DE1598264A1 - Verfahren und Praeparat fuer klinische Diagnosen - Google Patents

Verfahren und Praeparat fuer klinische Diagnosen

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DE1598264A1 DE19661598264 DE1598264A DE1598264A1 DE 1598264 A1 DE1598264 A1 DE 1598264A1 DE 19661598264 DE19661598264 DE 19661598264 DE 1598264 A DE1598264 A DE 1598264A DE 1598264 A1 DE1598264 A1 DE 1598264A1
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    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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Description

No. 3, Ühonbashi Honßho 3-cliQtDe, Ohao-ku,
Tokyo, Japan
Verfahren und Präparat für klinische Diagnosen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren und ein, Präparat für klinische Diagnosen und bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Ölutaminsäiire-Ketoaäuretraneaminase sowie auf ein Präparat für diesen Zweck.
Dursn den Ausdruck "Glutaminsäure-Eetosäuxetransaminaee* wird eine Q-lutaminsäure-Ketosäuretransaminase alt Ausnahme der Glutaminsäure-OxaleeBigeäuretraneaainase definiert.
Ea iet feekAnnt, daß 41« Aktivität von &lutaainBäare-K*to-Bäurttraneaiiinase in Geweben oder Körperflüssigkeit·!! bei _
BenkfcoMo: DreedAei «MO Aa Heroe Vt*
F Is^P
Dflvev |M^^K^MF '
verschiedenen Herzkrankheiten! leberkrankheiten oder dgl. schwankt; aus diesem Grunde wurde die Bestimmung der Aktivität der Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase zur Diagnose dieser Krankheiten durchgeführt.
Bisher wurden zwei /erfahren zur Bestimmung der Aktivität von Grlutaminsäure-Brenztraubensäureaminase bei klinischen und biochemischen Forschungen routinemäßig durchgeführt. Diese Verfahren beruhen auf verschiedenen Prinzipien, und zwar bedient sich das eine Verfahren der Spektrophotometrie, während sich das andere Verfahren die Färbung zunutze macht, die durch 2,4-Dinitrophenylhydrazone von entweder nicht umgesetzten oder umgesetzten oir-Ketosäuren entwickelt wird. Das erstere Verfahren ist exakt und einfach durchzuführen, es erfordert jedoch einen UV-Spektrophotometer zur Bestimmung der optischen Dichte bei 340 au. Muß daher eine große Anzahl von Proben gemessen werden, so wie dies bei klinischen Forschungen der fall ist, so erfordert dies einen großen Zeitaufwand. Das letztere Verfahren hat den Vorteil, daß es keinen TJV-Spektrophotometer erfordert, es ist jedoch weniger empfindlich und ungenau.
Sin Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Schaffung eines neuen, einfach durchzuführenden und genauen Verfahrens zur Bestimmung der Aktivität von Glutaainsäure-Ketosäuretransaainasen.
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Ein weiteres Ziel der rorliegenden Erfindung ist ein tür diesen Zweck geeignetes, stabiles und beque« zu handhabendes Präparat.
Das erfindungsgeaäße BeetimatungSTerfahren umfaßt die Kupplung von zwei ensyaatischen Reaktionen, und zwar die GIutamineäure-Ketosäuretransaminierungereaktion und die GIutejBineäure-Oxaleseigeäaretraneaminierungereaktion, die Umwandlung der als Ergebnis der Glutaminsäure-KetosäuretraHB-aminierungsreaktion gebiÄten !^-Ketoglutarsäure und der zugesetzten Asparaginsäure in Glutaminsäure bzw. Oxalessigsäure durch die Glutaainsäure-Oxaleseigeäuretraneaminierungsreaktion und die Messung der Menge der gebildeten Oxalessigsäure.
Erfindungsgeeäß kann die Glutaainsäure-Ketosäuretraneaalnaseaktirität durch Zugabe einer Ketosäure oder von Salzen dieser Säure, Glutaninsäure oder deren Salzen, Asparaginsäure oder deren Salzen und GlutaainBäure-Oxaleseigsiuretransaainaee zu einer geeigneten iienge einer Probelösung bestiaat werden, wobei die vorstehend angegebenen enzyaatischen Reaktion ablaufen and die Menge der gebildeten Oxalessigsäure gemessen wird.
Der Mechanismus der enzymatischen Reaktionen ist wie folgt;
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Ketosäure . /Glutaminsäure w ^.Oialessigsäure
Aminosäure ^-Ketoglutarsäure / \Asparaginsäure
Glutaminsäure-Keto- Glutaminsäure-Oxales sigsäuretransaminase säuretransaminase
Wie aus dem vorstehend angegebenen Mechanismus hervorgeht, wird eine der Probelösung zugesetzte Ketosäure durch die Einwirkung der zu bestimmenden Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase in eine entsprechende Aminosäure umgewandelt, wobei gleichzeitig die Bildung von fe-Ketoglutarsäure aus Glutaainsäure erfolgt. Die gebildete («-Ketoglutarsäure reagiert mit Asparaginsäure durch die Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase unter Bildung der der «/-Ketoglutarsäure äquivalenten Mengen an Oxalessigsäure und Glutaminsäure. Daher kann die Glutaminsäure-Ketosäuretransaminaseaktivität durch Messung der Menge an gebildeter Oxalessigsäure bestimmt werden.
Bei der praktischen Durchführung kann die Glutaminsäure-KetoBäuretransaminaseaktivität durch Zugabe einer Ketosäur« oder eines ihrer Salze, Glutaminsäure oder eines ihrer Salze, Asparaginsäure oder eines ihrer Salze und Gtlutanineäure-Oxalessigsäuretransaminase zu einer geeig-. neten Menge einer Probelösung, die Glutaminsäure-Keto-Bäuretransaminase enthält, Einstellung des pH-Wertes in
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dem Reaktionsmedium durch Zugabe einer Pufferaischung auf ungefähr 7 bis ungefähr 9» vorzugsweise 8,0, eine geeignete Zeitlang, im allgemeinen 6-10 Minuten andauernde Inkubation zur Bildung der Oxalessigsäure bei 30 - 40° C, vorzugsweise bei 37° 0, und Messung der Menge an gebildeter Oxalessigsäure bestimmt werden. Alle diese Agentien können für sich allein, in Porm einer Mischung oder in Form von Mischungen, die vorher auf irgendeine geeignete Weise vermischt wurden, zugesetzt werden.
