DE2728456A1 - Verfahren zur feststellung pathogener mikroorganismen in den menschlichen atemwegen - Google Patents

Verfahren zur feststellung pathogener mikroorganismen in den menschlichen atemwegen

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DE2728456A1
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Description

Die Lungenentzündung beim Menschen umfaßt im allgemeinen einen akuten entzündlichen Zustand eines oder beider Lungenflügel, der durch pathogene Mikroorganismen, wie Bakterien oder Viren, sowie durch chemische Reizmittel oder Fremdstoffe verursacht werden kann. Zur Feststellung der Ursache und der Diagnose sind daher Proben von Lungenflüssigkeit erforderlich. Ideale Proben von Lungenflüssigkeit bestehen aus homogenen Proben, die man durch chirurgische Eingriffe, z.B. transtracheale Aspiration erhalten kann. Selbstverständlich sind chirurgische Eingriffe zeitraubend und stellen für den Patienten ein Risiko dar. In Bezug auf transtracheale Aspirationen werden lebensbedrohliche Reaktionen berichtet. Zum Beispiel sind Patienten, die an entkräftenden Krankheiten, wie Blutdyscrasie leiden, für schwerwiegende Komplikationen bei der transtrachealen Aspiration besonders anfällig.
Die meisten Xrzte greifen daher auf Sputumproben vom morgendlichen Aushusten als Proben von LungenflUssigkeit zurück. Diese Maßnahme ist einfach und sehr üblich. Die durch Aushusten erhaltene Sputumprobe kann jedoch leicht
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2728Λ56
durch die normale Flora im Mund, der Nase, im hinteren Rachenraum und im Magen verunreinigt sein. Hinzu kommt, daß Sputumproben von an Lungenentzündung erkrankten Patienten sehr viskos und in ihrer Beschaffenheit heterogen sind und sich daher nur schwer in reproduzierbarer Weise dispergieren lassen. Eine quantitative Analyse des Sputums ist bei sehr viskosem heterogenen Sputum nicht möglich, da es bei einer quantitativen Analyse von Proben, wie Sputum, im allgemeinen notwendig ist, die Proben zu verdünnen und darauf kleinere Anteile der Proben auf verschiedene Wachstumsmedien auszustreichen und dann die Art und Anzahl der Kolonien der Mikroorganismen auf den Medien zu bestimmen. Im allgemeinen beträgt die maximale Anzahl der Kolonien, die auf einer Petrischale wirksam ausgezählt werden kann, etwa 3OO. Ferner nimmt man an, daß normale Sputumproben verunreinigende Mikroorganismen in Mengen bis zu 10 je ml enthalten können, während die die Lungenentzündung verursachenden Mikroorganismen in Mengen von im allgemeinen mehr als etwa 10 je ml vorhanden sind. Bevor daher eine Sputumprobe quantitativ analysiert werden kann, muß sie in solcher Weise verdünnt werden, daß die pathogenen Mikroorganismen gleichmäßig in der erhaltenen verdünnten Probe dispergiert sind. Wenn darum ein kleinerer Anteil dieser verdünnten Sputumprobe quantitativ auf die Art und Anzahl der pathogenen Mikroorganismen analysiert wird, läßt sich die genaue Anzahl der pathogenen Mikroorganismen je ml Sputumprobe genau errechnen.
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Um das Problem der Verunreinigung von außen und der heterogenen Beschaffenheit der Sputumprobe zu verringern und eine quantitative Sputumanalyse zu ermöglichen, wurden bereits mehrere Versuche gemacht, die Sputumprobe enzymatisch oder chemisch zu hydrolysieren. Es wurden schon mehrere solcher hydrolysierender Mittel untersucht, die jedoch alle einen oder mehrere der folgenden Nachteile hatten: sie waren kostspielig, sie ließen sich nicht lange aufbewahren, sie waren temperaturempfindlich, toxisch in Bezug auf einige oder viele pathogene Mikroorganismen, oder sie erforderten eine lange Hydrolysezeit. Zum Beispiel wurde eine Reihe proteolytischer Enzyme sowohl in eitrigem als auch schleimigem Sputum untersucht. Von diesen Enzymen erschienen Trypsin, Elastase und Chymotrypsin als am wirksamsten, während Enzyme, wie Bromelain, Ficin oder Papain nur in extrem hohen Konzentrationen wirksam waren und Plasmin keinen nachweisbaren Effekt auf die Viskosität von Sputum hatte. Alle diese proteolytischen Enzyme scheinen bei schleimigen Sputumproben wirksamer zu sein als bei eitrigen Sputumproben. Die am häufigsten für quantitative Sputumanalysen angewandten hydrolytisch wirkenden Mittel sind wässrige Lösungen von N-Acetylcystein und Clelands Reagenz (1,4-Dithio-mesoerythrit). Im allgemeinen zeigt bei niedrigeren Konzentrationen Clelands Reagenz eine größere schleimlösende Wirkung als N-Acetylcystein, jedoch verliert Clelands Reagenz in wässriger Lösung seine schleimlösende
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Wirksamkeit gewöhnlich in verhältnismäßig kurzer Zeit. Außerdem sind beide Reagentien in Konzentrationen, die für eine rasche Hydrolyse des Sputums erforderlich sind, gegenüber pathogenen Mikroorganismen etwas toxisch.
Demzufolge werden die meisten Sputumproben unter Anwendung einer nicht-quantitativen Ausstreichmethode untersucht, die im allgemeinen darin besteht, daß man die heterogene Sputumprobe auf verschiedene Wachstumsmedien ausstreicht. Diese Methode führt zu einer wesentlichen Anzahl falscher positiver Kulturen und in vielen Fällen zu einem Überwachsen der pathogenen Organismen durch verunreinigende Mikroorganismen.
Es wurde nun gefunden, daß bestimmte gereinigte Saponine mucolytische Wirkung besitzen, und in wirksamer Weise sowohl eitrige als auch schleimige Sputumproben abbauen und damit die pathogenen Mikroorganismen gleichmäßig dispergieren, ohne sie zu beeinträchtigen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird daher eine Sputumprobe mit einer wirksamen schleimlösenden Menge eines nicht-toxischen Saponins in Berührung gebracht, damit diese in einen Zustand von im wesentlichen gleichmäßiger Viskosität übergeführt wird. Beim Mischen der Probe werden die in ihr enthaltenen pathogenen Mikroorganismen einheitlich verteilt. Anschließend wird die so
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erhaltene Probe quantitativ analysiert.
