DE2138841A1

DE2138841A1 - Verfahren zum Nachweisen und Zahlen von Bakterien in Urinproben

Info

Publication number: DE2138841A1
Application number: DE19712138841
Authority: DE
Inventors: Emmett William Baltimore Picciolo Grace Lee Tantalion Chapelle, Md, (V St A)
Original assignee: National Aeronautics and Space Administration NASA
Current assignee: National Aeronautics and Space Administration NASA
Priority date: 1970-08-04
Filing date: 1971-08-03
Publication date: 1972-03-02
Also published as: JPS549079B1; CA945461A; GB1330594A; US3745090A

Description

Di. EWlEGAND D'.PL-ING W. NIEAAANM

DR= M. KÖHLER D!?L-!NG. C- GCRNHARDT 2 1 3 8 8 Λ 1

MÖNCHEN HAMBURG

TELEFON: 55547« 800OMuNCHENIS,

TELEGRAMME·. KARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10

3. August 1971 ¥ 24 860/71

Efational Aeronautics and Space Administration, Washington, D.O. (V.St.A.)

Verfahren zum nachweisen und Zählen von Bakterien in Urinproben

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sum Nachweisen und Zählen τοπ in Urinproben vorhandenen Bakterien und zur Bestimmung des Ausmaßes von Infektionen der Harnwege? sie betrifft insbesondere ein neues Verfahren zum Zählen von Bakterien., das auf der Gegenwart und Bestimmung von Adenosintriphosphat (ATP) beruht, bei dem es sich um ein in allen bekannten Lebewesen vorhandenes lucleotid handelt»

Ein schnelles Routineverfahren zum quantitativen nachweisen und Zählen von Bakterien ist häufig von lebenswichtiger Bedeutung. Die klassischen Verfahren, welche den Vorteil der positiven Identifizierung der Bakterien haben, sind gewöhnlich langsam und erfordern ziemlich komplizierte Medien, Das hier beschriebene Verfahren zum Nachweisen und Zählen der in einer Urinprobe vorhandenen Bakterien bietet eine hohe Empfindlichkeit, Schnelligkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit. Dieses erfindungsgemäße Verfahren macht von der hohen Spezifizität und Empfindlichkeit einer easjmatischen Bioluminiszenzreaktion beim Analysieren einer Urinprobe in Verbindung mit einem neuen Verfahren Entfernung von störenden Verbindungsn aus der Probe Gebrauch^

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so daß die enzymatische Bioluminiszenzreaktion für "bakterielles Adenosintriphosphat quantitativ wird.

ATP ist allgemein in allem Lebewesen vorhanden, so daß diese Verbindung ein ausgezeichneter Indikator für die Anwesenheit der verschiedenen Lebensformen, z.B. von Bakterien, ist. Eines der empfindlichsten Verfahren für den quantitativen Fachweis (Analyse) von ATP ist eine enzymatische Bioluminiszenzanalyse. Bei dieser Reaktion tritt die Bioluminiszenz als Folge der Umsetzung von ATP mit einer Enzymluc if erase, die derzeit aus G-lühwürmchen (Leuchtkäfern) gewonnen wird, und einem Substrat Luciferin plus divalenten Metallionen, wie z.B. Magnesium- oder Manganionen, auf.

Es konnte bereits früher anhand von reinen Kulturen einerReihe von Bakterienspecies gezeigt werden, daß die Konzentration der bakteriellen ATP in enger Beziehung zu der Zahl der Bakterien stehen kann. Dies ist in dem Artikel von E.W. Chappelle und G-.V. Levin in "Biochemical Medicine" Bd. 2, Seiten 41 bis 52 (Juni 1968)» näher diskutiert. Durch Messung des ATP-G-ehaltes auf der Basis einer Einheitszelle einer Reihe von Species wurde ein durchschnittlicher ATP-Gehalt einer Bakterienzelle von allgemein 3 x 10 μg (innerhalb eines Bereiches von 0,28 χ 10 μg bis 8,9 x 10"" μg) festgestellt. Um die Anwendung der ATP-Analyse für den Nachweis der Bakterien im Urin zu ermöglichen, mußte ein Verfahren zur Entfernung des nicht-bakteriellen Urin-ATP vor dem Nachweis des bakteriellen ATP entwickelt werden. Die primären Quellen für das nicht-bakterielle Urin-ATP sind das freie lösliche ATP und das ATP in den roten und weißen Blutkörperchen. Die Entfernung des nicht-bakteriellen ATP wird dadurch erzielt, daß man zuerst mit Hilfe eines nicht-ionischen Detergens beispielsweise die roten und weißen Blutkörperchen der Urinprobe zerstört (zerbricht), wodurch das ATP in einem freien löslichen Zustand freigesetzt wird. Anschließend wird das gesamte, frei" lösliche₅ nicht-bakterielle ASP durch Zugabe eines ATP hydrolysierendea Enzyms (d.h. einer Adenosintriphosphatase) hydroly-

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siert. Das ATP hydrolysierende Enzym wird dann entweder durch Erhitzen denaturiert (d.h. zerstört) oder auf chemischem Wege inaktiviert.

Nach der Entfernung des nicht-bakteriellen ATP aus der Urinprobe wird das bakterielle ATP durch Zerbrechen der Bakterien mit Säure freigesetzt. Danach wird die Säure neutralisiert und der pH-Wert und die ionische Festigkeit .der Urinprobe wird durch einen Puffer auf die optimale Luciferaseaktivität eingestellt. Die Urin probe wird bei diesem Punkt der Behandlung als behandelte Urinprobe bezeichnet. Sie wird mit einer luciferase/Luciferin-Mischung kombiniert und wenn Bakterien vorhanden sind, wird das durch die Bioluminiszenzreaktion emittierte licht nachgewiesen- und durch eine geeignete Vorrichtung aufgezeichnet.

Das Verfahren zur Bestimmung des in der behandelten Urinprobe vorhandenen ATP beruht auf einem Bioluminissenz-Enzymsystem, dem gleichen, wie es bei Glühwürmchen auftritt. Der gegenwärtig anerkannte Reaktionsmechanismus für dieses Enzymsystem· ist folgender:.

E + LH₂ + ATP ^M5 ⁺⁺. ELH₂AIiP + PP

ELH₂AMP + O₂ z- E + AMP ■+ CO₂ -l· Licht +.T

E =, Glühwürmchen-Luciferase

LH₂ = reduziertes Luciferin

ATP = Adenosintriphosphat

AMP = Adenosinmonophosphat

PP = Pyrophosphat

T = Thiazolinon

Mg"¹"** = Magnesiumion

CO₂ = Kohlendioxyd

O₂ = Sauerstoff

Wenn alle Komponenten der obigen Umsetzung in einer Konzentration im Überschuß zum ΛΤΡ gehalten werden, ist die Lichtemission direkt

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proportional zur Menge des eingeführten ATP. Dadurch ist es möglich, die Größe der Lichtemission direkt in Beziehung zur ATP-Konzentration zu setzen, wenn die behandelte Urinprobe mit der Luciferase/Luciferin-Mischung kombiniert wird unter Verwendung einer wie nachfolgend näher beschrieben hergestellten Standardkurve. Wenn man außerdem die Anzahl der Bakterien wissen will, die zu der ATP-Konzentration in der Urinprobe äquivalent ist, so kann dies durch einfache Division der ATP-Konzentration, basie™

—10 rend auf der Messung der Lichtemission, durch 3 x 10 μg, dem durchschnittlichen ATP-G-ehalt einer Bakterienzelle, bestimmt werden.

