JPS6117466B2 - - Google Patents

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JPS6117466B2
JPS6117466B2 JP52031016A JP3101677A JPS6117466B2 JP S6117466 B2 JPS6117466 B2 JP S6117466B2 JP 52031016 A JP52031016 A JP 52031016A JP 3101677 A JP3101677 A JP 3101677A JP S6117466 B2 JPS6117466 B2 JP S6117466B2
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solvent
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JP52031016A
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Ii Modorobitsuchi Iwan
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Publication of JPS6117466B2 publication Critical patent/JPS6117466B2/ja
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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

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  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液状媒体中のレービル酵素の安定化
に関するものである。
近年、米国において毎年行なわれている生化学
的臨床検査の25%が信頼できないものと推測され
ている。不正確な試験は、不必要な医療処置や必
要な処置の不実施、無駄な支出などを伴うもので
ある。その高度な特異性から、酵素測定法の利用
がここ数年間非常に増大し、この傾向は更に続く
ものと思われるが、精度ある確実な結果を得るた
めには、厳しい品質管理の測定が必要である。こ
の要求は、酵素の働きの機構と同様にその正確な
性質がほとんどまだ知られていないことから生ず
るものである。現在、酵素試薬の製造において最
大の制限となるのはその製品の特徴が一定しない
ことである。一般に知られる方法では、多くのレ
ービル成分の使用が要求され、これらの成分の数
は減少することはなく、むしろ更に増加する傾向
にある。
酵素の反応活性を安定化するために使用される
技術で現在商業的な地位にあるのは、凍結乾燥
し、乾燥状態で調合して元来製薬及びその関連産
業で乾燥粉末を錠剤化するのに使用されるような
形にしたり、固形マトリツクス中に酵素の化学構
造を封じ込めることによつて不動化するなどとい
う方法で、それらを固形マトリツクス中に封じ込
めるものである。これらの言葉の内容に反して、
これらの試みは実際的でなく、望ましくなく、し
かも高価につくものである。製造業者は強制的に
水を除去し、部分的な製品を供給するので、最終
製品の稀釈や使用にあたつて品質管理工程の一部
を放棄することとなる。また研究所では包装、試
薬の浪費、凍結乾燥、乾燥調合などと多大な代価
を支払うこととなり、更に製品の有用性を包装様
式やその大きさで限ることとなる。
また、均質な良い製品を得ることは困難であ
り、このことはほとんど市販の凍結乾燥処理した
血清について酵素成分の許容変動率が容器間で平
均値の±10%であるということで例示される。
本発明ではレービル酵素が化学的に改良され、
本発明で酵素の反応性が冒されることなく長い間
安定となる。本発明は品質管理がその製造、包
装、貯蔵及び使用のすべてを通じて保証される試
薬を提供する。その包装、凍結乾燥及び試薬の浪
費などというような高価格となる厳密な包装によ