Das erfindungsgemäß verwendbare nicht-toxische Saponin kann nach dem in der US-PS 3 883 425 beschriebenen Verfahren, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird, gereinigt werden.
Saponine sind Glycoside, die vielfach in Pflanzen angetroffen werden und öl-in-Wasser Emulsionen zu bilden vermögen. Sie wirken als Schutzkolloide. Jedes Saponinmolekül besteht aus einem Sapogenin, das den Agluconbestandteil des Moleküls darstellt, und aus einem Zucker.
Das Sapogenin hat entweder die Struktur eines Triterpenoids (d.h. es weist gewöhnlich einen Fünfring auf, wie Quillaja Sapogenin) ,* oder eine Steroidstruktur (gewöhnlich mit einer Spiro-Acetalseitenkette, wie in Diosgenin). Der Zuckeranteil der SaponLnglucoside umfaßt einen oder mehrere Zucker, wie Glucose, Saccharose, Xylose, eine Pentose oder Methylpentose oder andere Zucker. Bei der Hydrolyse ergeben die Saponine das Sapogenin und einen oder mehrere dieser Zucker.
Im Handel erhältliche Saponine bestehen aus einem weißen bis braunen amorphen stechenden Pulver mit unangenehmem Geruch und Geschmack. Dieses Pulver ist in Wasser sehr gut löslich und schäumt, wenn es mit Wasser geschüttelt wird, sehr stark.
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Die im Handel erhältlichen Saponine werden dadurch hergestellt, daß man Pflanzengewebe mit Wasser und/oder anderen organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, extrahiert und das Saponin durch Fällung, Umkristallisation und dergleichen gewinnt. Saponine sind in Pflanzen weit verbreitet. Zum Beispiel treten Saponine sehr verbreitet in der Pflanzenfamilie Caryophyllaceae auf. Spezifische Beispiele für Saponinquellen sind Quillaria saponaria, Panamaholz, Bäume der Familie Sapindaceae, Glycyrrhiza glabra Pflanzen und dergleichen. Ein spezifisches Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung von im Handel erhältlichem Saponin ist in Kingzette's Chemical Encyclopedia, D.H. Hey, 9. Auflage (1966) beschrieben, bei dem entweder gepulverte Quillaria saponaria mit heißem Alkohol extrahiert oder ein wässriger Extrakt von pulvriger trockener Quillaria saponaria mit Alkohol zum Sieden erhitzt wird, worauf man das Saponin aus dem Alkohol beim Abkühlen auskristallisieren läßt.
Saponine sind bei oraler Verabreichung an Menschen praktisch nicht toxisch, stellen jedoch, wenn sie in den Blutstrom injiziert werden, starke Haemolytica dar, die die roten Blutkörperchen auflösen. Wegen dieser Eigenschaft werden die Saponine üblicherweise in Laboratorien für die Auflösung von roten Zellen verwendet, wenn ihre Gegenwart andere Verfahren beeinträchtigt, z.B. bei Haemoglobinbestimmungen und der Zählung von weißen Zellen.
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In der oben genannten US-PS 3 883 425 ist ein Verfahren zur Entfernung mikrobieller Toxine aus durch Extraktion von Pflanzen erhaltenen Saponinen beschrieben, bei dem aus einer wässrigen Lösung dieser Saponine die Bestandteile mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als etwa 600, z.B. einer Molekülgröße in wässriger Lösung zwischen etwa 140 und etwa 600 entfernt werden. Eine in dieser Patentschrift angegebene Technik besteht in der Herstellung einer wässrigen Lösung eines im Handel erhältlichen Saponinextrakts von Pflanzen, worauf diese Lösung durch eine Filtermembran mit Mikroporen einer mittleren Porengröße von nicht unter etwa 11 und nicht über etwa 24 A im Durchmesser geführt wird. Die wässrige Lösung, die die Filtermembran passiert hat, enthält das antimikrobielle Toxin, während das Saponin vom Filter zurückgehalten wird.
Es wurde nun gefunden, daß diese gereinigten Saponinextrakte aus Pflanzen wirksame mucolytische Mittel darstellen, die alle Arten von Sputum abbauen und die mikrobiellen Pathogene in ihm dispergieren, ohne sie zu beeinträchtigen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Sputumprobe in herkömmlicher Weise entnommen. Danach wird das Sputum mit einer kleinen aber wirksamen mucolytischen Menge des oben beschriebenen nicht-toxischen Saponins ver-
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mischt. Vorzugsweise befindet sich das Saponin in wässriger Lösung, wenn es mit dem Sputum gemischt wird. Die wässrige Lösung kann jede geeignete Konzentration haben, so daß, wenn die gewünschte Menge der Lösung mit dem Sputum vermischt wird, ausreichend Saponin zum Abbau des Sputums vorhanden ist. Im allgemeinen sind in der gebildeten Mischung aus Saponin und Sputum etwa 0,1 bis etwa 20 Gew.% und vorzugsweise etwa 1,0 bis etwa 10 Gew.% und noch besser etwa 5 bis etwa 10 Gew.% Saponin notwendig.
Außerdem ist es vorteilhaft, der erhaltenen Mischung aus Saponin und Sputum etwa 0,1 bis etwa 20 Gew.% und insbesondere etwa 5 bis etwa 10 Gew.% eines Antischauiranittels zuzufügen, das für die mikrobiellen Pathogene nicht schädlich ist. Solche geeigneten Antischaummittel werden z.B. unter dem Warenzeichen Dow X Antischaummittel B und Dow X H 10 vertrieben. Diese Mittel enthalten chemische Polymere von Dimethylsiloxan und ein sterilisierbares, z.B. autoclavierbares, nichtionisches Emulgiermittel, z.B. ein unter dem Warenzeichen Triton X vertriebenes. Ein bevorzugtes Antischaummittel ist Dow X H 10, da es gegenüber der Sterilisation durch Autoclavieren sehr beständig ist. Das Saponin baut in wirksamer Weise sehr rasch alle Arten von Sputum, sowohl schleimiges als auch eitriges Sputum ab und bildet eine gleichmäßig viskose Mischung.
