JPH0130839B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は安定化されたニコチンアミド−アデニ
ンジヌクレオチド、特に還元型もしくは酸化型の
遊離のニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド
および同じく還元型もしくは酸化型のそのホスフ
エートに関する。 臨床化学、生化学、食品化学、薬剤学およびそ
の他の分野において、多種類の酵素的反応が分析
上の目的に使用されている。特に、臨床化学的常
用診断学において多くの血液、血清、血漿、体液
および尿試料中の代謝産物および酵素が酵素的に
研究されている。多くの反応成分の不安定性の故
に、使用準備ずみの試薬溶液を最低の費用で調製
しうる工業的に製造された組み合せ包装を使用す
ることが臨床化学基礎実験室において慣例となつ
ている。 それゆえ、可能な限り使用期間の長い製剤をつ
くり出すことが課題となつている。試薬の使用に
際して操作の簡単なことと関係して、試験の実施
に必要な物質を可能な限り多く一つの容器中に充
填する努力がなされており、あるいはやむなくそ
うされている。しかしながら異なる物質は、たと
えそれらが凍結乾燥もしくは乾燥充填された形で
存在していたとしても、それらの安定性に相互に
否定的に影響しうる。それゆえ試薬の使用期間を
延長する適当な添加物質（安定剤）を見出すこと
が極めて重要である。 溶解した形においてのみでなくまた凍結乾燥も
しくは乾燥充填された状態ですでに大きな問題を
投ずる特別に不安定な生化学物質は、いずれも還
元型ならびに酸化型におけるニコチンアミド−ア
デニンジヌクレオチドまたはニコチンアミド−ア
デニンジヌクレオチドホスフエートである。これ
らの物質は非常に多くの酵素的測定において補酵
素として必要であり、還元型においては同時に分
光測定の色素でもある。 上記補酵素の崩壊の結果として、検出されるべ
き物質は最早や支障なく分光測定されえないかも
しくは全く分光測定されえない。何故なら、吸収
性物質の濃度が過度に低いか、あるいは補酵素の
濃度減少の結果として測定されるべき反応の速度
が過度に低いからである。 反応式 ピルベート＋NADH₂LDH ―――→ Ｌ−ラクテート＋
NAD によるラクテート−デヒドロゲナーゼ（LDH）
の活性測定の場合、還元された補酵素ニコチンア
ミド−アデニンジヌクレオチド（NADH₂）が貯
蔵の間にLDH抑制体を形成し、これがかなり誤
つた負のLDH値を生じうるという別の問題点が
生ずる。前記抑制体はNADH₂濃度の減少がどう
にか検出され得る前にすでに高度に活性となり得
る。 しかしながら、アスパラテート−トランスアミ
ナーゼ、アラニン−トランスアミナーゼ、α−ヒ
ドロキシブチレート−デヒドロゲナーゼ、クレア
チン−キナーゼ、グルタメート−デヒドロゲナー
ゼの検出のような多くの他の重要な測定方法、全
酵素的尿素測定、酵素的トリグリセリド測定ある
いはヘキソキナーゼ法によるグルコース測定に際
してもまた、還元型または酸化型におけるニコチ
ンアミド−アデニンジヌクレオチドまたはニコチ
ンアミド−アデニンジヌクレオチドホスフエート
は、試験用包装の使用期間を限定し、かつその安
定化について特に興味をもたれる敏感な成分に属
する。 ドイツ特許第1289668号明細書および同第
1598157号明細書によれば、グルタチオンならび
にシステイン、システインカルバミドおよびアセ
チルシステインが還元型ニコチンアミド−アデニ
ンジヌクレオチドの安定剤として知られている。
ドイツ特許第1930059号明細書には、ポリビニル
ピロリドン（PVP）が還元型および酸化型ニコ
チンアミド−アデニンジヌクレオチドホスフエー
トの安定剤として記載されている。 アカシアまたはアラビアゴムおよびマンニツト
もまたこの目的に適当なものと考えられている。 アルブミンおよびゼラチンもまた同様にすでに
安定化された補酵素に充填物質として加えられて