Da die vorstehend erwähnten zwei enzymatischen Reaktionen reversibel sind, können die Substrate nicht in beliebigen Mengen zugesetzt werden. Eine Ketosäure oder deren Salze, Glutaminsäure oder deren Salze und Asparaginsäure oder deren Salze können im allgemeinen in einem molaren Verhältnis von 0,8-3 : 1- 5 '· 10-30, vorzugsweise 1 : 2 : 15, verwendet werden. Glutaminsäure und Asparaginsäure können entweder in der L-Form oder in der D,l-]?orm eingesetzt werden. Eine Ketosäure, Glutaminsäure und Asparaginsäure können in ]?orm wasserlöslicher Salze, beispielsweise in Form von Mono- oder Dilithium-, Natriumoder Ealiumsalzen, verwendet werden.
Die Menge der Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase ist nicht kritisch, es ist lediglich dafür Sorge zu tragen, daß ein nennenswerter Überschuß an dieser Verbindung zugesetzt wira. Wird Beispielsweise die Aktivität in Eörperflüssig-
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keiten bestimmt, dann wird Grlutaminsäure-OxalessigsäuretrarB aminase vorzugsweise in Konzentrationen von IO - 100 m-IiU. (International Units) auf 0,2 al lörperflüssigkeit zugesetzt.
Vorzugsweise kann Pyridoxalphosphat zur Beschleunigung der Transaminierungsreaktion zugegeben werden.
Um einen reibungslosen Ablauf der enzymatischen Reaktion zu gewährleisten, wird vorzugsweise eine Puffermischung zur Aufrecht erhaltung eines pH-tfertes in dem Reaktionen] edium während der Messung zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 verwendet. Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer und dgl. kann in vorteilhafter Weise eingesetzt werden.
Die Menge der gebildeten Oxaleesigeäure kann nach Beendigung der Umsetzung durch gewöhnliche analytische Verfahren bestimmt werden, wobei das vorteilhafteste Verfahren in einer colorimetrischen Methode unter Verwendung eines Parbentwicklers, insbesondere eines Azoniumsalzes, besteht.
Einige Azoniumsalze inhibieren nicht die enzymatischen Reaktionen, sondern reagieren mit Oxalessigsäure in spezifischer Weise unter gesteuerten Bedingungen unter Bildung einer gefärbten Kupplerverbindung, die ie sichtbaren Spektrua eine Absorption aufweist. Daher kann ein Azoniumsalz dem enzymatischen Reaktionsmedium vor oder nach der Inkubation zugesetzt werden, wobei die Menge der gebildeten Oxaleeeigeäure
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in vorteilhafter Weise unter Verwendung eineβ Colorimeters oder visuell durch Vergleich der entwickelten farbe alt einer Standardfarbkarte be8tinert wird. Ale Azoniuasalze seien beispielsweise 4-Aaino-2,5-diäthoxybenzaniliddiazoniuachlorid, OTBeneaaid^-aethoxy-e-toluidindiazoniuachlorid, tetrazotiertes o-di-Anisidin und dgl. erwähnt. Einige Azoniumsalze können in vorteilhafterer Weise in Pore eines Doppelsalze ait eines anorganischen Halogenid, Sulfat oder dgl. eines Metalles wie beispielsweise Cadaiua, Mangan, Zink, Magnesiua und dgl., beispielsweise Manganchlorid, Magnesiumchlorid, Cadaiuachlorid, Zinkchlorid und dgl., aus den nachstehend noch näher erläuterten Gründen verwendet werden.
Sie Menge der gebildeten Oxalessigsäure kann außerdem durch Verwendung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin bestiaat werden. Bei diesen Verfahren wird die Menge der gebildeten Oxalessigsäure als 2,4-Dinitrophenylhydrazonderivat beetiaat. Die gebildete Oxalessigsäure kann auch in Torteilhafter Welse in einer Lösung bestinet werden, die nur Oxaleesigsäure enthält und durch Säulen- oder Papierchroaatographie hergestellt wurde.
Die Menge der gebildeten Oxaleesigsäure kann weiterhin aittels einer Mischung aus Anilin und Zitronensäure bestirnt werden. Bei dies·« Verfahren wird die gebildet· Oxalessigsäure
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durch die Einwirkung einer Mischung aus Anilin und Zitronensäure zu Brenztraubensäure und Kohlendioxyd zersetzt, so daß die enzymatische Aktivität durch Messung der Kohlendioxydgasmenge unter Verwendung eines Warburg-Manometers bestimmt werden kann.
Die enzymatische Aktivität kann ferner durch eine Kombination der vorstehend beschriebenen zwei Verfahren gemessen werden, uni zwar durch Zersetzung der gebildeten OxalesBigsäure in Brenztraubensäure und Kohlendioxyd und Messung der Menge der gebildeten brenztraubensäure durch Verwendung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin. Wird jedoch die Aktivität von Gluta-Binsäure-Brenztraubensäuretransaminase bestimmt, dann muß die gebildete Oxalessigsäure zur Bestimmung ihrer Menge von der Heaktionsmischung abgetrennt werden, da ein Überschuß an Brenztraubensäure dem Reaktionsmedium zugesetzt wurde.
Bei der Messung der Menge an gebildeter Oxalessigsäure unter Verwendung eines Azoniumsalzes ist es vorteilhaft, die Messung nach der Abstoppung der enzymatischen und der Parbentwicklungsreaktion durchzuführen. Die enzymatische Reaktion kann durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise Methanol, Äthanol, Isopropanol und dgl., und die Farbentwicklungsreaktion durch Steuerung des pH-Wertes in dem Eeaktionsmedium, im allgemeinen durch Zugabe einer organischen und/oder anorganischen Säure, wie beispielsweise Essigsäure, Trichloressigsäure, Schwefel-
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säure, Salzsäure und dgl., abgestoppt werden.