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Die Sputumprobe wird dann sorgfältig gemischt, um eine gleichmäßige Dispergierung der in ihr enthaltenen Mikroorganismen zu bewirken. Falls gewünscht, können Anteile der gebildeten abgebauten Sputumprobe direkt auf verschiedene Medien aufgestrichen werden, um eine bessere qualitative Sputumanalyse zu ermöglichen, die nicht der großen Anzahl falscher positiver Kulturen und dem überwachsen pathogener Flora durch verunreinigende Mikroorganismen unterworfen ist, wie die herkömmliche qualitative Analyse ohne Verwendung abgebauten Sputums.
Für die Durchführung der verbesserten quantitativen Sputumanalyse gemäß der Erfindung wird die mit Saponin behandelte Sputumprobe mit phosphatgepufferter normaler Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 oder einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel, welches die Analyse nicht beeinträchtigt und gegenüber den mikrobiellen Pathogenen nicht toxisch ist, in gewünschter Weise verdünnt, z.B. im Verhältnis 1:100 bis 1:1000. Die erhaltene verdünnte Probe wird zur gleichmäßigen Verteilung der mikrobiellen Pathogene in der Lösung sorgfältig gemischt. Dann werden Proben der verdünnten Lösung herkömmlichen Wachstumsmedien zugefügt und bebrütet. Zunächst werden alle auf den Medien gebildeten Kolonien identifiziert und gezählt. Da man den Verdünnungsgrad der Sputumprobe kennt, läßt sich die Gesamtmenge der verschiedenen Arten mikrobieller Pathogene leicht errechnen. Falls gewünscht kann alternativ die nicht
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verdünnte Probe einer mikroskopischen Untersuchung unterzogen werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
In diesem Beispiel ist die Toxizität verschiedener bekannter mucolytischer Mittel mit der von Saponin verglichen. In jedem Fall wurden Stämme der in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Bakterien über Nacht in den angegebenen Medien gezüchtet. Die Trübung der erhaltenen Kulturmedien wurde mit steriler Kochsalzlösung auf einen Bariumsulfatstandard
von annähernd 10 Bakterien je ml gebracht. Darauf wurde die gebildete Brühe im Verhältnis 1:200 mit Nährbrühe verdünnt. Zunächst wurde eine 40 Gew.%ige Lösung von Saponin, das gemäß dem Verfahren in der US-PS 3 883 425 zur Entfernung toxischer Verunreinigungen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als etwa 600 in wässriger Lösung gereinigt worden war, zu den in der Tabelle 1 angegebenen Wachstumsmedien für die verschiedenen Bakterien gegeben. Darauf wurde 1 ml jeder Bakterienkultur-Suspension zu 1 ml der oben beschriebenen Saponinlösung gegeben, um eine Endkonzentration von 20 Gew.% Saponin zu erhalten. Darauf wurde über Nacht bei 37°C bebrütet. Auf reichem Agar mit einem Gehalt von 1 Gew.% Glucose, oder Blutagar wurde auch eine Kontroll- und Testsuspension ausgestrichen.
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Die anderen auf ihre Toxizität untersuchten Verbindungen bestanden aus Clelands Reagenz (1,4-Dithio-mesoerythrit), N-Acetylcystein und Natriumlaurylsulfat. Diese mucolytischen Mittel wurden in den Konzentrationen und in den Wachstumsmedien für die einzelnen Mikroorganismen,wie in der Tabelle 1 angegeben, hergestellt und auf die gleiche Weise wie das Saponin auf ihre Toxizität geprüft.
Wenn die einzelnen Bakterien in der die angegebene Menge mucolytisches Mittel enthaltenden Brühe wuchsen, wurde der Versuch wiederholt, um zu sehen, ob sich das Wachstum in einem zweiten Versuch reproduzieren ließ. Wenn entweder beim ersten oder beim zweiten Mal kein Wachstum erhalten wurde, wurde ein dritter Versuch zur Erzielung von Wachstum der Bakterien durchgeführt. In einigen Fällen führte man einen dritten Versuch durch, auch wenn die Bakterien in den beiden vorhergehenden Versuchen wuchsen. Entsprechend zeigt in der Tabelle ein Pluszeichen erfolgreiches Wachstum und ein Minuszeichen negatives Wachstum an, nämlich: +++ = Wachstum in allen drei Versuchen
= kein Wachstum in allen drei Versuchen —+ = Wachstum in einem der drei Versuche -++ = Wachstum in zwei der drei Versuche.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt:
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Tabelle 1 Organismus
Art der
Wachstums brühe *
Mucolytisches Mittel und Konzentration in %
N-AcetyIcystein Natriumlaurylsulfat
0,5% 5,0% 2,5 % 10,0%
Clelands
0,1% 0,5%
Escherichia coli I 1
Staphylococcus XIII 1
Pseudomonas species 1
Candida species - 1
Torulopsis glabrata 1
Streptococcus pyogenes 2
Streptococcus pneumoniae 3
Citrobacter freundii 1
Klebsiella pneumoniae 1
Enterobacter aerogenes 1
Salmonella cholerasuis 1
Proteus mirabilis 1
Listeria monocytogenes 4
iJeisseria meningitidis 4
Bruceila suis 4
Bacteroides fragilis 5
Clostridium perfringins 5
Propionibacterium shermanii 5
Mycoplasma hominis 6
H
-+ ——
++ +-
++ +-
+- +-
NT NT
NT
NT
NT
NT
fy 1
CO 2
CO 3
CO 4
O 5
«D
Wachstum in reicher Brühe mit 1 Gew.% Glucose Wachstum in Todd-Hewett Brühe, nachfolgend auf Blut ausgestrichen Wachstum in reicher Brühe mit 1 Gew.% Glucose, nachfolgend auf Blut ausgestrichen Wachstum in reicher Brühe mit 1 Gew.% Glucose, nachfolgend auf Blut in einem CO_-Gefäß ausgestrichen Wachstum in einer Pepton-Hefe-Glucose-Maltose Brühe, nachfolgend auf Blut in einem unter anaeroben Bedingungen gehaltenen Gefäß ausgestrichen
ursprüngliches Wachstum in einer PPLO-Brühe, nachfolgend auf PPLO-Agar in einem CO_-Gefäß ausgestrichen NT - nicht untersucht
IS»
6 -
OO
Ul
CD
Aus der obigen Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die relativ hohe Konzentration des gereinigten Saponins die untersuchten Mikroorganismen nicht abtötete oder ihr Wachstum hemmte. Dagegen verhinderten alle übrigen untersuchten mucolytischen Mittel das Wachstum mehrerer Mikroorganismen bei viel geringerer Konzentration als der des Saponins. Es ist auch festzustellen, daß sogar bei der empfohlenen Anwendungskonzentration der gegenwärtig verwendeten mucolytischen Mittel (0,5 % N-Acetylcystein und 0,1 % Cleland's Reagenz) Toxizität gegenüber verschiedenen Organismen festgestellt wurde.
