous medium insulited enzyme, characterized in that it has _a) an aqueous carrier, b) at least 100 I.U. per liter of enzyme dissolved in the aqueous vehicle, class consisting of glucose-6-phosphate dehydrogenase, hexokinase, glutamate dehydrogenase, creatine phosphokinase, pyruvate kinase and alkali phosphatase, c) between 5 and 70% by volume non-reactive, with water miscible, organic solvent which is liquid which enzyme is selected from it at least at room temperature and whose presence does not affect the activity of the enzyme, d) at least 0.01% of a water-soluble polymer in said solution and which does not substantially inhibit enzymatic activity, e) a bacteriostat, which causes stabilization at least through bacteriostatic action. 19. Blandning enligt krav 18, att den innefattar ett labilt andra enzym, k ä n n e t e c k - n a d därav, 10 15 20 25 30 35 446 742 23 vilket också stabiliseras av åtminstone nämnda organiska lösningsmedel eller polymer.A composition according to claim 18, wherein it comprises a labile second enzyme, characterized by it, which is also stabilized by at least said organic solvent or polymer. 20. Blandning enligt krav 18, därav, k ä n n e t e c k - n a d att bakteriostaten utgöres av en azid- lösning.A mixture according to claim 18, wherein the bacteriostat is an azide solution. 21. Blandning enligt krav 18, k ä n n e t e c k - n a d därav, att det organiska lösningsmedlet har följande karakteristika: ' a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskàpstemperaturer, C) icke reagerar med enzymer på annat sätt än genom utbildning av elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten, e) låg normal frisolvolysenergi (normal resonans upprätthàlles).Mixture according to Claim 18, characterized in that the organic solvent has the following characteristics: 'a) pH between 4 and 10, b) liquid at room and refrigerator temperatures, C) does not react with enzymes other than by the formation of electrostatic (ie hydrogen) bonds, d) miscible with water, e) low normal frisol volysis energy (normal resonance is maintained). 22. Blandning enligt krav 21, k ä n n e t e c k - n a d därav, att det organiska lösningsmedlet icke reagerar med nämnda enzym och vattenhaltiga bärare vid rums- och kylskåpstemperaturer.22. A mixture according to claim 21, characterized in that the organic solvent does not react with said enzyme and aqueous carriers at room and refrigerator temperatures. 23. Blandning enligt krav 18, att enzymet väljes från den klass, som k ä n n e t e c k - n a d därav, består av G-e-PDH, HK, GLDH, cK, PK och PEP.A mixture according to claim 18, that the enzyme is selected from the class known as k - n a d thereof, consists of G-e-PDH, HK, GLDH, cK, PK and PEP. 24. '24. Sätt att stabilisera en flytande blandning enligt krav 1 för användning vid biologiska diagnostiska bestäm- ningar och som innehåller enzymer och/eller koenzymer, vilka normalt är instabila 1 vattenhaltiga media, k ä n n e t e c k n a t av stegen att a) blanda vatten med ett vattenblandbart, icke-reaktivt organiskt lösningsmedel för att åstadkomma en lösning av vattenblandbart lösningsmedel, där det organiska lös- till en mängd av 5 till 70 volymprocent vilket organiska lösningsmedel är flytan- ningsmedlet ingàr av lösningen, och de åtminstone vid rumstemperatur, b) tillsätta en polymer till lösningen av vatten- blandbart organiskt lösningsmedel, c) tillsätta till lösningen åtminstone en sådan mängd per liter av ett labilt koenzym, som är tillräcklig för att utföra en bestämning och som löses i lösningen 10 15 20 25 30 35 446 742 24 och samverkar med ett enzym vid en bestämningsreaktion - och där koenzymets aktivitet förblir opäverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion, varvid koenzymet väljes från den klass, som består av nikotin- amid-adenindinukleotid, adenosintrifosfat, adenosin-5'- -difosfat, nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat och adenosinmonofosfat, d) justera pH till ett område mellan 6,0 och 8,5, så att koenzymet