いる（ドイツ特許第1930059号明細書参照）。 細菌、細菌物質代謝生成物、ウイルス、血清お
よび酵素のような生物学的に活性な物質の安定化
法はドイツ特許第1183629号明細書に記載されて
いる。これにはジイソシアネートと交さ結合した
加水分解的に分解されたゼラチンがなかんずくＬ
−グルタミン酸ナトリウムと組み合わせて使用さ
れている。前記特許明細書中特に実施例において
示されるように、このような安定化剤は特に痘苗
製造および抗原性および免疫原性構造の生成に重
要である。 使用されている安定剤の多数のものはそれらの
効力がヌクレオチドに関しては未だ満足しうるも
のではないことを示している。 今、驚くべきことに、酸化もしくは還元された
ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドおよび
またそのホスフエートが、加水分解的に分解さ
れ、かつ場合によつては交さ結合したコラーゲン
なかんづくこのように処理されたゼラチンを包合
している場合には従来知られている試薬中におい
て一層良好な安定性を示すことが見出された。 交さ結合しているゼラチンで安定化されたニコ
チンアミド−アデニンジヌクレオチドはゼラチン
で安定化されたものに比較して下記の利点を有す
る、すなわち凍結乾燥物は速やかに溶解し、そし
て37℃で数週間貯蔵された場合でもなお溶解する
が、一方ゼラチンで安定化され、この条件下に貯
蔵された凍結乾燥物は不完全にしか溶解しない。
それに加え、架橋ゼラチンの使用により生産技術
上の利点すなわちジヌクレオチドが約２〜４℃で
操作されるという利点が得られる。この温度では
架橋ゼラチンの10％までの溶液が調製されうる
が、一方ゼラチンはこの条件下では約0.1％以上
の濃度の溶液から晶出する。さらにゼラチンを溶
解させるのに溶解速度を充分に高めるには加温し
なければならない。

【表】 ＋ 凍結乾燥物が一部不溶
従つて本発明の目的は ａ） 還元型もしくは酸化型のニコチンアミド−
アデニンジヌクレオチドあるいは還元型もしく
は酸化型のニコチンアミド−アデニンジヌクレ
オチドホスフエートおよび ｂ） 加水分解的に分解された、場合により交さ
結合しているコラーゲン からなる安定な混合物にある。 本発明の目的はさらに、還元型もしくは酸化型
におけるニコチンアミド−アデニンジヌクレオチ
ドおよび（または）還元型もしくは酸化型のニコ
チンアミド−アデニンジヌクレオチドホスフエー
トの溶液に、加水分解的に分解され、場合によつ
ては交さ結合したコラーゲンを加え、次いでこの
混合物を場合によつては乾燥、なかんずく凍結乾
燥することを特徴とする、前述のヌクレオチドの
安定化法にある。 水性溶液中ならびに乾燥生成物中のコラーゲン
生成物の濃度はヌクレオチド1gあたり0.001〜
1200gなかんずく0.01〜300gとりわけ0.5〜20gで
ある。 特に適当なコラーゲン生成物はドイツ特許第
1118792号明細書および同第1155134号明細書によ
り知られているものである。これらは、コラーゲ
ンもしくはその分解生成物を水性溶液中60〜150
℃の温度で分子量2000〜20000なかんずく5000〜
10000まで分解させ、この分解されたコラーゲン
をジイソシアネートと、場合により不活性有機溶
媒の存在下中性ないし弱アルカリ性のPH範囲で０
〜100℃の温度において、使用イソシアネートの
量が前記分解されたコラーゲン中に存在するアミ
ノ基およびグアニジノ基の数から算出される量よ
り少なく、なかんずくその量の約20〜80％である
ようにして反応させ次でこうして得られる交さ結
合生成物をPH約７に調整するか、もしくはコラー
ゲン分解生成物をジイソシアネートと、場合によ
つては不活性有機溶媒の存在下中性ないし弱アル
カリ性のPH範囲において０〜100℃の温度で反応
させ、その際、使用されるイソシアネートの量は
存在するアミノ基およびグアニジノ基の数から算
出される量の20〜80％とし、こうして得られる交
さ生成物を水溶液中60〜150℃の温度で分子量