Beispiel 2
Mehrere Sputumproben wurden klinisch analysiert, nachdem die Proben in nicht-toxischem Saponin gelöst worden waren. Die erzielten Ergebnisse wurden mit solchen verglichen, die in Herkömmlichen Routine-Sputumuntersuchungen in einem Krankenhaus erhalten worden waren. Zu Anfang wurden am frühen Morgen Sputumproben genommen, und es wurden Naßpräparate und Abstriche hergestellt, um die Art des Sputums und charakteristische Eigenschaften, z.B. Sporen, festzustellen. Die Sputumproben wurden wie folgt mit den Bewertungen 1 bis 4 versehen:
Bewertung 1: Speichel - schaumig, klar, farblos, hauptsächlich Epithelzellen auf einem 4OX Feld
Bewertung 2: schleimig -farblos, klar bis durchscheinend,
überwiegend Eosinophile und Macro- phagen, polymorphonukleare Zellen weniger als 60%, weniger als die Hälfte eines 4OX Feldes mit Zellen.
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Bewertung 3: schleimig-eitrig - farblos bis grünlich,
leicht durchscheinend, annähernd die Hälfte des Feldes gefüllt mit Zellen
Bewertung 4: eitrig - gelb oder grünlich, wolkig, poly-
morphonukleare Zellen mehr als 70%, mehr als die Hälfte des Feldes bedeckt mit Zellen.
709881/0984
Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die herkömmliche und die erfindungsgemäße quantitative Sputumanalyse, die durch Saponin abgebautes Sputum verwendet, an 80 Sputumproben durchgeführt wurde, wobei 29 Ergebnisse voneinander abwichen. In 26 Fällen führte die erfindungsgemäße quantitative Analyse zu einem positiven Ergebnis, die herkömmliche Methode jedoch nicht. In 3 Fällen wurde mit der herkömmlichen Methode ein positives Ergebnis erzielt, dessen Bewertungen jedoch nicht hoch genug waren, um nach dem quantitativen Standard als positiv zu gelten. Besonders bemerkenswert ist, daß bei 7 Patienten mit der quantitativen Methode auf Schokolade-Platten Haemophilus influenzae in einer Bewertung von mehr als 10 je ml gefunden wurde, dieser jedoch mit der herkömmlichen Methode infolge von überwachsungen nicht entdeckt wurde. Dieser besondere Organismus ist bei der Lungenentzündung von großer klinischer Bedeutung. Auch wurden in 4 Fällen andere Organismen, die Doppelinfektionen verursachten, überwachsen und mit der herkömmlichen klinischen Laboratoriumsmethode nicht entdeckt. Die meisten Unterschiede in den in der Tabelle angegebenen Ergebnissen traten bei Hefen auf, die mit der quantitativen Methode als positiv ermittelt wurden, mit der herkömmlichen klinischen Methode jedoch nicht ermittelt oder nur in Form von leichtem Wachstum festgestellt wurden.
709881/0964
sn Platten
Die abgebaute Sputumprobe wurde auf die folgenden
ausgestrichen: BA, CHOC, EMB, MAN, MAN-PEN und SDA-GENT.
Darauf wurden aus einem Teil des abgebauten Sputums zwei 1:100
2 4
Verdünnungen hergestellt, um 10 und 10 Verdünnungen zu erhalten, z.B. wurde für die 10 Verdünnung 0,1 ml Sputum in 9,9 ml
4 2
Kochsalzlösung und für die 10 Verdünnung 0,1 ml der 10 Verdünnung in 9,9 ml Kochsalzlösung gegeben. Dann wurde eine 0,01 ml
4
Schleife zum Ausstreichen der 10 Verdünnung auf die folgenden Platten verwendet: BA, CHOC, EMB, MAN, MAN+PEN und SDA-GENT, um eine endgültige definierte Verdünnung von 10 zu erhalten.
Darauf wurde eine weitere 0,01 ml Probe auf SDA+GENT aus der
2 4
10 Verdünnung ausgestrichen, um eine Verdünnung von 10 zu ergeben. Alle diese Platten wurden bebrütet und nach 24 und 48 Stunden untersucht. Die SDA Platten wurden ferner nach einer Woche untersucht. Die Auswertung wurde in folgender Weise vorgenommen :
a) normale Flora (normale Menge und Art von Mikroorganismen im Nasen-Rachenraum) für Alpha Streptococcus und Neisseria sowie Diphtherie hervorrufende Mikroorganismen im Bereich von 10 und 10 .
b) Positive Infektion für alle anderen nicht-Hefe Organismen (andere als oben unter a) angegeben) im Bereich von 10 und mehr.
c) 10 , 1 bis 5 Organismen, beliebig gefunden auf einem Satz von Platten, als möglich positiv.
d) 1O und mehr, 1 bis 5 Organismen, beliebig gefunden auf einem Satz von Platten, als möglich positiv für Candida albicans und als positiv für alle übrigen Hefen.