stabiliseras, e) tillsätta minst 100 I.U. per liter av ett labilt enzym till lösningen, vilket enzym löses i lösningen och sam- verkar vid en bestämningsreaktion och där enzymets och koenzymets aktiviteter förblir opåverkade av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en biologisk diagnostisk bestämningsreaktion och f) försegla blandningen i en behållare.24. '24. A method of stabilizing a liquid mixture according to claim 1 for use in biological diagnostic assays and containing enzymes and / or coenzymes which are normally unstable in aqueous media, characterized by the steps of a) mixing water with a water-miscible, non-aqueous medium. reactive organic solvent to provide a solution of water-miscible solvent, wherein the organic solvent in an amount of 5 to 70% by volume which organic solvent is the liquid is included in the solution, and they at least at room temperature, b) adding a polymer to the solution of water-miscible organic solvent, c) adding to the solution at least such an amount per liter of a labile coenzyme which is sufficient to carry out a determination and which is dissolved in the solution and interacts with an enzyme at a determination reaction - and where the activity of the coenzyme remains unaffected by the presence of the organic solvent in the the mixture or in a determination reaction, the coenzyme being selected from the class consisting of nicotinamide amine adenine dinucleotide, adenosine triphosphate, adenosine 5'-diphosphate, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and adenosine monophosphate between 6.0 and 8.5, so that the coenzyme is stabilized, e) add at least 100 IU per liter of an labile enzyme to the solution, which enzyme dissolves in the solution and cooperates in a determination reaction and where the activities of the enzyme and coenzyme remain unaffected by the presence of the organic solvent in the stabilized mixture or in a biological diagnostic determination reaction and f) sealing the mixture in a container. 25. Sätt enligt krav 24, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymet väljes från den klass som består av glykos-6-fosfat- dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehydro- genas, kreatin-fosfokinas, pyruvat-kinas och alkalifosfatas.25. The method of claim 24, wherein the enzyme is selected from the class consisting of glucose-6-phosphate dehydrogenase, hexokinase, glutamate dehydrogenase, creatine phosphokinase, pyruvate kinase and alkali phosphatase. 26. Sätt enligt krav 25, av steget att tillföra en bakteriostatisk agent, som k ä n n e t e c k n a t också verkar som enzymstabiliserande agent.The method of claim 25, of the step of administering a bacteriostatic agent, which may also act as an enzyme stabilizing agent. 27. Sätt enligt krav 26, att den bakteriostatiska agenten utgöres av en k ä n n e t e c k n a t därav, azidförening.27. The method of claim 26, wherein the bacteriostatic agent is a known compound, azide compound. 28. sätt enligt krav 25, av steget att tillsätta ett andra koenzym till lösningen, k ä n n e t e c k n a t vilket också stabiliseras i denna.28. The method of claim 25, comprising the step of adding a second coenzyme to the solution, which is also stabilized therein. 29. Sätt enligt krav 25, k ä n n e t e c k n a t av steget att tillföra ett andra enzym till lösningen, vilket också stabiliseras i denna efter justering av pH- värdet.29. A method according to claim 25, characterized by the step of adding a second enzyme to the solution, which is also stabilized therein after adjusting the pH value. 30. Sätt enligt krav 25, av steget att tillsätta ett lösningsmedel med följande k ä n n e t e c k n a t karakteristika: 10 15 20 25 30 35 446 742 25 a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskåpstemperaturer, c) icke reagerar med enzymerna eller koenzymerna på annat sätt än genom att utbilda elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, d) blandbart med vatten, e) làgnormalfri solvolysenergi (normal reso- _ nans upprätthàlles).The method of claim 25, of the step of adding a solvent having the following characteristics: a) pH between 4 and 10, b) liquid at room and refrigerator temperatures, c) unreacted with the enzymes or coenzymes other than by forming electrostatic (ie hydrogen) bonds, d) miscible with water, e) low-normal solvolysis energy (normal resonance is maintained). 