JPS5843078B2 - 安定化した液体酵素及び助酵素組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的には、酵素と助酵素の安定化と安定化の
方法のある新しく、かつ有用な改良にかかるものである
。

更に詳しくは、単一の水溶性有機溶媒中で、不安定な酵
素と助酵素を安定化するものである。

現在、商業ベースで行なわれている酵素又は助酵素の反
応能力を安定化させる方法は、主として製薬等の工業で
乾燥粉を錠剤化するときに用いられる凍結乾燥又は乾燥
混合によって、ソリッドマトリックスに酵素等を固定化
するものとソリッドマトリックス中に酵素の化学構造を
固定化するものである。

これらの方法は、実際的でも望ましいものでもないし、
コストが高くつく不具合もある。

メーカーは水分を除去したり、不完全な製品を供給させ
ざるを得ないのが現状であり、希釈中の品質管理工程の
部分を放棄したり、決定的な製品の使用を放棄している
。

製薬所では、包装、試薬ロス、凍結乾燥及び乾燥混合に
高いコストをかけざるを得ないし、製品の有効性は包装
様式とサイズにより更に制約される。

更に、製品の均一を良くすること困難である。

このことは大抵の商業ベースの凍結乾燥の標準細潰のび
ん間の酵素成分の許容度は平均で±１０係であると記録
されていることからも分る。

従って、単一の容器の中に安定化した助酵素及び、又は
酵素が液体組成を供給することが、本発明の第一の目的
である。

酵素の助酵素の安定化が相当の期間経過後もその酵素活
性に影響を与えないような、水溶性有機溶媒を用いたタ
イプの不安定な酵素及び助酵素組成物を供給するのが、
本発明の第二の目的である。

その他の不安定な助酵素又はその外、他の不安定酵素が
共存しても、不安定な酵素及び、又は助酵素を安定化で
きる方法を供給し、かつその組成物の保存性が優れてい
るということが、本発明の次の目的であり、顕著なとこ
ろである。

本発明では、 ａ）水性媒体 ｂ）少くとも上記水性媒体に溶解し、ある測定をなすの
に充分な量の助酵素、及び／又は上記水性媒体に溶解し
た少くとも１００１．Ｕ、の酵素、Ｃ）上記水性媒体中
に存在する少くとも室温で液体である５％Ｖ／Ｖ以上の
非反応性かつ水混和性の有機溶剤を含む組成物であって
、ｐＨ約６．０〜約８．５の液体組成物を提供する。

これによって、通常水性媒体中で不安定な酵素例えばグ
ルコース−６−フォスフニードブハイドロゲナーゼ、ヘ
キソキナーゼ、グルタメートデバイドロゲナーゼ、クレ
アチンフオスフオキナーゼ、クレアチンキナーゼ、ピル
ベートキナーゼ及びアルカリフォスファターゼや助酵素
、例えばニコチンアミドーアゲニン ジヌクレオタイド
、アデノシン トリフオスフェート、アデノシン−５７
−ジフオスフエート、ニコチンアミド−アデニン ジヌ
クレオタイドフオスフエート及びアデノシンモノフォス
フェートを安定な液体組成物として生化学的診断測定に
使用できるものとする。

本発明に従って不安定な酵素と助酵素を処理すると、そ
の結果、酵素又は助酵素の反応性や光学的吸収能力に影
響を与えることなく長期間安定となる。

安定な液体状の酵素と助酵素試薬を提供することは現在
、他の系統的分類法と同様にＮＡＤ／ＮＡＤＨの一緒に
なった系統的分類法の比色適応能力を高める、これは主
にその成分の分離が容易にできるからである。

安定な液体試薬は、ＮＡＤＨと他の助酵素の消費が測定
の基礎であり、カラー試薬がＮＡＤＨとその主反応から
分離せねばならないような時には特に有利である。

紫外線モードでは、液体系は、凍結乾燥又は乾燥媒体の
調整品とくらべて使用の柔軟性があるだけでなく、薬の
均一性と包装性に優れている。

以下に述べるような酵素と助酵素の安定性を与えるよう
計画されている液媒では、一つ又はそれ以上の助酵素が
その媒地の中で、安定化できるというように、全く特異
な系をとるものである。

この他一つ又はそれ以上の酵素がその液体媒地で安定化
される。

更に助酵素も酵素も単一容器中で、同じ液媒地で安定化
される。

酵素及び、又は助酵素の安定性は、蒸留水中に更に付加
的にゼラチンのようなポリマーをとかすことでなしとげ
られてもよい。

ゼラチンは主成分の０．１％Ｖ／Ｖになるように溶解す
るのがよい。

その抜水にとかしたゼラチンをゼラチンが全部溶けるよ
うに約３０℃まで加熱する。

ある場合には、殺菌剤としてだけでなく、安定剤として
も働くアシビ化合物を用いてもよい。

その後、この溶液を室温即ち約２０℃に冷やすことが必
要である。

−ツのケースとして、助酵素ニコチンアミドーアデニン
ジヌクレオタイド（ＮＡＤ）を、ｐＨの調整のために
トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタンのような緩
衝剤と共に、この溶液に加える。