709881/0984
In jedem Fall wurde die Zelldichte in der Weise bestimmt, daß man beobachtete, welcher Prozentsatz eines 40X Feldes auf einer Naßprobe mit Zellen gefüllt ist. Die Cytologie wurde durch Anfärben eines Objektträgers (Papanicolaou), Auszählen von 200 Zellen der Probe und Identifizieren der polymorphonuklearen Zellen (PMN), der Eosinophilen, der Basophilen, der Macrophagen, der Monocyten und der Lymphocyten bestimmt.
Nachdem jede Sputumprobe bewertet war, wurde eine Routineanalyse durchgeführt, die 6 halbquantitative Ausstriche umfaßte. Ein Teil der Sputumprobe wurde auf einer Blut-Agar Platte (BA), ein Teil auf einer Schokolade-Agar Platte (CHOC), ein Teil auf einer Eosin-Methylenblau Platte (EMB), ein Teil auf einer Mannitsalz Platte (MAN), ein Teil auf einer Mannitsalz Platte, die Penicillin enthielt ( MAN-PEN) und ein Teil auf einer Sabourand + Gentamicin Platte (SDA-GENT) ausgestrichen, worauf man die Bakterien wachsen ließ und sie danach identifizierte. Der restliche Teil jeder Probe wurde mit der gleichen Menge 10Gew.%igem Saponin, das gemäß der US-PS 3 833 425 gereinigt worden war, und 0,1 m Natriumcitrat und einem Antischaummittel (Antifoam B Emulsion Dow Corning) versetzt, um eine Endkonzentration von 5 Gew.% Saponin zu erhalten. Anschließend wurde die Saponin-Sputum Mischung mindestens 30 Sekunden umgewirbelt.
709881/0984
Tabelle
Fall
Nr.
Klinische Ergebnisse der Sputumuntersuchung auf herkömmliche
und erfindungsgemäße quantitative Weise
Z putUmbewertung
herkömmliche Analyse
Folgerung
quantitative Analvse
Folgerung
(O
Go oo 1
(O OO
*" 2 2 2 1
leicht Enterococcus, leicht Klebsiella pneumoniae, leicht Staphylococcus epidermidis, leicht Pseudomonas
leicht Staphylococcus aureus
mäßig Serratia marcescens, leicht Pseudomonas
normale Flora normale Flora normale Flora
leicht Pseudomonas albicans, leicht Candida albicans
stark Klebsiella pneumoniae, leicht Candida tropicalis, leicht Enterococcus normale Flora
normale Flora
wesentliches
Wachstum von
Serratia
marcescens
normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora
normale Flora
2 χ 10 7 Neis-
seria Derflava
1 χ 10 Pseudo-
monas aeruqmosa
1 χ 10 5 Serratia
marcescens
normale Flora normale Flora normale Flora
χ 10 Pseudo-
raonas aeruginosa
positiv für Kleb- 2,5 χ 10 Hefe siella pneumoniae (Candida krusei
und Torulopsis cTlabratai 1 χ Klebs.pneumoniae, χ 10' En-erococ
normale Flora
möglicherweise positiv für Neisseria per-
fläva
positiv für Pseudomonas aetu-
ginosa, moglicnerweise positiv für Serratia marcescens
normale Flora normale Flora normale Flora
mög1icherwe i se positiv für Pseudomonas aerugir.os i
positiv fvine Klebs.pneu nc η>ae und Enterococcus(D)
:us
Sputumbewertung
Tabelle 2 (Fortsetzung) herkömmliche Analyse Folgerung
quantitative Analyse
Folgerung
O 1
12 CD
CD
CD
O
CD 2
13 OB 3
14
mäßig Candida albicans
normale Flora
mäßig Klebs.pneumoniae, leicht Candida albicans
normale Flora
mäßig Klebsieila pneumoniae, leicht Candida albicans
leicht Staphylococcus aureus, leicht Candida albicans
Candida albicans
positiv für Candida alb.
normale Flora
positiv für
Klebsiella
pneumoniae TNTC Hansenula ς polymorpha, 1 χ 10"" Klebs.pneumoniae
χ 105 Staphylococcus aureus
χ 106 Klebs. pneumoniae, 1 χ 10 Candida albicans
positiv für Hefe, möglicherweise positiv für Klebs. pneumoniae
normale Flora
leicht Pseudomonas fluorescens, normale Flora leicht Candida albicans
χ 10° Candida albicans, 1 χ 10 Pseudomonas fluorescens. 1 χ 10" Klebs.pneumoniae
normale Flora normale Flora
positiv für
Klebsiella
pneumoniae normale Flora
positiv für Candida alb.
χ 10° Candida albicans
χ ΙΟ6 Candida albicans, 1x10° Staph. aureus
χ 10J Candida albicans
leicht Beta streptococcus,leicht Staphylococcus aureus, leicht Candida albicans und Candida tropicalis "*"
χ 10 Torulopsis maaii.4x10 Candida albicans
-positiv für Candida albicans, möglicherweise positiv für Klebs. pneumoniae
positiv für Candida albicans u. Pseudomonas fluorescens, möglicherweise positiv für-Klebs.pneumoniae
normale Flora
positiv für Candida albicans ·' :
positiv für Candid« albicans u. Stach, aureus
möglicherweise positiv für Candid» albicans
positiv für Torulopsls maqii und Candida albieans
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Fall Sputum- herkömmliche Analyse Nr. bewertung
Folgerung
quantitative Analyse
Folgerung
Haemophllus influenzae
normale Flora
stark Enterobacter cloacae, stark Klebsieila pneumoniae, stark Staphylococcus epidermid.