Die bisher zur Bestimmung und zum Zählen der Bakterien im Urin angewendeten Methoden sind folgende: (1) Kulturmethoden, welche die Ausstreich (streak) - und die 6-ießplattenmethoden umfassen und (2) direkte Methoden, die auf der mikroskopischen Zählung beruhen und eine weitere Methode, die auf der Fähigkeit der Organismen, Nitrate zu Hitriten zu reduzieren, beruht.

Die Äusstreich-methode (streak method) wird in der Weise durchgeführt, daß man eine geringe Menge Urin auf eine feste Agarplatte, welche Nährstoffe enthält, ausstreicht, Die G-ießplattenmethode ist genauer, verbraucht aber viel mehr Zeit, da dafür Reihenverdünnungen der zu analysierenden Urinprobe und eine anschließende Mischung genau aliquoter Teile der Verdünnungen mit vorerhitztem, einen flüssigen Bakteriennährstoff enthaltendem Agar erforderlich sind. Die erhaltene Mischung wird dann in sine Petrischale gegossen und beim Stehenlassen verfestigt sie sich zu einer Platte. In beiden oben beschriebenen Verfahren ist eine Inkubationszeit von 1 bis 4 Tagen erforderlich, danach v/erden die Platten auf das Bakterienkoloniewachstum hin untersucht, wobei die Anzahl der Kolonien ein Maß für den Bakteriengehalt (Anzahl der Bakterien) ist. Diese beiden Verfahren sind bestenfalls halbquantitativ und erlauben nicht den Kachweis von nicht-kultivierbaren Organismen, die von Interesse sein können.

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Obwohl sowohl die Ausstreich- als auch die G-ießplattenmethoden zur Bestimmung des Bakteriengehaltes Ergebnisse liefern, welche Ia Wechselbeziehung zu anderen Symptomen der Infektionen der Harnwege stehen, haben sie Nachteile, Die Quelle für diese Nachteile beruht in der G-rundanforderung für das bakterielle Wachstums die bestimmte Schwierigkeiten aufweist. Eine davon ist die» öaß die Inkubationszeit, wie erwähnt, zwischen etwa 1 und etwa 4 Sagen variieren kann. Eine Verzögerung dieser Dauer bei der Diagnose einer Infektion der Harnwege könnte in einigen Fällen von kritischer Bedeutung sein. Der Wert der Kulturmethoden kann in !rage gestellt sein_s wenn man die wählerische und an eine einzige Lebeisbedingung gebundene Natur vieler Bakterienspecies im Hinblick auf spezielle Nährstoff- und Umgebungsanforderungen in Erwägung zieht= Deshalb ist, wenn man in Erwägung zieht₉ daß die meisten klinischen Laboratorien nur zwei Typen von Nährmedien in der Kultur von Urinproben verwenden^ durchaus die Möglichkeit gegeben_P daß bestimmte lebende Organismen nicht gefunden werden,, Experimente haben nämlich gezeigt_s daß ein beträchtlicher Prozentsatz an Urinbakterien obligate Inaerobi' sind« Natürlich bestehen noch weitere Gkründe für das Ausbleiben des Bakterienwachs= tvmsp wie z„B» Absterben der ZeIIe₉ Ruhezustand und Anwesenheit von bakteriostatischen Mitteln»

Die direkte mikroskopische Zählmethode erfordert die Aufbringung von genau aliq.ia.oten Anteilen der Urinprobe auf ein geeichtes Dia» Anschließend wird das Dia durch ein Mikroskop betrachtet und die vorhandenen Bakterien werden gezählte Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß Zeit und Mühe eines Fachmannes verschwendet werden, neben der Tatsache_ff daß sie nicht für die Analyse von trüben^Prob©n angewendet werden kann. Das direkte mikroskopische Verfahren ist im allgemeinen genauer als die KuItürverfahren, da darin die Bakterien direkt gezählt werden? statt daß es von der Fähigkeit der Bakterien^ zu wachsen und Kolonien zu bilden^ abhängt.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum laeliweisen raid Zählen von Bakterien In einer Urinproba_s mit öes-

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sen Hilfe es möglich ist, die verschiedenen, ATP enthaltenden, nicht—bakteriellen Zellen zu zerbrechen, ohne dadurch die bakteriellen Zellen, die ebenfalls ATP enthalten, zu beeinträchtigen; das nicht—bakterielle ATP mit einem geeigneten Hydrolysemittel zu hydrolysieren und anschließend die Probe zur Zerstörung oder Inaktivierung des Hydrolysierungsmittels zu behandeln; die Bakterienzellen mit Säure au zerbrechen, um das darin enthaltene bakterielle ATP freizusetzen, die Säure zu neutralisieren und den pH-Wert und die Ionenstärke der Probe auf einen Wert einzustellen, welcher die Umsetzung von ATP mit einer Luciferase/ Luciferin-Mischung fördert; die behandelte Probe mit der Lucife— rase/Luciferin-Mischung zu kombinieren und die Menge an dadurch emittiertem Licht mit einer geeigneten, an sich bekannten Vorrichtung zu messen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, daß das nichtbakterielle ATP, das als J?olge der in der Probe vorhandenen roten oder weißen Blutkörperchen vorliegt, entfernt wird, ohne daß die ATP enthaltenden Bakterien beeinträchtigt werden, wobei das ATP schließlich quantitativ bestimmt wird. Nach der Entfernung des unerwünschten, nicht—bakteriellen ATP werden die Bakterien gerbrochen, um daraus das ATP freizusetzen, wodurch sie für die quantitative Bestimmung verfügbar sind. '

Die Erfindung betrifft, kurz gesagt, ein Verfahren zum Nachweisen und Zählen der Bakterien im Urin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) der Urinprobe eine Verbindung zugibt, die imstande ist, das darin enthaltene, nicht-bakterielle ATP in einem frei-löslichen Zustand freizusetzen, ohne das in den in der Probe vorhandenen Bakterien enthaltene ATP freizusetzen,

fb) eine Verbindung zusetzt, die in der Lage ist, das gesamte frei-lösliche, nicht-bakterielle Äüö? au hydrolysieren., (c) die Probe behandelt sur Zerstörung oder Inaktivierung des Hydrolysierungsmittels,

die Probe ansäuert_f um die Bakterien au zerbrechen und das'

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darin enthaltene bakterielle ATP freizusetzen₅

(e) die Säure neutralisiert und den pH-Viert und die Xonenstärke (lonenkraft) auf einen Wert einzustellen, der die Bioluminiszenzreaktion des bakteriellen ATP mit einer Lueiferase/Luciferin-Mischung fördert,

(f) die oben behandelte Urinprobe-mit einer Luciferase/lucifering-Mischung kombiniert, die ein divalentes Metallkation, wie z.B. Magnesium oder Mangan, enthält, und

(g) die Menge des bei dieser Umsetzung emittierten Lichtes nachweist und aufzeichnet, unter Verwendung einer photometrischen Torrichtung mit einer geeigneten Empfindlichkeit ο