Im allgemeinen wird die Messung nach der Abstoppung der Farbentwicklungsreaktion anschließend an die Abstoppung der enzyaatischen Reaktion durchgeführt. Wird Jedoch 6-Benzafflid-4-methoxy-iB-toluidindiazoniunchlorid oder das Doppelsalz dieser Verbindung verwendet, dann können die zwei vorstehend genannten Reaktionen gleichzeitig abgestoppt werden, da die optimalen pH-Werte der enzymatischen Säure der Farbentwicklungsreaktionen praktisch gleich sind und die gebildete Oxalessigsäure schnell Bit diesem Azoniumsalz reagiert. In dieses Falle wird daher eine Mischung aus Alkohol und Schwefelsäure oder Salzsäure mit einem Yolumenverhältnis von 95 - 99 : 5 - 1 in vorteilhafter Weise als Reaktioneabstoppmittel verwendet. Sie enzymatische Reaktion wird durch 2,4-Dinitrophenylhydrazin inhibiert, so daß es nicht erforderlich ist, ein Abstoppmittel für die enzymatische Reaktion zur Abstoppung der Farbentwicklungsreaktion im falle der Verwendung von 2,4-Dintrophenylhydrazin einzusetzen. Bei der Messung mittel« eines Warburg-Manometers ist di· Verwendung eines Abstoppmittels für die enzymatische Reaktion aus dem gleichen Grunde nicht erforderlich.
Ale erfindungsgeeäß au bestimmende Glutaminsäure-Ketosäur·- transaainasen seien Glutaminsäure-Brenstraubensäuretransaminase, &lataminsäare-p-hydrosyphenylbrenjrtraubensaur·- traneaainas·t Glutafflineäure-Iaidazolbrenetraubeneäuretrane-
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aninase, Glutamineäure-Glyoxylsäuretransaiiinase und dgl. erwähnt. Die erfindungsgenäß verwendete Ketosäure muß je nach der zu bestimmenden Transaminase ausgewählt werden.
Als den zu bestimmenden Transaminasen entsprechende Ketosäuren seien Brenztraubensäure (Glutaainsäure-Brenztraubensäur etransaminase) , p-Hydroxypheny!brenztraubensäure (GIutaminsäure-p-Hydroxyphenylbrenztraubensäuretransaminase) , Iieidazolbrenztraubensäure (Glutaminsäure-Inidayolbrenztraubensäuretransaminase) , Glyoxylsäure (Glutaminsäure-Glyoxylsäuretransaainaee) erwähnt.
Erfindungsgemäß kann die enzymatische Aktivität einer Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase auf einfache und genaue Weise bestimmt werden, ohne daß dabei ein UV-Spektrometeiri-Brforderlich ist; das erfindungsgemäße Verfahren ist auch dann bequem durchzuführen, wenn eine große Anzahl von Proben gemessen werden nuß. Insbesondere dann, wenn ein Azoniumsalz verwendet wird, ist das Verfahren im Hinblick darauf, daß es möglich ist, die gebildete Oxalessigsäure unter Verwendung eines Colorimeters oder visuell durch Vergleich der entwickelten Farbe mit einer Standardfarbkarte zu bestimmen, sehr geeignet.
Die erfindungsgemäß verwendeten fieaktionsmittel sind folgende:
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(1) Ketosäure oder deren Salze
(2) Glutaminsäure oder deren Salze
(3) Asparaginsäure oder deren Salze
(4) Glutaainsäure-Oxalessigsäuretransaminase
(5) Oxalessigsäurebestimmungsmittel
(6) Puffermiachung, die dazu geeignet ist, den pH-wert in dem Reaktionsaedium während der Messung aufrechtzuerhalten.
Außer den vorstehend angegebenen Agentien können, falls erforderlich, Pyridoxalphosphat, eineLCittel oder eine Lösung zur Abstoppung der Reaktion sowie ein inaktives Verdünnungsmittel verwendet werden.
Pyridoxalphosphat wird in vorteilhafter //eise aur Begünstigung eines glatten Verlaufes der enzymatischen Reaktion verwendet, da diese Verbindung ein Coenzym verschiedener Transaninasen ist.
Diese Agentien (1-6) und Pyridoxalphosphat können für sich allein, in Form einer Mischung oder in Porin von Mischungen zugesetzt werden. Im allgemeinen ist es zweckmäßig, das Präparat zu verwenden, welches durch Veraischen einiger oder aller dieser Agentien unmittelbar vor°lfEige Zeit vor der Verwendung hergestellt wurde. Zur Vereinfachung des Bestimmungsverfahrens ist es besonders vorteilhaft, Präparate in Fora von Tabletten, Pulvern, Granulaten, Flüssigkeiten oder
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dgl. zu verwenden, die einige Zeitlang vorher hergestellt wurden. Ale typische geeignete Präparate seien die folgenden erwähnt:
Typ A. Ein Sortiment, das sich wie folgt zusammensetzt:
(1) Ein Präparat enthaltend
eine Ketosäure oder eines ihrer Salze Glutaminsäure oder eines ihrer Salze Asparaginsäure oder eines ihrer Salze Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase Pyridoxalphosphat
ein Oxalessigsäurebestimmungsmittel eine Puffermischung, die dazu geeignet ist, in dem Reaktionsmedium den pH-Wert von ungefähr 7 bis ungefähr 9 aufrechtzuerhalten.
Geeignete Präparatform: Tabletten, Pulver und Granulate.
(2) ein Abstoppmittel für die enzymatisehe Reaktion
(3) ein Abstoppmittel für die Farbentwicklung
Typ B. Ein Sortiment, das eich wie folgt zusammensetzt: (1) Ein Präparat enthaltend eine Ketosäure oder eines ihrer Salze Glutaminsäure oder eines ihrer Salz« Asparaginsäure oder eines ihrer Salze Glutamineäure-Oxalessigsäuretransafflinas·
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Pyridoacalphosphat
eine Puffermischung, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dem Reaktionsmedium zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 aufrechtzuerhalten.
Geeignete Präparatform: Tabletten, Pulver und Granulate.
(2) ein Qxalessigsäurebestimmungsmittel Geeignete Präparatforms Tabletten, Pulver und Granulate.
(3) ein Abstoppmittel für die enzymatische Reaktion
(4) ein Abstoppaittel für die Parbentwicklung
Typ C. Ein Sortiment, das sich wie folgt zusammensetzt: (1) Bin Präparat enthaltend
eine Ketosäure oder eines ihrer Salze Glutaminsäure oder eines ihrer Salze Asparaginsäure oder eines ihrer Salze eine Puffermischung, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dem Reaktionsmedium zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 aufrechtzuerhalten.