21 1886 3 normale Flora tropicalis
22 2 normale Flora
23 O 2 normale Flora
24 β» 2 leicht Candida
leicht Klebsieila pneumoniae, 3 KoI. Staphylococcus aureus
normale Flora
leicht Candida tropicalis
positiv für Haemophllus influenzae
normale Flora
positiv für Enterobacter cloacae. Klebs. pneumoniae und Staph.epidermid.
normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora
normale Flora
normale Flora normale Flora
influenzae, 1 χ 10J Torulopsis glabrata
normale Flora 108 Klebsiellj
gneumoniae, >10°^
Enterobacter cloa-
-~m in"
cae, 10J Candida krusei, 103 Torulopsis glabrata. 2* Cand.tropicalis
Penicillium humulli normale Flora normale Flora
2,5 X 104 Candida tropicalis. 1,5 χ 10 Torulopsis crlabrata
■%• 10 Klebs. pneumon.
normale Flora
,6
Escherichia coil. Torulopsis glabrata
positiv für Haemophilus influenzae. möglicherweise positiv für Torulopsis glabr.
normale Flora
positiv für Klebs Xn pneumoniae, Ente- Oi robacter cloacae. Cand. krusei, Torulopsis glabrata u.Candida trop i-
calis
normale Flora normale Flora normale Flora
positiv für Candida tropicalis u. Torulopsis glibr.
möglicherweise positiv für Klebs. pneumoniae
normale Flora
möglicherweise positiv für Escherichia coli und Torulopsis glabrata
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Fall
Nr. 		709 Sputum
bewer
tung 		herkömmliche Analyse Folgerung quantitative
Analyse 		Nl
OO
Folgerung *■»
cn
Oi
28 OO
00
^^ 		4 normale Flora normale Flora 6 χ 10-H'aemophilus.
1 χ 10 Torulopsis
glabrata 		möglicherweise
positiv für
HaemoDhilus
und Tgru^opsi,s crlabr.
29
30 		O 2
3 		normale Flora
mXßiq Acinetobacter cal
coaceticus (H) 		normale Flora
positiv für
Acinetobacter 		normale Flora
2 χ 108 Acinetobac
ter calcoaceticus iu.) ,
1 χ 10° Haemophilua
Q
x 10 Diplococcus 		normale Flora
positiv für Aci-
netobacter cal
31 to
0»
*» 		4 normale Flora calcoaceticus(H)
normale Flora 1 		normale Flora
1 χ 105 Candida alb. 		coaceticus und
Haemophilus
positiv für Diplo-
COCCUS
32
33 		3
2 		normale Flora
Candida albicans 		normale Flora .
positiv für 		normale Flora
positiv für Can-;
Candida alb. normale Flora
10 Pseudomonas aeru-
ginosa. 10^ Proteus
mirabilis 		dida albicans
34
35 		2
3 		normale Flora
leicht Enterobacter
cloacae 		normale Flora
normale Flora 		normale Flora ;
möglicherweise
positiv für Pseu^ ·
1 χ 10 Proteus vulg. domonas aeruqinosä:'
u.Proteus mirabilis
36 3 leicht Proteus vulgaris normale Flora normale Flora möglicherweise
1 xiO3 Candida positiv für Pro- ,;
teus vulqaris ... :
37 3 leicht Candida albicans normale Flora albicans normale Flora
38 2 normale Flora normale Flora möglicherweise
positiv für Can-
dida albicans
Ii
Kail Nr.
Sputumbewer tung
label.· herkömmliche Analyse
CO
ο
u>
-*el zui.q * Folgerung
quantitative Analyse
Folgerung
■.Jii ■- Klebsiella pneumoniae,
tt-ciit Ente; ;caceus und Candida tropicalis
stark Candida albicans, leicht Klebs.pneumoniae
normale Flora
leicht Candida albicans
stark Candida albicans
normale I lora
Proteus mirabilis und grampositive Cocci (nicht 1SO- '■ ierbar)
-apfiylucocc -w aureua sr.ar» Xlebsiei'a pneumonia;
positiv für Klebsiella
positiv für Candida alb.
normale Flora normale Flora
positiv für Candida alb.
normale flora
i ebij.ei.la
;
pneumoniae. 10
Enterococcus.
Candida alb.
10' Klebsiella pneumoniae,
Candida albicans
Haemophilus
normale Flora Candida alb.
cans,
Capdida albi-Serratia
liquefaciens, 10
Pseudomonas
normale Flora
Proteus mira-
pneumoniae, Bas j.di omycetas
normale Flora
.. 108 Klepsieila
Oiioumoniae
positiv für Candida albicans, möglicherweise positiv für Enterococcus u.Kleb».pneumoniae
positiv für Klebsiella pneumoniae. Candida albicans
möglicherweise positiv für Haemophilus
normale Flora
positiv für Candida albicans
positiv für Candida ι albicans. möglicherweise positiv für Serratia liquefaoxer.s und Pseudomonas
normale Flora
möglicherweise posi-1 iv für Proteus mir.är
iCbi ir Kχ■-: L. j j. alia pneumoniae
normale Flora
positiv füi Kleb- Oi sieila pneumoniae O>
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Fall Sputum- herkömmliche Analyse Nr. bewer-
tung
Folgerung
quantitative Analyse/
Folgerung
2
3
3
4
co 3
^ 2
»- 3
3
4
2
normale Flora
leicht Klebsiella pneumoniae, leicht Beta Streptococcus. müßig Citrobacter freundii
normale Flora
müßig Candida albicans
leicht Candida albicans
stark Klebsiella pneumoniae. le*icht Escherichia coil
leicht Klebsiella pneumoniae. leicht Candida tropical!«
leicht Haemophilus, Candida albicans
mäßig Haemophilus
stark Klebsiella pneumoniae. leicht Escherichia coli
normale Flora normale Flora
positiv für Citro- 1 χ 10° Pseudobacter freundii monas putida
normale Flora positiv für Candida albicans
normale Flora positiv für Klebsiella pneumoniae
normale Flora
leicht normale Flora positiv für Haemo-Dhilus
positiv für Klebsiella pneumoniae
normale Flora
χ 105 Candida albicans und Candida tropicalis
χ 10J Candida albicans
x 108 Neiaseria species, 1 Fusarium species
~- 3 χ 105 Candida para-psilosis
χ 10 Candida g albicans. 1 χ 10 Haemophilus
1,0 χ 10K philus
Haemo-
χ 10° Klebsiella pneumoniae
normale Flora
möglicherweise positiv für Pseudomonas putida
normale Flora
positiv für Candida albicans und Candida tropicalis
mög1icherwe i se positiv für Candida ι albicans ^,
möglicherweise positiv für ' Neisseria Species
positiv für Candida para-psilosis
positiv für Haemophilus, möglicherweise. : positiv für Candida : albicans · ■
positiv für Haemo- ' philu»
möglicherweise posi- OO tiv f. Klebs. pneumon. .P*
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Fall Sputum- herkömmliche Analyse bewer- tung
