DE2711754C2 - Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms, das in wäßrigem Medium instabil ist - Google Patents

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Aceton, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylsulfon oder Tetrahydrofuran verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel 1,2-Propandiol in einer Menge von 20 bis 40% der Lösung vor der Verdünnung verwendet

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration an dem Polymer in der verdünnten Lösung auf 0,05 bis 0,5 Gew.-% einstellt

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man der fertigen Lösung noch Milchsäure, L-Alanin, Pyruvat L-Aspartat oder alpha-Ketoglutarat in einer Menge von 2 bis 4% und ein bakterizides Mittel in einer Menge von 0,01 bis 03% zusetzt

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung vor der Verdünnung 2 bis 3 Tage bei einer Temperatur unter 60° C hält

7. Stabilisierte flüssige Enzymmasse, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 6 hergestellt ist

8. Verwendung einer nach einem der Ansprüche 1 bis 6 hergestellten stabilisierten Enzymmasse zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Glutamat-oxalacetat-transaminase, Glutamat-pyruvattransaminase, Lactat-dehydrogenase, Creatin-phosphokinase, alpha-Hydroxy-buterid-dehydrogenase oder Glucose (über Hexokinase-G-6-PDH) in biologischen Flüssigkeiten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms, das in wäßrigem Medium instabil ist.

Die derzeit üblichen Verfahren zum Stabilisieren des Reaktionsvermögens von Enzymen bestehen darin, daß man sie in eine feste Matrix einschließt, was entweder durch Gefriertrocknen oder durch Trockenmischen, wie es für die Tablettierung getrockneter Pulver in der pharmazeutischen Industrie üblich ist erfolgen kann, oder daß man die chemische Struktur des Enzyms durch Einschließen in eine feste Matrix immobilisiert Solche Verfahren sind aber schwer durchführbar und aufwendig. Der Hersteller muß das Wasser entfernen und ein Teilprodukt liefern, wobei er auf einen Teil des Qualitätskontrollzyklus bei Verdünnung und Anwendung des Endproduktes verzichten muß. Die Laboratorien sind gezwungen, die hohen Kosten für Verpackung, Abfall an Reagenz, Gefriertrocknen und Trockenmischen zu tragen, und der Wert des Produktes wird weiter durch Art und Größe der Verpackung begrenzt.

so Außerdem ist es schwierig, Produkte mit gleichmäßiger Beschaffenheit herzustellen. Beipielsweise wird für die meisten gefriergetrockneten Kontrollsera eine Variationsbreite des Enzymgehaltes von Flasche zu Flaschen von ± 10% vom Mittelwert angegeben.

Aufgabe der Erfindung ist es, labile Enzyme in flüssigen Präparaten chemisch so zu modifizieren, daß sie über längere Zeit stabi! bleiben, ohne ihre enzymatische Reaktivität zu verlieren, und insbesondere derart, daß die Qualität der erhaltenen Produkte während der Herstellung, Verpackung, Lagerung und Verwendung nicht beeinträchtigt wird und die Kosten für Gefriertrocknung und Reagenzabfall entfallen.

Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms, das in wäßrigem Medium instabil ist gemäß Patentanspruch 1. Die Ansprüche 2 bis 6 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Die Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäß hergestellte Enzymmasse (Anspruch 7) und die Verwendung derselben gemäß

Anspruch 8.

Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung stabilisierten Enzyme sind durch Vergleich mit frischen Reagenzien bewertet worden. Die Untersuchungen zeigen eine Beziehung von 1 :1 zwischen flüssigen und frisch η Reagenzien mit vergleichbarer Sensitivität und Präzision. Die Schaffung von Enzymreagenzien in flüssiger Form steigert die colorimetrische Anwendbarkeit derzeitiger NAD/NADH-Kupplungsmethodologien hauptsächlich dadurch, daß die Abtrennung von Ingredienzien leicht durchführbar ist. Flüssige Reagenzien sind von besonderem Vorteil, wenn ein NADH-Verbrauch die Grundlage der Messung bildet und das Farbreagenz von NADH und dem Reaktionsmedium abgetrennt werden muß. Bei UV-Bestimmungen bietet das flüssige Enzympräparat den Vorteil besserer Homogenität und Verpackung, sowie Flexibilität bei der Verwendung

verglichen mit den gefriergetrockneten oder Trockenmedienpräparaten.