Geeignete Präparatformι wäßrige Lösungen, Tabletten, Pulver und Granulate.
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(2) ein Präparat, enthaltend Glutamineäure-Oxalessigsäuretransaminase Pyri doxalpho sphat
Geeignete Präparatform: Tabletten, Pulver, Granulate sowie ein poröees Folienmaterial, dae mit der vorstehend angegebenen Mischung imprägniert ist.
(3) ein Ozalessigsäurebestimmungsmittel Geeignete Präparatform: Tabletten, Pulver und Granulate.
(4) ein Abstoppmittel für die enzymatische Reaktion
(5) ein Abstoppmittel für die Farbentwicklung
Typ D.
(1) eine Mischung enthaltend
eine Ketosäure oder eines ihrer Salze Glutaminsäure oder eines ihrer Salze Asparaginsäure oder eines ihrer Salze Glutaninsäure-Oxalessigsäuretransaninase Pyridoxalphosphat
eine Puffermischung, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dem Reaktionsmedium zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 aufrechtzuerhalten.
Geeignete Präparatform: Tabletten, Pulver und Granulate.
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(2) ein Oxalessigeäurebestimmungsmittel Geeignete Präparatfora: Tabletten, Pulver und Granulate.
Das Iräparat des Typs A kann durch Zugabe eines inaktiven Verdünnungsmittels, beispielsweise Lactose, Polyvinylpyrrolidon, Carboxymethylcellulose und dgl,, zu einer Mischung, die sich aus einer Ketosäure oder eine« ihrer Salze, Glutaminsäure oder einem, ihrer Salze, Asparaginsäure oder einem ihrer Salze, Pyridoxalphosphat, Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminaee, einer Puffermischung, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dem Reaktionsmedium während der Messung zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 aufrechtzuerhalten, und einem Oxaleesigeaurebestimmungeaittel zusammensetzt, zubereitet w€rd, wobei aus der erhaltenen Mischung ein Pulver, Granulat oder Tabletten hergestellt werden können. Die flüssige Form kann ebenfalls hergestellt werden, sie ist jeiooh für eine lange Aufbewahrung nicht geeignet. Bei der Herstellung des Typs A ist es erforderlich, daß das Oxaleseigsäurebeetiaaungsmittel nicht die enzyaatische Reaktion inhibiert. In diesem Sinne ist die Verwendung eines Azoniuasalzes am zweckmäßigsten. Wird ein Azoniuasalz verwendet, das durch Umsetzung mit der Oxalessigsäure in dem gleichen pH-Bereich, der bei den enzymatischen Reaktionen eingehalten wird, eine gefärbte Kupplerverbindung bildet, dann können die zweite und die dritte Abstopplösung zur Herstellung einer einzigen Reaktionsabstopplösung vermischt werden, vor-
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ausgesetzt, daß die einzelnen Lösungen untereinander mischbar sind und nicht miteinander reagieren· beispielsweise kann eine Äthanol/Schwefelsäure-Mischung verwendet werden.
Das Präparat dieses Typs ist für quantitative und halbquantitative Analysen geeignet.
Das Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Ketosäuretransaminasen unter Verwendung des Präparats des Typs A geht wie folgt vor sich:
Zuerst wird das Präparat in einem kleinen Volumen destilliertem Wasser aufgelöst. Zu einer geeigneten Menge einer Probelösung wird diese Lösung zugesetzt, worauf die Mischung eine geeignete Zeitlang bei 30 - 40° C, vorzugsweise 57° C, inkubiert wird. Die Farbe entwickelt sich schrittweise, und zwar proportional der Menge der gebildeten Oxalessigsäure. Nach der Inkubation werden die Abstopplösung für die enzymatische Reaktion und die Abstopplösung für die Färbentwicklung zur Abstoppung der enzymatisehen Reaktionen und der Farbbildung zugesetzt. Die Transaminaseaktivität wird durch Messung der optischen Dichte der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung eines Colorimeters oder durch visuellen Vergleich der entwickelten Farbe mit einer Standardfarbkarte bestimmt.
Da einige der-Farbentwickler relativ instabil sind, ist es oft vorzuziehen, zwei oder drei Präparate abzutrennen. In
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einem derartigen Falle ist die Verwendung der Präparate der Typen B oder C zweckmäßig.
Die erste Zusammensetzung dee Typs B wird auf die gleiche Weise hergestellt, wie die des Typs A.
Als zweites Oxalessigsäurebestimmungsmittel wird in vorteilhafter Weise ein Azoniumsalz verwendet.
Die Bestimmung der Aktivität einer G-lutaainsäure-Ketosäuretransaminase kann auf die gleiche Weise wie bei Verwendung des Präparats des Typs A durchgeführt werden. Die zweite Zusammensetzung kann im FaIIe der Verwendung eines Azoniumsalzes vor oder nach den enzymatischen Heaktionen zugesetzt werden.
Das Präparat des Typs C ist· für quantitative Analysen am geeignetsten.
Das erste Präparat des Typs C kann in form einer wäßrigen Flüssigkeit oder in fester Form, beispielsweise als Tabletten, Granulate oder Pulver, verwendet werden. Eine wäßrige flüssige Form kann durch Auflösung dieser Substrate in einer geeigneten Menge Wasser, Zugabe einer Puffermischung, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in einem Reaktionsmedium während der Messung zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 aufrechtzuerhalten und, falls erforderlich, durch Zugabe eines
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inaktiven Stabilisierungsmittels zu der erhaltenen Mischung hergestellt werden.
Eine feste Form kann durch Vermischen einer PuffermiBchung, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in einer Probelösung während der Messung zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 zu halten, mit einer Mischung aus Glutaminsäure oder einem ihrer Salze, einer Ketosäure oder einem ihrer Salze und Asparaginsäure oder einem ihrer Salze hergestellt werden. Erforderlichenfalls kann ein inaktives Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Lacton, Polyvinylpyrrolidon, Cprboxymethylzelluloae und dgl., zugesetzt werden.
In dem zweiten Präparat kann Glutamineäure-Oxalessigsäuretransaminase in Form eines aue reinen Kristallen hergestellten Pulvers oder in Form einer Mischung aus Glutaninaäure-Oxalessigsäuretransaminase und Ονο-Albumin verwendet werden. Glutaminsäure-Oxaleesigsäuretransaminaee und Pyridoxalphoephat können, auf ein poröses Folienmaterial aufimprägniert, verwendet werden.