この場合、ｐＨば、望ましいｐＨば、７．５であるが、
約６．０から約８６５の間で調整する。

助酵素を添加した後で、グリセロールのようなポリオー
ルを約３０ ％Ｖ／Ｖになるように加える。

ポリオールを加えた後に、ｐＨを再び約７．５になるよ
う調整する。

本発明によると、一つ以上の助酵素が、上記の溶媒中で
安定化される。

この場合助酵素の他のものはＮＡＤの添加前又は後でも
加えることができる。

例えば、本発明の他の実施例として、アゾンシン トリ
フオスフェート（ＡＴＰ）を他の助酵素として加えるこ
とができる。

助酵素を添加し、液体のｐＨを調整した後に、例えばヘ
キソナーゼ（ＨＫ）のような酵素も加えることができる
。

代表的な例として、ヘキソナーゼをグリセロールサスペ
ンション又は、硫酸アンモニウムサスペンションのよう
なサスペンションにして加えることができる。

例えば、グリコース−６−フォスフェート デヒドロゲ
ナーゼのような他の酵素も加えられてもよい。

安定化した液状の酵素及び、又は助酵素溶液を準備した
後、アンバーガラスびんに移し、密封の状態にシールす
る。

更に、これらのびんは、代表的な場合には、冷凍下で貯
蔵される。

安定化した酵素と助酵素の保存性は、顕著な減成なしに
、これらの条件下で４年間までのびる。

本発明を更に詳細に説明する。

臨床診断の分野における本発明の商業的応用は、これに
限定されるものではないが、例えば生物分泌液のグルコ
ース濃度などというように基質濃度を決めるために用い
られる診断試薬で示される。

にも拘わらず、本発明に関連して調整された組成物は、
他の生物的成分を決定し、定量することができる。

例えば生物分泌液中の次のような成分を決定し、定量で
きる。

１ グルタミツクーオキザロアセティツク トランスア
ミナーゼ（ＳＧＯＴ） ２ グルタミツクーピルビック トランスアミナーゼ（
ＳＧＰＴ） ３ ラフティック デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ−Ｐ） ４ ラフティック デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ−Ｌ） ５ クレアチン フオスフオキナーゼ（ＣＰＫ）６ α
−ハイドロキシブチイック デヒドロゲナーゼ（α−Ｈ
ＢＤ） ７ グルコース（ヘキソナーゼー〇−６−ＰＤＨ経由） これら上述の試薬は、しばしば同じように反応し、いく
つかの共通な不安定成分を含み、そこに含まれているい
くつかは共通している。

次の化学反応式は、含まれる反応の一般的な性質を図示
するモデルとして示す。

反応式１・・・・・・・・・・・・一般的モデル上にあ
げたすべての酵素反応は、本発明と一致して、この一般
式に従うであろう。

ここでの反応（２）は、常にカップリング反応として参
照され、反応（２）又は（３）は、測定反応として、又
反応（１）は、初期反応として特徴づけられる。

しかしながら、これら３つのすべての反応が測定に必要
なのでなく、事実それらは、二つ又は一つに限定しても
よいということが分っている。

ラフティック デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）活性の紫外線
測定の場合には、反応２）のみが含まれ、下記の通りで
ある。

逆に、上述の３つの反応以上のものが、クレアチン フ
オスフオキナーゼ（ＣＰＫ）の場合のように、含まれる
かもしれない。

記号： ＣＫ−クレアチン キナーゼ ＣＰ−クレアチン フォスフェート ＣＰＫ ＝クレアチン フォスフアーゼ ＡＤＰ ＝アデノシンー５７−ジフオスフエートＡＭ＝
アデノシン モノフォスフェート ＡＴＰ −アゾンシン トリフオスフェートＨＫ−ヘ
キソナーゼ ＮＡＤ ＝ニコチンアミドーアデニン ジヌクレオタイ
ド ＮＡＤＰ−ニコチンアミド−アデニン ジヌクレオタイ
ド フォスフェート ＮＡＤＨ２＝ニコチンアミド−アデニン ジヌクレオタ
イド、 還元形 ＧＬＤＨ−グルタメート デヒドロゲナーゼＧ−６−Ｐ
ＤＨ−グルコース−６−フォスフェート デヒドロゲナ
ーゼ Ｇ−６−Ｐ−グルコース−６−フォスフェートＩＮＴ
＝テトラゾリウム塩 ＰＥＰ ＝フォスフオニノール ピルベートＰＭＳ
＝フェナジン メソサルフェートＰＫ＝ピルベート キ
ナーゼ この場合に、反応（２）と（３）はカップリング反応と
考えられ、反応（３）と（４）は測定反応、そして反応
（１）は初期反応であろう。

反応式１・・・・・・・・・一般式を参照して、この反
応順序を利用することで、反応基質／生成物か又は触媒
酵素かのいずれかの定量分析をすることができるという
ことを明らかとなり、一般に知られている。

生物学の分野におけるこれら構成要素の定量化は人又は
動物の病状の診断や処置の手段として広く受は容れられ
使用される。

酵素は大きな分子量をもつ複雑な蛋白質分子で、通常そ
の化学構造は未知のものが多く、現在その触媒能力と、
基質特異性で分類されている。

酵素は単一の基質、又は類似の基質群の反応を触媒する
ことのできる生物的触媒として再定義されるであろう。

助酵素はよく定義づけられた構造をもつ低分子量の生物
的化学物質で、その反応又は相互作用は、特殊な酵素の
分析又は反応に必要である。

助酵素は触媒として、その構造又は原子組成に不可逆的
な変化を生じる。

助酵素は、臨床分析処置に非常に有用である。

あるものは非常に強い吸光をもち、その反応は基質に従
い化学量論的であり、それ故、吸光形の出現と消失を測
定分析的に追跡できる。

ニコチンアミド−アデニン ジヌクレオタイド（ＮＡＤ
）と、その還元形（ＮＡＤＨ２）は、上述のＳ、Ｇ、０
．Ｔ、 Ｓ、Ｐ、Ｇ、Ｔ、、ＬＤＨ分！ 析のような多くの重要な臨床分析に用いられている。