10000〜100000まで分解させ、得られる溶液をPH
７に調整することにより製造される。平均分子量
35000の3.5％溶液として前記生成物はまた血漿置
換用の注入溶液として市販されている。 安定化されたヌクレオチド溶液のPH値は安定化
効果に何ら決定的な意味をもたないが、敏感な物
質を顧慮して極端なPH値をさけるのが好ましい。
溶液の好ましいPH範囲はPH５〜11である。特に良
好な安定化効果はPH７〜９で観察される。 PH値の調整には通常の緩衝物質が使用されう
る。適当な緩衝物質の例は、りん酸もしくはほう
酸のような弱酸もしくは中等度の酸の種々のアル
カリ金属塩の混合物、弱酸もしくは中等度の酸と
そのアルカリ土類金属塩との混合物（例えばフタ
ル酸、フタル酸アルカリ）、あるいはトリス−ヒ
ドロキシメチルアミノメタン、または生化学反応
において一般に使用されるようなある種の有機化
合物に基く緩衝物質である。 本方法により安定化された剤は特に乾燥された
形、なかんずく凍結乾燥された形においてそのす
ぐれた安定性を示す。乾燥生成物中におけるコラ
ーゲン生成物対ヌクレオチドの重量比は水溶液の
それに相当する。 本発明の目的はさらに、加水分解的に分解さ
れ、場合によつては交さ結合しているコラーゲン
をそれぞれ還元型およびまた酸化型のニコチンア
ミド−アデニンジヌクレオチドおよび（または）
ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドホスフ
エートの安定化に使用することにある。 本発明により安定化された乾燥されたニコチン
アミド−アデニンジヌクレオチドおよび（また
は）そのコラーゲン生成物との混合物は水に容易
に溶解する。本発明による安定剤は波長334nm、
366nmあるいは340nmにおいて非常にわずかの固
有吸光しか示さないので、分光測定に際し背景吸
光の増大による妨害を生じない。これは試薬とし
て通常使用されるかもしくは検出されるべき酵素
例えばアラニン−トランスアミナーゼ、アスパラ
テート−トランスアミナーゼ、ラクテート−デヒ
ドロゲナーゼ、グルタメート−デヒドロゲナー
ゼ、マレート−デヒドロゲナーゼまたはウレアー
ゼの活性に何ら影響しない。 本発明により安定化されるニコチンアミド−ア
デニンジヌクレオチドはそれ自体で、あるいは試
薬の実施に必要なその他の成分と共に凍結乾燥さ
れうる。かかる成分の例としては、基質（例えば
アラニン、アスパラテート、グルタメート、ピル
ベート、２−オキソブチレート、２−オキソグル
タレート）、補助酵素（例えばマレート−デヒド
ロゲナーゼ、ラクテート−デヒドロゲナーゼ、ウ
レアーゼ、グルタメート−デヒドロゲナーゼ）、
アデノシンジホスフエートあるいはアデノシント
リホスフエートのようなその他の補酵素、あるい
はトリスヒドロキシメチルアミノメタン−HClお
よびその他の前述のもののような酵素学上慣用の
緩衝物質があげられる。ニコチンアミド−アデニ
ンジヌクレオチドに対する本発明による剤の特に
好ましい安定化作用は以下の実施例に示される。
この点に関しては、安定化作用をより迅速に明示
するために安定度試験は＋37℃の激烈な温度負荷
の下において行なわれたことが認識されるべきで
ある。しかしながら、製剤は通常＋２℃〜＋６℃
で貯蔵され、その場合に実質上一層高い安定性が
達成される。 実施例 １ ドイツ特許第1118792号明細書に記載の方法に
より得られる安定剤1.56％あるいはポリビニルピ
ロリドン（PVP）2.1％を有する溶液中にそれぞ
れ1.14ミリモル／の還元型ニコチンアミド−ア
デニンジヌクレオチド（NADH₂）を溶解させ
る。得られる混合物を同量ずつガラスビンに充填
し凍結乾燥させる。このガラスビンを＋37℃で貯
蔵する。種々の時点で前記凍結乾燥生成物試料を
ラクテート−デヒドロゲナーゼ（LDH）の測定
に使用し、そして（または）凍結乾燥生成物中に
残存するNADH₂量を測定する。 LDH活性の測定はドイツ臨床化学協会、Z.