Das dritte Oxalessigsäurebestimmungsmittel ist das gleiche, wie es in dem Präparat des Typs B verwendet wird.
Das erste Präparat des Typs D kann auf die gleiche Weise wie das erste Präparat des Typs A hergestellt werden.
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In dem Präparat dee Type D kann als Oxalessigsäurebestimmungsmittel 2,4-DinitrophenylhzdraBin in vorteilhafter Weise verwendet werden.
Das Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer Grlutamin-Bäure-Ketosäuretraneaminaee unter Verwendung des Präparats des Typs D, in welchem als Oxalessigsäurebestimmungsmittel 2,4-Dinitrophenylhydrazin enthalten ist, geht wie folgt vor sich:
Das erste Präparat wird in einem kleinen Volumen destilliertem Wasser aufgelöst. Zu einer geeigneten Menge einer Probelösung wird diese Lösung zugesetzt, worauf die Mischung eine geeignete Seitlang bei 30 - 40° C, vorzugsweise 37° C, inkubiert wird.
Nach der Inkubation wird das zweite Präparat, das 2,4-Dinitrophenylhydrazin enthält, zugegeben, worauf die Menge an gebildeter Oxalessigsäure gemessen wird. Die Farbe wird durch Zugabe einer alkalischen Substanz, wie beispielsweise Natriuahydroxyd, Kaliumhydroxyd, Lithiuahydroxyd und dgl., gebildet.
Nach Beendigung der Farbbildung kann die Menge der gebildeten Oxalessigeäure durch Messung der optischen Dichte bei 505 mu bestimmt werden. In diesem Falle wird die enzymatisch^ Reaktion durch die Zugabe der alkalischen Substanz inhibiert, so daß kein Abstoppmittel für die enzymatisch^ Reaktion erforderlich ist.
r η au a ,-■/ s 7 BAD ORIGINAL'
Außer diesen 4 Typen können noch verschiedene andere Präparattypen, verwendet werden.
Wird das Präparat unmittelbar vor seiner Verwendung hergestellt, dann kann jede Präparatform in vorteilhafter Weise verwendet werden. Im allgemeinen ist es jedoch zweckmäßig, ein geeignetes Präparat zu verwenden, welches eine Zeitlang yör seiner Verwendung hergestellt wurde.
Das Präparat, das nur Substrate, wie beispielsweise eine Ketosäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure oderederen Salze als aktive Bestandteile enthält, k>tnn in Form einer wäßrigen Flüssigkeit oder in fester Form als Tabletten, Granulate oder Pulver verwendet werden, wobei jede Form auf die gleiche Weise hergestellt werden kann, wie sie bei der Herstellung des ersten Substratpräparate des Typs C beschrieben wurde.
Bas Präparat, welches das Enzym und/oder ein Azoniumsalz enthält, wird in vorteilhafter Weise zu einer festen yorm verarbeitet, da die enzymatisch^ Lösung und die Azoniumsalzlösung in wäßriges Zustand instabil sind, und zwar neigt die erstere dazu, durch verschiedene Faktoren inaktivi»r*tzu werden, wäferend die letztere leicht durch Licht oder Wärme zersetzt wird.
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Als Farbentwickler kann ein. Azoniuasalz, 2,4-Dinitrophenylhydrazin oder dgl., insbesondere jedoch, ein Azoniuaaale, verwendet werden. Bei der Verwendung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin auß dieses als Präparat für sich abgetrennt werden, da dieses Mittel die enzymatieche Reaktion inhibiert.
Als AEoniumealae können die vorstehend beschriebenen verwendet werden. Von diestn AeQniuasalBen 1st 6-Ben»aaid-4-methoiy-a-toluidindiazoniufflchlorid, vorsugsweise in Fora eines Doppelsalzee mit einem anorganischen Hetallsals, an vorteilhaftesten.
Gegenüber den 6-Benaaaido~4-aethoiy-ai-toluidindiaaoniuachlorid ist das Doppelsalz dieser Verbindung mit Zinkchlorid gegenüber Feuchtigkeit und Hitze stabil, so daß es bei der Verwendung des einfachen Salzes erforderlich ist, während der Herstellung und Aufbewahrung entsprechende Voraiohtsaaßnahaen anzuwenden; das Doppelsalz ist stabiler und reagiert Bit Oialessigsäure in spezifischer Weise unter Bildung einer gefärbten Kupplerverbindung, sogar dann, wenn eine Äthanollösung einen Monat lang in der Kälte stehengelassen wird. Mit Oxalessigsäure eingesetztes e-Bensanido^Hoethoxy-in-toluidindlazoniuiBchlorld ergibt eine rotgefärbte Kupplerverbindung, die unter alkalischen Bedingungen eine maxiaale Absorption bei 520 - 530 au aufweist, und die unter sauren Bedingungen in Form einer gelbgefärbten Kupplerverbindung vorliegt, die bei einem
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pH-Wert von 6 eine maximale Absorption bei 41C au besitzt. Jede dieser Färbentwicklungen kann zur Messung der Oxalesaigsäure verwendet werden, es ist jedoch vorteilhaft, die unter alkalischen Bedingungen auftretende rote farbe zu verwenden.
Die Entwicklung der roten Farbe erfolgt bei Zimmertemperatur schnell· die gebildete gefärbte Kupplerverbindung ist unter sauren Bedingungeneinige Stunden lang stabil. Danach kann jedoch, je nach der Konzentration der Oxalessigsäure, eine Ausfällung des gefärbten Kupplerproduktes auftreten, wobei unter diesen Bedingungen die Messung unmöglich gemacht wird. TJm diesen Hachteil zu überwinden, werden über 50 i* Äthanol zugesetzt, wobei das Äthanol den Niederschlag auflöst. Daher wird das Azoniumselz in vorteilhafter Weise in Form einer wäßrigen oder einer Lösung in einem organischem Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthanol, verwendet.
An Stelle der Verwendung des Doppelsalzes in flüssigem Zustand kann die durch Vermischen der Diazoniumsalzesung mit der Lösung des anorganischen Metallsalze* erhaltene gemischte Lösung verwendet werden.