Folgerung
quantitative Analyse
Folgerung
60 7098I 4
61 2
62 0984 4
63
64 		4
2
65 4
66
67 		3
3
68 2
69 2
leicht Haemophilus
leicht Klebsieila pneumoni
normale Flora Haemophilus
leicht Serratia liquefaciens
normale Flora normale Flora
stark Klebsieila pneumoniae, leicht Enterococcus
normale Flora
mäßig Staphylococcus aureus, leicht Alpha Streptococcus
stark Serratia liquefaciens. leicht Alpha Streptococcus
normale Flora normale Flora normale Flora
>3 χ 10 Haemophilus
1 χ 106 Klebsiella pneumoniae, 1 χ Candida albicans
positiv für Haemophilus
3 positiv für Klebsiella 10 pneumoniae. möglicher
weise positiv für
normale Flora Candida albicans t
normale Flora 1 χ 107
philus 		Haemo- normale Flora ai
positiv für
Haemophilus 		normale Flora positiv
philus 		für Haemo- I
normale Flora normale Flora normale Flora
normale Flora normale Flora normale Flora
normale Flora normale Flora
positiv für Klebsiella pneumoniae
normale Flora
positiv für Staphylococcus aureus
positiv für Serratia liquefaciens
normale Flora
1 X 10 Enterococcus (D), 3 χ 10 Klebsiella pneumon.
normale Flora
1 χ 107 Staphylococcus aureus
>108 Serratia liquefaciens
normale Flora
positiv für Enterococcus (D) und TUebsiella pneumoniae
normale Flora
positiv für Staphylococcus aureus
positiv für Serratia liquefaciens
normale Flora
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Fall Sputum herkömmliche Analyse bewer-
tung
Folgerung
quantitative Analyse
Folgerung
3
2
4
75« 2 β»
· 4
3
2
3
mäßig Enterobacter aeroaenes positiv für Entero- 1 χ 10 Enterobacter
normale Flora
leicht Klebsiella pneumoniae. leicht Enterococci bacter aerogenes
normale Flora
normale Flora
Enterobacter. Candida
Enterobacter ae, rooenes. albicans
leicht Klebsieila pneumoniae (2)
normale Flora normale Flora
Alpha Streptococcus. Neisseria normale Flora
normale Flora normale Flora normale Flora
aerogenes. 1 χ 10 Serratia liquefaciens
positiv für Enterobacter aerogenes, möglicherweise positiv für Serratia liquefaciens
1 x 10 Serratia Haue- positiv für Serrafaciens tia liquefaciens
normale Flora
I XiO4 Candida albj.-cans
> 1 x 10 Enterobacter cloacae. 1,5 χ 103 Candida albicans
normale Flora
* 1 χ 10 Haemophilus■ 1 χ 106 Klebsiella pneumoniae und Hormo-
dendrum Species. 1 χ Pasteurella
normale Flora normale Flora
1x10" Haemophilus. 1x10/ Klebsiella pneumoniae
positiv für Candida albicans
positiv für Enterobacter cloacae und Candida albicans
positiv für Haemophilus. möglicher-,weise positiv für 10 Klebsiella pneumo · niae und Pasteurella
normale Flora normale Flora
positiv für Haemophilus und Klebsiella pneumoniae
Um eine Beziehung zwischen den Laboratoriumsergebnissen und den Krankengeschichten herzustellen, zeigt die Tabelle 3 einige Beziehungen zwischen quantitativen Sputumanalysen und Halsbefunden sowie Lungenautopsien.
Tabelle 3
Patient
Nr.
Kultur Ergebnisse
III
VII
VIII
Hals Sputum *'
Hals Sputum
Sputum
Hals
Hals
Sputum
Hals
Sputum
Lungenautopsie
Hals
Sputum
Hals
Sputum
Sputum
Lungenautopsie
Mund
Hals Lunge
Sputum leicht Candida albicans
1 χ 10 Candida albicans, 1x10 Proteus und Pseudgmpnas aeruginpsa
normale Flora
108 Haemophilus, 106 Klebsiella _Eneum.ojiiae, 105 Pasteurella,.
1 χ 10 Klebsiella pneumpni_ae._ mäßig Candida albicans leicht Pseudpmpnas aeruginos.a 1 χ 10 Pseudomonas aeruginpsa
S ta ph y_locpccus, Streptococcus Beta, leicht Klebsiella £neumpn_iae 10 Klebsiella pneumoniae stark Klebsiella pneumoniae leicht Candida albicans
>10 Candida albicans, 10 Serratia liquefaciens, 10 Pseudomonas Enterococcus, Escherichia coIi normale Flora
normale Flora
Enterobacter aerogenes.
stark Klebsiella pneumoniae und Candida tropicalis
stark Klebsiella pneumoniae und Candida tropicalis
stark Klebsiella Enej^oniae_ und Can-^ dida tronicalis
~8~ 7
10 Klebsiella pneumoniae, 10 Er^-
terococcus
709881/0964
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Patient Kultur Ergebnisse
Nr.
X Hals Lactobacillus und Candida albicans.