Für die Anwendung der ATP-Analyse für den Nachweis der Bakterien in einem wässrigen physiologischen System,, beispielsweise Urin, ist es notwendig, eine Möglichkeit zur Entfernung des nicht-bakteriellen ATP aus dem System zu entwickeln. Die primären Quellen des nicht-bakteriellen ATP in einer Urinprobe sind beispielsweise das frei-lösliche ATP und das in den roten und weißen Blutkörperchen, die auch mit anderen Verunreinigungen in der Urinprobe vorhanden sein können _s enthaltene ATP. Die Entfernung des nicht-bakteriellen ATP wird dadurch erzielt, daß die roten und weißen Blutkörperchen (Blutzellen) zerstört (zerbrochen) werden unter Freisetzung des ATP daraus in einem frei-=löslichen Zustand und daß anschließend ein das ATP hydrolysierendes Enzym (z.B. Adenosintriphosphatase) zugegeben wird, um das gesamte frei-lösliche ATP in der Urinprobe zu zerstören» Nach der Inaktivierung oder Denaturierung (d.h. Zerstörung) des ATP-Hydrolysierenzyms wird das in den Bakterien enthaltene ATP durch Zerbrechen der Bakterien freigesetzt und mit der Luciferase/Luciferin-Mischung umgesetzt, was zu einer Lichtemission mit einer Größe proportional zur ATP-Konzentration und infolgedessen proportional zum Bakteriengehalt (Anzahl der Bakterien) in der Urinprobe führt.

Zum Zerbrechen der nicht-bakteriellen Zellen zur Freisetzung des ATP daraus kann jedes beliebige Mittel verwendet werden, vorausgesetzt, daß es zvM Zerbrechen nur der nicht-bakteriellen Zellen

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ausreichend selektiv und nicht toxisch ist oder nicht-toxisch g€ lacht werden kann. Das heißt, nichts sollte eine nachfolgende Umsetzung; insbesondere die Bioluminiszenzreaktion des bakteriellen ATP mit der Lueiferase/Luciferin-Mischung stören. Eine Möglichkeit zur Zerstörung (zum Zerbrechen) der nicht-bakteriellen Zellen ist die, daß die Oberflächenspannung der nicht—bakteriellen Zellen herabgesetzt wird.

Bestimmte oberflächenaktive Verbindungen, welche die Oberflächenspannung von wässrigen Lösungen herabsetzen, insbesondere jene, die zur Klasse der kationischen, anionischen und nicht-ionischen Detergentien gehören, sind im allgemeinen ausreichend selektiv, um die nicht—bakteriellen Zellen zu zerbrechen, so daß das ATP daraus freigesetzt werden kann, ohne daß die Bakterien in der Probe beeinträchtigt werden«, Obwohl in den erfindungsgemäßen Verfahren kationische und anionische Detergentien verwendbar sind, sind nicht-ionische Detergentien, wie z.B. Octylphenoxypolyäthoxyäthanol_?wirtschaftlich, leicht herstellbar, höchst zufriedenstellend und deshalb bevorzugt. Beispiele für einige andere oberflächenaktive Verbindungen$ die in diese Kategorie fallen, sind Triterpenoidsaponine, Steroidsaponine, SuIfosuccinate, wie z.B. Dioctylnatriumsulfosuccinate, verschiedene Glycoside und einige Polyoxyäthylenderivate von partiellen ITettsäureestern von Sorbitanhydriden»

Das Zerbrechen der nicht—bakteriellen Zellen wird· im allgemeinen bei Umgebungstemperatur und bei Normaldruck durchgeführt, wobei man die Urinprobe etwa 1 Minute bis etwa 1 Stunde lang, vorzugsweise 5 bis 20 Minuten^ ganz besonders bevorzugt, etwa 10 Minuten längs stehen läßt. Die Zeit, für die man die Urinprobe stehen läßt, beispielsweise wenn ein nicht-ionisches Detergens, wie s.B. Octylphenoxypolyäthoxyäthanol, zu der Urinprobe zugegeben worden ist, hangt teilweise von der Temperatur ab, da die Zerstörungsgeschwindigkeit (Zerbrechungsgeschwindigkeit) für jedes Grad Temperaturanstieg merklich zunimmt. Beim langen Stehenlassen oder bei erhöhten Temperaturen kann jedoch das nicht-ionische De-

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tergens "beginnen, die Bakterien anzugreifen, wodurch die Präzision und Genauigkeit des Verfahrens herabgesetzt wird. Das nichtionische DetergenS;, Octylphenoxypolyäthoxyäthanol₉ wirkt , wenn es als Zerstörungsmittel verwendet wird, am besten₉ wenn es in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 5?0 VoI*-$ vorliegt und der ürinprobe in einer solchen Menge zugegeben wird, die etwa 5 bis 15 Vol.-fo der Urinprobe entspricht.

Nachdem die ATP enthaltende^nicht—bakteriellen Zellen durch das Gctylphenoxypolyäthoxyäthanol selektiv aufgebrochen worden sind ■und das ITP aus den nicht—bakteriellen Zellen in einem frei-löslichen Zustand freigesetzt worden ist* wird der Urinprobe eine Verbindung zugesetzt, die in der lage ist, das gesamte frei-lösliche ATP in der Urinprobe zu hydrolysieren. Das zweckmäßigste ■nicht-toxische Mittel zur Hydrolyse des ATP ist die Vezfae.ndung von ATP hydrolysierenden Enzymen, die.gewöhnlich als Adenosintriphosphatasen bezeichnet werden. Es kann jede beliebige Adenosintrisphosphatase (ATP-ase), z.B." Kartoffelapyrase_p Xnsektenapyrase, Muskel-ATP-ase und Leber-ATP-ase verwendet werden. Kar» toffelapyrase ist das bevorzugte Hydrolysemittel für die Verwendung bei der Durchführung der Erfindung, da sie vollständiger charakterisiert ist, leicht gereinigt und leicht hergestellt werden kann und ausgezeichnete Ergebnisse liefert.

Mach der Zugabe der Adenosintriphosphatase läßt man die Urinprobe bei Umgebungstemperatur und Normaldruck ausreichend lange stehen, so daß die Hydrolyse bis zur Vollständigkeit fortschreiten kann. Im allgemeinen läßt man die Probe etwa 1 bis etwa 25 Minuten₉ vorzugsweise etwa 5 bis etwa 15 Minuten lang stehen»

Wenn einmal das nicht-bakterielle ATP freigesetzt und durch 'die ATP-ase hydrolysiert worden ist, muß das hydrolysierende Enzym inaktiviert oder zerstört werden (Denaturierung des Enzyms), um eine Störung der Analyse des nachfolgend aus den. Bakterien freigesetzten ATP zu vermeiden. Dies kann physikalisch oder durch chemische Mittel durchgeführt werden. Typische chemische Mittel

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sind Säuren, Basen, Salze von Schwermetallen, organische Lösungsmittel und solche Verbindungen, die als Enzyminhibitoren klassifiziert werden. Physikalische Mittel sind Wärme und Kurzwellenbestrahlung. Das kurzzeitige Erhitzen der Urinprobe, d.h. etwa 1 bis etwa 15, Torzugsweise etwa 5 bis etwa 12 Minuten lang auf 60 bis 100⁰C ist wirksam für die Denaturierung des hydrolysierenden Enzyms. Auch die Zugabe von Perchlorsäure zu der Urinprobe ist wirksam zur Inaktivierung des hydrolysierenden Enzyms.