ＮＡＤとＮＡＤＨ２は約７００の分子量をもつ非常に複
雑な生物分子である。

ＮＡＤＨ２ば３４０ｎｍに強い吸収をもち、一方ＮＡＤ
ばこの波長では吸収しない。

基質は既知の構造をもつ有機化合物で、それら反応又は
相互反応物が酵素によって触媒されて、その成分の構造
や原子組成や、立体的化学ローテーションに変化を生じ
ないものである。

一般に基質は、それらがバクテリアや菌類や、他の微生
物の食物として使われて微生物的減成をする傾向がある
。

換言すれば、これらの化合物は水媒中又は、中性に近い
ｐＨ（ｐＨ４から１０の範囲）内で安定を保つ。

顕著な基質は、グルコース、ラクテート、又はラフティ
ックアシッド グルコネートなどである。

次の反応式は、助酵素ＡＴＰとＮＡＤを使って、グルコ
ースを決定することを図示したものである。

フオスフオグルコ酸 初期反応を起こす酵素はへキソキナーゼであり、そして
カップル反応及測定反応をおこす酵素は、Ｇ−６−ＰＤ
Ｈである。

上の反応においてグルコースは測定反応で生じたＮＡＤ
Ｈを測定することで決定される。

実際は、この反応は、完全に終了するまで行ない、生成
した助酵素ＮＡＤＨの量を本質的に測定すればよい。

ＮＡＤば、水の中と乾燥状態では不安定であるが、湿気
のある状態にさらされた時には、ＮＡＤＨ２から還元さ
れたものほどそう不安定ではない。

従って、ＮＡＤＨ２は湿気のあ′るところで保存しなけ
ればならない。

一方ＮＡＤは、本発明に従って、水溶液中で容器にパッ
クでき、安定化される。

酸性ｐＨでは安定性は良いが、アルカ’Ｊ ｐＨでばＮ
ＡＤばこわれやすい傾向がある。

正確なメカニズムも、最終生成物も明らかではないが、
破壊されたＮＡＤば、もはや助酵素として効果的に働く
ことができないということだけで充分だし、必要な波長
で有効な影響ももっていない。

本発明のユニークな利点の一つは、すべての成分が、−
うの試薬びんの中で安定化できるということである。

一般に、安定化した酵素又は助酵素を簡単に述べると二
つの重要な価値がある。

これらの価値の一つは、水媒中で非常に安定性の高い酵
素又は助酵素を供給するということであり、第二の価値
は、可能な限り包装の数を制限できるということである
。

ＮＡＤのような助酵素の安定性について、ＮＡＤばＮＡ
ＤＨよりもずっと安定であるということが観察されてい
る。

それ故、ＮＡＤＨの場合に、必要な複雑な安定化の技術
を使う必要はない。

従って、すべての試薬は、一つの溶液中にパックできる
。

本発明の酵素と助酵素を安定化するに際し、例えば、ゼ
ラチンのようなポリマーを蒸留水にとかしてもよいが、
このポリマーは冷凍下で沈澱を生ぜず、均一な混合物で
いられる量だけ、安定した溶液に添加するのが望ましい
。

このポリマーば、全組酸物に対して、約０．０１％から
約０．５％の量だけ存在すべきであり、０．０５％から
０．２５％の範囲が適当である。

本発明に用いられる安定剤として有用な水溶性ポリマー
はいずれも酵素活性を阻害しないものであり、かつポリ
マーマトリックス中で、酵素を固定することができるも
のである。

このポリマーば、ポリビニールピロリジンのような合成
物質又は、変性したコラーゲンであるゼラチンのような
生物的に生成したデキストランのような有機物質であっ
てもよい。