31. Sätt enligt krav 30, därav, k ä n n e t e c k n a t att det organiska lösningsmedlet utgöres av en polyol, som innehåller 2-4 hydroxylgrupper och 2-10 kol- atomer.31. A process according to claim 30, wherein the organic solvent is a polyol containing 2-4 hydroxyl groups and 2-10 carbon atoms. 32. Blandning enligt krav 25, k ä n n e t e c k n a d därav, att lösningsmedlet tillsättes till en mängd av ca 25 till ca 40 volym%A mixture according to claim 25, characterized in that the solvent is added in an amount of about 25 to about 40% by volume. 33. Blandning enligt krav 25, k ä n n e t e c k - n a d därav, att nämnda polymer ingår med en mängd av minst 0,01 %.A composition according to claim 25, characterized in that said polymer is present in an amount of at least 0.01%. 34. Sätt att stabilisera en blandning enligt krav k ä n n e t e c k n a t a) lösa koenzymet i den vattenhaltiga bäraren b) förena nämnda koenzym innehållande vattenhal- 24, av stegen, att tiga_bärare med minst 5 volym% av ett icke reaktivt vatten- blandbart organiskt lösningsmedel för att åstadkomma en stabiliserad blandning där koenzymets aktivitet förblir opàverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro.34. A method of stabilizing a mixture according to claim 1) dissolving the coenzyme in the aqueous carrier b) combining said coenzyme containing water content 24, of the steps of silencing carriers with at least 5% by volume of a non-reactive water-miscible organic solvent to provide a stabilized mixture in which the activity of the coenzyme remains unaffected by the presence of the organic solvent. 35. Sätt enligt krav 34, k ä n n e t e c k n a t av steget att lösa en sådan vattenlöslig polymer i bland- ningen, som icke väsentligt förhindrar enzymatisk aktivitet.A method according to claim 34, characterized by the step of dissolving such a water-soluble polymer in the mixture which does not substantially prevent enzymatic activity. 36. Sätt enligt krav 34, k ä n n e t e c k n a t av steget att tillföra ett andra koenzym till lösningen, vilket också stabiliseras i denna.36. The method of claim 34, comprising the step of adding a second coenzyme to the solution, which is also stabilized therein. 37. Sätt enligt krav 34, k ä n n e t e c k n a t därav, att lösningsmedlet uppvisar följande karakteristika: a) pH mellan 4 och 10, b) flytande vid rums- och kylskåpstemperaturer, c) icke reagerar med koenzymer pà annat sätt än genom att bilda elektrostatiska (dvs hydrogena) bindningar, 446 742 10 15 20 25 30 35 26 - d) blandbart med vatten, e) låg normal fri solvolysenergi (normal resonans upprätthålles).A method according to claim 34, characterized in that the solvent has the following characteristics: a) pH between 4 and 10, b) liquid at room and refrigerator temperatures, c) does not react with coenzymes other than by forming electrostatic ( ie hydrogena) bonds, 446 742 10 15 20 25 30 35 26 - d) miscible with water, e) low normal free solvolysis energy (normal resonance is maintained). 38. Sätt enligt krav 34, därav, att lösningsmedlet tillföres till en mängd av ca 25 till ca 50 volym%.The method of claim 34, wherein the solvent is added in an amount of about 25 to about 50% by volume. 39. Sätt enligt krav 37, att lösningsmedlet utgöres av en flytande polyol, k ä n n e t e c k n a t k ä n n e t e c k n a t därav, innehållande från 2-10 kolatomer och 2-4 hydroxylgrupper.39. The method of claim 37, wherein the solvent is a liquid polyol, characterized in that it contains from 2 to 10 carbon atoms and 2 to 4 hydroxyl groups. 40. 