Zur Durchführung der Inaktivierung oder Denaturierung des hydrolysierenden Enzyms kann eine ganze Reihe von Verbindungen und Verfahren angewendet werden, wobei nur Voraussetzung ist, daß sie tatsächlich die Aktivität desselben zerstören,ohne die Bakterienseilen oder die Bioluminiszenzreaktion, die zur Bestimmung des bakteriellen ATP verwendet wird, merklich zu beeinträchtigen.*) Die Denaturierung des hydrolysierenden Enzyms wird im allgemeinen bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise bei 95⁰C, und Normaldruck durchgeführt, wenn es jedoch zweckmäßiger oder erforderlich ist, kann dies auch bei erhöhten Drucken durchgeführt werden, es besteht kein Grund, dies nicht zu tun. *)Jede verwendete, gegenüber der Luciferase-ATP-Reaktion toxische Verbindung mußte letztlich entfernt oder neutralisiert werden. Obwohl die vorstehende Beschreibung sich nur mit der Zugabe eines nicht-ionischen Detergens zu der Urinprobe vor der Zugabe des das ATP hydrolysierenden Enzyms befaßt, wobe-i diese: nacheinander augegeben werden, können diese beiden Bestandteile selbstverständlich auch gleichzeitig, entweder getrennt oder als Mischung, zugegeben werden. Wenn einmal das potentiell störende5 nicht-bakterielle ATP wirksam aus der Urinprobe entfernt und das hydrolysierende Enzym inaktiviert oder denaturiert worden ist, wird die Probe auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Dann wird das bakterielle ATP durch Zerbrechen (Zerstören) der Zellwände der vorhandenen Bakterien freigesetzt und das so freigesetzte ATP wird iiit der Lucif erase/luciferin-Kombination, wie oben angegeban, ,gesetzt.

Ziub Zerbrechen der Zellwände und zum Freisetzen des bakteriellen

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ATP können viele verschiedene Verbindungen und Verfahren angewendet werden. Dazu gehören z.B. organische Säuren, wie Essigsäure und Ameisensäure, und anorganische Säuren, wie Perchlorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und. Salpetersäure. Außerdem eignen sich Ultraschallschwingungen und einige organische Lösungsmittels, wie ζ.B₀ Butanols, zur Freisetzung des bakteriellen ATP. Auch hier ist wieder Grundvoraussetzung für dieses Reagens, daß es die Bakterienwände zur Freisetzung des ATP zerbricht, ohne mit dem ATP zu reagieren und ohne die nachfolgenden Reaktionen, insbesondere die Biolumineszenzreaktion des ATP mit der Luciferase/Lueiferin-Kombination zu stören.

Perchlorsäure ist für diese:Stufe außergewöhnlich gut geeignet und nach der Zugabe einer geringen Menge Perchlorsäure in einer verhältnismäßig niedrigen Konzentration läßt man die Probe etwa 1O"bis etwa 15¹, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 7 Minuten lang stehen. Die Reaktion erfolgt schnell und es ist keine große Zeitspanne zur Freisetzung des bakteriellen ATP erforderlich. Wenn man die Probe nach der Perchlorsäurezugabe zu lange stehen läßt, kann das aus den Bakterien freigesetzte ATP durch die Säure nachteilig beeinträchtigt werden. Wenn zuviel Säure verwendet wird, wird die Präzision der Endanalyse beeinträchtigt, da das Säureanion einen nachteiligen Einfluß auf die Bioluminiszenzreaktion hat. Obwohl die Reaktionsgeschwindigkeit für jede Temperatur·= zunähme ansteigt, ist die Zerstörung (das Zerbrechen) der Bak= terien bei Umgebungstemperatur im allgemeinen optimal, wobei bei erhöhten Temperaturen, die sehr gut zu einem Nachteil führen können, der darin besteht, daß das ATP zerstört werden könnte, keinen merklichen Vorteil bringen. Es ist zwar am zweckmäßigsten, die Bakterien bei Umgebungstemperaturen zu zerbrechen, es besteht jedoch kein Grund, warum dies nicht auch bei Temperaturen bis herunter auf 5⁰C erfolgen könnte.

In einer 1,0 ml-Probe von Urin, bei der Perchlorsäure zur Freisetzung des bakteriellen ATP verwendet wird, kann eine 0,05 bis

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5,0 η Perchlorsäurelösung in einer Menge innerhalb des Bereiches von 0,05 bis 1,0 ml verwendet werden. Bei einer nicht ausreichenden Menge an Säure werden die Zellwände der Bakterien nicht zerbrochen, während ein Überschuß an Säure einen nachteiligen Einfluß auf das ATP haben kann, nachdem es freigesetzt worden ist.

Die Neutralisation der Säure kann mit einer organischen oder einer anorganischen Base durchgeführt werden. Beispiele für solche Basen sind Alkalimetallhydroxyde und Erdalkalimetallhydroxyde sowie solche organische Verbindungen, die Wasserstoffionen akzeptieren können, ohne die hier interessierende Bioluminiszenzreaktion nachteilig zu beeinflussen. Die Grundanforderung an die Base ist natürlich die, daß sie in der lage ist, die Säure zu neutralisieren. Eine bevorzugte Base ist außerdem eine solche, in der das Kation der Base mit einem störenden Anion einer Säure der vorherigen Stufe reagiert unter Bildung eines unlöslichen Niederschlages, wodurch störende Ionen aus der Probe entfernt und künftige Störungen bei der Analyse durch diese Ionen vermieden werden. Dies ist bevorzugt wie in jeder anderen Anordnung, mit der Ionen entfernt werden, welche die Bioluminiszenzreaktion stören können. Dies ist auch vom wirtschaftlichen Standpunkt aus gesehen praktisch, da eine zusätzliche Stufe in der Analyse vermieden wird, nämlich die Forderung, daß diese Ionen vor der Bioluminiszenzreaktion entfernt werden. Die Menge an verwendeter Base kann innerhalb eines Bereiches von 0,05 bis 1,0 ml einer 0,05 bis 5,0 η Kaliumhydroxydlösung liegen. Durch eine nicht ausreichende Menge an Base wird die Säure nicht wirksam neutralisiert und ein Überschuß an Base kann für das aus den Bakterien freigesetzte ATP schädlich sein.

Der End-pH-Wert und die End-Ionenstärke der Probe wird dann mit einem Puffer eingestellt, der entweder praktisch zur selben Zeit wie die Base oder zu irgendeiner Zeit danach augegeben werden kann. Der Puffer hat die Aufgabe, den pH-Wert der Urinprobe ziemlich genau bei etwa 7,4 zu halten, das ist der optimale pH-Wert für die maximale Aktivität der Luciferase/Luoiferin-Kombination.