る不都合は避けられる。液状の酵素系は扱い易
く、その応用範囲を広げ、また成分の分離も安価
に容易にできる。従つて、すべての副反応が終わ
つた後に、望ましい反応を起こすというようなこ
とも可能となる。
本発明の安定化された酵素は、液状酵素試薬を
新鮮な試薬と比較するという研究で評価してき
た。この研究は、感応性と精度の比較で液と新鮮
な試薬の間に1:1の相関を示した。液の形での
酵素の提供は、成分の分離が簡単にできるので、
今日行なわれているNAD/NADH系の反応にお
いて比色測定の適用性を高める。特に液状試薬は
NADHの消費が測定の基礎となり、着色試薬が
NADHと反応主体から分離されなければならない
場合に有利である。紫外線法では、液状酵素が凍
結乾燥や乾燥媒体の調製に比して取り扱い易いだ
けでなく、試薬の品質が均質であり包装性も良い
などの利点がある。
臨床酵素学では、既成の液状媒体中の酵素試薬
の安定化は臨床研究所の要望や基準局の要求する
信頼度を満足するための新規な興味深い方法であ
る。液状酵素系の適応性は手動の試験に好都合で
あるというだけでなく、自動化された器械分析な
どへの適用性をも確実とする。
本発明の組成物は、100I.U.以上の酵素、5%
以下の少なくとも室温で液体である非反応性かつ
水混和性の有機溶剤、及び0.01%以上の水溶性ポ
リマーを含有し、酵素及びその他のレービル成分
が安定化されており、しかもビヒクル中酵素がな
お活性である水性ビヒクルを含むことを特徴とす
る。
本発明では、少なくとも0.05%のポリマーと少
なくとも20%V/Vの有機溶剤を含む水性酵素基
剤に親液化された乾燥酵素を溶解することでレー
ビル酵素の安定化が達成される。この溶液は変性
点以下、好ましくは60℃以下、更に多くの場合は
40℃以下の温度に少なくとも30分、通常は2〜3
日保持される。その後、溶液は水で20倍以上、一
般には30倍に稀釈される。この間更にポリマーを
加えて、稀釈状態でのポリマーを0.05%以上の基
準に保つ。次いで、100〜10000I.U./の酵素濃
度に適当に稀釈した溶液を個々の容器に納め、30
℃以下の温度に冷却貯蔵する。
この稀釈溶液は、更に基質緩衝剤や静菌剤
(bacteriastatic agent)やその他の成分を必要に
応じて含有してもよい。これらの成分を加える場
合には、稀釈溶液は個々の容器に入れ、封をして
貯蔵する前によく混合して均一な基質溶液とす
る。
基質は、酵素の触媒作用による反応すなわち相
互作用で化合物の構造に変化を生ずる既知の構造
をもつ有機化合物、例えば、乳酸、L−アスパラ
ギン酸塩、アルフアケトグルタル酸塩、L−アラ
ニンなどである。
一般に、基質は食物をバクテリア、菌類又は他
の微生物に供した場合と同様に微生物分解しやす
い。他方、これらの化合物は中性近く、一般には
PH4−10で水性媒体に安定である。従つて、もし
基質を酵素組成物に添加した場合には、安定な媒
体としては、酸性のリン酸アルカリ金属塩のよう
なPH調節用緩衝剤や化学的に基質と反応ないか又
は基質の酵素反応を防害しない殺菌剤を含むべき
である。殺菌剤の添加量は、組成物中0.01〜0.3
%程度であるのが好ましい。代表的な例として、
0.1%のアジ化ナトリウム、安息香酸、フエノー
ル、チモール又はベンタクロロフエノールなどが
ある。
ある種の有機溶剤は、基質反応が実際に生ずる
か又は触媒の作用を受ける分子部分である官能基
の位置を保護することによつて更に酵素を微生物
の作用を受け分解することから保護することで酵
素を液媒中安定化すると信じられている。酵素が
この溶剤の濃度が高いと、基質に対する触媒活性
が持たないので、濃厚な溶剤ではある種の物理的
な又は化学的な反応が生じていることは明らかで
ある。しかし、稀釈状態に酵素をもどすと、十分
活性となり、数ケ月から数年にわたつて、貯蔵期
間を長くしてもその十分な活性度を高水準で保つ
ものである。酵素分子の内部の化学構造が保護さ
れる必要はない。反応位置が保護されていれば、
酵素の触媒活性は完全に保たれる。
また、微生物分解も塩類を少なくとも1%、通
常2〜8%又はそれ以上の高濃度で使用すること