ポリマーは、一般的に約３０℃まで加熱することにより
、水に溶かす。

ポリマーの水に対する溶解度は温度の増加に伴ってふえ
る。

ポリマーが完全に水にとけたあと、アジド塩のようなア
ジド化合物を加えることができるが、その量は約０．１
％Ｗ／Ｗが望ましい。

しかしながらアジド化合物の量は０．０１％から約０．
５％の範囲であってもよい。

アジド化合物は、酵素の安定性を助けるのにむしろ驚く
ほどの効果を示すことが、本発明で見出された。

従来はアジド化合物は単にバクテリアの働きをとめるも
の又は殺菌剤として働くと考えられていた。

他の成分とのくみ合わせ下で、アジド化合物の安定化の
完全なメカニズムは完全には理解されていないが、アジ
ド化合物が安定性を増すということが確立された。

多くの場合、アジド塩は必要でなく、除去することもで
きる。

かくして多くの場合、水媒中のポリマー及び有機溶媒だ
けで不安定成分の必要な安定性を与えるのに充分である
。

ある二三の場合には、アジド塩は安定化を妨害したり、
例えばグルコースのような基質に本質的な影響を与える
傾向があるので、除去しなければならない。

前述に加え、基質と化学的に反応しない又は、酵素反応
を阻害しない他の殺菌剤や殺黴剤が採用される。

例えばアジド塩に添加して用いられるこれらの殺菌剤等
のいくつかは、安息香酸、フェノール、チモール又は、
ペンタクロフェノールである。

ある場合には、安定化した組成物を使うとき、反応の開
始を助長するマグネシウムのような金属を採用するのが
望ましい。

塩化マグネシウムという塩の形で用いられるマグネシウ
ムは、この目的のために提供された試薬の一つである。

この試薬は、本発明の安定化した組成物に加えるのでな
く、使用の際に加えるのである。

カップルする酵素を活性化するこの試薬は、約０．０１
％から約１係までの量で使うべきであるが、約０．０３
％が望ましい。

このプロセス中のこの時点で、溶液を、水浴中で約２０
℃から２５℃くらいの室温に冷やす。

この溶液を冷やした後で、トリス（ハイドロキシメチル
）アミノメタンのような緩衝剤を加える。

代表的には、この緩衝剤は約５０ミリモルから２００ミ
リモルの量を加えるが、少くともｐＨ゛を６、。

ヵ１．約８．５（７）範囲内、。保つ。、３充分ヶ量≠
、ある。

他の既知の緩衝剤及び他の形の緩衝剤がこのプロセスに
採用することができる。

ある場合に、緩衝塩をｐＨを６．０から８．５の間に維
持するのに必要な量だけ加える。

一般的に、緩衝剤は、０．１から１係のアルカリ金属の
水酸化物と、０．５から３係のアルカリ金属の酸性炭酸
塩の組み合わせである。

金塩容量は必要とするポリマーの量にも影響される。

更に高い塩容量例えば重量で４係以上では、塩によって
与えられる静電安定化のためにポリマーの必要量は少な
くなる。

しかしながらこの高い塩容量では、ポリマーが溶液を濁
らせたり、沈澱したりするので、再溶解するために、溶
液をあたためる必要がある。

溶液のｐＨを所望の範囲に調整してから、ＡＴＰ又はＮ
ＡＤ等のような、最初の助酵素を加える。

この場合、ＡＴＰは、全組成物の約０．３ミＩＪモルか
ら約３０ミリモルの間で加える。

前述のように、安定化した酵素及び助酵素相方を含む溶
液を形成することができる。

このようにして、２以上の助酵素及び２以上の酵素を同
一溶液中で安定化できる。

例えば、助酵素ＡＴＰは、ここで述べる方法で安定化さ
れる。

他方、ＮＡＤもここで述べる方法によって独自に安定化
される。

しかしながら、２以上の助酵素を安定化するとき、その
助酵素は、一般的に同時に加えてもよいし、どんな順序
で加えてもよい。

ＮＡＤは、全組成物の約０．６ミＩＪモルから約６０ミ
リモルの範囲で加えるのが望ましい。

このプロセス中のこの時点で、ｐＨは少くとも６゜５か
ら約ＥＩＯ以下の範囲に調整するべきであり、７．５の
ｐＨが望ましい。

ｐＨ調整後、グリセロールのような適当な有機溶媒を加
える。

この場合、２５％から４０ ％Ｖ／Ｖの範囲内であるが
、一番望ましいのは、有機溶媒を３０ ％Ｖ／Ｖ加える
ことである。

しかしながら、有機溶媒の量は、約５係から７０％Ｖ／
Ｖの間で変化させうる。

有機溶媒は次の特性をもつべきである。

１ ｐＨが４から１０の範囲； ２ 室温又は冷凍温度下で液体であること；３ 静電気
結合（水素結合）を生成する以外は、ＮＡＤ又はＡＴＰ
及び同様のものと反応しない；４ 水と混和しゃすい； ５ 加溶媒分解の標準フリーエネルギーが低い（ノルマ
ルレゾナンスが決っている）。

溶剤は、水にとけ、室温又は冷凍温度下で液体で、かつ
静電気結合を形成する以外は、酵素と助酵素の反応基と
反応して減成しないものでなければならない。

有効な溶剤は一般に、エーテル類、ケトン類、スルホン
類、スルホキシド類のような安定な有機溶媒と、メタン
、エタノール、プロパツール、ブタノールのようなアル
コール類、アセトン、ジオキサン、ＤＭＳＯ、ジメチル
スルフォン及びＴＨＦである。

しかしながら、この処理段階での溶媒の濃度が低いほど
高い活性が、液体ポリオール溶媒の場合に見出されてい
る。

例えば、グリセロール、エチレングリコール、フロピレ
ンゲリコール又はブタンジオールのような２ないし４の
水酸基と２ないし１０の炭素原子を含む液体ポリオール
類が望ましい。

グリセロール、プロピレン グリコール、１．２−フロ
パンジオールは、これらすべての特性をもっていること
が分っており、よりぬきの溶媒である。

選ばれた有機溶媒がポリオールであるとき、アジド化合
物や他の殺菌剤をこのために用いる必要はない。

というのは、ポリオールが殺菌剤として有効に働くから
である。

しかしながら、選ばれた溶媒及びポリマーが、水溶媒中
で必要な安定性を与えるとはいえ、ポリマーと酵素間の
カップリングを増加すると考えられる限りにおいてはア
ジド化合物が時として望ましいものである。