46. Sätt enligt krav 35, k ä n n e t e c k n a t därav, att polymeren utgöres av gelatin, ingående i lös- ningen i en mängd av minst 0,01 %.40. A method according to claim 35, characterized in that the polymer consists of gelatin, contained in the solution in an amount of at least 0.01%. 41. Sätt att stabilisera ett labilt enzym enligt krav 18, k ä n n e t e c k n a t av stegen att a) sammanföra vatten med ett vattenblandbart, or- ganiskt lösningsmedel för att bilda en lösning därav och vilket organiska lösningsmedel är flytande åtminstone vid rumstemperatur, så att lösningsmedlet ingår till en mängd av 5 till 70 volymprocent, b) tillsätta minst 0,01% vattenlöslig polymer till lösningen, c) tillsätta en bakteriostatisk agent, som också stabiliserar enzymet i nämnda lösning, åtminstone genom bakteriostatisk verkan, d) lösa minst l00 I.U. per liter av ett enzym i nämnda lösning för att bilda blandningen och vilket enzym i första hand är aktivt för påverkan av den biologiska beståndsdelens reaktivitet vid en biologisk diagnostisk bestämning och där enzymets aktivitet förblir opåverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en biologisk diagnostisk bestämningsreaktion, e) enzymet väljes från den klass, som består av glykos- 6-fosfat-dehydrogenas, hexokinas, glutamat-dehydrogenas, kreatin-fosfokinas, pyruvatkinas och alkalifosfatas och f) försegla blandningen.A method of stabilizing an labile enzyme according to claim 18, characterized by the steps of a) combining water with a water-miscible organic solvent to form a solution thereof and which organic solvent is liquid at least at room temperature, so that the solvent is included to an amount of 5 to 70% by volume, b) add at least 0.01% water-soluble polymer to the solution, c) add a bacteriostatic agent, which also stabilizes the enzyme in said solution, at least by bacteriostatic action, d) dissolve at least 100 IU per liter of an enzyme in said solution to form the mixture and which enzyme is primarily active in influencing the reactivity of the biological component in a biological diagnostic determination and in which the activity of the enzyme remains unaffected by the presence of the organic solvent in the stabilized mixture or in a biological diagnostic determination reaction, e) the enzyme is selected from the class consisting of glucose-6-phosphate dehydrogenase, hexokinase, glutamate dehydrogenase, creatine phosphokinase, pyruvate kinase and alkali phosphatase and f) seal the mixture. 42. Sätt enligt krav 41, k ä n n e t e c k n a t därav, att den bakteriostatiska agenten utgöres av en azidförening. 10 15 20 25 30 35 446 742 27 _42. The method of claim 41, wherein the bacteriostatic agent is an azide compound. 10 15 20 25 30 35 446 742 27 _ 43. Sätt enligt krav 41, av steget att tillsätta ett andra enzym till lösningen, k ä n n e t e c k n a t vilket också stabiliseras i denna.A method according to claim 41, of the step of adding a second enzyme to the solution, characterized in that it is also stabilized therein. 44. Blandning enligt krav 2 för biologiska diagnos- tiska bestämningar av kreatin-fosfokinas eller glykos k ä n n e t e c k n a d av, att blandningen innefattar a) åtminstone tillräcklig mängd av ett första koenzym, vald från den klass som innefattar nikotinamid-adenin- dinukleotid, reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotid och nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och ett andra koenzym, valt fràn den klass, som innefattar adenosin-5'- difosfat, adenosinmonofosfat och adenosintrifosfat lösta i den vattenhaltiga bäraren, b) ett enzym, valt från den klass, som innefattar glykos-6~fosfat-dehydrogenas och hexokinas och löst i den vattenhaltiga bäraren, c) mellan 5 och 70 volym~procent icke-reaktiv polyol såsom lösningsmedel och där enzymernas och koenzymernas aktiviteter förblir opåverkade av det organiska lösnings- medlets närvaro i den stabiliserade blandningen eller vid en bestämningsreaktion, d) en vattenlöslig polymer ibäraren,smninte i väsent- lig grad förhindrar enzymatisk aktivitet.Mixture according to claim 2 for biological diagnostic determinations of creatine phosphokinase or glucose, characterized