で制御されうる。この塩分子は酵素の特殊な配列
及び活性位置を保護する静電結合を形成すること
によつてその活性位置を保護してもよい。
酵素は大きな分子量の複雑な蛋白質分子で一般
にその化学構造は知られていない。酵素はその触
媒活性及び極端な基質特異性で現在分類されてい
る。酵素は単一基質の反応又は基質の類似する群
の反応に触媒作用をする生物学的な触媒として表
わすこともできる。
典型的な酵素としてLDH、MDH、CPKなどが
ある。酵素は稀釈安定化された組成物に一般に
100〜10000I.U.の量で存在する。
基質は、反応又は相互作用が酵素触媒で生じ、
化合物の構造、原子組成又は立体化学回転に変化
を生じる既知の構造をもつた有機化合物である。
一般に基質は食物をバクテリア、菌類又はその
他の微生物に供した場合と同様に微生物分解しや
すい。他方、これらの化合物は中性近く(例えば
PH4〜10)で水性媒体に安定にとどまる。
代表的な基質としてはL−アラニン、ビルビン
酸塩、L−アスパラギン酸塩、アルフアーケトグ
リコン酸塩などがある。基質は普通塩の形で存在
し、酵素の安定化を高めるのに有用な塩濃度の一
部を形成する。酵素の安定性は基質濃度と共に増
加する。しかし、約8%を越すような高基質濃度
では、酵素活性は抑制される。故に、基質濃度は
普通約2〜4%程度にしておくべきである。
緩衝用塩もまた上述の塩濃度の一部に供されて
もよい。緩衝塩はPHを4〜10、通常6−8に保つ
のに必要な量添加される。一般に、緩衝剤は0.1
〜1%アルカリ金属水酸化物と0.5〜3%の炭酸
又はリン酸の酸性アルカリ金属塩との結合であ
る。また、塩濃度の総量が必要とするポリマー量
に影響する。4%以上というように高い塩濃度で
は塩によつて供される静電安定化によつてポリマ
ーが少なくてよい。しかし、濃度があまり高いと
ポリマーが溶液を曇らせ、析出してくるので再溶
解するためめに溶液をあたためることが必要とな
る。
ポリマーは、稀釈安定溶液中沈でんを生ずるこ
とはないが、冷却下均質な懸濁液となるような量
まで供するのが好ましい。ポリマーは、0.01〜
0.5%で存在するのが好ましく、更に0.05〜0.25%
であるのが好ましい。本発明で安定剤として有用
な水溶性ポリマーは酵素活性を抑制するものでな
く、ポリマーマトリツクス中に酵素を捕えること
のできるものである。このポリマーにはポリビニ
ルピロリドンのような合成有機物質、ゼラチンの
ような水溶性蛋白質、及びデキストランのような
水溶性多糖類が含まれる。
溶剤は、水と混和性があつて、中性又はアルカ
リ性PHを有し、室温及び冷却室の温度で液状であ
り酵素の反応位置と静電結合以外の分解的な反応
をしないものであることが必要である。通常、有
用な溶液はエーテル類、ケトン類、スルホン類、
スルホキシド類及びアルコール類などの極性有機
溶剤であり、例えばメタノール、エタノール、プ
ロパノール、ブタノール、アセトン、ジオキサ
ン、DMSO、ジメチルスルホン及びTHFなどが
含まれる。しかし、2−4の水酸基を含み、かつ
2−10の炭素原子を含む液状ポリマー溶剤、例え
ばグリセリン、プロパンジオール、ブタンジオー
ル、エチレングリコールなどでは低い溶剤濃度で
の処理でより高度の活性が認められる。
溶剤は処理工程を通じて少なくとも20%、特に
25〜50%の量で存在するのがよい。溶剤の種類に
よつては酵素活性を60%以上に安定化した活性に
保つために70%程度の高濃度を必要とする。
次に実施例を示す。
実施例 〔1〕 酵素基剤原 料 ゼラチン 0.1% W/W 1,2−プロパンジオール 30% V/V 水 70% V/V 22500I.U./に相当する量のLDH酵素を、硫
酸アンモニウム懸濁液(2.2M)又は真空乾燥状
態で、この酵素基剤に溶解し、4−30℃に2−3
日間保つた。
基質試薬原 料 L−アラニン 22g/ アルフアーケトグルタル酸 1.6 KH2PO4 14 NaOH 5 NaN2 1 ゼラチン 1 酵素基剤をこの基質試薬懸濁液に添加し、30倍
に稀釈し、混合して均一な懸濁液とした。この懸
濁液は冷凍貯蔵するが、冷却下におかれた保存性