Für die Enzymdiagnostik bietet die Stabilisierung von Enzymen in gebrauchsfertigen Flüssigkeiten einen außerordentlichen Fortschritt hinsichtlich der Befriedigung der Bedürfnisse klinischer Laboratorien und der Anforderungen von Überwachungsgremien an die Zuverlässigkeit von Tests. Die Flexibilität flüssiger Enzympräparate gewährleistet ihre Anwendbarkeit mit automatisierter Instrumentation sowie bei manuell durchge- s führten Tests.

Gemäß der Erfindung erfolgt die Stabilisierung labiler Enzyme also durch Auflösen lyophilisierter trockener Enzyme in einem wäßrigen Medium, das wenigstens 0,05% Polyvinylpyrrolidon, Dextran oder Gelatine und wenigstens 20 VoL-% an einem organischen Lösungsmittel enthält Die Lösung wird wenigstens 30 Minuten, gewöhnlich 2 bis 3 Tage, bei einer Temperatur unter dem Denaturierungspunkt, zweckmäßig unter 60⁰C und in den meisten Fällen unter 40⁰C gehalten. Dann wird die Lösung mit Wasser bis wenigstens zur 2Of ach en und gewöhnlich 30fachen Verdünnung verdünnt, und weiteres Polyvinylpyrrolidon, Dextran oder Gelatine wird zugesetzt, um die Konzentration an einem solchen Polymer in der verdünnten Lösung bei wenigstens 0,05 bis 0,5 Gew.-⁰/c zu halten. Die verdünnte Lösung, die zweckmäßig 100 bis 10 000IE Enzym je Liter enthält, kann dann in Behälter abgefüllt und abgedichtet werden und wird bei Temperaturen von 30° C oder darunter gelagert (vgl. die grundlegenden Bedingungen des Anspruchs 1 in diesem Zusammenhang).

Die verdünnte Lösung kann erforderlichenfalls auch Substratpuffer und bakterioslatische Mittel sowie andere Komponenten enthalten. Wenn solche anderen Ingredienzien zugesetzt werden, wird die verdünnte Lösung gemischt, so daß eine homogene Substratlösung gebildet wird, bevor sie in die einzelnen Behälter abgefüllt wird und die Behälter abgedichtet und gelagert werden.

Substrate sind organische Chemikalien bekannter Struktur, deren Reaktionen oder Interaktionen durch Enzyme katalysiert werden, wobei es zu einer Änderung der Struktur, der atomaren Zusammensetzung oder der stereochemischen Rotation der Verbindung, beispielsweise Milchsäure, L-Aspartat oder alpha-Ketoglutarat, L-Alanin oder dergleichen, kommt

Substrate unterliegen leicht einem mikrobiologischen Abbau, da sie Nährstoffe für Bakterien, Fungi und andere Mikroorganismen sind. Im übrigen bleiben diese Verbindungen im wäßrigen Medium bei oder nahe neutralem pH, beispielsweise bei einem pH von 4 bis 10, stabil. Wenn also das Substrat dem Enzympräparat zugesetzt wird, sollte das stabilisierende Medium auch einen Puffer zur Steuerung des pH, wie ein saures Alkaliphosphat, und ein bakterizides und/oder fungizides Mittel, das nicht chemisch mit dem Substrat reagiert oder die Enzymreaktion des Substrats behindert, enthalten. Beispiele sind 0,1% Natriumazid, Benzoesäure, Phenol, Thymol oder Pentachlorphenol.