Dieser Farbentwickler reagiert nicht mit ^-Ketoglutarsäure, auch dann nicht, wenn die Konzentration an dieser Verbindung 3,3 mMol beträgt. Auch dann, wenn die Probe, von der die
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enzymatl8Che Aktivität bestiamt werden soll, infolge der Anwesenheit anderer inaktiver Proteine oder dgl. trüb ist, let es aöglich, die Bestimmung durchzuführen, da die Farbe auch in einer Äthanolkonzentration von über 50 i» entwickelt wird und die Probelöeung durch die durch die Anwesenheit von Äthanol bedingte Proteinausfällung klar wird.
Sie vorliegende Erfindung läßt sich in breitem Rannen industriell anwenden, beispielsweise in der FernentIndustrie und in der pharmazeutischen Industrie sowie für klinische Diagnosen; sie ist jedoch auch auf ein Arbeitsgebiet anwendbar, bei dea beispielsweise die Bestimmung einer GIutaaineäure-Ketosäuretransaainaseaktivität erforderlich ist.
Beispiel 1
Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Brenztraubensäuretransaminase
Zu 0,2 al einer Probelösung, die durch Homogenisierung von Rattenleber, Zugabe des 20-fachen Voluaena einer physiologischen Kochsalzlösung und Zentrifugieren sur Entfernung des Sohlmaaes hergestellt wurde, wurden i,l al BrenmtraubensäurelBsung alt einer Konsentration von 100 ^Mol/ml und 0,1 al einer 1,5 £-lgen KCl-Losung von GlutaainsäurevOxalessigeäuretraneaminase alt einer Konzentration von 24 a-I.U./ 0,1 al zubegeben.
0 0 9 8 8 ?/(H5 7
Getrennt wurden 7500 pMol !-Asparaginsäure, 1000 ^uMoI L-Glutaminsäure und 2,5 mg PyridozalphoBphat zu 20 ml Wasser gegeben, worauf der pH-Wert mittels 10 ?i-iger EOH-Lösung auf 8,0 eingestellt wurde und dae ganze Volumen der Lösung durch Zugabe von Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) auf 50 ml aufgefüllt wurde.
Zu der ersteren Lösung wurde 1,0 al der letzteren Lösung gegeben, worauf die erhaltene Mischung 10 Minuten lang bei 37° C inkubiert wurde. Nach den Zusatz von 3,0 ml der Doppelsalzlösung aus ö-Benzamid-^methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid und Zinkchlorid mit einer Konzentration von 20 mg/ml zu der Lösung zugegeben, worauf diese erneut 6-10 Minuten lang zur Entwicklung der roten farbe bei 37° C inkubiert wurde. Dann wurde 1,0 ml 2 η HCl der Lösung zur Abstoppung der Farbentwicklung zugegeben. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung der Lösung bei 3000 TTpa wurde die optische Dichte der überstehenden flüssigkeit bei 520 mu in eines Colorimeter bestimmt.
Beispiel 2
Bestimmung der Aktivität von Glutamineäure-GlyoiylBäuretransaminaee
In 3,6 ml destilliertem Wasser wurden 39»53 mg !-Asparaginsäure, 5,84 mg !-Glutaminsäure, 0,1 mg Pyridoxalphoaphat, 24t2 Bg Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan, 10,0 mg Glutamin-
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säure-Oxalessigsäuretraneaminase (2400 m-I.U./g) und 1,5 mg Glyoxylsäure gelöst.
0,4 ml der in Beispiel 1 verwendeten Probelösung And 4,0 ag des Doppelsalzes aus ö-Benzamido^-methoxy-m-toluidindiazoniuachlorid und Magnesiumchlorid wurden der Lösung zugesetzt. Nach 8 Minuten dauernder Inkubation bei 37° 0 wurden 6,0. al Äthanol und 2,0 ml 2 η HCl-Lösung der erwähnten Lösung zugefügt. Hach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung bei 3000 Upe wurde die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 520 aji in einem Colorimeter bestimmt.
Beispiel 3
Bestimmung der Aktivität von (xlutaminsäure-Brenztraubensäuretransaminase
Es wurden folgende Lösungen in das Hauptabteil eines Warburg-Bechers einpipettiert: 1000 jiMol !-Glutaminsäure, 7500 äMoI L-Asparaginsäure, 0,1 ml einer 1,5 #-igen KCT-Lösung von Grlutaminsäure-Oxaleseigsäuretransaminase mit einer Konzentration von 24 a-I.U./0,l ml, 2,5 mg Pyridoxal phosphat und 0,2 ml Serua. Hach einer 10 Minuten andauernden Inkubation bei 37° 0 wurden aus dem ersten Seitenarm 0,1 ml BrenztraubeneäurelöBung mit einer Konzentration von 100 /iMol/al ausgeschüttet und 30 Minuten iang bei 37° 0 in kubiert worauf 0,5 ml eines Anilincitratreagenzes, das
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durch Veraischen gleicher Volumina Anilin und Zitronensäurelösung (50 g Zitronensäure in 50 al Wasser) hergestellt worden war, aus dem zweiten Seitenarm ausgeschüttet wurden und das in Freiheit gesetzte Gas innerhalb von 10 Minuten gemessen wurde.
Gleichzeitig wurde ein Zontrollversuch durchgeführt, bei dem alle Beagentien mit Ausnahme der enzymatisch·!! Lösung verwendet wurden.
Beispiel 4
Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Brenztraubensäuretransaminase
Zu 5,0 ml der Reaktionsmischung, die gemäß Beispiel 1 erhaltene Oxalessigsäure enthielt, wurde 5,0 ml einer 10 'zeigen Metaphosphorsäure gegeben, worauf die Lösung geschüttelt und filtriert wurde.
Zu 4,0 ml des Piltratβ wurde 1^0 ml der 2,4-Dinitrophenylhydrazinlösung, die durch Zugabe von 0,1 g 2,4-Dinitrophenylhydrazin zu 100 ml 2 η HCl hergestellt worden war, gegeben, worauf die Lösung vermischt und 30 Minuten lang bei 30° C inkubiert wurde. Die Reaktionsnischung wurde in Eis gekühlt, worauf dreimal mit 8,0 ml Essigsäureäthylester und 2,0 ml Garbonatlösung, die durch Auflösung von 50 g Kaliumcarbonat und 5 g Natriumbicprbonat in Yasser und
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Auffüllung auf 1 1 hergestellt wordtn war, extrahiert wurde.