は3年間で50〜90%の活性を保持する。
このような安定化法の臨床医学における商業的
な適用としては次のようなものがあるが、これに
限られるものではない。例えば、の診断用試薬は
生物学上下記の成分の定性及び定量に使用され
る。
1 グルタミン酸−オキザル酢酸トランスアミナ
ーゼ (SGOT) 2 グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナー
ゼ (SGPT) 3 乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH) 4 クレアチンホスホキナーゼ(CPK) 5 α−ヒドロキシブテリド デヒドロゲナーゼ (α−HBD) 6 グルコース(ヘキソキナーゼ−G−6−
PDHを経て) 次に、これら診断用試薬の実施例を示す。
実施例 〔2〕 血清グルタミン酸オキザル酢酸トランスアミナ
ーゼ(SGOT)測定用の安定化された液状、酵素
試薬組成物を製造した。まず、下記成分; グリセリン 4ml うさぎの筋からの 乳酸塩デヒドロゲナーゼ 2500IU(30℃) 水 4ml ゼラチン 1g を混合して酵素調合物を作り、次いで水1に下
記成分; アスパラギン酸 200ミリモル α−ケトグルタル酸 16ミリモル トリス(ヒドロキシメチル) 0.1モル アミノメタン を混合して液体ベースを製造した。その後、この
PHを塩酸又は水水酸化ナトリウムで最終PH7.8に
調節し、アジ化ナトリウム1gを添加し、約45℃
に加熱した。その後、酵素調合物を加え、これら
二つの溶液をおだやかに30分以上混合した。
このようにして得た酵素試薬組成物を助酵素試
薬と結合し、SGOT測定に使用した。助酵素試薬
は10ミリモルのニコチンアミドアデニンジスクレ
オチド還元物(NADH2)を含むもので、NADH2
約6.6g/と安定剤1,2−プロパンジオール
が10%V/Vのモレキユラーシーブ(4メツシ
ユ)と共に混合されており、水分量を0.5%以下
に調整されたものである。
実施例 〔3〕 グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ
(SGPT)測定用の安定化された液状酵素試薬組
成物を下記成分を混合して製造した。本発明で
は、この組成物を二液に形成されてもよい。すな
わち、酵素試薬と紫外線測定用助酵素試薬に形成
して、使用時に混合してもよい。そこで、ここで
は、二液試薬を調整した。
基質試薬反応成分 L−アラニン 250mM α−ケトグルタル酸 8.6mM LDH(うさぎの筋からの 乳酸デヒドロゲナーゼ)750UI/L(PH377.4) アジ化ナトリウム 保恆剤 0.1%V/V 燐酸カリウム 緩衝剤 0.1モル ゼラチン 安定剤 0.1%V/V ここで、緩衝剤はトリス(ヒドロキシメチル)
アミノメタン80ミリモルに変えてもよい。
上記基質試薬組成物をSGPT測定用の助酵素試
薬と結合した。助酵素試薬は10ミリモルのニコチ
ンアミド−アデニンジスクレオチド還元物
(NADH2)を含むもので、NADH2約6.65g/と
安定剤1,2−プロパンジオールを10%V/Vの
モレキユラーシーブと共に混合して、水分量0.5
%以下にしたものである。
なお、SGPTの比色測定用の二種の添加試薬す
なわち着色試薬とピルベート標準試薬を下記の通
り用いた。
着色試薬反応成分 INT(2−p−ヨードフエニル−3−p−ニト
ロフエニル−5−フエニル−テトラゾリウムク
ロライド) 0.741mM PMS(フエナジン メソスルフエート)
0.037mM ピルビベート標準試薬反応成分 当量 ピルビン酸 500IU/L この着色試薬とピルベート試薬はいずれも基質
試薬に存在するのと同様の添加剤、例えばアジ化
ナトリウムなどの保恆剤及びゼラチン又はグリセ
リンのような安定剤を含む。
実施例 〔4〕 クレアチンホスホキナーゼ(CPK)測定用の
安定化された液状酵素試薬組成物を下記成分を混
合して調整した。本発明では、この組成物を三液
に形成して使用時に混合してよく、ここでは三液
試薬を調整した。