Vermutlich stabilisiert das gemäß der Erfindung verwendete organische Lösungsmittel das Enzym in dem flüssigen Medium, indem es die funktioneile Gruppe, d. h. den Teil des Moleküls, wo die Substratreaktion tatsächlich erfolgt oder katalysiert wird, schützt und indem es das Enzym gegen eine Verunreinigung durch Mikroben und damit gegen einen Abbau schützt Offensichtlich kommt es zu einer physikalischen oder chemisehen Reaktion in dem konzentrierten Lösungsmittel, da das Enzym bei dieser Lösungsmittelkonzentration keine katalytische Aktivität für das Substrat hat. Bei der Verdünnung wird jedoch die Aktivität des Enzyms wieder hergestellt, und es behält seine volle Reaktivität über längere Lagerungszeiten, beispielsweise zwischen einigen Monaten bis zu einigen Jahren. Die innere Struktur des Enzymmoleküls muß dabei nicht erhalten bleiben, solange die reaktive Gruppe und damit die katalytische Aktivität des Enzyms intakt bleibt Die folgende Beschreibung soll Aufgaben, Vorteile und Gegenstand der Erfindung näher veranschaulichen.

Enzyme sind hochmolekulare komplexe Proteinmoleküle von im allgemeinen unbekannter chemischer Struktur. Sie werden derzeit nach ihrer katalytischen Aktivität und ihrer extremen Substratspezifität klassifiziert. Enzyme können als biologische Katalysatoren, die eine Reaktion eines einzelnen Substrats oder einer Gruppe ähnlicher Substrate zu katalysieren vermögen, bezeichnet werden.

Typische Enzyme sind LDH, MDH, CPK und dergleichen. Das Enzym ist in dem verdünnten stabilisierten Präparat in einer Menge von typischerweise 100IE bis 10 000IE anwesend.

Substrate sind organische Chemikalien bekannter Struktur, deren Reaktionen oder Interaktionen von Enzymen katalysiert werden, wobei eine Veränderung der Struktur der Verbindung, der atomaren Zusammensetzung oder der stereochemischen Rotation erfolgt

Substrate sind im allgemeinen anfällig gegen mikrobiologischen Abbau, da sie als Nährstoffe für Bakterien, Fungi und andere Mikroorganismen dienen. Im übrigen bleiben diese Verbindungen in wäßrigem Medium bei oder nahe neutralem pH (d. h. bei einem pH in dem Bereich von 4 bis 10) stabil.

Typische Substrate sind L-Alanin, Pyruvat L-Aspartat, Λ-Ketoglutarat und dergleichen. Die Substrate liegen gewöhnlich in der Form von Salzen vor und bilden einen Teil des Salzes, das zur Verbesserung der Stabilität des Enzyms verwendet wird. Die Enzymstabilität steigt mit der Substratkonzentration. Bei hohen Substratkonzentrationen über etwa 8% wird jedoch die Enzymaktivität inhibiert. Daher ist die Substratkonzentration auf einem Optimum, im allgemeinen bei etwa 2 bis 4%, zu halten.

Auch das Puffersalz bildet einen Teil des oben genannten, zur Verbesserung der Stabilität des Enzyms verwendeten Salzes. Das Puffersalz wird in einer Menge, die notwendig ist, um das pH zwischen 4 und 10, typischerweise zwischen 6 und 8, zu halten, zugesetzt. Der Puffer ist im allgemeinen eine Kombination von 0,1 bis 1 °/o an einem Alkalihydroxid und 0,5 bis 3% an einem sauren Alkalicarbonat oder -phosphat Der Gesamtsalzgehalt beeinflußt auch die erforderliche Menge an Polymer. Bei höherem Salzgehalt von beispielsweise über 4 Gew.-% ist wegen der elektrostatischen Stabilisierung durch das Salz weniger Polymer erforderlich. Bei höherem Salzgehalt kann das Polymer jedoch die Lösung trüben oder aus der Lösung ausfallen, so daß die Lösung erwärmt werden muß, um es wieder zu lösen.