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Wenn die Wasserstoffionenaktivität (pH) merklich niedriger oder merklich höher wird, leidet die Endgenauigkeit der Analyse darunter wegen der geringeren Aktivität der Luciferase/Luciferin-Kombination. Außerdem sind in Gegenwart eines Puffers die Volumina der in den vorherigen Stufen erforderlichen Säure und Base nicht ganz so kritisch, da der Puffer irgendwelche kleineren Diskrepanzen ausgleicht. E_s kann jeder Puffer verwendet werden, der den pH-Wert der Urinprobe innerhalb des Bereiches von etwa 6,8 bis 7,8, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 7,2 bis 7,6 und ganz besonders bevorzugt bei etwa 7,4 hält, ohne daß die Hauptreaktion gestört wird. Die Menge des zugegebenen Puffers, fällt im allgemeinen in den Bereich von etwa 0,05 bis etwa 1,0 ml bei einer Konzentration von etwa 2 bis 2,5 M. Pu^r, welche diesen Anforderungen genügen und in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind z.B. TES-Puffer ^/N-tris-(Hydroxymethyl)-methyl-2-aminoäthansulfonsäurj^7"; Phosphatpuffer; Arsenatpuffer; Trispuffer, z.B. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; Arsinpuffer; G-lycylgryeinpuffer und N^-Hydroxyäthylpiperazin-N^-' äthansulfonsäure-puffer.

Die wie oben hergestellte behandelte Urinprobe wird dann mit der Luciferase/Iiuciferin-Kombination, die divalente Magnesium- oder Manganionen enthält, kombiniert und das während der Bioluminiszenzreaktion abgegebene Licht wird durch geeignete Instrumente gemessen.

Ein bekanntes Instrument, mit dem das oben genannte Verfahren automatisiert v/erden kann, welches das bei der Bioluminiszenzreaktion emittierte Licht mißt, weist einen drehbaren Tisch mit im Abstand voneinander angeordneten Behältern für die kontinuierliche Aufnahme von Phiolen von Urinproben, die automa-Nj tisch zugeführt v/erden, und für die anschließende Weiterbewegung der Phiolen an einer Mehrzahl von Verteilereienrichtungen vorbei*)auf. Mit dem rotierbaren Tisch sind auch Heizeinricho tungen, Kühleinrichtungen und Lichtdetektoreinrichtungen, alle _» genau angeordnet wie die Verteilereinrichtungen, verbunden, so

^ *) die nacheinander eine vorbestimmte Menge der in dem Verfahren ο verwendeten verschiedenen Bestandteile in die vorbeigeführten Phiolen verteilen,

daß der richtige zeitliche Ablauf, wie oben angegeben für jede Operation des Verfahrens eingehalten wird. Es sei darauf hingewiesen, daß die Fläche, bei der die Bioluminiszenzreaktion auftritt und an der die Lichtdetektoreinrichtung angebracht ist, zur Erzielung einer Messung des abgegebenen Lichtes gegen Licht abgedichtet ist, so daß die Lichtdetektoreinrichtung nur das bei der Bioluminiszenzreaktion abgegebene Licht registriert. Wenn es erwünscht ist, das Hydrolysiermittel durch ein chemisches Mittel zu inaktivieren, kann die Heizeinrichtung und ein Teil der Kühleinrichtung ausgeschaltet werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, in denen alle Teile und Prozentsätze, wenn nichts anderes ange- £pben,ist, auf das Gewicht bezogen sind.

Beispiele 1 bis 17

Das bei der Analyse der in der folgenden Tabelle I angegebenen Proben angewendete Verfahren bestand darin, daß eine Urinprobe hergestellt und zur Entfernung sov/ohl des ATP im frei-löslichen Zustand als auch des ATP in den in der Probe vorhandenen roten oder weißen Blutkörperchen behandelt wurde. Dies wurde durch selektives Zerbrechen der roten und weißen Blutkörperchen mit Triton X-100 (Handelsname der Pa. Rohm und Haas Corp. für Octyl phenoxypolyäthoxyäthanol) und Zugabe von Kartoffelapyrase als das ATP hydrolysierendes Enzym erzielt. Hach kurzer Zeit wurde die Urinprobe auf etv/a 95⁰C erhitzt, um die Kartoff elapyrase zu denaturieren. Danach wurde die Probe mit Perchlorsäure angesäuert, um die Bakterien zu zerbrechen und dann wurde vor der Einstellung des pH-Wertes der Probe auf etv/a 7,4 mit einem TES-Puffer /N-tris-(Hydroxymethyl)-methyl-2-aKiino~ä thansulfonsäureT" mit einer Kaliumhydroxydlösung neutralisiert. Ein Teil dieser behandelten Urinprobe wurde dann, wie nachfolgend näher erläutert wird, mit der divalente Magnesium- öder Manganionen ent-

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haltenden Luciferase/Luciferin-Kombination kombiniert und das abgegebene Licht wurde gemessen.

Behandlung_der_Urin2roben

a) Eine 1,0 ml-Probe von Urin wurde mit 0,1 ml einer 1 vol.-$igen Triton X-100-Lösung und 0,1 ml einer Kartoffelapyraselösung (wie oben beschrieben) gemischt und 10 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen.

b) Die Probe wurde dann 10 Minuten lang auf etwa 95⁰C erhitzt, um die Kartoffelapyrase zu denaturieren. Nach dem Erhitzen ließ man die Probe auf Umgebungstemperatur abkühlen und dann wurden 0,1 ml einer 1,On Perchlorsäure zugegeben und man ließ die Probe 5 Minuten lang stehen.

c) Die Perchlorsäurelösung wurde dann durch Zugabe von 0,1 ml einer 1,0 η Kaliumhydroxydlösung neutralisiert.

d) Der End-pH-Wert der Probe wurde durch Zugabe von 0,1 ml eines 2,0 M TES-Puffers ^-tris-(Hydroxymethyl).-methyl-2-aminoäthansulfonsäure/ auf 7,4 gebracht, wodurch die behandelte Urinprobe erhalten wurde.

Teilweise gereinigte Glühwurm-Luciferase wurde aus toten Glühwurmkörpern (dired firefly lanterns) auf die folgende Art und Weise hergestellt. 1 g eines Acetonpulvers, hergestellt aus den Körpern, wurde mit 10 ml eines kalten 0,05 M TES-Puffers gemischt und 30 Minuten lang gerührt. Nach 15-minütigem Zentrifugieren der Mischung bei 13 000 χ g wurde die obenstehende Lösung auf eine mit 0,05 M TES-Puffer bei einem pH von 7,4 äquilibrierte Sephadex G-200~Kolonne (Sephadex G-200 = Handelsname für Dextranperlen, welche Verbindungen auf der Basi3 des Molekulargewichtes

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trennen) und mit dem gleichen Puffer eluiert. Die aus der Kolonne erhaltenen Fraktionen wurden auf ihre Luciferase-Aktivität hin untersucht durch Entfernung von 0,2 ml aliquoten feilen, zu welchen 0,1 ml des· TES-Puffers, der 0,1 mg/ml synthetisches Iiuciferin und 0,01 M Magnesiumsulfat enthielt, zugegeben wurde.

■^ie Luciferase-Aktivität wurde auf der Basis der Lichtemission

—2
bei Zugabe von 10 μg ATP zu der Mischung gemessen. Die aus der Kolonne erhaltenen aktivsten Fraktionen, bezogen auf die Vergrößerung der Lichtemission, wurden ausgewählt, miteinander vereinigt und mit einer Luciferin/Magnesium-Lösung /T Teil Luciferase auf 2 Teile Luciferin (0,1 mg/ml)-Magnesiumsulfat (0,01 M_27 gemischt und dann in 10 ml-Volumina lyophilisiert. Die lyophilisierten Mischungen wurden dann bei -40⁰C aufbewahrt, und durch Zugabe von 10 ml destilliertem Wasser' jeweils beim Gebrauch hergestellt.