緩衝剤試薬 ジチオトレイトール 32mM D−グルコース 83mM N−アセチルシステイン 12mM イミダゾール 緩衝剤 1.2g/ エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)
0.7g/ デキストラン 15.0g/ PHを酢酸10ml/の添加で5.2に調節する。
基質試薬 クレアチンフオスフエート 300mM アデノシン−5−ジフオスフエート 28mM アデノシン−5−モノフオスフエート 25mM グルコース−6−フオスフエート デヒドロゲナーゼ(L.メセント) 20000IU/L グリセリン 38%V/V アジ化ナトリウム 0.05%V/V トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (TRIS)緩衝剤 1.42g/100ml 助酵素試薬 NAD(ニコチンアミド アデニン ジスクレオチド) 30mM アデノシン−5−モノフオスフエート 22mM ヘキソキナーゼ(イースト) 80000IU/L マグネシウム 200mM グリセリン 50%V/V また、これらの試薬は同様にある種のいくつか
の一般的なレービル成分に作用する。その化学反
応の数種のものは一般的なものである。次に代表
的な化学反応式を掲げ、起りうる反応の一般的な
性質を述べる。
反応式1……一般例 上にあげた酵素反応はすべてこの一般例に従う
だろう。反応(2)は通常カツプリング反応として関
係づけられるものであり、反応(2)又は(3)は測定反
応であり、反応(1)は初期反応として特徴づけられ
るものである。しかし、これら三種の反応がすべ
て測定に要求されるものではなく、事実これらの
二種又は一種に限られてもよいことがわかつてい
る。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性の紫外
線測定の場合、下記に示す如く単に反応(2)だけが
含まれる。
反応式2……LDH なお、逆に上記三種の反応より多くの反応がク
レアチンホスホキナーゼ(CPK)のような場合
には含まれる場合がある。
反応式3……CPK (注) CP=クレアチンホスフエート ADP=アデノシン−5′−ジホスフエート ATP=アデノシン−トリホスフエート HK=ヘキソキナーゼ NAD=ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチ
ド NADH2=還元されたニコチンアミド− アデニンジヌクレオチド G−6−PDH=グルコース−6−ホスフエート デヒドロゲナーゼ INT=テトラゾリウムソルト PMS=フエナジンメトサルフエート この場合、反応(2)及び(3)はカツプリング反応と
考えてもよく、反応(3)又は(4)は測定反応、反応(1)
は初期反応である。
上記反応式1……一般式から、この反応系が反
応基質/生成物及び触媒酵素のいずれの定量分析
にも適用できることが明らかとなり、かつ知られ
る。
生物学上これらの成分の定量法は、人及び動物
の病状の診断及び手当てによく受入れられ、広く
使用される診断法である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 酵素100I.U.以上、少なくとも室温で液体で
    ある非反応性で水混和性の有機溶剤5%以下、及
    び酵素活性を抑制することなくポリマーマトツク
    ス中に酵素を捕えることができる水溶性ポリマー
    0.01%以上を含有する、酵素が安定化されてお
    り、しかもビヒクル中酵素がなお活性である水性
    ビヒクルを含むことを特徴とする水性媒体中で不
    安定な酵素のための安定化された液状酵素組成
    物。 2 溶剤がケトン類、エーテル類、スルホン類、
    スルホキシド類及びアルコール類から選ばれた有
    機溶剤であることを特徴とする特許請求の範囲第
    1項記載の組成物。 3 溶剤が1,2−プロパンジオールであること
    を特徴とする特許請求の範囲第2項に記載の組成
    物。 4 溶剤が0.05〜5%の量で存在することを特徴
    とする特許請求の範囲第2項記載の組成物。 5 酵素が上記溶剤を少なくとも20%含む水性の