Nach der Zugab« von 0,5 al 6 n HCl-Löeung su den eisgekühlten Extrakten wurden diese Bit 8,0 al lesigeäureäthyleeter extrahert.
Der erhaltene Bxtrakt wurde unter Yeraindertem Druck extrahiert und anschließend in Aceton aufgelöst, worauf die Lösung zur Durchführung der Papierohronatographie auf ein filterpapier in Fora eine· Fleckens aufgegeben wurde.
2,4-Dinltrophenylhydraeon Rf
O0-Ke to glutarsäure 0,05 Brenztraubensäure4 0,35 OxalesBigsäure 0,12
lach der Trocknung des Filterpapiers wurden die aus Oxalessigsäure bestehenden Hecken ausgeschnitten und alt einea kleinen Yoluaen einer Oarbonatlösung extrahiert.
Die optische Dichte des Extrakts wurde bei 505 aa in einea Coloriaeter gesessen.
0 0 9 8 8 3 C A 5 7
Beispiel 5
Präparat zur Bestimmung der Aktivität von Glutaminsäure-Glyoxylsäuretransaminase
(1) Tablette A
L-Asparaginsäure 39»53 mg !-Glutaminsäure 5»84 mg
Pyridoxalphosphat 0,10 mg
Tris(hydroxymethjrl) -
aminomethan 24,2 mg
Glutaminsäure-Oxal-
eesigsäuretransaminase
(2400 m-I.U./g) 10,0 mg
Glyoxylsäure 1,50 mg
Zu der vorstellend angegebenen Mischung wurde lactose bis zu einem Gesamtgewicht von 90 mg zugesetzt, worauf aus der Mischung nach einem üblichen Verfahren eine !Tablette hergestellt wurde.
(2) Tablette B
Doppelsalz aus ö-Benzamido^-methyl-m-toluidindiazoniumchlorid und Magnesiumchlorid 4,0 mg
Zu diesem Doppelsalz wurde Lactose bis zu einer Gesamtmenge von 10 mg zugesetzt, worauf aus der grhaltenen Mischung nach einem herkömmlichen Verfahren eine Tablette . · hergestellt wurde.
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1 59826 A
(3) Gemischte lösung aus 6,0 ml Äthanol und 2,0 ml η HGl.
Bei der Verwendung wurde die Tablette A in 3,6 ml destillier tem Wasser gelöst, worauf C,4 ml einer Probelösung und anschließend die Tablette B zugefugt wurden. Die Mischung wurde 8 Minuten lang bei 37° C umgesetzt, worauf die dritte gemischte Lösung zugefügt wurde. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung bei 3000 Upm wurdie die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 530 mu in einem Colorimeter bestimmt.
Beispiel 6
Präparat für die Bestimmung der Aktivität von Glut aminsäure-Brenztraub ens äuretrans am inas e
(1) Asparaginsäure
Glutaminsäure
Pyridoxalphosphat
Iris(hydroxymethyl)-Aminomethan
Doppelsalz aus 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazottiumohlorid und Manganchlorid
Brenztra.ubensäure
Glutaminaäure-OxalesBigsäuretransaainaae (2400 a-I.Ü./g) 10,0 mg
39 ,53 mg
5 ,84 mg
0 ,10 mg
24 ,20 mg
4 ,0 mg
2 ,0 mg
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Zu dieser Mischung wurde Lactose bis zu einer Gesamtmenge von 100 mg zugesetzt, worauf nach einem üblichen Verfahren ein Granulat hergestellt wurde.
(2) Gemischte Lösung aus 6,0 ml Äthanol und 2,0 ml 2 η HCl.
Zur Verwendung wurde diese Tablette in 3f0 ml destilliertem Wasser gelöst, worauf 0,2 ml einer Probelösung zugesetzt wurden. Diese Mischung wurde 10 Minuten lang bei 37° C umgesetzt, worauf die zweite gemischte lösung zugegeben wurde. Nach einer 10 Minuten dauernden Zentrifugierung bei 3000 Upm wurde die optische Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 520 mji in einem Colorimeter bestimmt.
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Claims (1)

  1. Patentansprüche t
    1. Verfahren zur Bestimmung der enzynaa ti sehen Aktivität einer Glutaminsäure-Ketosäuretransaminase mit Ausnahme der GlutaminBäure-Oxaleseigeäuretransaminaee, dadurch gekennzeichnet, daß eine Grlutaaineäure-OxalessigsäuretransaoBinierungsreaktion mit einer Glutaminsäure-Ketosäuretransaainierungsreaktion mit Ausnahae der GlutanjinBäure-Oxalessigsäuretransaainierungereaktion gekuppelt wird und die Menge der gebildeten Oxalessigsäure geoessen wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurcfh gekennzeichnet, daß eine Ketosäure, Glutaaineäure, Asparaginsäure und GIutaainsäure-Oxaleseigsäuretraneaainaee einea geeigneten Volumen einer Probelösung zur Bildung von Oxaleseigsäure zugesetzt werden und die Menge der gebildeten Oxalessigsäure gemessen wird.
    3· Verfahren nach Anspruch 2» dadurch gekennzeichnet, daß an Stelle der freien Säuren, ein in Wasser löelichee Ketosäureaalz, ein in Wasser lösliches Glutaaineäuresalz und ein in Wasser lösliches Asparaginsäuresals verwendet werden.
    4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß als Salze einer Ketosäure, der Glutaminsäure and der
    0 C S S 8 3 / G A 5 7 ■
    Asparaginsäure lithium-, Natrium- und Kaliumsalze verwendet werden.
    5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ketosäure, Glutaminsäure und Asparaginsäure in
    einem molaren Verhältnis von 0,8-3 J 1-5: 10-30 verwendet werden.
    6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Probelösung ferner Pyridoxalphosphat zugesetzt wird.
    7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der gebildeten
    Oxalessigsäure mittels eines Azoniumsalzes bestimmt wird.
    8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Azoniumsalz 6-Benzamido-4—methoxy-m-toluidindiazoniuochlorid verwendet wird.
    9« Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Azoniumsalz 4-Aeino-2,5-diäthoxybenzaniliddiazoniumchlorid oder tetrazotiertes o-Dianisidin verwendet wird.