Die Kartoffelapyrase wurde hergestellt durch Schälen und Zerschneiden von 500 g weißen Kartoffeln, Zugeben zu 250 ml kühlem destilliertem Wasser und 5-minütiges Homogenisieren in einem Mischer. Die¹ Suspension wurde'dann durch zwei Schichten eines . Seihtuches filtriert und das Eiltrat wurde bis zur 20 $igen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt, damwurde der pH-Wert auf etwa 4,0 eingestellt. Zur Erzielung einer 40 ^igen Sättigung wurde dann weiteres Ammoniumsulfat zugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13000 χ g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen und die oben stehende Lösung würde mit Ammoniumsulfat bis zur 75 ?oigen Sättigung versetet. Nach 15-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde die Mischung wie oben sentrifugiert. Der Niederschlag wurde dann in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Der Extrakt wurde auf eine mit 0,01 M Calciumchlorid in 0,05 M TES-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 äquilibrierte Sephadex G-100-Kolonne gebracht. Die erhaltenen Fraktionen wurden durch Zugabe von 0,1 ml aliquoten Teilen jeder Fraktion zu 1 μg ATP, enthalten in 1 ml

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Lösung, und 5-minütiges Stehenlassen der aliquoten Teile auf ihre Apyraseaktivität hin untersucht, danach wurde unter Verwendung des Glühwurm-Luciferase-Tests das verbliebene ATP gemessen. Aktive Fraktionen waren solche, die ein vollständiges Verschwinden des ATP aufwiesen. Diese Fraktionen wurden miteinander vereinigt, lyophilisiert und bei -40⁰C aufbewahrt. Bei ihrer Verwendung werden sie durch Zugabe von destilliertem Wasser aufbereitet.

Das Luciferin wurde nach dem Verfahren von White et al in "Journal of the American Chemical Society', Bd. 85, Seiten 337 - · bis 343 (1963), hergestellt.

Verfahren: Mit Hilfe einer Nadel und einer Spritze wurden 0,1 ml der behandelten Urinprobe, die wie oben beschrieben hergestellt worden war, in eine Küvette injiziert, die 0,3 ml der Magnesium enthaltenden Luciferase-Luciferin-Kombination enthielt. Dies wurde für jede der 17 Proben durchgeführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens wurden jede Küvette und eine Lichtdetektoreinrichtung in einer gegen Licht abgedichteten Kammer zueinander angeordnet, so daß das durch die Bioluminiszenzreaktion abgegebene Licht innerhalb der jeweiligen Küvette durch die Lichtdetektoreinrichtung aufgenommen und danach mit Hilfe einer Aufzeichnungseinrichtung, die elektrisch mit der Lichtdetektoreinrichtung gekuppelt war, gemessen. Eine Standardkurve der Größe der Lichtemission gegen die ATP-Konzentration wurde folgendermaßen hergestellt:

Eine Reihe von 0,1 ml-Proben, die bekannte Mengen an reinem ATP in gelöster Form enthielten und den Bereich von 10~" μg bis her-

unter auf 10 μ§ überdeckten, wurde hergestellt. Jede der ATP-Proben wurde einzeln in eine getrennte Küvette mit einer frisch hydratisierten Luciferase-Luciferin-Mischung (hergestellt wie oben beschrieben) injiziert und die Größe des jeweils emittier-

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ten Lichtes bei den jeweiligen erhaltenen Luminiszenzreaktionen wurde gemessen. Sowohl die Injektion des ATP als auch die Messung des emittierten Lichtes wurden auf identische Art und Weise wie oben beschrieben mit der Urinprobe durchgeführt. Pur jede der 0,1 ml-Proben einer bekannten Menge an ATP wurde ein spezieller Lichtemissionswert erhalten. Diese Lichtemissionswerte wurden gegen die entsprechenden ATP-Mengen aufgetragen unter Bildung der Standardkurve.

Unter Verwendung dieser Standardkurve wurden die aus den 17 Urinproben erhaltenen und durch die Aufzeichnungseinrichtung gemessenen Lichtemissionswerte in ATP-Konzentrationen umgewandelt. Natürlich muß eine Standardkurve wegen der täglichen Änderungen der Luciferase-Aktivität zur Erzielung der genauesten Ergebnisse jeden Tag hergestellt werden. Die in der zweiten Spalte der folgenden Tabelle I angegebenen Bakterienzahlen wurden einzeln errechnet durch Division der ATP-Konzentrationen jeder der 17 Urinproben, die aus der Standardkurve erhalten wurden, durch 3 x 10 μg, dem mittleren ATP-Gehalt einer Bakterienzelle. Die nach der ATP-Methode erhaltenen Bakterienzahlen wurden mit den Bakterienzahlen verglichen, die mit der gleichen Probe unter Verwendung der G-ießplatten- und mikroskopischen Methoden erhalten wurden. Die dritte und vierte Spalte der folgenden Tabelle I enthalten diese zuletzt genannten Daten.

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Tabelle I

Bestimmung der Anzahl der Bakterien pro ml nach verschiedenen

Methoden

Probe Nr.	ATP-Methode	χ 10⁷	Gii _	X	10.5	mikroskopische	Methode
		χ 10⁷	ißt	X	10³		χ 10⁷
1	8	χ 10⁹	)latten-	X	10⁸	CPi	X 10⁸
2	8	χ 10⁹	' Methode	X	10⁷	7	χ 10⁹
3	7	χ 10⁸	4	X	io5	2	χ 10⁸ ·
4	9	χ 10⁸	9	X	10⁴	2	χ 10⁷
5 "	4	χ 10⁷	2	X	10⁷	8	χ 1Ό⁷
6	7	χ 10⁷	2	X	ΙΟ⁷	2	X 10⁸
7	4	χ 1Ö⁹	3	X	10⁵	2	'X ΙΟ⁸
8	3	χ 10⁷	1	_Η	-)	4	χ 10⁸
9	5	χ 10⁷	1	_Η	-;	1	χ ΙΟ⁷
10	3	χ 1Ö⁷	2	X	10⁷	2	χ 10⁷
11 '	8	χ 10⁸	3	X	10⁴	2	χ ΙΌ⁸
. 12	6	χ ΙΟ⁷		-		3	χ 1Ö⁷
13	2	χ 10⁸		X	10⁷	2	χ 10⁷
14	4	χ 10⁷	2	_Μ	"' -	4	χ 10⁸
15 ·	5	χ 10⁷	8	X	ΙΟ⁵	7	χ 10⁷
16	3		2	χ 10⁹
17	1	3	1

2

^ = gibt anj daß keine Organismen wuchsen

Ein Vergleich der unter Anwendung der ATP-Methode erhaltenen Werte mit denjenigen, die bei der Gießplatten-Methode erhalten wurden, zeigt, daß die ATP-Methode viel genauer ist als die Gießplatten-Methode,- die auch den Nachteil hat, daß sie mehr Zeit verbraucht und außerordentlich umständlich ist. Aus der vorstehenden Ts-belle I ist zu ersehen, daß die ATP-Methode bessör mit der mikroskopischen Methode übereinstiiümt, während die Gießplätten-Methode um bis zu 6 Größenordnungen variiert.