Klin.Chem.Klin.Biochem.、第10巻、第182頁
（1972年）の記載に従つて行われる。 凍結乾燥生成物の貯蔵の間に形成される抑制体
はLDH活性の測定の際に値の低下により認めら
れるであろう。 凍結乾燥生成物中に残存するNADH₂量はW.
Gerhardt氏等のScand.J.Clin.Lab.Invest.、第33
巻、第１頁（1974年）の記載に従つて測定され
る。

【表】 前記のドイツ特許第1118792号明細書に記載の
方法により得られる安定剤は次のようにして製造
される。 15.12％の水分および1.68％の灰を有する60gの
ゼラチンから調製された５％強度の骨ゼラチンの
水溶液１を6.9のPH値に調整しついで蒸気オー
トクレーブ中に置いた密閉容器中において120℃
で５1/2時間加熱する。約90℃に冷却後、容器を
オートクレーブから取り出して放置し、室温に冷
却させる。その溶液を過しそして9gの純粋な
塩化ナトリウムを加え、そのPH値を約７に調整し
た後に溶液中に、25c.c.テトラヒドロフラン中の
1.6c.c.ヘキサメチレン−ジイソシアネートの溶液
を激しく撹拌しながら約30℃の温度で流し入れ
る。その溶液のPH値に絶えず注目し、それを希水
酸化ナトリウム溶液の添加により約７に維持す
る。３時間後反応は完了する。テトラヒドロフラ
ンを除去するためにその溶液を真空中で約半分の
量に濃縮し、その際発泡を防止するために数滴の
オクチルアルコールを添加し、その添加するオク
チルアルコールは蒸留中通過させる。ついでその
溶液を水を用いて１に調製し、必用に応じ再び
過しついで凍結乾燥させる。 実施例 ２ （尿素試薬） 前記実施例１に記載の方法と同様であるが、ド
イツ特許第1155134号明細書記載の方法により得
られる剤40g/、NADH₂4.54ミリモル／、２
−オキソグルタレート357ミリモル／およびグ
ルタメート−デヒドロゲナーゼ18U／mlを有する
溶液をガラスビン中で凍結乾燥する。このガラス
ビンを＋37℃で貯蔵する。 表記の特定の時点にて凍結乾燥生成物の試料を
PH8.0のトリス緩衝液に溶解し、その後過剰量の
アンモニウムイオンを加え、340nmにおける分光
法によるNADH₂含量の測定を行う。その結果を
以下の表に示す。 貯蔵（37℃） NADH₂濃度 出発値 100％ 14日 93％ 28日 91％ 54日 88％ 84日 87％ 上記と同じ方法によりその他のヌクレオチド含
有試薬が安定化されうる。ヌクレオチド１〜3g
に対して２〜20gのコラーゲン生成物を加える場
合には同様の良好な結果が得られる。 実施例 ３ 水55mlに前記実施例１の場合と同様にドイツ特
許第1118792号明細書に記載の方法により得られ
る安定剤0.86gおよびポリビニルピロリドン
（PVP）0.86gをそれぞれ溶解させる。両方の液体
に次でそれぞれ54.6mgの還元型ニコチンアミド
−アデニンジヌクレオチドホスフエート
（NADPH₂）を溶解し、得られる混合物を同量ず
つガラスビンに充填し凍結乾燥する。このガラス
ビンを＋37℃で貯蔵する。表記の特定の時点にお
いてビンを開け、凍結乾燥された内容物の
NADPH₂含量を式 ２−オキソグルタレート＋NADPH₂＋ NH₄ ⁽⁺⁾GlDH ―――――→ グルタメート＋NADP に従つて分光測定する。 結 果

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ａ） 還元型もしくは酸化型におけるニコチ
   ンアミド−アデニンジヌクレオチド、あるいは
   還元型もしくは酸化型におけるニコチンアミド
   −アデニンジヌクレオチドホスフエートおよび ｂ） 加水分解的に分解され、交さ結合している
   コラーゲン からなる安定な混合物。 ２ ヌクレオチド：コラーゲン比が１：0.001〜
   １：1200であることを特徴とする前記第１項によ
   る混合物。