    10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Azoniuaealz ein Doppelsalz aus 6-Benzaaido-4-methoxy-
    an—
    m-toluidindiazoniuachlorid und einem organischen Metallsalz verwendet wird.
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    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als anorganisches Metallsalz Manganchlorid, Magnesiumchlorid, Cadniumchlorid oder Zinkchlorid verwendet wird.
    12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ketosäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure und das Doppelsalz aus 6-Benzamido-4-methoxy-m~toluidindiazoniumchlorid und einem anorganischen Metallsalz sowie Glutaaiinsäure-Oxalessigsäuretransaminase einem geeigneten Volumen einer Probelösung zugegeben werden, der pH-Wert auf ungefähr 7 bis ungefähr 9 mittels einer Pufferlösung eingestellt wird, zur Bildung der Oxalessigsäure die ulischung eine bestimmte Zeitlang bti einer Temperatur von 30-4-0 C inkubiert wird und die Menge der gebildeten Oxalessigsäure unter Verwendung eines Azoniumsalzes bestimmt wird,
    13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Zugabe einer Pufferlösung auf 8,0 eingestellt wird, die Mischung 6-10 Minuten lang zur Bildung von Oxalessigeäure bei einer Temp ratur von 37° 0 inkubiert wird und zur Abstoppung der enzymatischen Reaktion und der färbentwicklung eine Reaktionssfcetopp-
    lösung zugegeben wird, worauf die gebildtte OxaLeesig- >
    säure unter Verwendung «ines Azoniumsalaes btetieat J -.
    wird.
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    14. Präparat für die Bestimmung der enzyaatisehen Aktivität einer Glutaminsäure-Xetosäuretransaminase mit Ausnahme der Glutaninsäure-Oxaleesigsäuretransaminase, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Ketosäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase, einem Farbentwickler und einer Puffermischung, die zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes zwischen 7 und 9 geeignet ist.
    15. Präparat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zetosäurey Glutaminsäure und Asparaginsäure in
    einem molaren Verhältnis von 0,8 - 3 : 1 - 5 : JO - 30 zugegen sind.
    16. Präparat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbentwickler aus einem Azoniumsalz besteht.
    17. Präparat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Azoniumsalz ö-Benzamido^-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid ist.
    18. Präparat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Azoniumsalz «la Doppelsalz aus 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumsalz und einem anorganischen
    Metallsalz ist.
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    .35- 159826A
    19. Präparat nach Anerruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische Metallealz aus lianganchlorid, diagnesiuüjchlorid, Cadmiuinchlorid oder Zinkchlorid besteht.
    2C. Präparat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Azoniumsalz aus 4-Amino-2,ü;-Diäthoxyfcenzaniliddiazoniumchlorid oder tetrazotiertem o-Dianisidin besteht.
    21. Präparat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdea Pyridoxalphosphat enthält,
    22. Iräparat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substrate ein Ketosäuresalz, GIutaxinsäureealz und Aeparaginsäuresalz enthält.
    23. Präparat nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet,
    daß die Salze lithiua-, Natrium- oder Kaliumsalze sind.
    24. PräparatSortiment zur Bestimaung der enzyaatischen Aktirität einer GlutaainBäure-KetosäuretraneaiBinase mit Ausnanae von Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Ketosäurβ, Glutaainsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure-Cxalessigeauretransaainase, Pyridoxalphosphat, einea Azoniuasalz and einer Pufferaischung, die dazu geeignet ist, den
    ÜC38S3/0^:57 BAD ORIGINAL
    pH-Wert zwischen 7 and 9 aufrechtzuerhalten.
    25. Sortiment nach Anspruch 24» dadurch gekennzeichnet» daß das Azoniumsals aus ö-Benzamido^-iaethoxy-mtoluidindiazoniuachlorid besteht.
    26. Sortiment nach Anspruch 24$ dadurch gekennzeichnet, daß es in folgende zwei Präparate aufgeteilt istt
    (1) Ein Präparat, das eine Ketosäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure-OxaleBBigBäuretransaDtinase, Pyridoxalphosphat und eine Poffermischung enthält, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dem ReaktionsaediUB EwJEDhtn ungefähr 7 und ungefähr 9 aufrechtzuerhalten.
    (2) Ein Präparat, das ein Azoniuesalz enthält.
    27· Sortiaent nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dafi das Azoniuasalz. aus einem Doppeleale aus 6-Benzaaido-4-iBethoxy-e-toluidin und einen anorganischen MetallsalB besteht.
    28* Sortiment nach Ansprach 24, dadurch gekennzeichnet, daß es in folgende drei Präparate aufgeteilt istt
    (1) ein Präparat, das eine Ketosäore, Glutaminsäure, Asparaginsäure and ein« Puffereischung
    BAD ORIGINAL
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    enthält, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dem Reaktionaaediua zwischen ungefähr 7 und ungefähr 9 aufrechtzuerhalten.
    (2) Sin Präparat, das Grlutaainsäure-Oxalessigaäuretranaaainaae und Pyridoxalphosphat enthält.
    (3) Sin Präparat, daa ein Azoniuasalz enthält.
    . 'ft-
    29. Sortiaent nach Anspruoh 28, dadurch gekennzeichnet, daß daa Azoniuaiealz aus einea Soppelaalz aus 6-Benzaaido-4— fflethoxy-a-toluidindiazoniuaohlorid und einea anorganischen Metallaalz besteht.
    30. Sortiaent nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß daa zweit« enzyaatiaohe Präparat auf einea porösen folienaaterial aufimprägniert iat.
    31· Präparataortiaent zur Bestiaaung der enzyaatiaohen Aktivität einer CHutaaineaure-Ketoeauretraneaainase ait Auanahae der CHutaaineäure-OxaleeeigBäuretransaainaee, dadurch gekennzeichnet, daß *e aus einea eraten Präparat, daa eine Ketosäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, GIutaainaäare-OxaleBBigBäuretranBaainase, Pyridoxalphosphat and eine Pafferaiaohang, die dazu geeignet ist, den pH-Wert in dea Heaktionaaadiua zwiechen ungefähr 7 und ungefähr 9 aufreohtzaerhalten, enthält und einea zweiten Präparat, daa 2,4-Dinitrophenylhydrazin enthält, besteht.
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    BAD ORIGiNAL
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