グリセロール又は他のポリオールを添加後、できた溶液
のｐＨを再調整する。

代表的には、ｐＨばわずかに塩基性に傾くので、１規定
のＨＣｌを添加してｐＨを調整する。

同様にして、もしｐＨがわずかに酸性になるならば適当
な塩基を加えて、ｐＨを７．５に調整する。

重要なことの一つは、助酵素ＮＡＤが過剰量存在すると
いうことである。

前述のようにグルコースの決定は、ＮＡＤから生成する
ＮＡＤＨを測定することで達成される。

ＮＡＤＨは、酸性環境では不安定で、ｐＨ５で減成しは
じめるし、更に、ｐＨ４では非常にすみゃかに減成する
。

従って、溶液のｐＨば、中性ｐＨ７以上を保つべきであ
る。

ＮＡＤば、酸性環境下で実際には安定であるが、本発明
によると、ｐＨ７，５のわずかに塩基性の環境下でも本
質的に減成しないことが分っている。

ＮＡＤば、かなり過剰に加えても、この液体環境下で、
数年経過後にも常に充分な減成しないＮＡＤが存在する
。

一般にいって、所望の決定を行なうのに少なくとも十分
な量ですべての助酵素を含ませる。

助酵素の最大量は商業的な実用性によって制限されるが
、本質的に最大量はない。

助酵素を液体溶液に加えた後、選んだ酵素を加える。

助酵素の場合と同様、酵素はどんな順序で加えてもよい
。

又１つ又はそれ以上の酵素を同一の溶液に加えてもよい
。

本発明による望ましい観点および、上述の酵素系による
と、二つの酵素は、ＨＫとＧ−６−ＰＤＨである。

ＨＫはリットル当り１１１１．Ｖ、以上加えるのが望ま
しい（ｐＨが７．６．２５°Ｃ）。

しかしながら、少なくともリットル当り１．０００１．
Ｕ、のＨＫを加えるのが望ましい。

Ｇ−６−ＰＤＨは、Ｌ−メセンテロイド菌から形成し、
リットル当り約１００１．Ｕ、から３０．０００１．Ｕ
、又はそれ以上の範囲に濃縮するのが望ましい。

本発明によると、通常ｐＨが約７．８で、２５°Ｃで使
われるとき、２つのタイプのＧ−６−ＰＤＨの量は約３
．０００ Ｉ 、Ｕ、が望ましい。

酵素の量は少くともリットル当り１００１．Ｕ。

（インターナショナルユニット）存在すべきであるが、
大抵の商業ベースの試薬では、酵素例えばヘキソキナー
ゼ゛ば、少くともリットル当り１．０ＯＯ１，Ｕ、存在
すべきである。

通常の商業ベースの包装品では酵素はｐＨ７，６で約２
５℃の温度下で約１．０００から１０．０００１．Ｕ、
存在する。

しかしながら、通常大抵の場合、酵素の量は１００．０
００１．Ｕ、を越さないものであるが、酵素の最大量に
は制限はない。

本発明のプロセスでは、酵素は最終のｐＨが調整された
あとで加えるということが重要である。

酵素と助酵素の安定化成就する全メカニズムは、まだ完
全には分っていないが、基質反応が現実に起反分子の一
部であるか又は他に触媒化される官能基をその選ばれた
溶媒が保護することによって、溶媒中の酵素を安定化さ
せると考えられる。