    媒体で前処理されていることを特徴とする特許請
    求の範囲第1項記載の組成物。 6 ポリマーが0.05〜0.5%の量で存在すること
    を特徴とする特許請求の範囲第1項記載の組成
    物。 7 ポリマーがゼラチンであることを特徴とする
    特許請求の範囲第6項記載の組成物。 8 PHが4〜10であることを特徴とする特許請求
    の範囲第6項記載の組成物。 9 少なくとも室温で液状である非反応性水混和
    性有機溶剤20%以上と酵素活性を抑制することな
    くポリマーマトリツクス中に酵素を捕えることが
    できる水溶性ポリマー0.05%以上を含む水性媒体
    中酵素分子の溶液を形成し; 形成された酵素溶液をその変性点以下の温度に
    30分以上保ち、酵素の反応性位置を安定化し; その後、この溶液を水で稀釈して、酵素含有量
    が少なくとも100I.U.であり、溶剤含有量が5%
    以下であり、水溶性ポリマーの含有量が少なくと
    も0.01%であるようにすることを特徴とする水性
    媒体中で不安定な酵素のための安定化された液状
    酵素組成物製造方法。 10 溶剤がケトン類、エーテル類、スルホン
    類、スルホキシド類及びアルコール類から選ばれ
    た有機溶剤であることを特徴とする特許請求の範
    囲第9項記載の方法。 11 溶剤が1,2−プロパンジオールであつて
    処理工程に20〜40%の量で存在することを特徴と
    する特許請求の範囲第10項記載の方法。 12 ポリマーがゼラチンであつて、上記溶液中
    0.05〜0.5%の量で存在することを特徴とする特
    許請求の範囲第9項ないし第11項いずれかに記
    載の方法。 13 酵素100I.U.以上; 室温で液体である非反応性かつ水混和性の有機
    溶剤5%以下; 酵素活性を抑制することなくポリマーマトリツ
    クス中に酵素を捕えることができる水溶性ポリマ
    ー0.01%以上;及び 基質と緩衝剤を含む塩類及び殺菌剤からなる群
    から選ばれる少なくとも一種の添加剤;を含有
    し、酵素がすべて安定化され、その中で酵素がな
    お活性である水性ビヒクルを含むことを特徴とす
    る水性媒体中で不安定な酵素のための安定化され
    た液状酵素組成物。 14 酵素が少なくとも20%の非反応性水混和性
    有機溶剤を含む水性媒体で前処理されていること
    を特徴とする特許請求の範囲第13項記載の組成
    物。 15 殺菌剤0.01〜0.3%の量で存在することを
    特徴とする特許請求の範囲第13項又は第14項
    記載の組成物。 16 1〜8%の塩類及び0.01〜0.3%の殺菌剤
    を含有することを特徴とする特許請求の範囲第1
    5項記載の組成物。 17 塩類が乳酸、L−アスパラギン酸塩、アル
    フアケトグルタル酸塩、L−アラニン又はピルビ
    ン酸塩から選ばれたものであり、2〜4%の量で
    存在することを特徴とする特許請求の範囲第16
    項記載の組成物。 18 ポリマーが0.05〜0.5%の量で存在するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第13項ないし第
    17項いずれかに記載の組成物。 19 ポリマーがゼラチンであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第18項記載の組成物。
JP3101677A 1976-03-17 1977-03-17 Stabilized liquid enzyme reagent composition Granted JPS52134086A (en)

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US66785676A 1976-03-17 1976-03-17

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