in that the mixture comprises a) at least a sufficient amount of a first coenzyme, selected from the class comprising nicotinamide adenine dinucleotide, reduced nicotinamide adenine dinucleotide and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and a second coenzyme selected from the class comprising adenosine 5'-diphosphate, adenosine monophosphate and adenosine triphosphate dissolved in the aqueous carrier, b) an enzyme selected from the glucose-6-phosphate dehydrogenase and hexokinase and dissolved in the aqueous carrier, c) between 5 and 70% by volume of non-reactive polyol as solvent and where the activities of the enzymes and coenzymes remain unaffected by the presence of the organic solvent in the stabilized mixture or in a determination reaction, d) a water-soluble polymer carrier, which does not substantially prevent enzymatic activity. 45. Blandning enligt krav 1 för biologiska diagnos- tiska bestämningar av kreatin-fosfokinas eller glykos, k ä n n e t e c k n a d av, att den innefattar a) minst 30 volym% icke-reaktiv vattenhaltig bärare, b) minst tillräcklig mängd av ett första koenzym, valt fràn den klass, som innefattar nikotinamid-adenin- dinukleotid, reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotid och nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat och ett andra koenzym, valt från den klass. som innefattar adenosin-5'- difosfat, adenosinmonofosfat och adenosintrifosfat, löst i den vattenhaltiga.bärare och.samverkande i en bestämnings- reaktion, c) såsom lösningsmedel enmed vatten blandbar polyol i den vattenhaltigabärare därkoenzymernas aktivitet för- blir opåverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro. 10 15 446 742 28Mixture according to claim 1 for biological diagnostic determinations of creatine phosphokinase or glucose, characterized in that it comprises a) at least 30% by volume of non-reactive aqueous carrier, b) at least sufficient amount of a first coenzyme, selected from the class comprising nicotinamide adenine dinucleotide, reduced nicotinamide adenine dinucleotide and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and a second coenzyme selected from that class. comprising adenosine 5'-diphosphate, adenosine monophosphate and adenosine triphosphate, dissolved in the aqueous carrier and cooperating in a determination reaction, c) as a solvent with a water-miscible polyol in the aqueous carrier in which the activity of the enzymes remains unaffected by the organic matter. . 10 15 446 742 28 46. Blandning enligt krav 18 för biologiska diagnos- . tiska bestämningar av kreatin-fosfokinas eller glykos, k ä n n e t e c k n a d därav, att den uppvisar a) en vattenhaltig bärare, b) minst 100 I.U. hexokinasenzym per liter, löst i den vattenhaltiga bärare, c) minst 100 I.U. glukos-6-fosfatdehydrogenasenzym per liter löst i den vattenhaltiga basen, d) mellan 5 och 70 volymprocent icke-reaktivt med vatten blandbart organiskt lösningsmedel i den vatten- haltiga bäraredär enzymernas aktivitet förblir opàverkad av det organiska lösningsmedlets närvaro, -dye) minst 0,01% av en vattenlöslig polymer i nämnda lösning och som icke väsentligt hämmar enzymatisk aktivitet, och, f) en bakteriostat som medför stabilisering åtmin- stone genom bakteriostatisk verkan.A mixture according to claim 18 for biological diagnostics. technical determinations of creatine phosphokinase or glucose, characterized in that it has a) an aqueous carrier, b) at least 100 I.U. hexokinase enzyme per liter, dissolved in the aqueous vehicle, c) at least 100 I.U. glucose-6-phosphate dehydrogenase enzyme per liter dissolved in the aqueous base, d) between 5 and 70% by volume of non-reactive water-soluble organic solvent in the aqueous carrier where the activity of the enzymes remains unaffected by the presence of the organic solvent, -dye) at least 0, 01% of a water-soluble polymer in said solution and which does not substantially inhibit enzymatic activity, and, f) a bacteriostate which causes stabilization at least by bacteriostatic action.