更に、安定化は、酵素と助酵素を微生物汚染を防ぎ、か
つ減成を防ぐことによって、得られると考えられる。

助酵素ＮＡＤば、助酵素ＮＡＤＨとＮＡＤがプロピレン
グリコールのような溶剤に多少溶けにくいという点で異
っている。

しかし、ＮＡＤば、水に対し更に安定であり、助酵素は
ポリオールによって安定化されるようだ。

純粋なポリオールは、酵素を変性するが、水と溶媒の混
合物のような水溶液の存在下では、酵素は変性しない。

極性基が安定状態に酵素の活性基を維持するために有機
溶媒中に必要であるということば明らかである。

明らかに、酵素及び助酵素は、触媒活性を保持し、指定
濃度に減成しない限りにおいて、ある形の物理的又は化
学的反応が濃縮した水性有機溶媒中で起っている。

更に、ポリマーは酵素とポリマーの間に静電気又は共有
結合が生じるために、アジド化合物とある形で反応する
ようだ。

実際は、ポリマーは酵素の活性基をいくらかカプセル化
するためにひっばり、それによって、保護するようであ
る。

こうして酵素の減成又は、他の形の減成が防止されたり
、あるいは起らなくなる。

上述のように、同一溶液中において少なくとも２以上の
助酵素又は２以上の酵素を安定化させることができる。

更にもつと重要なことは、同一溶液で酵素と助酵素双方
を安定化することが可能であるということである。

ポリマーがある程度の安定効果を持つようだが、有機溶
媒の水溶液が助酵素を安定化する主な要因であると考え
られる。

酵素の安定化において、有機溶媒とポリマーの双方が、
安定化を生じる主な要因であるようだ。

加えて、多くの場合、アジド塩が安定性を増すことを助
ける。

いずれの場合にも、酵素も助酵素もまだ同一の溶液にあ
ることが観察できる。

安定化された酵素及び助酵素組成物で達成されるその後
の反応のいくつかは以下の通りである。

クレアチンのリン酸化を含む反応は次の通りである。

残る反応はすべて上述の記号衣を参照して、自ずから説
明される。

ＮＡＤＰ反応については、ＡＤＰ反応に対しては 次の反応においては、クレアチン＋ＡＴＰの出発反応が
ＡＤＰを供給するために採用される。

従って、 次の反応は、安定化した液体組成物中で、ウレアーゼと
ＧＬＤＨ酵素を使用した場合を示す。

本発明はこれに限るものではないが、更に示すと次のよ
うな実施例がある。

実施例 １ 約０．７ｇのゼラチンポリマーを約７００ｒＩＬｌの水
に加える。

この溶液を、ゼラチンポリマーを溶解するために約３０
℃以上に加熱する。

ポリマー添加後、温度を約２２℃に下げるために水浴に
入れる。

それからｐＨを６．５から８．０の範囲内に調整する。

温度が下がり、ｐＨ調整後、約２ｇのＡＴＰをこの溶液
に加え、次に４９のＮＡＤを加える。

３ｇの塩化マグネシウムをＮＡＤと共に加える。

それから３００ｒＩＬｌのグリセロールを加える。

グリセロール添加後、ｐＨを１規定の塩酸を添加して約
７，５に調整する。

完全な溶液ができた後、溶液はプラスティック又はガラ
スの容器に移し、密閉する。

容器は、密閉して冷凍下で貯蔵する。

このようにして、安定化された助酵素組成物ば、特別な
減成もなく最高４年まで安定して貯蔵できることが分っ
ている。

実施例 ２ 実施例１で作ったサンプルは、ガラス容器に密閉する前
に、酵素ヘキソナーゼも加えることができる。

保存性も特別な減成なしに同じである。実施例 ３ 実施例２のサンプルは又、ガラス容器に密閉する前に、
酵素Ｇ−６−ＰＤＨを加えることができ、保存性も特別
な減成なしに同様にながいものが得られる。

実施例 ４ 約１．（Ｂｉ！のデキストランポリマーを約７００ｒＩ
Ｌｌの水に加える。

次にこの溶液を３０℃以上に加熱して、ポリマーを溶解
する。

この溶液を温度を約２２℃に下げるために水浴に入れる
。

温度が下った後に、約２．２９のＮＡＤＰを溶液に加え
、次に、４ｇのＡＴＰを加える。

溶液のｐＨを６．５から８．０の範囲に調整した後、３
２５ＷＬｌのグリセロールを加える。

グリセロール添加後、ｐＨを１規定の塩酸で約７．５に
調整する。

完全な溶液ができた後、溶液をプラスチック又はガラス
容器に移し、フタをする。

容器は空気が入らないように密閉し、冷凍下で保存する
。

アジド塩を加えてないが、安定化された助酵素の組成物
はほとんど実施例１の組成物と同様に有効であるという
ことが分っている。

次の例は、式の形で表しであるが、本発明の安定化され
た組成物を作る種々の重要な段階で加えられる試薬及び
その量を示している。

実施例 ６ 安定化したＡＤＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ、ＨＫ及Ｇ−−ＰＤ
Ｈ リットル当り約３００１．Ｕ、から約１５，０００１、
Ｕ、のＧ−６−ＰＤＨ及びリットル当り約１００１、Ｕ
、から約１０，０００１．Ｕ、のＨＫをパック前の実施
例５の液に加える。

実施例 ８ ＮＡＤ及びＨＫの安定化 １．５９のＮＡＤ ０．１モルのｐＨ７のピペラジン ビス エタンスルフ
オン酸緩衝液の１０ｍ１に溶解 ｐＨを６から７に調整 １０ｒＩＬｌのグリセロールを添加 ｐＨを再調整 ミリグラム当り１５０１．Ｕ、の活性をもつ）ＴＫを１
０１ｎ？添加し溶解 実施例 ９ クレアチン、ＡＴＰ及びＰＥＰの安定化 実施例 １０ 実施例９の安定化した溶液に、リットル当り１００から
１０，０００１．Ｕ、のＬＤＨを加え、そしてリットル
当り１００から１０，０００１．Ｕ、のＰＫを加え、包
装する。

実施例５から１０の組成物は、各４例ら本質的な減成も
なく、４年近くの長期保存性を有し、その保存安定性は
現在市販されている凍結乾燥品より以上のものであった
。

次に、本発明を利用した診断測定試薬について実施例を
示す。

実施例 １１ グルコース試薬 それぞれ１８ｍ３６ケ月の貯蔵寿命をもつ水性酵素試薬
と水性酵素試薬を用いて、下記の組成からなる水性複合
試薬を作成した。

この複合溶液は２°〜８℃で４ケ月、２３℃で１０日間
安定であった。

実施例 １２ クレアチン キナーゼ 試薬 クレアチンフォスフェートとグルコースをｐＨ約９．８
の３０％Ｖ／Ｖグリセロール水溶液に含む水性助酵素試
薬溶液１０容量部と、ｐＨ６，０〜６．２の６係グリセ
ロール水溶液に酵素を含む水性基質試薬９０容量部を用
いて、下記の組成からなる安定な複合試薬を作成した。