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Es wurden ürinproben von 700 Patienten des Johns Hopkins Hospitals auf Bakterien untersucht und die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die nach der Gießplatten-Methode erhalten wurden. In allen Fällen, in denen die Kolonieanzahl 10 000 pro ml nach der Gießplattenkultur überstieg, war die AIP-Ansprechempfindlichkeit posititv. Darüber hinaus war in den meisten Fällen die Bakterienanzahl, die nach dem ATP-Test erhalten wurde, viel höher als diejenige, die bei der Koloniezählung erhalten wurde. Bei einer beträchtlichen Anzahl von Fällen war nämlich die ATP-Untersuchung positiv, die Koloniezählung war· negativ. Mögliche Erklärungen für diese Diskrepanzen sind bereits weiter oben angegeben.

Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren, so wie es vorstehend beschrieben wurde, die Stufen der Hitzedenaturierung des ATP hydrolysierenden Enzyms ATP-ase (Kartoffelapyrase-Lösung) und die anschließende Abkühlung der ürinprobe auf Umgebungstemperatur umfaßt, sei darauf hingewiesen, daß diese Stufen ebenso wie die Stufe der Neutralisation der Perchlorsäure durch Zugabe der Base (Kaiiumhydroxydlösung) weggelassen werden kann, wenn nicht mehr als 10 Sekunden zwischen der Zugabe des Puffers und der Zugabe der Luciferase-Luciferin-Mischung verstrichen .sind. Diese Forderung kann leicht durch ein automatisches Instrument erfüllt werden. In dieser Situation wird die Säure (Perchlorsäure) der Urinprobe zugegeben, nachdem die Triton X-100- und Kartoffelapyrase-Lösung, die in der Urinprobe bereits vorhanden sind, etwa 10 Minuten lang inkubiert worden ist. Die Perchlorsäure inaktiviert in diesem Falle das hydrolysierende Enzym und zerstört (zerbricht) eventuell vorhandene Bakterien. Wiederum läßt man wie in dem oben beschriebenen Verfahren die Urinprobe mit der zugesetzten Perchlorsäure 5 Minuten lang stehen und die Urinprobe wird durch Zugabe eines Puffers, in diesem Falle eines Tris-Puffers, vorzugsweise von 2,5 M Iris-ihydroxjnnethyl)-aminomethan auf einen End-pH-Wert von 7,4 gebracht, wodurch die behandelte Urinprobe erhalten wird, die dann sofort mit der Magnesium enthaltenden Luciferase-Luciferin-Kombination gemischt wird.

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Unter Verwendung dieses Alt ernatiwe rf ahrens wurde eine Reihe von Urinproben getestet. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammen mit denjenigen angegeben, die nach den üblichen mikroskopischen und Gießplatten-Methoden zur Analyse der gleichen Proben erhalten wurden. Daraus ist zu ersehen, daß die oben gegebenen Erläuterungen .für die Tabelle I auch auf die Tabelle II zutreffen.

Tabelle II

Bestimmung der Anzahl der Bakterien pro ml nach verschiedenen

Methoden

Probe Nr.	alternative ATP-Methode	X	10⁶	Grießplatten- Methode	X	10*	10²	mikroskopische Methode	χ	10⁴
1	2,8	X	10⁵	1	X	10⁵	10⁷	• 2,4	χ	10⁵
2	7,4	X	10⁶	2	X	10²		1	X	10⁵
3	2,3	X 0	10⁸	1	χ 10² J>	10²	1	X 0	10⁷
4 5	6,6	X	10*	1	X	2,3	χ	10⁴
6	6	X	10⁷	1	X	2	X	10⁷
7	6,6	0		4	_-i	6	0
8		X	10⁶		X		χ	10⁴
9	2	.1	2

⁷^ = zeigt an, daß keine Organismen wuchsen

a) Eine 1,0 ml-Probe von Urin wurde mit 0,1 ml einer 1 vol. %igen Triton X-100-Iösung und 0,1 ml einer Kartoffelapyrase LÖBung gemischt und 10 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehengelassen.

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b) Dann wurden 0,1 ml einer 1,0 η Perchlorsäure zugegeben und " die Probe wurde 5 Minuten lang stehen gelassen. In diesem Falle wurden durch die Perchlorsäure sowohl die Kartoffelapyrase (das hydrolysierende Enzym) inaktiviert als auch die vorhandenen Bakterien zerstört (aufgebrochen) unter Freisetzung des ATP.

c) Dann wurde der End-pH-Wert der Probe durch Zugabe von 0,1 ml von 2,5 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (ein Tris-Puffer) auf 7,4 gebracht, wodurch die behandelte Urinprobe erhalten wurde.

d) Sofort wurden 0,1 ml der behandelten Urinprobe in eine Küvette injiziert, die 0,5 ml der Magnesium enthaltenden Luciferase-Luciferin-Kombination enthielt, wobei die Küvette in Nachbarschaft zu einer lichtdetektoreinrichtung in einer gegen Licht abgedichteten Kammer angeordnet war, so daß das bei der Bioluminiszenzreaktion abgegebene Licht durch die Lichtdetektoreinrichtung aufgenommen und danach mit Hilfe einer Aufzeichnungseinrichung, die mit der' Photodetektoreinrichtung elektrisch gekuppelt war, gemessen werden konnte.

Die obigen Stufen a) bis d) wurden für jede Urinprobe wiederholt.

Das hier beschriebene erfindungsgeniäße Verfahren führt zu einer beträchtlichen Zeiteinsparung im Vergleich zu den bekannten Verfahren, da während des Bakterienwachstums auf dem Nährmediumsubstrat keine Inkubationszeit erforderlich ist. AuSerdem kann diese Analyse auch von Mcht-Mikrobiologen durchgeführt werden und die wertvollen Fachkräfte können anderweitig wirksamer verwendet v/erden. Der Test eignet sich für alle Bakterien,, lebende oder tote, er ist nicht auf diejenigen beschränkt, die aerob wachsen können, er ist unabhängig von dem Typ des für die Bakterien für das richtige Wachstum erforderlichen Nährmediums und wird im allgemeinen durch die Anwesenheit von bakteriostatischen Mitteln, welche das Wachstum inhibieren, nicht"beeinträchtigt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur geeignet für die Verwendung zum Analysieren von Urinproben zur Bestimmung von In-

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fektionen der Harnwege durch Messung der Menge der Bakterien, sondern es ist auch für die Bestimmung der Bakteriengehalte in anderen wässrigen Körperflüssigkeiten, wie z.B. der Lymphflüssigkeit, im Plasma, Blut, Rückenmarksflüssigkeit, Speichel und Schleim geeignet, um nur einige wenige zu nennen. Außerdem ist e.s besonders geeignet zum Messen der Bakteriengehalte in wässrigen Körperflüssigkeiten, die außer den Bakterien sowohl freies lösliches ATP als auch ATP enthaltende,nicht-bakterielle Zellen aufweisen.