SE7711853A 1976-09-13 1977-10-20 STABILIZED FLUID Aqueous Mixture CONTAINING ENZYMES AND / OR COENZYMS FOR USE BY BIOLOGICAL AND DIAGNOSTIC DETERMINATIONS AND SETTING TO STABILIZE Aqueous Enzyme and / or Coenzyme SE446742B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72256576A 1976-09-13 1976-09-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE7711853L SE7711853L (en) 1979-04-21
SE446742B true SE446742B (en) 1986-10-06

Family

ID=24902389

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE7711853A SE446742B (en) 1976-09-13 1977-10-20 STABILIZED FLUID Aqueous Mixture CONTAINING ENZYMES AND / OR COENZYMS FOR USE BY BIOLOGICAL AND DIAGNOSTIC DETERMINATIONS AND SETTING TO STABILIZE Aqueous Enzyme and / or Coenzyme

Country Status (7)

Country Link
JP (2) JPS5843078B2 (en)
CA (1) CA1102225A (en)
CH (1) CH631208A5 (en)
DE (1) DE2740957A1 (en)
FR (1) FR2364457A1 (en)
GB (1) GB1570971A (en)
SE (1) SE446742B (en)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1102225A (en) * 1976-09-13 1981-06-02 Ivan E. Modrovich Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions and method of preparing same
DE2814154A1 (en) * 1978-04-01 1979-10-11 Behringwerke Ag STABILIZED NICOTINAMIDE NUCLEOTIDES AND METHOD FOR MANUFACTURING THEM
JPS5513008A (en) * 1978-07-11 1980-01-29 Mitsui Toatsu Chem Inc Stabilization of aqueous solution of enzyme
CA1187388A (en) * 1978-09-20 1985-05-21 American Monitor Corporation Stabilization of working reagent solutions containing nadh, nadph, and/or enzymes, and the use of such stabilized reagents in enzymes or substrate assays
JPS55138399A (en) * 1979-04-13 1980-10-29 Dainippon Pharmaceut Co Ltd Composition for determining beta-d-galactosidase and method thereof
JPS5982398A (en) * 1982-11-01 1984-05-12 Toyobo Co Ltd Method for stabilizing coenzyme
JPS6095746U (en) * 1983-12-08 1985-06-29 株式会社ニツコー Radio control toy radio transmitter
JPS62101773A (en) * 1985-10-29 1987-05-12 白木金属工業株式会社 Electronic key apparatus
US5298406A (en) * 1992-09-14 1994-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Formulation for stabilizing enzymatic activity and immunoreactivity of creatine kinase and creatine kinase isoenzymes
DE10313972A1 (en) * 2003-03-27 2004-10-21 Degussa Ag Coupled cofactor-dependent enzymatic reaction system
WO2006038647A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-13 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for stabilizing coenzyme and composition therefor

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1084079A (en) * 1964-11-30 Beckman Instruments Inc
DE1673194A1 (en) * 1965-07-22 1970-10-29 Dresden Arzneimittel Method and means for the determination of transaminase activities
US3296094A (en) * 1966-05-05 1967-01-03 Baxter Laboratories Inc Stabilized aqueous enzyme solutions
US3557002A (en) * 1967-11-15 1971-01-19 Procter & Gamble Stabilized aqueous enzyme preparation
US3627688A (en) * 1968-11-12 1971-12-14 Procter & Gamble Stabilized aqueous enzyme containing compositions
GB1322951A (en) * 1969-10-29 1973-07-11 Warner Lambert Co Process and agent for the determination of glucose
DE2061984C3 (en) * 1970-12-16 1974-04-11 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Reagent for the determination of lactate dehydrogenase in the color test
DE2302721C2 (en) * 1973-01-19 1975-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Method for the determination of creatine kinase
US3920798A (en) * 1973-05-08 1975-11-18 Union Carbide Corp Zeolite y synthesis
US3962037A (en) * 1975-01-30 1976-06-08 Miles Laboratories, Inc. Composition for stabilizing an enzyme-containing reagent
NL7603588A (en) * 1975-04-21 1976-10-25 Hoffmann La Roche STABILIZED COENZYME SOLUTION.