（前日助酵素試薬及び基質試薬の貯蔵寿命はいずれも１
８〜３６ケ月であった。

）この複合試薬は２〜８℃で約２ケ月の貯蔵寿命を有す
るものであった。

実施例 １３ ポリマー含有タレアチン キナーゼ系試薬下記のＣＫ−
ＵＶ基質、助酵素及び緩衝剤水溶液はいずれも２〜８℃
で１８〜３６ケ月の貯蔵寿命を有するものであった。

１ ＣＫ−ＵＶ基質： クレアチン フォスフェー
ト３００ｍＭ；アデノシン−５′−シフオスフェート（
ＡＤＰ）２８ｍＭ；アデノシン−５′−モノフォスフェ
ート（ＡＭＰ）２５ｍＭニゲルコース−６−フォスフェ
ート デヒドロゲナーゼ（Ｌ、メセンテロイド類）≧
４００００ＩＵ／ｌ；アジ化ナトリウム１％ｗｇｔ／Ｖ
：グリセロール３０容量係。

２ ＣＫ−ＵＶ助酵素： ニコチンアミド アデニ
ン ジヌクレオチド（ＮＡＤ）３０ｍＭ：アデノシン−
５７−モノフォスフェート（ＡＭＰ）２２ｍＭ；ヘキソ
ナーゼ（イースト）≧ １６００００ ＩＵ／１（ｐＨ８，０） ；マグネシウ
ム２００ｍＭ；グリセロール５０容量係。

３ＣＫ−ＵＶ緩衝剤： Ｄ−グリコース８３ｍＭ；Ｎ−
アセチルシスティン１２ｍＭ；ジチオトレイトール６５
ｍＭ；イミダゾール２５ｍＭ： ＥＤＴＡ、デキストリ
ン、ｐＨ５，３゜容量比１：１：１０の割合でこれらを
用いて、下記の組成の複合溶液を作成した。