We-in die Erfindung in der oben genannten automatisierten Vorrichtung durchgeführt wird, anstatt mit 1,0 ml einer Urinprobe zu beginnen, wobei nach der Behandlung derselben 0,1 ml der behandelten Probe in eine die Luciferase-Luciferin-Mischung enthaltende Küvette injiziert wird, enthält die Vielzahl der in den rotierbaren Tisch eingeführten Phiolen jeweils eine 0,1 ml-Urinprobe und jeder der Bestandteile wird hintereinander in einer speziellen Zeitfolge zur Formulierung der behandelten Urinprobe zugegeben, die ihrerseits die injizierte Luciferase-Luciferin-Mischung enthält. Dies steht im Gegensatz zu dem beschrietmen allgemeinen Verfahren, bei dem die Probe in die Küvette injiziert wird, welche die Luciferase-Luciferin-Mischung enthält.

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Claims

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Patentansprüche

Verfahren zum Nachweisen und Zählen von Bakterien in einer rinprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die in der Probe vorhandenen Nicht-Bakterienzellen, die Adenosintriphosphat (ATP) enthalten, zerstört (zerbricht),

b) das nicht-bakterielle ATP zerstört,

c) das Zerstörungsmittel entfernt,

d) die Bakterienzellen zerbricht unter Freisetzung des ATP,

e) die Wasserstoffionenkonzentration der Probe auf einen Wert einstellt, der für eine Bioluminiszenzreaktion von ATP mit einer Luciferase-Luciferin-Mischung günstig ist unter Bildung einer behandelten Urinprobe,

f) die behandelte Urinprobe mit einer Luciferase-Luciferin-Mischung behandelt, die auch ein divalentes Metallkation aus der Gruppe Magnesium und Mangan enthält, und

g) die Menge an dabei emittiertem Licht aufzeichnet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die ATP enthaltenden Nicht-Bakterienzellen durch eine Verbindung zerbricht (zerstört), welche die Oberflächenspannung genügend herabsetzt, um das nicht-bakterielle ATP freizusetzen,

b) das nicht-bakterielle ATP mit einem ATP hydrolysierendeii Enzym zerstört,

c) das hydrolysierende Enzym durch Wärmedenaturierung entfernt,

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d) die Bakterienzellen durch. Ansäuern der Probe zerbricht und daß man

e) die angesäuerte Probe mit einer geeigneten Base neutralisiert, bevor die Wa'sserstoffionenkonzentration der Probe auf den Wert eingestellt wird, der die Bioluminiszenzreaktion des ATP mit der Luciferase-Luciferin-Mischung begünstigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe auf eine Temperatur von mehr als 60⁰C ausreichend lange erhitzt wird, um die Denaturierung des hydrolysierenden Enzyms sicherzustellen, und daß die Wasserstoffionenkonzentration der neutralisierten Probe mit einer Pufferlösung eingestellt wird unter Bildung der behandelten Urinprobe, mit einem pH-Wert von etwa 6,8 bis etwa 7,8.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) mit einer Säure aus der Gruppe Perchlorsäure, Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure, Essigsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure ansäuert,

b) mit einer Base aus der Gruppe der Alkalimetallhydroxyde und Erdalkalimetallhydroxyde neutralisiert, und

c) die Wasserstoffionenkonzentration mit einem Puffer einstellt, der einen pH-Wert von etwa 6,8 bis etwa 7,8 aufrechterhält.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die ATP enthaltenen^nicht—bakteriellen Zellen mit einem nichtionischen Detergens zerbricht,

b) aln ATP hydrolysierendes Enzym Adenosintriphosphatase-verwendet,

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c) die Probe etwa 1 bis etwa 15 Minuten lang auf 60 bis 100⁰C erhitzt, um die Apyrase zu denaturieren,

d) die Probe mit einer anorganischen Säure ansäuert zum Zerbrechen der Bakterienzellen,

e) die Probe mit einer Alkalimetallbase neutralisiert, und

f) die Wasserstoffionenkonzentration einstellt unter Verwendung eines Puffers, der einen pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 7,6 aufrechterhält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als nicht-ionisches Detergens Octylphenoxypolyäthoxyäthanol, als Adenosintriphosphatase eine Kartoffelapyrase-Lösung, als anorganische Säure Perchlorsäure und als Alkalimetallbase Kaliumhydroxyd verwendet wird.
7· . Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Octylphenoxypolyäthoxyäthanol in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 5,0 Vol.-% verwendet und der Probe in einer Menge zusetzt, die etwa 5 bis 15 Vol.-# der Probe entspricht,

b) eine Menge der Kartoffelapyrase-Lösung zugibt, um einen Überschuß gegenüber der für die Hydrolyse des nicht-bakteriellen ATP erforderlichen Menge zu erzielen und daß man die Probe ausreichend lange stehen läßt, um das Zerbrechen und die Hydrolyse zu . bewirken,

c) die Probe etwa '5 bis etwa 15 Minuten lang auf 95⁰C erhitzt, um die Denaturierung der Kartoffelapyrase herzustellen,

d) die Probe mit Perchlorsäure einer Konzentration von 0,05

bis 5,0 η ansäuert und etwa 10 Sekunden bis etwa 15 Minuten längsteilen läßt, um das Zerbrechen der Bakterien zu gewährlei.sten,

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e) die Perchlorsäure mit Kaliumhydroxyd einer Konzentration von 0,05 "bis 5,0 η neutralisiert, so daß die Kaliumionen mit den Perchlorationen einen unlöslichen Niederschlag bilden und

f) die Wasserstoffionenkonzentration mit einem nicht störenden Puffer einstellt, der einen pH-Wert von etwa 7,2 bis etwa 7,6 aufrechterhält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) 0,1 ml einer 1 vol.-^igen Lösung von Octylphenoxypolyäthoxyäthanol zu 1,0 ml der Urinprobe zugibt und 0,1 ml einer Kartoff elapyrase-Lösung damit kombiniert, v/obei man die Probe etwa 3 bis etwa 20 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen läßt,

b) die Perchlorsäurelösung mit Kaliumhydroxyd neutralisiert und die Wasserstoffionenkonzentration unter Verwendung von N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoäthansulfonsäure einstellt und

c) dann 0,1 ml der behandelten Urinprobe zu einer Magnesium enthaltenden Luciferase-Luciferin-Mischung zugibt.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) 0,1 ml einer 1 vol.-^igen Lösung von Octylphenoxypolyäthoxyäthanol zu 1,0 ml der Urinprobe zugibt und 0,1 ml einer Kartoffelapyraselösung damit kombiniert, wobei man die Probe etwa 5 bis etwa 20 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen läßt,

b) die Probe etwa 8 bis etwa 12 Minuten lang auf 95⁰C erhitzt, um die Denaturierung der Kartoffelapyrase sicherzustellen,

c) die Probe mit etv/a 0,1 ml einer 1,0 η Perchlorsäure ansäuert und etwa 5 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen läßt,

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d) die Perchlorsäurelösung durch Zugabe von 0,1 ml einer 1,0 η Kaliumhydroxydlösung neutralisiert,

e) die Wasserstoffionenkonzentration durch Zugabe von 0,1 ml
einer 2 M N-Tris-(h3rdrox3rmethyl)-methyl-2-aminoäthansulfonsäure einstellt zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes bei etwa 7,4» und

f) 0,1 ml der behandelten Urinprobe dann zu 0,3 ml einer Magnesium enthaltenden Luciferase-Luciferin-Mischung zugibt.

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