JPS52111183A (en) * 1976-03-12 1977-09-17 Hitachi Ltd Hand rail guiding device
CA1091174A (en) * 1976-03-17 1980-12-09 Ivan E. Modrovich Stabilized liquid enzyme
FR2344570A1 (en) * 1976-03-17 1977-10-14 Modrovich Ivan PROCESS FOR STABILIZING A LABILE COENZYME
CA1102225A (en) * 1976-09-13 1981-06-02 Ivan E. Modrovich Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions and method of preparing same

Also Published As

Publication number Publication date
GB1570971A (en) 1980-07-09
DE2740957A1 (en) 1978-03-16
CA1102225A (en) 1981-06-02
JPS5843078B2 (en) 1983-09-24
SE7711853L (en) 1979-04-21
JPS5352685A (en) 1978-05-13
FR2364457B1 (en) 1980-04-25
JPH0147999B2 (en) 1989-10-17
CH631208A5 (en) 1982-07-30
JPS60105494A (en) 1985-06-10
FR2364457A1 (en) 1978-04-07
DE2740957C2 (en) 1987-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4271264A (en) Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions
US4250254A (en) Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions
EP0034213B1 (en) A stabilized aqueous coenzyme solution for use in a clinical assay, a method of stabilizing a labile coenzyme in an aqueous clinical assay solution and a kit for use in said clinical assay
US4372874A (en) Stabilization of hydrolysis prone labile organic reagents in liquid media
US4277562A (en) Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions
EP0072581B1 (en) The stabilization of working reagent solutions containing enzymes, and the use of such stabilized reagents in enzyme or substrate assays
SE446742B (en) STABILIZED FLUID Aqueous Mixture CONTAINING ENZYMES AND / OR COENZYMS FOR USE BY BIOLOGICAL AND DIAGNOSTIC DETERMINATIONS AND SETTING TO STABILIZE Aqueous Enzyme and / or Coenzyme
US4310625A (en) Stabilized liquid enzyme compositions for diagnostic determinations
CA1092035A (en) Liquid stabilized coenzyme
CN105002263B (en) A kind of reduced coenzyme complex reagent and its application
JPS6324900A (en) Stabilized liquid enzyme composition for quantifying glucose, test kit using the same and quantifying method
JPS5934119B2 (en) Composition for measuring creatine kinase
US4132598A (en) Stabilized liquid phosphate containing diagnostic compositions and method of preparing same
CA1091174A (en) Stabilized liquid enzyme
US5266472A (en) Stabilization of the enzyme urate oxidase in liquid form
CA1127055A (en) Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions and method of preparing same
US4310624A (en) Stabilized liquid coenzyme compositions for diagnostic determinations
JP5812285B2 (en) Method and kit for measuring dehydrogenase or corresponding substrate
EP0119722B1 (en) Measuring composition
US4219645A (en) Stabilized nicotinamide-adenine dinucleotides and process for their preparation
JP5843072B2 (en) Method for measuring specific substance and kit for measuring specific substance
US5834227A (en) Kit for assaying creatine kinase
EP0006582A2 (en) Method for stabilizing solutions of gamma-glutamyl-p-nitroanilide
JP3470099B2 (en) Stabilized coenzyme solution for measuring dehydrogenase or its substrate and use thereof
JPS5995900A (en) Composition for determination

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed

Ref document number: 7711853-7

Effective date: 19870915

Format of ref document f/p: F