Das Polymer wird vorzugsweise bis zu einer solchen Menge in der verdünnten stabilisierten Lösung gehalten, daß es unter Kühlschrankbedingungen ohne auszufallen in homogener Suspension bleibt. Das Polymer ist in

einer Menge von 0,01 bis 0,5%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,25%, anwesend. Wasserlösliche Polymere, die sich als Stabilisierungsmittel gemäß der Erfindung eignen, sind PoIyvinylpyrroUdon oder Dextran oder Gelatine, die denaturiertes Collagen ist

Das Lösungsmittel muß mit Wasser mischbar sein, neutrales oder alkalisches pH haben, bei Raumtemperatur 5 und Kfihlschranktemperaturen flüssig sein und darf keine abbauenden Reaktionen nut den reaktiven Stellen des Enzyms eingehen, sondern darf nur elektrostatische Bindungen bilden. Geeignete Lösungsmittel sind allgemein polare organische Lösungsmittel, wie Äther, Ketone, Sulfone, Sulfoxide und Alkohole, wie Methanol, Äthanol PropanoL Butanol. Aceton, Dioxan, DMSO, Dimethylsulfon und THF. Jedoch wurde für flüssige Polyole mit 2 bis 4 Hydroxylgruppen und 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie Glycerin, Propandiol Butandiol, Ätl.ylenglykol und io dergleichen, eine höhere Aktivität bei niedrigei'er Lösungsmittelkonzentration für die Behandlungsstufe gefunden.

Das Lösungsmittel muß während der Behandlungsstufe in einer Menge von wenigstens 20%, insbesondere 25 bis 50%, anwesend sein. Einige Lösungsmittel erfordern Konzentrationen bis zu 70%, um eine stabilisierte Aktivität über 60% der Enzymreaktivität zu erhalten.

Beispiel 1
Enzymgrundlage
2Q Material Menge

Gelatine 0,1% GewVGew.

1,2-Propandiol 30% VoL/Vol.

Wasser 70% VoL/Vol.

In der Enzymgrundlage wurde eine Suspension von trockenen lyophilisierten LDH-Enzym in einer Menge gleich 22 500IE/1 in 2,2m Ammoniumsulfat gelöst, und die Lösung wurde 2 bis 3 Tage bei 4 bis 30° C gehalten.

Substratreagenz

Material Menge

i; (g/l)

!'.·■ L-Alanin 22

35 «-Ketoglutarsäure 1,6

ΐ KH₂PO₄ 14

W NaOH 5

P NaN₂ 1

'ι Gelatine 1

Die Enzymgrundlage wurde durch Zugabe der Substratreagenzsuspension auf das 30fache verdünnt und

¹ gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Die Suspension wird unter Kühlen gelagert. Die Lage-

[':] rungsbeständigkeit unter Kühlbedingungen wird mit 3 Jahren bei verbleibenden 50 bis 90% Aktivität angenom-

;,| men.

f'; 45 In der klinischen Diagnostik können die gemäß der Erfindung stabilisierten Enzympräparate u. a. zum Nach-

'■: weis und zur quantitativen Bestimmung der folgenden Bestandteile biologischer Flüssigkeiten verwendet wer-

V den:

¹; 1. Glutamat-oxalacetat-transaminase (SGOT);

v! so 2. Glutamat-pyruvat-transaminase (SGPT);

'?'■( 3.Lactat-dehydrogenase(LDH);

4. Creatin-phosphokinase (CPK);

5. Λ-Hydroxybuterid-dehydrogenase («-HBD);

6. Glucose (via Hexokinase-G-6-PDH).

; ι Diese Reagenzien reagieren ähnlich, enthalten einige gemeinsame labile Ingredienzien, und einige der ablau-

; ■■; fenden chemischen Reaktionen sind entsprechend. Das folgende Reaktionsschema ist ein Modell, das die Art der

ablaufenden Umsetzungen veranschaulicht:

Reaktionsschema 1. — Allgemeines Modell

Enzym 1 _v

(1.) Substrat(e) Produkt(e)

pH

Enzym 2 _v

(2.) Produkt/Substrat + NAD-NADH₂ -^ NADH₂-NAD + Produkt

pH

Katalysator _x
(3.) NADHj + Chromogen ^ Chromogen + NAD ₁₀

(oxidiert) (reduziert)

Alle oben aufgeführten enzymatischen Reaktionen folgen diesem allgemeinen Schema, wobei die Reaktion (2.) gewöhnlich als Kupplungsreaktion und die Reaktionen (2.) oder (3.) als Meßreaktionen bezeichnet werden und die Reaktion (1.) als die Primärreaktion bezeichnet werden kann. Für die Messung sind jedoch nicht alle drei 15 Reaktionen erforderlich; vielmehr kann ihre Zahl auf zwei oder eine begrenzt werden, im Falle der UV-Messung von Lactat-dehydrogenase (LDH)-Aktivität kommt nur die Reaktion (2.) in Betracht:

Reaktionsschema 2. — LDH

— 20

LDH .
Pyruvat + NADH₂ NAD + Lactat

Andererseits können auch mehr als die drei obigen Reaktionen ablaufen, wie im Fall der Creatin-phosphokinase (CPK): 25

Reaktionsschema 3. — CPK

CPK
(1.) CP + ADP ATP + Creatin ₃₀

(2.) ATP + Glucose s Glucose-6-Phos. + ADP

G-6-PDH _v 35

(3.) Glucose-6-Phos. + NAD t NADH₂ f

PMS . ;

(4.) NADH₂ + INT INT + NAD a

(ox) (red) 40 ·;

Symbole: ~ ■:,

CP = Creatin-phosphat (i,

ADP = Adenosin-5'-diphosphat 45 {

ATP = Adenosin-triphosphat

HK = Hexokinase ;

NAD = Nicotinamid-adenin-dinucleotid v.i

NADH2 = Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduziert k?

G-6-PDH = Glucose-e-phosphat-dehydrogenase 50 ^₁J

INT = Tetrazoliumsalz :^;,

PMS = Phenazin-methosuifaL fe

In diesem Fall können die Reaktionen (Z) und (3.) als die Kupplungsreaktionen, die Reaktionen (3.) oder (4.) als fv

die Meßreaktionen und die Reaktion (1.) als die Primärreaktion bezeichnet werden. 55

Mit Bezug auf das Reaktionsschema 1. — Allgemeines Modell ist bekannt, daß die Anwendung der Reaktionsfolge die quantitative Analyse entweder der Reaktionssubstrate/Produkte oder der katalysierenden Enzyme ermöglicht

Die quantitative Bestimmung dieser Bestandteile biologischer Flüssigkeiten ist bekannt und wird in großem Umfang für diagnostische Zwecke sowie für die Behandlung menschlicher und tierischer Erkrankungen ange- eo wandt

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Stabilisieren eines Enzyms, das in wäßrigem Medium instabil ist, dadurch gekennzeichnet, daß man

1) eine Lösung des Enzyms in einem wäßrigen Medium, das wenigstens 0,05 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon, Dextran oder Gelatine und wenigstens 20% an einem mit Wasser mischbaren, neutrales oder alkalisches pH haben, bei Raumtemperatur und Kühlschranktemperaturen flüssigen und keine abbauenden Reaktionen mit den reaktiven Stellen des Enzyms eingehenden Keton, Äther, Sulfon, Sulfoxid oder Alkohol

ίο enthält, herstellt;

2) diese Lösung wenigstens 30 Minuten bei einer Temperatur unter dem Denaturierungspunkt des Enzyms hält; und

3) die Lösung dann mit Wasser bis wenigstens zur 20fachen Verdünnung unter Zusatz von weiterem Polyvinylpyrrolidon, Dextran oder Gelatine verdünnt, bis der Enzymgehalt wenigstens 100 LE, der

Gehalt an organischem Lösungsmittel nicht mehr als 5% und der Gehalt an Polymer wenigstens 0,01 % beträgt