複合溶液は２〜８℃で１０日間安定であった。

なお、実施例（１１）〜（１３）に貯蔵寿命１８〜３６
ケ月とあるのは、測定された貯蔵寿命が３６ケ月で、市
販時に保証される寿命が１８ケ月であることを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ａ）水性媒体 ｂ）少くとも上記水性媒体に溶解し、ある測定をなすの
   に充分な量の助酵素、及び／又は上記水性媒体に溶解し
   た少くとも１００１．Ｕ、の酵素、Ｃ）上記水性媒体中
   に存在する少くとも室温で液体である５ ％ Ｖ ／
   Ｖ以上の非反応性かつ水混和性の有機溶剤を含む組成物
   であって、 上記組成物は約６．０から約８．５の間のｐＨを有し、
   かつ上記酵素がグルコース−６−フォスフ・エートデバ
   イドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルタメートデバイ
   ドロゲナーゼ、クレアチンフオスフオキナーゼ、クレア
   チンキナーゼ、ピルベートキナーゼ及びアルカリフォス
   ファターゼからなる群から選ばれ、上記助酵素がニコチ
   ンアミドーアデニン ジヌクレオタイド、アゾンシン
   トリフオスフェート、アデノシン−５７−ジフオスフエ
   ート、ニコチンアミドーアデニンジヌクレオタイドフオ
   スフエート及びアデノシン モノフォスフェートからな
   る群から−選ばれることを特徴とする通常水性媒体中で
   不安定な酵素及び助酵素の少なくとも一種を含有する生
   化学的診断測定に使用される安定化した液体組成物。 ２ 上記組成物が最初の不安定助酵素に加えて、少なく
   とも上述の有機溶剤により安定化される一種以上の第二
   の不安定助酵素を含有することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の組成物。 ３ 更に、上記溶剤が、 ａ） ｐＨが４から１０ ｂ）室温及び冷凍温度で液体 Ｃ）静電気結合を生じる以外は、助酵素又は酵素と反応
   しない。 ｄ）水と混和する。 ｅ）加溶媒分解の標準フリーエネルギーが低い（ノルマ
   ルレゾナンスが決っている）という性質をもつことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ４ 上記組成物が少くとも２つの助酵素と、少くとも２
   つの酵素を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の組成物。 ５ａ）少くとも３０％Ｖ／Ｖの非反応性の水性媒体 ｂ）上記水性媒体に溶解し、判定反応中に協同し、判定
   するのに少くとも充分な量の助酵素 Ｃ）少くとも室温で液体である、上記水性媒体中の水混
   和性有機溶剤を含む組成物であって、ｄ）助酵素が安定
   であるように約６．０から約８，５のｐＨを有し、かつ ｅ）上記助酵素がニコチンアミドーアデニンジヌクレオ
   タイド、アデノシン トルフォスフェート、アデノシン
   −５７−ジフオスフエート、ニコチンアミド−アデニン
   ジヌクレオタイドフオスフエート及びアデノシン モ
   ノフォスフェートからなるクラスから選ばれることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ６ 上記有機溶剤が、室温及び冷凍温度で、助酵素及び
   水性媒体と非反応性であることを特徴とする特許請求の
   範囲第５項記載の組成物。 ７ 助酵素が、液体組成物のリットル当り１．２グラム
   以上の濃度のＮＡＤであることを特徴とする特許請求の
   範囲第５項記載の組成物。 ８ 上記有機溶剤が ａ） ｐＨが４から１０ ｂ）室温及び冷凍温度で液体 Ｃ）静電気結合（水素結合）を生成する以外は助酵素と
   反応しない ｄ）水と混和しやすい ｅ）加溶媒分解の標準フリーエネルギーが低い（ノルマ
   ルレゾナンスが決っている）という性質をもつことを特
   徴とする特許請求の範囲第５項記載の組成物。 ９ 上記有機溶剤がポリオールであることを特徴とする
   特許請求の範囲第８項記載の組成物。 １０ａ）水性媒体 ｂ）少くとも上記水性媒体に溶解し、ある測定をなすの
   に充分な量の助酵素、及び／又は上記水性媒体に溶解し
   た少くとも１００１．Ｕ、の酵素、Ｃ）上記水性媒体中
   に存在する少くとも室温で液体である５％Ｖ／’Ｖ以上
   の非反応性かつ水混和性の有機溶剤、及び ｄ）本質的に酵素反応を阻害しない水に溶けるポリマー
   を含む組成物であって、 上記組成物は約６．０から約８．５の間のｐＨを有し、
   かつ上記酵素がグルコース−６−フォスフニードブハイ
   ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルタメートデバイド
   ロゲナーゼ、クレアチンフオスフオキナーゼ、クレアチ
   ンキナーゼ、ピルベートキナーゼ及びアルカリフォスフ
   ァターゼからなる群から選ばれ、上記助酵素がニコチン
   アミド−アデニン ジヌクレオタイド、アデノシン ト
   リフオスフェート、アデノシン−５′−シフオスフェー
   ト、ニコチンアミドーアデニンジヌクレオタイドフオス
   フエート及びアデノシンモノフォスフェートからなる群
   から選ばれることを特徴とする通常水性媒体中で不安定
   な酵素及び助酵素の少なくとも一種を含有する生化学的
   診断測定に使用される安定化した液体組成物。 １１ 上記組成物が最初の不安定助酵素に加えて、少な
   くとも上述の有機溶剤により安定される一種以上の第二
   の不安定助酵素を含有することを特徴とする特許請求の
   範囲第１０項記載の組成物。 １２上記組戒物が、少くとも上記有機溶剤又は上記ポリ
   マーによって安定化される不安定な第二の酵素を含むこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の組成物。 １３上記溶剤が、 ａ） ｐＨが４から１０の間 ｂ）室温及び冷凍温度で液体であること Ｃ）静電気結合（水素結合）を生じる以外は酵素又は助
   酵素と反応しないこと ｄ）水に混和しやすいこと ｅ）加溶媒分解の標準フリーエネルギーが低いこと（ノ
   ルマルレゾナンスが決まっている）という特性をもつこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の組成物。 １４上記有機溶剤が２から４の水酸基と、２から１０の
   炭素原子を含むポリオールであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１３項記載の組成物。 １５上記溶剤を体積で約２５係から約４０係量で存在す
   るように加えることを特徴とする特許請求の範囲第１０
   項記載の組成物。 １６上記ポリマーは少くとも０．０１％の量存在するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載の組成物。 １７ａ）水性媒体 ｂ）少くとも上記水性媒体に溶解し、ある測定をなすの
   に充分な量の助酵素、及び／又は上記水性媒体に溶解し
   た少くとも１００１．Ｕ、の酵素、Ｃ）上記水性媒体中
   に存在する少くとも室温で液体である５％Ｖ／Ｖ以上の
   非反応性かつ水混和性の有機溶剤 ｄ）本質的に酵素反応を阻害しない水に溶けるポリマー
   及び ｅ）殺菌作用と共に安定化作用も与える殺菌剤を含む組
   成物であって、 上記組成物は約６．０から約８．５の間のｐＨを有し、
   かつ上記酵素がグルコース−６−フォスフニードブハイ
   ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルタメートデバイド
   ロゲナーゼ、クレアチンフオスフオキナーゼ、クレアチ
   ンキナーゼ、ピルベートキナーゼ及びアルカリフォスフ
   ァターゼからなる群から選ばれ、上記助酵素がニコチン
   アミド−アデニン ジヌクレオタイド、アデノシン ト
   リフオスフエート、アデノシン−５７−ジフオスフエー
   ト、ニコチンアミドーアデニンジヌクレオタイドフオス
   フェート及びアデノシン モノフォスフェートからなる
   群から選ばれることを特徴とする通常水性媒体中で不安
   定な酵素及び助酵素の少なくとも一種を含有する生化学
   的診断ス１１定に使用される安定化した液体組成物。 １８上記組成物が最初の不安定酵素に加えて、少なくと
   も上述の有機溶媒により安定化される一種以上の第二の
   不安足動酵素を含有することを特徴とする特許請求の範
   囲第１７項記載の組成物。 １９上記組成物が少くとも上記有機溶剤又は上記ポリマ
   ーによって安定化される不安定な第二の酵素を含むこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１７項記載の組成物。 加上記殺菌剤がアジド化合物であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１７項記載の組成物。 ２１ 上記有機溶剤が ａ）ｐＨが４から１０ ｂ）室温及び冷凍温度下で液体 Ｃ）静電気結合（水素結合）を生成する以外は酵素と反
   応しない ｄ）水と混和しやすい ｅ）加溶媒分解の標準フリーエネルギーが低い（ノルマ
   ルレゾナンスが決っている）という特性をもつことを特
   徴とする特許請求の範囲第１７項記載の組成物。 拉上記有機溶剤が、室温及び冷凍温度下で上記酵素及び
   水性媒体と反応しないことを特徴とする特許請求の範囲
   第２１項記載の組成物。