Sputum 10 Klebsiella pneumpniae, 10 Entero
bacter cloacae, 10 Candjda k_ruseii, 104 Candida tropicalis. 10^ Torulopsis ^labräta
XI Hals mäßig Staphylococcus aureus Sputum 1x10 Staphylococcus _aureus
XII Hals stark JÜj2bs_iella pneumoniae und EntfiJCQ-
Jsacter ^aerogenes., Candida albicans
Sputum 10 Enterobacter aeiQ3en.gs. und 10
Candida albicans
Blutunter- Enterobacter aerogenes und Pseudomonas suchung
XIII Hals normale Flora
104 Cand glabrata
4 4
Sputum 10 Candida tropicalis, 10 Torulopsis
Quantitative Sputumanalyse
Aus der Tabelle 3 ist ersichtlich, daß in einigen Fällen die Halsbefunde die gleichen Organismen ergaben wie das Sputum, was bedeutet, daß der Patient entweder Kolonien aufwies oder unter Umständen eine orale Verunreinigung der Sputumprobe vorlag. Wiederholte Kultivierungen und Beobachtungen bei Änderung der Auszählungen könnten den Arzt befähigen, zwischen diesen beiden zuletzt genannten Möglichkeiten zu unterscheiden. Falls Kolonien festgestellt werden, könnte man dann Vorsichtsmaßnahmen treffen, um eine Lungeninfektion zu verhindern. Weiterhin zeigt die erfindungsgemäße quantitative Sputumanalyse
709881/0984
in vielen Fällen eine schwere Infektion an, während die Analyse der Halsprobe dies nicht tut. Im letzteren Fall würden die erhaltenen Werte den Schluß stützen, daß eine minimale nasopharyngale Verunreinigung vorliegt und in diesem Fall eine Lungeninfektion sehr wahrscheinlich ist.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die mucolytische Wirkung, d.h. die Fähigkeit zur Verringerung der Viskosität von Saponin bei klinischen Sputumproben. Die Sputumprobe bestand aus 2 ml mit der Bewertung 2 gemäß dem obigen Beispiel 2. Zur Messung der Viskosität der Probe wurde ein kleines Viskosimeter, wie es in "A Simple Method of Measuring Sputum Viscosity", von A.O.Jenssen, in Scand.J.Resp.Dis., Band 54 (1973), Seite 290 bis 296 beschrieben ist, zusammengebaut. Dieses Viskosimeter besteht aus einem einzigen Kunststoffblock, dessen Grundfläche plan geschliffen ist. In diese Grundfläche wird ein im Schnitt halbkreisförmiger Gang ausgebohrt, der in einer senkrechten Bohrung endet, die oben eine Y-förmige Vorrichtung aufzunehmen vermag, deren einer Zweig über einen Kunststoffschlauch mit einem Luftflußregulator und der andere über einen Kunststoffschlauch mit einem Wassermanometer verbunden ist. In die senkrechte Bohrung wurde gerade über dem Gang ein Luftauslaß ausgebohrt. Druckveränderungen wurden als Absinken der Höhe der Wassersäule im Manometer gemessen. Die Zeit, die bis zur Leerung des Viskosimeters erforderlich war, wurde in Sekunden festgehalten.
709881/0984
Zur Messung der Viskosität einer gegebenen Probe wurde Sputum auf eine Glasplatte gebracht. Das Viskosimeter wurde bei konstantem Luftfluß auf das Sputum gestellt, das den Gang des Viskosimeters füllte. Der Luftauslaß an der Seite des Viskosimeters wurde geschlossen. Die Zeit bis zur Leerung des Viskosimeters und dem maximalen Absinken der Höhe der Wassersäule wurde notiert. Die Veränderung der Höhe der Wassersäule in ml wurde durch Multiplizieren mit 0,00881 in mmHg (Druck) umgewandelt. Nach dem Aufsatz von Jenssen ergibt sich: Druck χ Sekunden χ Κ = Viskosität, wobei K eine Kalibrierungskonstante für das Viskosimeter darstellt.
Das Viskosimeter wurde gegen ein Oswald Viskosimeter unter Verwendung von Glycerin als Primärstandard kalibriert. Für dieses Viskosimeter gilt K = 13,5 χ 10 . Die mit dem Sputum der Bewertung 2 erhaltenen Viskositäten bei und ohne Zugabe des im Beispiel 1 und 2 beschriebenen gereinigten Saponins sind in der Tabelle 4 zusammengestellt:
Tabelle 4
Mucolytische Wirkung von Saponin auf eine klinische Sputumprobe
Beschaffenheit des Sputums: 2 ml mit der Bewertung 2,0
Centipoise
A. Viskosität von 5 verschiedenen Anteilen vor der Zugabe von Saponin:
B. Viskosität von 4 verschiedenen Anteilen nach der Zugabe von 0,1 ml 13%igem Saponin:
709881/0984
X = 169 s.d.= 7
881 8306
1 ,332 166
14 ,295 177
19 ,929 161
6 ,962 172
X = 8678
s.d. =
9
Man sieht, daß das Saponin das Sputum wirksam löst und zu einer im wesentlichen gleichmäßigen Viskosität aller Anteile führt.
sch:cm
709881/0984

Claims (8)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur Feststellung pathogener Mikroorganismen in den Atemwegen, bei dem eine Probe Lungenflüssigkeit genommen und auf die Gegenwart pathogener Mikroorganismen untersucht wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe der Lungenflüssigkeit mit einer wirksamen mucolytischen Menge eines hi-cht-toxischen Saponins versetzt, die erhaltene Probe mit im wesentlichen einheitlicher Viskosität sorgfältig vermischt und dann analysiert.
    709881/0984
    _ 2 —
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Analyse der behandelten Probe durch Ausstreichen von Anteilen der Probe auf Nährböden bewirkt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht-toxische Saponin mit der Probe der Lungenflüssigkeit in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 20 Gew.% der Mischung aus Lungenflüssigkeit und Saponin versetzt.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht-toxische Saponin mit der Probe der Lungenflüssigkeit in einer Menge von etwa 5 bis etwa 10 Gew.% der Mischung aus Lungenflüssigkeit und Saponin versetzt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht-toxische Saponin als wässrige Lösung verwendet.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung des nicht-toxischen Saponine eine kleinere Menge eines für die pathogenen Mikroorganismen nicht-toxischen Antischaununittels enthält.
    709381/0984
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-toxische Saponin aus Pflanzen extrahiert und dadurch nicht-toxisch gemacht wurde, daß man aus einer wässrigen Lösung des Saponinextraktes die Bestandteile mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als etwa 600 in der wässrigen Lösung entfernte.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Sputumprobe mit dem nicht toxischen Saponin versetzt und analysiert.
    709881/0984
DE19772728456 1976-06-28 1977-06-24 Verfahren zur feststellung pathogener mikroorganismen in den menschlichen atemwegen Granted DE2728456A1 (de)

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